大肠杆菌O36是一种致病菌，感染鸟类，引起鸟类的肠急性败血病 [Cheville NF，Arp LH.1978，“Comparative pathologic findings of Escherichia coli infection in birds”J Am Vet Med Assoc.1；173(5 Pt 2)：584-7]，因此需要一个可以快速、准确检测大肠杆菌O36的方法。 位于大肠杆菌表面的脂多糖是大肠杆菌致病的诱因，而O-抗原是脂多糖最 外层结构，是免疫系统识别的目标和噬菌体吸附的位点。O-抗原的缺失会造 成许多病原体的血清敏感，或者严重削弱病原体的毒力[Frank et al(1987) “The function of antibody and complement in the lysis of bacteria”.Rev Infect Dis 177：1750-1753.Pluschke G et al“Role of the capsule and the O-antigen in resistance of O18：K1 Escherichia coli to complement-mediated king”.J Bacteriol 42：907-913]。大肠杆菌是一个 种，种内的菌株一般通过O-抗原和H-抗原(有时通过K-抗原)来鉴定。其中 O-抗原具有高度多样性，大肠杆菌有166种不同的O-抗原，O-抗原的变化可 能是大肠杆菌的起源和维持其多样性的主要原因[Reeves，P.R(1992) “Variation in antigens，niche specific selection and bacterial populations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]。
O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡 糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷 酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖 单位，O-抗原的寡糖单位再通过o-抗原转运酶被转移到内膜外侧，而后通过 聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子 [Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends in Microbiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原 合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇 [Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在大肠杆菌、志贺氏菌和沙 门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001) “Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen loci：implication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection and Immunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coli O111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：gene clusters encoding the same colitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal of Bacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基 因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合 成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单 糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包 括o-抗原转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧， 再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因 的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联 结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖 单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决 定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。
因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有 极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗 原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上 世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手 段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足， 大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏 度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方 法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌 (S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏 菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification of abequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”， J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血 清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因 的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年， Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷 酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiological investigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-like toxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明 Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型 的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI 基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.and Reeves，P.R.(1995) “Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111”.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构 中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的。

本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O36的O-抗原特异的核苷酸。它是大 肠杆菌O36的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于o-抗原转运酶基因、聚合酶 基因及糖基转移酶基因的特异的核苷酸。
本发明的一个目的是提供了大肠杆菌O36的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。
本发明的次一目的是提供了构成大肠杆菌O36的O-抗原基因簇的基因：转运 酶基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与 wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf8、orf10、orf11、orf12 基因；糖合成路径基因，包括rmlB、rmlD、rmlA、rmlC；两个功能未知的基 因，包括orf5、orf7。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷 酸序列都列在表4中。
本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O36的O-抗原 基因簇中编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源 于编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于编码 糖基转移酶的基因，包括orf8、orf10、orf11、orf12基因。它们是上述基 因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O36的O-抗原是特异的； 尤其是表1中列出的源于编码转运酶的基因和聚合酶的基因和orf8基因的寡 核苷酸，它们对大肠杆菌O36的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可 重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O36的O-抗原也是高度特异的。
本发明的另一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或 者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些 方法来检测和鉴定大肠杆菌O36的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O36。
本发明的再一目的是提供了分离大肠杆菌O36的O-抗原基因簇的全序列的方 法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获 得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明对大肠杆菌O36的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长15248个碱基；或者具有一个或多个插入、 缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷 酸。
