大肠杆菌O49是一种致病菌，属于VTEC(Vero cytotoxin(VT)producing Escherichia coli)，可引起牛等牲畜的腹泻。[Tokhi AM et.al.(1993)“A longitudinal study of Vero cytotoxin producing Escherichia coli in cattle calves in Sri Lanka”.Epidemiol Infect.110(2)：197-208.]，具 有潜在的爆发性流行的危险。因此在农业、食品及卫生系统上急需一个可以 快速、准确检测大肠杆菌O49的方法。
位于大肠杆菌表面的脂多糖是大肠杆菌致病的诱因，而O-抗原是脂多糖 最外层结构，是免疫系统识别的目标和噬菌体吸附的位点。O-抗原的缺失会 造成许多病原体的血清敏感，或者严重削弱病原体的毒力[Frank et al(1987) “The function of antibody and complement in the lysis of bacteria”.Rev Infect Dis 177：1750-1753.Pluschke G et al“Role of the capsule and the O-antigen in resistance of O18：K1Escherichia coli to complement-mediated king.J Bacteriol 42：907-913]。大肠杆菌是一个种， 种内的菌株一般通过O-抗原和H-抗原(有时通过K-抗原)来鉴定。其中O-抗 原具有高度多样性，大肠杆菌有166种不同的O-抗原，O-抗原的变化可能是 大肠杆菌的起源和维持其多样性的主要原因[Reeves，P.R(1992)“Variation in antigens，niche specific selection and bacterial populations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]。
O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的 寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二 磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡 糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过o-抗原转运酶被转移到内膜外侧，而后通 过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子 [Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends in Microbiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原 合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇 [Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在大肠杆菌、志贺氏菌和沙 门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001) “Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen loci：implication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection and Immunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coli O111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：gene clusters encoding the same colitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal of Bacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基 因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合 成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单 糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包 括o-抗原转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧， 再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因 的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联 结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖 单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决 定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。
因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又 具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其 O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应 自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一 的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不 足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、 灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检 测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏 菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门 氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification of abequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”， J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血 清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因 的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年， Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷 酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiological investigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-like toxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明 Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型 的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI 基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.and Reeves，P.R.(1995) “Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111”.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构 中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的。

本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸。它 是大肠杆菌O49的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于o-抗原转运酶基因、聚 合酶基因及糖基转移酶基因的特异的核苷酸。
本发明的一个目的是提供了大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的全长核苷酸 序列。
本发明的次一目的是提供了构成大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的基因： 转运酶基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因 或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf6、orf9、orf11、orf12 基因；糖合成路径基因，包括rmlB、rmlD、rmlA、rmlC、vioA、gne；与脱 氢或脱水有关的酶的基因，包括orf7。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和 终止位置及核苷酸序列都列在表4中。
本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O49的O- 抗原基因簇中编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因； 源于编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于编 码糖基转移酶的基因，包括orf6、orf9、orf11、orf12基因。它们是上述基 因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O49的O-抗原是特异的； 尤其是表1中列出的源于编码转运酶的基因和聚合酶的基因的寡核苷酸，它 们对大肠杆菌O49的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合， 组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O49的O-抗原也是高度特异的。
本发明的另一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应， 或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这 些方法来检测和鉴定大肠杆菌O49的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O49。
本发明的再一目的是提供了分离大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的全序列 的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可 以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长14256个碱基；或者具有一个或多个插入、 缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷 酸。
前述的对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其包括命名 为rmlB，rmlD，rmlA，rmlC，vioA，orf6，orf 7，wzx，orf9，wzy，orf11， orf12，gne的13个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
前述的对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述基因 中具有高度特异性的基因包括：转运酶基因即wzx基因或与wzx有相似功能 的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基 因，包括orf6、orf9、orf11、orf12基因。其中所述的转运酶基因是SEQ ID NO：1中的6848至8350碱基的核苷酸；聚合酶基因是SEQ ID NO：1中的9551 至10723碱基的核苷酸；orf6是SEQ ID NO：1中的5733至6386碱基的核苷 酸；orf9是SEQ ID NO：1中的8347至9579碱基的核苷酸；orf11是SEQ ID NO：1 中的10738至11559碱基的核苷酸；orf12是SEQ ID NO：1中的11556至12455 碱基的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其还包括 源于所述的wzx基因或wzy基因或糖基转移酶基因的寡核苷酸；以及它们的 混合或它们的重组。
前述的对大肠杆菌O49的O-抗原高度特异的核苷酸，其特征在于，所述 的源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的6944至6961碱基的核苷 酸和7678至7695碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的7087至7104碱基的核苷 酸和7611至7628碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1 中的9821至9838碱基的核苷酸和10508至10525碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1 中的10009至10026碱基的核苷酸和10683至10700碱基的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、 鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
前述的对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，在通过插入 表达而提供表达大肠杆菌O49的O-抗原，以及制备细菌疫苗中的应用。
前述的对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于它作 为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片 或微阵列，供检测细菌的应用。
前述的对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于， 包括下述步骤：
(1)基因组的提取：在培养基中培养大肠杆菌O49型，离心收集细胞；得 到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测；
(2)通过PCR扩增大肠杆菌O49型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O49型 的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，将得到的PCR产物，用 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并该long PCR产物，并 用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物；
(3)构建O-抗原基因簇文库：将Long PCR纯化产物应用鸟枪法构建O-抗 原基因簇文库；
(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的克隆用实 验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的 覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；
(5)核苷酸序列的拼接及分析：应用生物信息学软件拼接和编辑所有的序 列，从而得到大肠杆菌O49型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；
(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O49型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy 基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因 内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺 氏菌的基因组为模板进行PCR，确定wzx、wzy基因对大肠杆菌O49型的O-抗 原的高度特异性；
(7)引物灵敏度的检测：培养大肠杆菌O49，细菌计数后分别将5×103， 5×102，5×101，5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中，混入细菌 的待检测物作为检测用样品，将样品加入LB培养基，取一些与样品混合过的 LB培养基过滤，将过滤液进行培养，从培养好的菌液中取数毫升处理后作为 PCR模板用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对大肠杆菌O49的灵敏度。
前述的对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于， 包括下述步骤：
(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O49，离 心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞， 37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后 加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液再 用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清液， 再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用 玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中，基因组 DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；
(2)通过PCR扩增大肠杆菌O49中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O49的基 因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇；首先根据经常发现于O-抗 原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预 变性2分钟，然后94℃变性10秒，61℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样 进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼 脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性；合并6管long PCR产物，并 用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；
(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构 建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2， 1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行；酶切10分钟使DNA 片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应；合并4 管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇 (25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍 体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中；随 后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)， 1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产 物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓 冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾，此混 合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与 Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为 90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶；最后用1/10体 积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙 醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。用Bio-Rad公司的电转化感 受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与 50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电 击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml 的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB 固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色 克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质 粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大 肠杆菌O49的O-抗原基因簇文库；
(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100 个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入 片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率，再通过将相联系的序列进行反 向测序及测通得到剩余20％的序列，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；
(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4 软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的核苷 酸全长序列，序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O49的基因 组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基， 保证3个以上高质量的覆盖率；在得到大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的核苷 酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for Biotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到13个开放 的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅 读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完 成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得 到大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的结构；
(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O49的O-抗原基因簇中的wzx、wzy 基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因 内的不同地方以确保其特异性；用这些引物以166种血清型的大肠杆菌和43 株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，所有引物都在大肠杆菌O49中得到阳性 结果，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组 中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PCR产物带，但其大小不 符合预期大小，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O49及其O-抗原都是高度特异 的。
(7)引物灵敏度的检测：购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g 一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O49的冻存菌液接种到有20 ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量 培养好的菌液作106和107倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取 50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算 原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×103，5×102，5×101，5个 和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液 于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5 分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮 15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用4对 寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的6944至6961碱基的核苷酸和7678至7695 碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的7087至7104碱基的核苷酸和7611至7628 碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的9821至9838碱基的核苷酸和10508至10525 碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的10009至10026碱基的核苷酸和10683至 10700碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg2+： 2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1 μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45 ″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电 泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。 参入了5×103，5×102，5×101，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR 反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到 阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O49的 检测灵敏度均为0.25个菌/g。