前述的对大肠杆菌O36的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其包括命名为 rmlB，rmlD，rmlA，rmlC，orf5，wzx，orf7，orf8，wzy，orf10，orf11，orf12的 12个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
前述的对大肠杆菌O36的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述基因中具 有高度特异性的基因包括：转运酶基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基 因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因， 包括orf8、orf10、orf11、orf12基因。其中所述的转运酶基因是SEQ ID NO：1 中的5982至7496碱基的核苷酸；所述的聚合酶基因是SEQ ID NO：1中的9583 至10659碱基的核苷酸；所述的orf8基因是SEQ ID NO：1中的8631至9515 碱基的核苷酸；orf10是SEQ ID NO：1中的10679至11587碱基的核苷酸；orf11 是SEQ ID NO：1中的11590至12738碱基的核苷酸；orf12是SEQ ID NO：1中 的12758至13783碱基的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O36的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其还包括源于 所述的wzx基因或wzy基因或糖基转移酶基因的寡核苷酸；以及它们的混合 或它们的重组。
前述的对大肠杆菌O36的O-抗原高度特异的核苷酸，其特征在于，所述的源 于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的6084至6101碱基的核苷酸和 7138至7155碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的6259至6277碱基的核苷酸和 6967至6984碱基的核苷酸；所述的源于wzy基因的寡核苷酸对是：
SEQ ID NO：1中的9697至9714碱基的核苷酸和10570至10587碱基的核苷酸， SEQ ID NO：1中的9814至9832碱基的核苷酸和10428至10445碱基的核苷酸； 所述的源于orf8基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的8656至8673碱基 的核苷酸和9330至9347碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的8758至8775碱基 的核苷酸和9475至9492碱基的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O36的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴 定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
前述的对大肠杆菌O36的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，在通过插入表达 而提供表达大肠杆菌O36的O-抗原，以及制备细菌疫苗中的应用。
前述的对大肠杆菌O36的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于它作为引 物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微 阵列，供检测细菌。
前述的对大肠杆菌O36的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包 括下述步骤：
(1)基因组的提取：在培养基中培养大肠杆菌O36型，离心收集细胞；得到 的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测；
(2)通过PCR扩增大肠杆菌O36型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O36型的 基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，将得到的PCR产物，用琼 脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并该long PCR产物，并用 DNA纯化试剂盒纯化PCR产物；
(3)构建O-抗原基因簇文库：将Long PCR纯化产物应用鸟枪法构建O-抗原 基因簇文库；    
(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的克隆用实验 室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆 盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；
(5)核苷酸序列的拼接及分析：应用生物信息学软件拼接和编辑所有的序列， 从而得到大肠杆菌O36型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；
(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O36型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy 和orf8基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相 应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43 株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，确定wzx、wzy和orf8基因对大肠杆菌 O36型的O-抗原的高度特异性；
(7)引物灵敏度的检测：培养大肠杆菌O36，细菌计数后分别将5×103，5 ×102，5×101，5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中，混入细菌的 待检测物作为检测用样品，将样品加入LB培养基，取一些与样品混合过的LB 培养基过滤，将过滤液进行培养，从培养好的菌液中取数毫升处理后作为PCR 模板用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对大肠杆菌O36的灵敏度。
前述的对大肠杆菌O36的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包 括下述步骤：
(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O36，离 心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞， 37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后 加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液再 用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清液， 再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用 玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中，基因组 DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；
(2)通过PCR扩增大肠杆菌O36中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O36的基 因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇；首先根据经常发现于O-抗 原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预 变性2分钟，然后94℃变性10秒，61℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样 进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼 脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性；合并6管long PCR产物，并 用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；
(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构 建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2， 1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行；酶切10分钟使DNA 片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应；合并4 管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇 (25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍 体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中；随 后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)， 1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产 物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓 冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾，此混 合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与 Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为 90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶；最后用1/10体 积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙 醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。用Bio-Rad公司的电转化感 受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与 50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电 击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml 的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB 固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色 克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质 粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大 肠杆菌O36的O-抗原基因簇文库；