也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的 全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长14256个碱基；或 者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功 能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O49的O-抗 原基因簇的结构，如表3所述，它其包括命名为rmlB，rmlD，rmlA，rmlC，vioA， orf6，orf7，wzx，orf9，wzy，orf11，orf12，gne的13个基因组成都位于 galF基因和gnd基因之间。
本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O49的O-抗原基因簇中的基因， 即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基 因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，包括orf6、orf9、orf11、 orf12基因；细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括rmlB、rmlD、rmlA、 rmlC、vioA、gne基因；与脱氢或脱水有关的酶的基因，包括orf7。它们在 O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。本发明 尤其涉及到o-抗原转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核 苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌 的O-抗原并不是特异的，而本发明涉及到的o-抗原转运酶基因、聚合酶基因 和糖基转移酶基因对大肠杆菌O49的O-抗原是特异的。
本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O49的O-抗原基因簇中的wzy 基因或与wzy有相似功能的基因和wzx基因或与wzx有相似功能的基因的寡 核苷酸和糖基转移酶基因包括orf6、orf9、orf11、orf12基因的寡核苷酸， 它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中源 于大肠杆菌O49的O-抗原基因簇中的wzy基因或与wzy有相似功能的基因、 wzx基因或与wzx有相似功能的基因的寡核苷酸对。在表1中也列出了这些 寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR 反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物只在 以大肠杆菌O49为模板进行的PCR扩增中得到预期大小的产物，而在以表2 所列的其它菌为模板进行的PCR扩增中都未得到预期大小的产物。更详细地 说，以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应在大多数细菌中均未得到任何 产物，虽然在有些菌中得到了PCR产物带，但其大小不符合预期大小，这是 由于引物结合到基因组的别的位置造成，这种问题可通过用基因内的其它引 物做PCR来避免。所以，可以确定这些引物即表1所列的寡核苷酸对大肠杆 菌O49及它们的O-抗原是高度特异的。
所述的对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸的分离和鉴定方法包括下 述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O49中的O-抗原基因簇；3) O-抗原基因簇文库的构建；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接 及分析，最终获得O-抗原基因簇的结构；6)特异基因的筛选；7)引物灵敏 度的检测。
本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显 而易见的。
如本发明所述，“寡核苷酸”主要是指来源于O-抗原基因簇中的编码转运 酶的基因、编码聚合酶的基因和编码糖基转移酶基因内的一段核苷酸分子， 它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变。尤其是源于wzx 基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的6848至8350碱基)，wzy基因(核苷酸 位置是从SEQ ID NO：1的9551至10723碱基)内的寡核苷酸对大肠杆菌O49 都是高度特异的。
此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突 变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中， 需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发 明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于转运酶基因，包括wzx基 因或与wzx有相似功能的基因；源于聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有 相似功能的基因；源于糖基转移酶基因，包括orf6、orf9、orf11、orf12基 因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这 套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的 混合物是源于转运酶基因、源于聚合酶基因和源于糖基转移酶基因中的寡核 苷酸的组合。
在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗 原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。
本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗 原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是： (i)编码转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚 合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因。(iii)编码糖基转移 酶基因，包括orf6、orf9、orf11、orf12基因。在条件许可的情况下至少一 个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因 特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O49。可用PCR方法检测，更可以将本发明 方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测， 或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
本发明者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷 酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核 苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码转运酶 基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、编码聚合酶的基因包括wzy 基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸和编码糖基转移酶基因包括orf6、 orf9、orf11、orf12基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O- 抗原来说是特异的，这一特殊细菌O-抗原是由大肠杆菌O49表达的。
另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的 方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交， 这些基因是：(i)编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基 因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii) 编码糖基转移酶基因，包括orf6、orf9、orf11、orf12基因。在条件许可的 情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上 的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O49。可用本发明中的寡核苷 酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后 作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或 微阵列检测样品中的抗原及细菌。
一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们 中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡 核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷 酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混 合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一 个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇 内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方 法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码转运酶的基因包括wzx 基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因包括wzy基因或与 wzy有相似功能的基因；源于编码糖基转移酶基因包括orf5、orf6、orf9基 因。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能 是糖合成中必须基因的核苷酸。
另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌 多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至 少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码 转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶 的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基 因，包括orf6、orf9、orf11、orf12基因。在条件许可的情况下至少一个寡 核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的 基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O49。可用本发明中的寡核苷酸作引物 通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过 杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的 一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于wzx基因或与wzx有相似功能 的基因及wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因包括orf6、 orf9、orf11、orf12基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时， 它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现 问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。
本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗 原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。由于O-抗原 合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法 和分子也应用于这些其他的多糖抗原。
本发明首次公开了大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从 这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表 达大肠杆菌O49的O-抗原，并成为有用的疫苗。
具体实施方式：
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。 实施例1：基因组的提取。
在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O49，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然 后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的 蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase， 65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚∶氯 仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提 以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用 70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂 糖凝胶电泳检测。
实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O49中的O-抗原基因簇
以大肠杆菌O49的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首 先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因 设计下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR 反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，61℃退火30秒， 68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到 PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6 管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化 PCR产物。
实施例3：构建O-抗原基因簇文库。
首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建 O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2， 1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA 片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4 管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇 (25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍 体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随 后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)， 1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产 物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓 冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混 合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与 Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为 90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体 积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙 醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。
其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细 胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm 培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm 剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃4000rpm离 心15分钟。倾尽上清液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于 4℃4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体， 于4℃4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃ 6000rpm离心10分钟，弃上清液，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮 细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。
最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌 DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏， 时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复 苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上 37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到 含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用 EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O49 的O-抗原基因簇文库。
实施例4：对文库中的克隆测序。
从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限 公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列 达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再通过反向测序及将有些序列测通得到， 最后获得O-抗原基因簇的所有序列。
实施例5：核苷酸序列的拼接及分析。
用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的 Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从 而得到大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序 列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O49的基因组作6个Long PCR 反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量 的覆盖率。在得到大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国 家生物技术信息学中心(The National Center for Biotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到13个开放的阅读框，用blast 系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它 们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用 Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O49的 O-抗原基因簇的结构，如表3所示。
通过检索和比较，发现orf1，orf2，orf3和orf4都与许多菌的合成鼠 李糖前体的dTDP-鼠李糖的四个合成酶基因有非常高的相同性(identity)， 其中：orf1与大肠杆菌的RmlB在361个氨基酸中有98％的相同性，98％的 相似性；Orf2与鲍氏志贺氏菌的RmlD在299个氨基酸中有96％的相同性， 97％的相似性；orf3与鲍氏志贺氏菌的RmlA在292个氨基酸中有98％的相 同性，99％的相似性，Orf4与鲍氏志贺氏菌的RmlC在180个氨基酸中有81 ％的相同性，86％的相似性，说明它们都有极高的同源性，可以确定orf1、orf2、 orf3、Orf4分别为dTDP-鼠李糖的rmlB基因、rmlD基因、rmlA基因、rmlC 基因，因此分别命名为rmlB、rmlD，rmlA、rmlC。blast比较发现orf5与 Pseudomonas syringaepv的DegT_DnrJ_EryC1家族的vioA基因相似，与vioA 基因编码的转氨酶拥有很高的同源性，在372个氨基酸中有66％的相同性，81％ 的相似性。可以确定orf5也是一个vioA基因，命名为vioA。通过进行blast 比较发现，Orf6与Vcinetobacter lwoffii的乙酰基转移酶在216个氨基酸 中分别有53％的相同性，75％的相似性，说明它们之间有较高的同源性，因此 推测orf6也是一个乙酰基转移酶基因，暂命名为orf6。Orf7与Caulobacter crescentus CB15的MaoC家族的蛋白在152个氨基酸中分别有48％的相同性， 71％相似性；MaoC家族的蛋白是一种脱水酶，因此推测Orf7也是一个脱水酶， 暂命名为Orf7。Orf8与Pseudomonas syringae pv的O-抗原转运酶在504 个氨基酸的序列中有37％的相同性，61％的相似性。并且通过Eisenberg等人的算 法[Eisenberg，D，Schwarz，E.et al(1984).Analysis of membrane and surface protein sequences with the hydrophobic moment plot.J.Mol.Biol.179： 125-142]发现orf8有14个潜在的穿膜区，它与许多wzx蛋白相似，而且在 wzx蛋白的氨基端有一个大约50个氨基酸的保守基序，所以可以确定orf8是 wzx基因，命名为wzx。orf9与Methanosarcina acetivorans str的糖基转移 酶在387个氨基酸中有26％的相同性，48％的相似性，所以推测orf9也是一个 糖基转移酶，暂命名为orf9。Orf10与许多Wzy蛋白相似，例如，和 Streptococcus agalactiae在379个氨基酸中有25％的相同性，46％相似性。 另外通过Eisenberg算法得知orf10有9个潜在的穿膜区，与其他的O-抗原 聚合酶有相似的二级结构，具有典型的O-抗原聚合酶的特征，所以确定orf10 是wzy基因，命名为wzy。Orf11与Clostridium perfringens str的糖基转 移酶在282个氨基酸中分别有39％的相同性，60％的相似性，说明它们之间有 较高的同源性，因此推测orf11是一个糖基转移酶基因，暂命名为orf11。通 过blast比较发现，Orf12与Shigella flexner的rfbG在289个氨基酸中分 别有48％的相同性，66％的相似性，说明它们之间有较高的同源性。rfbG属于 糖基转移酶家族2，是一个鼠李糖的转移酶，因此推测orf12是一个鼠李糖的 转移酶基因，暂命名为orf12。大肠杆菌O49的O-抗原结构未知，但以上结 果表明鼠李糖是大肠杆菌O49的O-抗原中的一种单糖。Orf13和Yersinia enterocolitica type O8的Gne在336个氨基酸中分别有60％的相同性，78％ 相似性；说明它们有很高的同源性，因此可以确定Ofr13是gne基因，命名 为gne。
实施例6：特异基因的筛选
针对大肠杆菌O49的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，这些基因 在核苷酸序列中的位置见表1。
在表1中列出了大肠杆菌O49的O抗原基因簇的转运酶基因和聚合酶基因 及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对 引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引 物在SEQ ID NO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温 度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其 大小也列于表中。
mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且 高度保守的一个基因，所以我们根据mdh基因设计了引物(5′-TTC ATC CTA AAC TCC TTA TT-3′)和(5′-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG-3′)，然后从166种 血清型的大肠杆菌中提取基因组，方法如前所述。用这对引物从166种血清 型的大肠杆菌的基因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。
表2是用于筛选特异基因的166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌及 它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每12-19个菌分为一组，总共13 组。它们的来源都列于表中。
在第3组中含有大肠杆菌O49的基因组DNA作为阳性对照。第13组中是 不含有大肠杆菌O49的基因组DNA，作为阴性对照。以每组菌做模板，用表1 中的每对引物按如下条件做PCR：在94℃预变性2分钟后，94℃变性15秒， 退火温度因引物的不同而不同(参照表1)，退火时间是50秒，72℃延伸2 分钟，这样进行30个循环。最后在72℃继续延伸10分钟，反应体系是25ul。 反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。
对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第 9组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到 任何大小正确的带。所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O49及其O-抗原都是高度 特异的。