(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100 个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入 片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率，再通过将相联系的序列进行反 向测序及测通得到剩余20％的序列，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；
(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4 软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O36的O-抗原基因簇的核苷 酸全长序列，序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O36的基因 组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基， 保证3个以上高质量的覆盖率；在得到大肠杆菌O36的O-抗原基因簇的核苷 酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for Biotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到12个开放 的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅 读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完 成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得 到大肠杆菌O36的O-抗原基因簇的结构；
(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O36的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、 orf8基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应 基因内的不同地方以确保其特异性；用这些引物以166种血清型的大肠杆菌 和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，所有引物都在大肠杆菌O36中得 到阳性结果，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大 多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PCR产物带，但其 大小不符合预期大小，所以wzx、wzy、orf8基因对大肠杆菌O36及其O-抗原 都是高度特异的。
(7)引物灵敏度的检测：购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g 一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O36的冻存菌液接种到有20 ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量 培养好的菌液作106和107倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取 50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算 原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×103，5×102，5×101，5个 和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液 于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5 分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮 15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用6对 寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的6084至6101碱基的核苷酸和7138至7155 碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的6259至6277碱基的核苷酸和6967至6984 碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的9697至9714碱基的核苷酸和10570至10587 碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的9814至9832碱基的核苷酸和10428至10445 碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的8656至8673碱基的核苷酸和9330至9347 碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的8758至8775碱基的核苷酸和9475至9492 碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg2+：2.5 μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl， 模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″， 72℃：1′，72℃：5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳， 若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参 入了5×103，5×102，5×101，和5个活菌的每份猪肉馅均在6对引物的PCR 反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在6对引物的PCR反应中得到 阴性结果。说明使用上述方法时，这6对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O36的 检测灵敏度均为0.25个菌/g。
也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O36的O-抗原基因簇的 全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长15248个碱基；或 者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功 能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O36的O-抗 原基因簇的结构，如表3所述，它其包括命名为rmlB，rmlD，rmlA， rmlC，orf5，wzx，orf7，orf8，wzy，orf10，orf11，orf12的11个基因组成都位于 galF基因和gnd基因之间。
本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O36的O-抗原基因簇中的基因， 即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基 因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，包括orf8、orf10、orf11、 orf12基因。细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括rmlB、rmlD、rmlA、 rmlC基因；两个功能未知的基因，包括orf5、orf7。它们在O-抗原基因簇中 的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。本发明尤其涉及到o-抗 原转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的 基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是 特异的，而本发明涉及到的o-抗原转运酶基因、聚合酶基因和糖基转移酶基 因对大肠杆菌O36的O-抗原是特异的。
本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O36的O-抗原基因簇中的wzy 基因或与wzy有相似功能的基因和wzx基因或与wzx有相似功能的基因的寡 核苷酸和糖基转移酶基因包括orf8、orf10、orf11、orf12基因的寡核苷酸， 它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中源 于大肠杆菌O36的O-抗原基因簇中的wzy基因或与wzy有相似功能的基因、 wzx基因或与wzx有相似功能的基因的寡核苷酸对和源于orf8基因的寡核苷 酸对。在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些 寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的 退火温度进行。这些引物只在以大肠杆菌O36为模板进行的PCR扩增中得到 预期大小的产物，而在以表2所列的其它菌为模板进行的PCR扩增中都未得 到预期大小的产物。更详细地说，以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应 在大多数细菌中均未得到任何产物，虽然在有些菌中得到了PCR产物带，但 其大小不符合预期大小，这是由于引物结合到基因组的别的位置造成，这种 问题可通过用基因内的其它引物做PCR来避免。所以，可以确定这些引物即 表1所列的寡核苷酸对大肠杆菌O36及它们的O-抗原是高度特异的。
所述的对大肠杆菌O36的O-抗原特异的核苷酸的分离和鉴定方法包括下 述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O36中的O-抗原基因簇；3) O-抗原基因簇文库的构建；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接 及分析，最终获得O-抗原基因簇的结构；6)特异基因的筛选；7)引物灵敏 度的检测。
本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显 而易见的。
如本发明所述，“寡核苷酸”主要是指来源于O-抗原基因簇中的编码转运 酶的基因、编码聚合酶的基因和编码糖基转移酶基因内的一段核苷酸分子， 它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变。尤其是源于wzx 基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的5982至7496碱基)，wzy基因(核苷酸 位置是从SEQ ID NO：1的9583至10659碱基)和源于orf8基因(核苷酸位置 是从SEQ ID NO：1的8631至9515碱基)内的寡核苷酸对大肠杆菌O36都是高 度特异的。