最后，通过PCR从大肠杆菌O49中筛选到对大肠杆菌O49的O-抗原高度 特异的基因：wzx、wzy基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸 对大肠杆菌O49的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷 酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O49是高度特异的。所有的这些寡核苷酸 都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O49，并能鉴定它们的O- 抗原。
实施例7：引物灵敏度的检测。
购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备 用。将10μl大肠杆菌O49的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中， 于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作106和107 倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂 平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生 猪肉馅中分别掺入5×103，5×102，5×101，5个和0个活菌，搅拌均匀，加 入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。 从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ 超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离 心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的 6944至6961碱基的核苷酸和7678至7695碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的 7087至7104碱基的核苷酸和7611至7628碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的 9821至9838碱基的核苷酸和10508至10525碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中 的10009至10026碱基的核苷酸和10683至10700碱基的核苷酸，进行PCR 反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg2+：2.5μl，Buffer：2.5μl， dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR 反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，   共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩 增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×103，5×102，5× 101，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参 入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述 方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O49的检测灵敏度均为0.25个菌 /g。
通过对O抗原基因簇的克隆和在减毒的疫苗菌株中的表达，可以组建重组 疫苗。O抗原为最主要的革兰氏阴性菌的表面抗原，可以引起强烈的免疫反应， 是制造重组疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret实验室成功的将志 贺氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙门氏菌Tyziai疫苗菌中表达，动物 实验证明可以引起兔子的免疫反应(Molecular Microbiology 1993，7：239-252)。中国军事医学科学院的小组也在从事与Viret实验室类 似的工作。王磊实验室在1999年成功的将大肠杆菌O111的O抗原基因簇在 沙门氏菌疫苗STM-1中表达，并证明组建成的菌株可以引起小鼠的血液和体 液反应(Microbial Pathogenesis 1999，27：55-59)。所以本发明O49的O 抗原特异基因序列可以应用于组建重组疫苗。
根据本发明的对大肠杆菌O49型的O-抗原特异的核苷酸序列(SEQ ID NO：1 所示)，构造特异核酸探针，将其固定到芯片的载体上制成生物芯片，将要检 测的样品适当处理后，与生物芯片进行杂交反应，然后利用生物芯片信号分 析设备就可以得到样品中相应的细菌情况。这种大肠杆菌O抗原鉴定的DNA 芯片将可以直接用于临床和其它检验场所(如食品加工和生产行业，畜牧兽 医行业海关检疫等的微生物检验)。这种芯片只需要扩大产量，在完全相同的 条件下就可以产业化。
表3是大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌 O49的O-抗原基因簇的结构，共由13个基因组成，每个基因用方框表示，并 在方框内写入基因的名称。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因， 它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗 原基因簇的全长序列。
表4是大肠杆菌O49的O-抗原基因簇中的基因的位置表，在表中列出了 大肠杆菌O49的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置， 在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在细菌中开放阅 读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。
              SEQ ID NO：1序列(SEQUENCE LISTING)
<110>天津生物芯片技术有限责任公司
<120>对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>14256
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>1
attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaacgcggtc      60
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atttctatct atgtttatat tctctgcggt caaaaaattt taatggtttc attacaaatt   13620
aattcccctg acaggagtaa acaatgtcaa agcaacagat cggcgtcgtc ggtatggcag   13680
tgatggggcg caaccttgcg ctcaacatcg aaagccgtgg ttataccgtc tctattttca   13740
accgttcccg tgaaaagacg gaagaagtga ttgccgaaaa tccgggcaag aagctggttc   13800
cttactatac ggtgaaagag tttgttgaat ctctggaaac gcctcgtcgc atcctgttaa   13860
tggtgaaagc aggtgctggc acggatgctg ctattgattc cctcaagcca tacctcgata   13920
aaggtgacat catcattgat ggtggtaata ccttcttcca ggacaccatt cgccgtaacc   13980
gtgagctttc tgccgaaggc tttaacttca tcggtaccgg tgtttccggc ggtgaagagg   14040
gcgcgctgaa aggtccttcc attatgcctg gtggccagaa agaagcctat gaactggttg   14100
ctccgatcct gaccaaaatc gccgccgttg ctgaagatgg ggagccatgt gttacctata   14160
ttggtgccga tggcgcgggt cactatgtaa aaatggttca caacggtatt gaatacggtg   14220
atatgcagct gattgctgaa gcctattctc tccttg                             14256
表1大肠杆菌O49的O抗原基因簇中wzx基因和wzy基因及其中的引物及PCR数据
                                                                          产生正
                                                                                   PCR的
                  基因的       正向引物位置    反向引物位置    PCR产物    确大小
基因    功能
                                                                                   退火温
                  碱基位置                                     长度       电泳带
                                                                                   度(℃)
                                                                          的组数
wzx     O-抗原    6848-8350    6944-6961       7678-7695       752bp      0        62
        转运酶
                               7087-7104       7611-7628       542bp      0        62
wzy     O-抗原    9551-10723   9821-9838       10508-10525     705bp      0        62
        聚合酶
                               10009-10026     10683-10700     692bp      0        63
表2 166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源
组号                 该组中含有的菌株                                               来源
1、野生型大肠杆菌    O1，O2，O5，O7，O8，O9，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O18，    IMVSa
                     O19ab，O20，O21，O22，O23，O24
2、野生型大肠杆菌    O4，O10，O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O34，O35，    IMVSa
                     O36，O37，O38，O40，O41，O42，O43
3、野生型大肠杆菌    O6，O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56，    IMVSa
                     O57，O58，O60，O61，O62，O53
4、野生型大肠杆菌    O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78，        IMVSa
                     O79，O80，O81，O82，O83，O68
5、野生型大肠杆菌    O84，O85，O86，O87，O88，O89，O90，O91，O92，O98，O99，        IMVSa
                     O101，O102，O103，O104，O105，O106，O97，
6、野生型大肠杆菌    O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113，           IMVSa
                     O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128，O117
7、野生型大肠杆菌    O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O136，O137，         IMVSa
                     O138，O139，O141，O142，O143，O144，O145，O140
8、野生型大肠杆菌    O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158，         IMVSa
                     O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166，O153                 b
9、野生型大肠杆菌    O168，O169，O170，O171，O172，O173，                           c
痢疾志贺氏菌         D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12，D13         d
10、鲍氏志贺氏菌     B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15， d
                     B16，B17，B18
11、福氏志贺氏菌     F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v：4)，F5(v：7)，F6，     d
                     DS，DR
12、野生型大肠杆菌   O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，O155，IMVSa
                     O124，O167，O162，O121，O127，O149，O119
13、野生型大肠杆菌   去除大肠杆菌O49的第三组的菌
为了检测的方便，每12-19个菌分为一组，总共12组，第13组作为阴性对照
a.Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australia
b.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark
c.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自 于IMVS
d.中国预防医学科学院流行病学研究所
表3是大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的结构表

galF  rmlB  rmlD  rmlA  rmlC vioA   orf6  orf7   wzx   orf9    wzy    orf11  orf12  gne   gnd
    1kb＿＿＿
表4是大肠杆菌O49的O-抗原基因簇中的基因的位置表
ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ACGCGTCCAA GAACGCGGTC      60
GAAAACCACT TCGACACCTC TTATGAGTTA GAATCACTCC TTGAGCAGCG CGTGAAGCGT     120
CAACTGCTGG CGGAAGTACA GTCCATCTGT CCGCCGGGCG TGACCATTAT GAACGTGCGT     180
CAGGGCGAAC CTTTAGGTTT AGGCCACTCC ATTTTGTGTG CGCGACCTGC CATTGGTGAC     240
AACCCATTTG TCGTGGTACT GCCAGACGTT GTGATCGACG ATGCCAGCGC CGACCCGCTA     300
CGTTACAACC TTGCTGCCAT GATTGCACGT TTCAACGAAA CGGGCCGCAG CCAGGTGCTG     360
GCAAAACGTA TGCCGGGTGA CCTCTCTGAA TACTCCGTCA TCCAGACTAA AGAGCCGCTG     420
GACCGTGAGG GTAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTTATCG AAAAACCGGA TCAGCCGCAG     480
ACGCTGGACT CAGACATCAT GGCCGTAGGT CGCTATGTGC TTTCTGCCGA TATTTGGCCG     540
GAACTGGAAC GTACTCAGCC TGGTGCATGG GGACGTATTC AGCTGACTGA TGCTATTGCC     600
GAGCTGGCGA AAAAACAATC CGTTGATGCA ATGCTGATGA CCGGCGACAG TTACGACTGC     660
GGCAAAAAAA TGGGCTATAT GCAGGCGTTT GTGAAGTATG GCCTACGCAA CCTGAAAGAA     720
GGGGCGAAGT TCCGTAAAGG TATTGAGAAG CTGTTAAGCG AATAATGAAA ATCTGACCGG     780
ATGTAACGGT TGATAAGAAA ATTATAACGG CAGTGAAAAT TCGCAGCAAA AGTAATTTGT     840
TGCGAATCTT CCTGCCGTTG TTTTATATAA ACCATCAGAA TAACAACGAG TTAGCAGTAG     900
GGTTTTATTC AAAGTTTTCC AGGATTTTCC TTGTTTCCAG AGCGGATTGG TAAGACAATT     960
AGCGTTTGAA TTTTTCGGGT TTAGCGCGAG TGGGTAACGC TCGTCACATC ATAGGCATGC    1020
ATGCAGTGCT CTGGTAGCTG TAAAGCCAGG GGCGGTAGCG TGCATTAATA CCTCTATTAA    1080
                                                         Orf1的起始
TCAAACTGAG AGCCGCTTAT TTCACAGCAT GCTCTGAAGT AATATGGAAT AAATTAA GTG  1140
AAAATACTTG TTACTGGTGG CGCAGGATTT ATTGGTTCAG CTGTAGTTCG TCACATTATA    1200
AATAATACGC AGGATAGTGT TGTTAATGTC GATAAATTAA CGTACGCCGG AAACCGGGAA    1260
TCACTTGCTG ATGTTTCTGA TTCTGAACGC TATGTTTTTG AACATGCGGA TATTTGCGAT    1320
GCACCTGCAA TGGCACGGAT TTTTGCTCAG CATCAGCCGG ATGCAGTGAT GCACCTGGCT    1380
GCTGAAAGCC ATGTTGACCG TTCAATTACA GGCCCTGCGG CATTTATTGA AACCAATATT    1440
GTTGGTACTT ATGTCCTTTT GGAAGCCGCT CGCAATTACT GGTCTGCTCT TGATAGCGAC    1500
AAGAAAAATA GCTTCCGTTT TCATCATATT TCTACTGACG AAGTCTATGG TGATTTGCCT    1560
CATCCAGATG AAGTAAATAA TAACGAAGAA TTACTCTTAT TTACTGAGAC GACATCTTAT    1620
GCGCCAAGCA GCCCTTATTC CGCATCAAAA GCATCCAGCG ATCATTTAGT CCGTGCGTGG    1680
AAACGTACCT ATGGTTTACC GACCATTGTG ACTAACTGTT CGAATAACTA CGGTCCTTAT    1740
CACTTTCCGG AAAAATTGAT TCCACTAGTA ATTCTTAATG CTCTGGAAGG TAAGGCATTG    1800
CCTATTTATG GTAAAGGGGA TCAAATTCGC GACTGGCTGT ATGTTGAAGA TCATGCACGT    1860
GCGTTATATA CCGTCGTAAC CGAAGGTAAA GCGGGTGAAA CTTATAACAT TGGTGGACAC    1920
AACGAAAAGA AAAACATCGA TGTAGTGCTC ACTATTTGTG ATTTGTTGGA TGAGATTGTA    1980
CCGAAAGAGA AATCTTACCG CGAGCAAATT ACTTATGTTG CCGATCGTCC GGGACACGAT    2040
CGCCGTTATG CCATTGATGC TGAGAAGATT GGTCGCGAAT TGGGATGGAA ACCACAGGAA    2100
ACGTTTGAGA GCGGGATTCG TAAAACGGTG GAATGGTACC TGTCCAATAC AAAATGGGTT    2160
GATAATGTGA AAAGTGGTGC CTATCAATTG TGGATTGAAC AGAACTATGA GGGCCGCCAG    2220
Orf1的终止Orf2的起始
TAATGAATAT CCTCCTTTTT GGCAAAAGAG GGCAGGTAGG TTGGGAACTA CAGCGTGCTC   2280
TGGCACCTTT GGGTAATTTG ATTGCTCTTG ATGTTCACTC CACTGATTAT TGTGGTGATT    2340
TTAGTAATCC TGAAGGTGTG GCTGAAACCG TCAAAAAAAT TCGCCCTGAT GTTATTGTTA    2400
ATGCTGCGGC TCATACTGCA GTAGATAAGG CTGAGTCAGA ACCCGAATTT GCACAATTAC    2460
TCAATGCGAC CAGCGTTGAA TCAATTGCAA AAGCGGCTAA TGAAGTTGGG GCCTGGGTAA    2520
TTCATTACTC AACTGACTAC GTATTTCCGG GAACCGGTGA AATACCATGG CTGGAGACGG    2580
ATGCAACCGC ACCGCTAAAT GTTTACGGTG AAACCAAGTT AGCCGGAGAA AAAGCGTTAC    2640
AGGAACATTG CGCGAAGCAT CTTATTTTCC GTACCAGCTG GGTATACGCA GGTAAAGGAA    2700
ATAACTTCGC CAAAACGATG TTGCGTCTGG CAAAAGAGCG TGAAGAATTA GCGGTTATTA    2760
ACGATCAGTT TGGTGCACCA ACGGGTGCTG AGCTGCTGGC TGATTGTACG GCACATGCTA    2820
TTCGTGTTGC ACTGAAAAAA CCAGAAGTCG CAGGCTTGTA CCATTTGGTA GCCAGTGGTA    2880
CCACAACCTG GTACGATTAT GCTGCGCTGG TTTTTGAAGA GGCGCGCAAA GCAGGCATTC    2940
CCCTTGCACT CAACAAGCTC AACGCAGTAC CAACAACTGC CTATCCTACA CCAGCTCGTC    3000
GTCCACATAA CTCTCGCCTT AATACAGAAA AATTTCAGCA GAACTTTGCG CTTGTCTTGC    3060
                                                         Orf2的终止
CTGACTGGCA GGTTGGCGTG AAACGAATGT TCAACGAATT ATTTACGACT ACAGCAATT T  3120
                                                         Orf3的起始
AATAGTTTTT GCATCTTGTT CGTGATGGTG GAGCAAGATG AATTAAAAGG AATGATGAA A 3180
TGAAAACGCG TAAAGGTATT ATTTTAGCGG GTGGTTCTGG TACACGTCTT TATCCTGTGA   3240
CTATGGCTGT CAGTAAACAG CTGTTACCGA TTTACGATAA ACCGATGATC TATTACCCGC    3300
TCTCTACACT GATGTTGGCG GGTATTCGCG ATATTCTGAT TATCAGTACG CCACAGGATA    3360
CTCCTCGTTT TCAACAACTG CTGGGTGACG GGAGCCAGTG GGGGCTAAAT CTTCAGTACA    3420
AAGTGCAACC GAGTCCGGAT GGTCTTGCGC AGGCATTTAT CATCGGTGAA GAGTTTATCG    3480
GTGGTGATGA TTGTGCTTTG GTTCTTGGTG ATAATATCTT CTACGGTCAT GATCTGCCGA    3540
AGTTAATGGA TGTCGCTGTT AACAAAGAAA GTGGTGCAAC GGTATTTGCC TATCACGTTA     3600
ATGATCCTGA ACGCTACGGT GTTGTTGAGT TTGATAAAAA CGGTACGGCA ATCAGCCTGG     3660
AAGAAAAACC GCTACAACCA AAAAGTAATT ATGCGGTAAC CGGGCTTTAT TTCTATGATA     3720
ACGACGTTGT CGAAATGGCG AAAAACCTTA AGCCTTCTGC CCGTGGTGAA CTGGAAATTA     3780
CCGACATTAA CCGTATTTAT ATGGAACAGG GGCGTTTATC CGTTGCCATG ATGGGGCGTG     3840
GTTATGCATG GCTGGATACG GGGACACATC AGAGTCTTAT TGAAGCAAGC AACTTCATTG     3900
CCACCATTGA AGAGCGCCAG GGACTAAAGG TTTCCTGCCC GGAAGAAATT GCTTACCGTA     3960
AAGGGTTTAT TGATGCAGAG CAGGTGAAAG CATTAGCTGA GCCGCTGAAA AAAAATGCTT     4020
                                   Orf3的终止Orf4的起始
ATGGTCAGTA TCTGCTGAAA ATGATTAAAG GTTAT TAATA AA ATGAACGT AATTAAAACA 4080
GAGATTCCAG ACGTATTAAT TTTCGAACCG AAAGTTTTTG GTGATGAGCG TGGTTTCTTT     4140
TTTGAGAGCT TTAACCAGAA GGTTTTTGAG GAAGCTGTAG GTCGCAAAGT TGAATTTGTT     4200
CAGGATAACC ATTCGAAGTC TAGTAAAGGT GTTTTACGCG GGCTGCATTA TCAGTTGGAA     4260
CCTTATGCAC AAGGGAAATT GGTGCGCTGC GTTGTTGGTG AGGTTTTTGA TGTTGCGGTT     4320