此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突 变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中， 需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发 明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于转运酶基因，包括wzx基 因或与wzx有相似功能的基因；源于聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有 相似功能的基因；源于糖基转移酶基因，包括orf8、orf10、orf11、orf12 基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使 这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸 的混合物是源于转运酶基因、源于聚合酶基因和源于糖基转移酶基因中的寡 核苷酸的组合。
在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗 原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。
本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗 原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是： (i)编码转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚 合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因。(iii)编码糖基转移 酶基因，包括orf8、orf10、orf11、orf12基因。在条件许可的情况下至少 一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基 因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O36。可用PCR方法检测，更可以将本发 明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检 测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
本发明者考虑到以下情况：当单个特异寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的 混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸 用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码转运酶基因 包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、编码聚合酶的基因包括wzy基因 或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸和编码糖基转移酶基因包括orf8、 orf10、orf11、orf12基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的 O-抗原来说是特异的，这一特殊细菌O-抗原是由大肠杆菌O36表达的。
另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的 方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交， 这些基因是：(i)编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基 因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii) 编码糖基转移酶基因，包括orf8、orf10、orf11、orf12基因。在条件许可 的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以 上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O36。可用本发明中的寡核 苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记 后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片 或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们 中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡 核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷 酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混 合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一 个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇 内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方 法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码转运酶的基因包括wzx 基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因包括wzy基因或与 wzy有相似功能的基因；源于编码糖基转移酶的基因包括orf8、orf10、orf11、 orf12基因。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷 酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。
另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌 多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至 少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码 转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶 的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基 因，包括orf8、orf10、orf11、orf12基因。在条件许可的情况下至少一个 寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样 的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O36。可用本发明中的寡核苷酸作引 物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通 过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的 一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于wzx基因或与wzx有相似功能 的基因及wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因包括orf8、 orf10、orf11、orf12基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时， 它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现 问题时，可选择寡核苷酸混合物检测混合基因以提供检测特异性。
本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗 原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。由于O-抗原 合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法 和分子也应用于这些其他的多糖抗原。
本发明首次公开了大肠杆菌O36的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从 这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表 达大肠杆菌O36的O-抗原，并成为有用的疫苗。
具体实施方式：
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。
实施例1：基因组的提取。
在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O36，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然 后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的 蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase， 65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚∶氯 仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提 以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用 70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂 糖凝胶电泳检测。
实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O36中的O-抗原基因簇
以大肠杆菌O36的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首 先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因 设计下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR 反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，61℃退火30秒， 68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到 PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6 管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化 PCR产物。
实施例3：构建O-抗原基因簇文库。