GATATTCGTA AATCGTCACC TACTTTTGGT AAGTGCTTAG AAGTTATATT ATCTGCAAAT     4380
AATAAAAAAC AATTATGGAT CCCTGAAGGA TTTGCGCATG GATTTCTAAC CTTACAAGAT     4440
GATACAGAAA TAATATATAA AACCACAAAT TACTATTCAC CAGAATATGA AAGAGCCATT     4500
ATTTGGAATG ATGAAGAGCT TTCAATTAAG TGGCCTAGTA AACCGGATAT CATATCTCAA     4560
                                        Orf4的终止   Orf5的起始
AAAGATAGTT TAGCCTCAGC ATTTTCATCT ATTAAATAT T GAAGAGAAAT AA ATGAATAA 4620
GAAAATACCA GTTACACAAC CATTTCTTCC TGAACTAAAT GAGTTTGTCC CTTACTTGCA     4680
ACAGATATGG GATAATAAAT GGTTAACAAA TAATGGCCCC TTCCACATGG AACTGGAGGA     4740
AGAACTATGT AAATATTTAG GGGTAAAACA TATATCATTA TTTACAAACG CAACAATAGC     4800
ATTGGTTACA GCTCTTCAAG CTTTACGAAT CTCAGGAGAA GTGATCACTA CACCTTATTC     4860
TTTTGTTGCG ACTAGTCATT CTATATTATG GAATAATCTC AAACCAGTTT TCGTTGATAT     4920
AGATAGTGAA ACTTTTAATA TTGATCCTGA CAAAATAGAG TCAGCCATAA CTTCTAATAC     4980
TACAGCAATA ATGCCAGTTC ATTGCTACGG TAATCCATGT GATGTTGAGA AAATTCAAAA     5040
AATAGCTGAT GATTATGGGT TAAAGGTGAT TTATGATGCG GCCCATGCCT TCGGTATTAA     5100
ATACAAAAAT AACAGCTTGT TGAATTATGG TGATTTGTCA ATTTTAAGTT TCCATGCAAC     5160
AAAGGTGTTT AATACTTTTG AAGGAGGAGC AATAATTTGT AAAGATGAAA AAACTAAGCT     5220
TAGGATTGAT AAATTAAAGA ATTTTGGATT TGTGGATGAG GTAACTGTTA CTGCCCCCGG     5280
CATAAATGGG AAAATGAGCG AGGTTAACGC AGCGTTTGGA TTATTGCAGT TAAAATATGT     5340
CAATGATGCG ATTCTTAAAC GAAAAGCAAT ACACGATTAT TACTGCCAAT CTTTAAATGA     5400
AGTGACGGGC TTGTCGATAC CTGAGTTTTC GCCAAACGCT ACAAGGAACT ATTCGTATTT     5460
TCCAGTTCTT ATTAATGAGG ATTTTTCAGT ATCTAGGGAT AAACTTCATG AGATATTGAA     5520
GTATAATAAT ATACTCTCTC GGCGATATTT TTACCCTTTA ATTAGCAATA TGCCGATGTA     5580
TAGAGGATTA CCTTCTGCTC TTTGTCATAA TCTTAGAAAT GCAAATTCTC TCTCTTCGAA     5640
AGTTCTTTGT TTACCTATTT ATAGCGAATT AACAATAGAA GAGTGTGATA AGATTATTAA     5700
                       Orf5的终止Orf6的起始
TCTCATAAAG AAAGTTAACG AAAGG TAATT AT ATGAAAAG CATTATTGGT ATTTATGGTG 5760
CTGGTGGTTT CGGTAGAGAG GTGCTACCTA TTATAAGACA ACAGGTTGGA TTAAAATCAG     5820
ATGTGGTTTT TATCGTTGAT GATATCAAAG AAAAGGTAGT CAATGAAACA AAGGTTGTAA     5880
CATTTGATGA GTTTTGTTCG CTAAAAGATA TGGATAAATA TTATACTGTT GCAATAGCAG     5940
ACAGTAAAGT GAGAATGGAG ATAGATATAA AATGCATCCG AGAGGGAATT AAGCCCATTT     6000
CTATTTATTC TCAAAACAGT GTGATAATGG ATGATGTACT GATTGGTGAT GGTGCGATTT     6060
TATCTCCTTT TACTTGTATA ACATCAAATG TAAGAATCGG GAAATCTTTT CATGCCAATT     6120
TATATAGTTA TATAGCGCAT GATTGTGTTA TTGGAGACTA TGTCACTTTA GCACCAGGTG    6180
TAAAATGTAA CGGTAATGTT ATTATAGAGG ATCATGCTTA TGTCGGAACT GGGGCAATAA    6240
TTCGACCTGG GACCAAAACA AAACCACTCG TAATTGGAAG CCATTCTATT ATTGGAATGG    6300
GGGCGGTTGT CACTAAAACA GTACCTTCAG GAAAAACAGT ATTTGGGAAT CCGGCAAAAA    6360
                    Orf6的终止Orf7的起始
TATTAGGCAA TAAGAGAGAA TCA TAAT ATGGATCCTATGC AAAATTTATA CATCGGGATG 6420
ACGGCACAGT ATTCCCAGAC TGTAAGTGAT AGTGATATAA AAGCGTTCTC TGGGCTAAGT    6480
GGTGATAAAA ACCCTGTTCA TATGAGCGAT GAATATGCGC AGAAAACCAT GTTTAAGAAA    6540
CGAATTGCTC ATGGTTTTAT GTCAGCAAGT TATTTTTCTG CAATCTTTGG CACAAAATTA    6600
CCAGGGGAGG GATGTGTATA TCTTTCTCAG ACACTAAAAT TTATAAAGCC AGTTTATATT    6660
GGTGATACAG TTACCGCTAT TGTAACCTTG ACGAAAATAA ATTCACGCTC TCGGCGATTG    6720
ACATTTGATA CAATCTGTGT TGTCAAGAAT GAAACTGTGA TATCCGGTGT TGCAGAGATA    6780
                    Orf7的终止
TATTTACCTA AAATAAGTGA G TAGATGATA ATTAGATTTT AAAAAGTAAA ACATTAAGCG  6840
     Orf8的起始
AAAATAC ATG TTAAGAAGAA ATGTTGTTTT TAATTATTTA GGGCAATTTT ACATATCCCT  6900
TATGGGGATA TGTATTTTTC CTCTATATTT AAGATATATT GGAGAGGAAG CGTATGGTTT    6960
AATTGGTTTT TTTGTTTGCC TTCAAACATG GATGCTTTTA TTTGATTTAG GCATGTCACC    7020
AACACTTTCT AGGCAAGTGG CCATAACTAA TGCTAATAAT GATTTTGATT TTTTAAGAAA    7080
ATTGATGAGA AGTCTCGAAT CGGTATTTTT CTTTATAGCA TTAATTATTA TGCTGTTAAT    7140
GGCCATTTTT TGTAATGATA TAGCCCAAAA ATGGTTGGCC GTTAAGAACT TAAATATTGA    7200
TGAAGTGGCA GTATGCATTG CAATAATGGG AGGGGTTGTT TCTTTACGAT GGTTTACTAG    7260
TCTCTATAAA AGCGGAATAA ATGGTTATGA AAAGCAAGCA TGGCTCAATG TAGTTAATAT    7320
TTTTATTGTA ACATTAAGAT TGCCTGCATC TTTGCTTCTA TTTATTTACT TTTCAAAATC    7380
CCTAATAATA TATTTTGTAT ATCAGCTGAT TATATCTATT GTTGAATTGT TTATTTATAA    7440
CAGGAAAATG TATAGATGTC TGCCAAAACG ATTAAATGAT AATCATAAGA TATATTTAAT    7500
ATCATGGGAT GTTTTAAAAA GTGTTTTACC TTTTGCTGCA GGAACTGCGT ATACTGCAGG    7560
AATATGGGTG TTATTAACGC AATTGGATAA GCTTTTACTT TCGAAAGTGT TAACGCTCAG    7620
CAACTTTGGT TTTTTTTCAT TGGTTGCAAC GTTGGTTGGA GGTATATTAA TGCTTTCTTC    7680
TCCCATCAGT AATGCCATTT TACCGCGAAT AACGGTTCTT GTGTCGCAAG GTAAAATTGA    7740
GCAAGTAGTT GGTTTGTATA CACGTTGTAC AAGATTTGTT TGTTGCGTAA TATTTCCTAT    7800
TACGATGGTT ATGATATGTT ATCCTTATCA GGTTATTTAT GGATGGACAG GAAATGACGT    7860
TACCGCAAAA TGGGCGATGA ACGTATTGCC CCTGTATTCT TTGGGTAATG CTCTTTTAGC    7920
AGTTATTGGA TTTCAGTATT ACTTACAATA TGCGTATGGT AAATTAAAAT TACACATTAT    7980
ATATAACACT GTATTGGCGA TTGTGTCGAT ACCAGCAGTA AGTTTTTTTG CTATTAGATA    8040
TGCAGCAATA GGCACGGGAA TTGTTTGGAT CGCAATTAAT AGTATTACAT TATTGTTTTG    8100
GACGTATATT GTGCATAATA AATTTCTTAA AGGAGTTCAT TTCAGATGGT TATTTCAAGA    8160
CGTTTTATTC CCCGCATTGA TTTCAGCAAT GATCATATTT ATTATTTCAA ATAATATAGA    8220
CACAACATCA CAGAGTAGAA TTGAAAATAT ACTTTTTGTA TCTTTAGTTA GTTTTACAAC    8280
AATAATTATA TCTCTTTTTG TTTCTTTTTT TACCGATATT ATGAGCTTTT TTAAAGGAAT    8340
Orf9的起始Orf8的终止
GGTTAA ATGA AAAATGTTTT ATTTATTAAT AGTGGTTTTG AACTTGGCGG AATTGAAACA  8400
TTCCTTGTTA GAGCAGCTAA AAATTTATCT AAAGATGTAA AGTATACACT CTTAATAATG    8460
AGTGATGCTA CGAACAAAGA TCTCCTTGAC AAGTTCTCTA TATATGGCGA TGTTATTTTT    8520
TTGAGTGATT TGCTATTATT TAATGCAGGT AAATATGCAA TACTAAGAAC CCTTTTACCT    8580
CTTAATCGAC AAAAAGTTAG AACTTTGCTC TCTCACATTG ATATAATTCA TGCCTCGTGC    8640
TCTTTCTCAT TAATTCTAAT GCGAAAACTA AGTTGTATTC TTAATAAAGG AATACTAGAG     8700
TCAGTTGGTG TCTATCATTC CAGAGAGTTT TTATGGGGGG AAAAAAAAAG ATTAATGAGG     8760
AAAACTCAAC TTTCAATGTT TAAAAAAATT CCTGCAAATA ACGTACTTTT CATGAATGAA     8820
TATACAGTTA AATTATATTC AGATATATTT AAGGTGAATT ATTATAATGC TTTACCAATT     8880
GGTATCGATA TTGGTATTTA TTCTGAATGT ATACCGAATA AAAATAGCGG AAGAATTGTA     8940
TCCATCGGAA GATTGGTCGA TTTTAAAACA TATAATTATC ATATGATAGA TTATTTATCT     9000
ACATTATCTA GTGAAAGAAG AAATATGTTA TGTTTTGAAA TATATGGAGA TGGCCCGGAA     9060
TCAGTTGCAC TGAAAAAATT AGCAAAACAA AGGAATGTGA AAGTAAAGTT TGGAGGGCGA     9120
TTAGAGTATA AAGATATGCC ATCCATTTTA GATGGTGCAA GTTTATTTAT AGGTTCAGGT     9180
ACTGCCATCG TTGAAGCGGC GGCAGCTGGT GTACCTTGTA TCATAGGGAT TGAATCAATT     9240
GATGAGCCTC TGACATATGG TTTTCTTACA GAAACAGTGG GGCTTTCGTT CCAAGAAATG     9300
GGACTGAATT ATCCCCTTAA AAAATATGAA ATGGCGATGA GTGAATTTTA TGAACTTTCA     9360
GAAGAAGATT ACTTAATATT ATCAGATAAG CATAGAAGAA GAGCCAAAGA TTTTTCATTA     9420
GATAATATGA AGTCAATTAT ACTTGATTAT TATGAAAATT TATCTGATAA CACAACTAGA     9480
AATAAACCAT GTATAATGTA TGCATTAAGC ACAATGTTTT GGATGATATT AAATAAAATG     9540
       Orf10的起始                      Orf9的终止
AAAATTAATA  ATGAGAGAAA TTCAATGTAT GATTTC TGAA AAGAAAAACA TGAGAATGTC 9600
TAGTTTTAAA GCTCCTTTAA TATTTTGTCT TCTTGCAGCA TTTTTACCTC TAGGTAGTAC     9660
AATTGGAGTT GCCTTTTCTT GGGTGATATT TCCAGCTATT GCCATAATAT TAACTTTTTT     9720
AGTTTCACGT TTTTTTTATA GATCTGGTGT TTATTTTTTA GTTCTGTCGA TAGTACTTCT     9780
AGTTTTAAAT TATGGCATAG TTTTACAATA TGTTTCATTT GCAGAGCGTT TAGAGTTTAA     9840
TATGCTGCTT GCAATTATTG GTTGTTTTTA TATGTCAGTG GTTTTTTTTT CATATAAATT     9900
CAATTTTTCT GACTTGTCAA AAGCAATTAA TATAGTATTA CTAATTAGTA TTATTTTATT     9960
TTTTATTCAA TTTTTATCAT ATTATTTGTT TAATTATAGG ATCGATTATA GTTTAGCTAC    10020
AGGTGGTATT GGTACTCGTA ACGATTATGG CTCATTGTAT AGAGCATCTG GTATCTTTAA    10080
TGAACCAGCT GAGTATTCAT CAGCAATAAC TGTTCTTGTT GTTTCAAGTT ATTTAATAAA    10140
CAGAAAATTA TCACTATTAA ATATCATAGC CCTTATAAGC ACAATGTTAT CTTTTTCATT    10200
TGTGGGAATT ATTCAGTCTT TCTTTGTCAT ATATATTGTT TTATTCCGAA ATCTTTGTAG    10260
GAAACCGGTA TATATTTTTT TAATTATCGG TATTGTTATT TTGGTTTGGA TTTCTTTTTT    10320
TGATTTATTT ATTGACAGAT ATGAGGCATT TATTAATGGA AGTGATGGTA GCAATAATAC    10380
AAAACTAGAT ACGTTAAATT TCTTTTTAAC GCATACAGAA TACCTTTTGG GGGGGGCTGG    10440
CTTAATTGGA TACGATCCAG AAACGATGCC ATTATTTATG CAAGGATTAT ATGATCTAAC    10500
ATTCTTTGGC TCGTGTATCA GTATTTTTGG TATTGTTATT GGTTCATTTA TTGCCATAGC    10560
GGTGACTGTT TATATTATAT ATAATTATAC TATTTCTGAT ATGACACTAA TTTTTATATG    10620
TTTGTTAAAA ATTAATGTAA TGATATATGC AGTATACTGG TTTTTTATAA TATTAATTAT    10680
                                        Orf10的终止        Orf11的起始
AATTCTGCCT AACTACATAC AAAAAACGAA GGTACATGTG  TGAAAATTCA TTTATTA ATG10740
CCTACGATAG GGCGGGCTGA AGAAATTGAA AAATTCATAT CATCAGTAAA TAAGAATAAT    10800
GCATCAGTGC AATTGCTTAT CGCTGATCAA AATGAAGTAG GATTTCTTGA ACCTAAAAAA    10860
TTATATGAAT GCGCTAAGAA TCAGAATATT GACATGCATT ATTTTCATAG TGAACAAAAA    10920
GGATTGTCTC GTAACAGAAA CTTTTTACTT TCAAAATTAG ATGCCCATGA AGGTATTATA    10980
GCATTCCCTG ATGATGACTG CCTATATTAT GAAGATACTT TAGATTTGGT AATGTCATTT    11040
TTTGAAAATA ATCCGAGTGT TGATGTTTTA TTGGGATGTA TATACGATAG GGAATATGAC    11100
AGATATTTAT TTAAAAAGTG GCCGAGAAAA AGTGTTGTGG TTAATTATTT AAATGTATAT    11160
TTTATGTCTT CCTCTATAAC AATTTTTGTT CGGAAACCGA ATCAGCAAAA ATTCGATCAA    11220
GCACTTGGAG CAGGGGCTGT ATACGGGTCA TGTGAAGATC CAGATTATCT TTATAGTTTA    11280
CTAAAAAAAG GATGCAAAAT AGTATATGAA CCCTCCATCC AAGTTTGGCA TCCTGCTCCT    11340
GATTATCATC AAATATCCTT GAGTAAGGTA TATTCCTATG CTAAAGGATT CGGATATTTT    11400
ATACGTAAAG ATATTGACGT TTATAAATCT ATATTGTTAG TATTGTTAAT TTCTAAAAAA    11460
CTGTTTCAAT TGATATTTAG ATTTAAACAT TTTCCGATAA AATATTTCAG AGCGTATTTT    11520
                              Orf12的起始Orf11的终止
TCAGGTTTAA TTAGTGGACT ATTGAGAAAG CAAAC ATGAG TCTTGTCAAG AGAGTTGCTG  11580
TTTTATTAGC AGCATATAAT GGAGTTAAGT GGATTGAAGA ACAAATTCAA TCAATACTTA    11640
ATCAGAAAAG TATTGATGTG ACAATATTTA TAAGCGTTGA TAAATCTACT GACGGTACAG    11700
AGGCTTTGGT TAAAAAAATT AGCCACAAAT ATAGTAATGT AAAATATTTA CCCTTCGGTT    11760
TTAAATTCGG AGGTGCAGCT AAAAATTTTT ATAGGCTCAT AAAAGAGGTT GATTTTGAGC    11820
TATTTGACTT TGTATCTCTG TCAGATCAAG ATGATATTTG GTACCCTAAT AAATTGATTA    11880
CAGCTGTTAA TAAGATCAAC ACCGGTTACG ATTTTTACTC AAGTAACGTT GTGGCTTTTT    11940
GGAAAAATGG TAAAAGAATA ATTATTAACA AAGCGCAAAA ACAACTACCG TATGATTATT    12000
TTTTTGAAGC CGCTGGTCCT GGATGTACAT ATGTTTTTAA ATCTTTTCAA GCTATCAAGC    12060
TGAAAGAATT TATTATTTCT AATTATAAAT CTGTATCAGA AATTGCACTT CATGATTGGT    12120
TAATTTATGC CTTTGCACGA AATTACAACT ATAAATGGTA TATTGATGAA TGGCCATCCA    12180
TGGATTATCG ACAACATGAA AATAACCAGG TTGGTGCTAA TGTAACCATA TATGGTGTAA    12240
TAAAACGCGT AAGACTAGTA AGACAAAAGT GGTACCGAAA TGAAATTATA AAAATAGCAA    12300
AATTATTACA GGTATCAAAT AATCATTTTA TCTCAAAATG TTTACAAGAA AGATACTTGA    12360
GTAACTTTTA CATGATCATG AATATGCATA AAATCCGACG TAGAAGAAGA GATAGGGTTA    12420
                                 Orf12的终止
TGTTATTCCT GCTGTGTGTG ATTAATTGGT TT TAATTTCA TACATAATTC GATTGTATTC  12480
AGCTATATTT ATGGTGTTTT CCATTGGATT CCATTTAATA ATAAATAGGA GGTAACGTTG    12540
                                               Orf13的起始
ACAATTCTGA TTACTGGCGG AGCAGGATAC ATTGGTTCTC ATACA GTGTT GGCTCTTTTG  12600
TGCAATGAAT ATGATGTCAT TGTTCTGGAT AACGAATGCA ATTCTTCTAT TGAATCGTTA    12660
TCTCGTGTTA AGTCAATCAC CGGAAAGGAA TTTTTATATG TTAATGGTGA TGTAAGAGAT    12720
CGTGGAAAGT TACGTACTAT TTTTAAACAA CATGAAATTA CTGATATTAT ACATTTTGCA    12780
GGGTTGAAAT CTGTCGGTGA ATCTATTAAA GCACCTTTAC AATACTACAA TAATAATGTT    12840
ATGGGTGCAA TTGTTCTTTT AGAGGAAATG ATTAGTTTTA ATATTCCTCA TATTATATTT    12900
AGTTCTTCGG CAACAGTTTA TGGCGAACCT ACTGAAATAC CTGTAACTGA AAGATCGAAA    12960
ATAGGAGGAA CAACTAATCC ATATGGTACT TCAAAACTTA TGGTTGAGCA GATCTTAGAG    13020
GACGTTACTC GTACTAATCC TGAATTTAGA GCAACTATAC TACGTTATTT CAACCCTGTT    13080
GGTGCTCATC CTTCAGGTCA CATAGGTGAA GATCCTAACG GTACTCCTAA CAATCTAGTT    13140
CCTTATGTTT GCCAAGTTGC TATCGGAAAA TATAAACAGG TTTCAATATA TGGCAATGAT    13200
TATCCAACTA AAGATGGTAC AGGTGTTCGT GATTTCATTC ATGTCATGGA TCTTGCTGAC    13260
GGTCATGTTG CAGCAGTACA ACACCGGAAT GAAGGGAAGA ATCATAAAAT ATATAACCTT    13320
GGAACAGGTG TAGGACACTC AGTTTTAGAT ATTTTGAAAA CCTTTAAACG TGTTGCGTCA    13380
ATTAATATTC CATATTCTTT TAATAATAGA CGTCCGGGGG ATATTGCTGA GTGTTGGTCC    13440
GATCCTACCA AGGCATTAAA TGAATTAGGG TGGAAAGCAA AATATGATTT AGATGAAATG    13500
                                                         Orf13的终止
GTTCGAGATG CTTGGAATTG GCAGAGAAAA AATCCTAATG GTTATAGTAA ACCT TAATTA  13560
ATTTCTATCT ATGTTTATAT TCTCTGCGGT CAAAAAATTT TAATGGTTTC ATTACAAATT    13620
AATTCCCCTG ACAGGAGTAA ACAATGTCAA AGCAACAGAT CGGCGTCGTC GGTATGGCAG    13680
TGATGGGGCG CAACCTTGCG CTCAACATCG AAAGCCGTGG TTATACCGTC TCTATTTTCA    13740
ACCGTTCCCG TGAAAAGACG GAAGAAGTGA TTGCCGAAAA TCCGGGCAAG AAGCTGGTTC    13800
CTTACTATAC GGTGAAAGAG TTTGTTGAAT CTCTGGAAAC GCCTCGTCGC ATCCTGTTAA    13860
TGGTGAAAGC AGGTGCTGGC ACGGATGCTG CTATTGATTC CCTCAAGCCA TACCTCGATA    13920
AAGGTGACAT CATCATTGAT GGTGGTAATA CCTTCTTCCA GGACACCATT CGCCGTAACC    13980
GTGAGCTTTC TGCCGAAGGC TTTAACTTCA TCGGTACCGG TGTTTCCGGC GGTGAAGAGG    14040
GCGCGCTGAA AGGTCCTTCC ATTATGCCTG GTGGCCAGAA AGAAGCCTAT GAACTGGTTG    14100
CTCCGATCCT GACCAAAATC GCCGCCGTTG CTGAAGATGG GGAGCCATGT GTTACCTATA    14160
TTGGTGCCGA TGGCGCGGGT CACTATGTAA AAATGGTTCA CAACGGTATT GAATACGGTG    14220
ATATGCAGCT GATTGCTGAA GCCTATTCTC TCCTTG                              14256
以上仅是本发明较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡依本发明技术实 质对以上实施例作修改、等同变化与修饰，均属本发明技术方案的范围内。