首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建 O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2， 1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA 片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4 管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇 (25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍 体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随 后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)， 1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产 物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓 冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混 合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与 Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为 90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体 积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙 醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。
其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细 胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm 培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm 剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃4000rpm离 心15分钟。倾尽上清液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于 4℃4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体， 于4℃4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃ 6000rpm离心10分钟，弃上清液，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮 细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。
最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌 DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏， 时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复 苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上 37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到 含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用 EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O36 的O-抗原基因簇文库。
实施例4：对文库中的克隆测序。
从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限 公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列 达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再通过反向测序及将有些序列测通得到， 最后获得O-抗原基因簇的所有序列。
实施例5：核苷酸序列的拼接及分析。
用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的 Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从 而得到大肠杆菌O36的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序 列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O36的基因组作6个Long PCR 反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量 的覆盖率。在得到大肠杆菌O36的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国 家生物技术信息学中心(The National Center for Biotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到12个开放的阅读框，用blast 系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它 们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用 Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O36的 O-抗原基因簇的结构，如表3所示。
通过检索和比较，发现orf1，orf2，orf3和orf4都与许多菌的合成鼠 李糖前体的dTDP-鼠李糖的四个合成酶基因有非常高的相同性(identity)， 其中：orf1与鲍氏志贺氏菌的RmlB在353个氨基酸中有98％的相同性，99 ％的相似性；Orf2与鲍氏志贺氏菌的RmlD在299个氨基酸中有97％的相同 性，98％的相似性；orf3与鲍氏志贺氏菌的RmlA在291个氨基酸中有97％的 相同性，98％的相似性，Orf4与鲍氏志贺氏菌的RmlC在171个氨基酸中有63 ％的相同性，75％的相似性，说明它们都有极高的同源性，可以确定orf1、orf2、 orf3、Orf4分别为合成dTDP-鼠李糖的rmlB基因、rmlD基因、rmlA基因、 rmlC基因，因此分别命名为rmlB、rmlD、rmlA、rmlC。大肠杆菌O36的O- 抗原结构未知，但以上结果表明鼠李糖是大肠杆菌O36的O-抗原中的一种单 糖。在genbank中寻找保守的功能域，发现orf5与Coenzyme F420-reducing hydrogenase有24％的相同性，45％的相似性；因为不知道大肠杆菌O36的O- 抗原的结构，因此orf5的功能未知，暂命名为orf5。Orf6与Shigella flexneri 2a str.301的O-抗原转运酶在418个氨基酸的序列中有21％的相同性，42％ 的相似性。并且通过Eisenberg等人的算法 [Eisenberg，D，Schwarz，E.etal(1984).Analysis of membrane and surface protein sequences with the hydrophobic moment plot.J.Mol.Biol.179： 125-142]发现orf6有14个潜在的穿膜区，它与许多Wzx蛋白相似，而且在 Wzx蛋白的氨基端有一个大约40个氨基酸的保守基序，所以可以确定orf6是 wzx基因，命名为wzx。Orf7与Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482的 一个保守的假设蛋白在386个氨基酸中分别有32％的相同性，51％相似性；因 此也不能确定orf7的功能，暂命名为orf7。在genbank中寻找保守的功能域， 发现orf8与pfam00535的糖基转移酶家族相似，E值为2×e-07，通过进行blast 比较发现，orf8与Clostridium acetobutylicum的糖基转移酶在449个氨基 酸中分别有32％的相同性，53％的相似性，说明它们之间有较高的同源性，因 此推测orf8也是一个糖基转移酶基因，暂命名为orf8。blast比较表明orf9 与许多Wzy蛋白相似，例如，和Shigella boydii在350个氨基酸中有22％ 的相同性，41％相似性。另外通过Eisenberg算法得知orf9有9个潜在的穿 膜区，与其他的O-抗原聚合酶有相似的二级结构，具有典型的O-抗原聚合酶 的特征，所以确定orf9是wzy基因，命名为wzy。通过进行blast比较发现， orf10与Shigella dysenteriae的鼠李糖的糖基转移酶有42％的相同性，65％ 的相似性，说明它们之间有较高的同源性，因此推测orf10也是鼠李糖的糖 基转移酶基因，暂命名为orf10。Orf11基因编码的蛋白与Escherichia coli 的WbnE蛋白有同源关系，两者在392个氨基酸中有42％的相同性和65％的相 似性。WbnE蛋白是一个糖基转移酶，因此推测orf11也是一个糖基转移酶的 基因，暂命名为orf11。blast比较发现，orf12与Lactobacillus plantarum WCFS1的一个乙酰基转移酶在354个氨基酸中有21％的相同性和32％的相似性， 因此推测orf12也是一个乙酰基转移酶基因，暂命名为orf12。
实施例6：特异基因的筛选
针对大肠杆菌O36的O-抗原基因簇中的wzx、wzy和一个糖基转移酶的 orf8基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。
在表1中列出了大肠杆菌O36的O抗原基因簇的转运酶基因、聚合酶基因 和orf8基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对 引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列 出了每个引物在SEQ ID NO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相 应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR 产物，其大小也列于表中。
mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且 高度保守的一个基因，所以我们根据mdh基因设计了引物(5′-TTC ATC CTA AAC TCC TTA TT-3′)和(5′-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG-3′)，然后从166种 血清型的大肠杆菌中提取基因组，方法如前所述。用这对引物从166种血清 型的大肠杆菌的基因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。
表2是用于筛选特异基因的166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌及 它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每12-19个菌分为一组，总共13 组。它们的来源都列于表中。
在第2组中含有大肠杆菌O36的基因组DNA作为阳性对照。第13组中是 不含有大肠杆菌O36的基因组DNA，作为阴性对照。以每组菌做模板，用表1 中的每对引物按如下条件做PCR：在95℃预变性2分钟后，95℃变性15秒， 退火温度因引物的不同而不同(参照表1)，退火时间是50秒，72℃延伸2 分钟，这样进行30个循环。最后在72℃继续延伸10分钟，反应体系是25ul。 反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。
对于wzx、wzy、orf8基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除 了在第2组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没 有扩增到任何大小正确的带。所以wzx、wzy、orf8基因对大肠杆菌O36及其 O-抗原都是高度特异的。
最后，通过PCR从大肠杆菌O36中筛选到对大肠杆菌O36的O-抗原高度 特异的基因：wzx、wzy、orf8基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡 核苷酸对大肠杆菌O36的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即 寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O36是高度特异的。所有的这些寡 核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O36，并能鉴定它们 的O-抗原。
实施例7：引物灵敏度的检测。
购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备 用。将10μl大肠杆菌O36的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中， 于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作106和107 倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂 平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生 猪肉馅中分别掺入5×103，5×102，5×101，5个和0个活菌，搅拌均匀，加 入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。 从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ 超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离 心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用6对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的 6084至6101碱基的核苷酸和7138至7155碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的 6259至6277碱基的核苷酸和6967至6984碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的 9697至9714碱基的核苷酸和10570至10587碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中 的9814至9832碱基的核苷酸和10428至10445碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1 中的8656至8673碱基的核苷酸和9330至9347碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1 中的8758至8775碱基的核苷酸和9475至9492碱基的核苷酸，进行PCR反 应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg2+：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP： 1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条 件为：95℃：5′，95℃：30″，5 6℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30 个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带， 则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×103，5×102，5×101，和 5个活菌的每份猪肉馅均在6对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活 菌的猪肉馅在6对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时， 这6对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O36的检测灵敏度均为0.25个菌/g。
通过对O抗原基因簇的克隆和在减毒的疫苗菌株中的表达，可以组建重组 疫苗。O抗原为最主要的革兰氏阴性菌的表面抗原，可以引起强烈的免疫反应， 是制造重组疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret实验室成功的将志 贺氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙门氏菌Tyziai疫苗菌中表达，动物 实验证明可以引起兔子的免疫反应(Molecular Microbiology 1993，7：239-252)。中国军事医学科学院的小组也在从事与Viret实验室类 似的工作。王磊实验室在1999年成功的将大肠杆菌O111的O抗原基因簇在 沙门氏菌疫苗STM-1中表达，并证明组建成的菌株可以引起小鼠的血液和体 液反应(Microbial Pathogenesis 1999，27：55-59)。所以本发明O36的O 抗原特异基因序列可以应用于组建重组疫苗。
根据本发明的对大肠杆菌O36型的O-抗原特异的核苷酸序列(SEQ ID NO：1 所示)，构造特异核酸探针，将其固定到芯片的载体上制成生物芯片，将要检 测的样品适当处理后，与生物芯片进行杂交反应，然后利用生物芯片信号分 析设备就可以得到样品中相应的细菌情况。这种大肠杆菌O抗原鉴定的DNA 芯片将可以直接用于临床和其它检验场所(如食品加工和生产行业，畜牧兽 医行业海关检疫等的微生物检验)。这种芯片只需要扩大产量，在完全相同的 条件下就可以产业化。
表3是大肠杆菌O36的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌 O36的O-抗原基因簇的结构，共由12个基因组成，每个基因用方框表示，并 在方框内写入基因的名称。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因， 它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗 原基因簇的全长序列。
表4是大肠杆菌O36的O-抗原基因簇中的基因的位置表，在表中列出了 大肠杆菌O36的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置， 在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在细菌中开放阅 读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。
              SEQ ID NO：1序列(SEQUENCE LISTING)
<110>天津生物芯片技术有限责任公司
<120>对大肠杆菌O36的O-抗原特异的核苷酸
<160>1    
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>15248
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>1
attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaacgcggtc     60
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tttttatcat ttgggctttg ttttcaataa gtataatata tcttgttcaa agtggtctaa  13380
tagttccatc ttattttgga ttttatcttt ttcacttaca ttagccattt ctgaagggat  13440
attttggggt tatactggga actattcatt tgctgtgtct caacttaaac tatcatcttt  13500
ggttctctct ttatgcgttt gtatggttgt ttatttttat ctaaaccatg atataaatta  13560
taaatacctt tctcaattag ggacaatgtc ctacgggatt tatcttactc atatgttgtt  13620
tgtttggttc tatcattatc tcttttcgta tacgagtgtg tttataaggc atttagttat  13680
ctcgtgtggc tttatcttta tattaagtac aatatcatca gttaccttag ttttttttat  13740
aagaaaaatt ttggggagat attccgtata tattgtaggg taggtgattg cttgatattt  13800
atactgtttt aagaagaagc ctaatttatc tcaatactgg gcatttcact agagctgtat  13860
tagtatattt gtcacattct catccgtatt tctaatgtat ttttcagagc aggagactta  13920
aatgtcaaag caacagatcg gcgtcgtcgg tatggcagtg atggggcgca accttgcgct  13980
caacatcgaa agccgtggtt ataccgtctc tattttcaac cgttcccgtg aaaagacgga  14040
agaagtgatt gccgaaaatc caggcaaaaa actggttcct tactatacgg tgaaagagtt  14100
tgttgaatct ctggaaacgc ctcgtcgcat cctgttaatg gtgaaagcag gtgcaggcac  14160
ggatgctgct attgattccc tcaaaccata tctcgataaa ggcgacatca tcattgatgg  14220
tggtaatacc ttcttccagg acaccattcg tcgtaatcgt gagctttctg cagaaggttt  14280
taacttcatt ggtaccggtg tttccggcgg tgaagaaggt gcgctgaaag gtccttccat  14340
tatgcctggt gggcagaaag aagcctatga acttgttgcg ccgatcctga ccaaaatcgc  14400
cgcagtggct gaagacgggg agccatgcgt tacctatatt ggtgccgatg gtgcaggtca  14460
ctatgtgaag atggttcaca acggtattga atacggtgat atgcagctga ttgctgaagc  14520
ctattctctc ctgaaaggcg gcctgaatct ctctaacgaa gaactggcac agacctttac  14580
cgagtggaat aacggtgaac tgagtagcta cctgatcgac atcaccaaag atatcttcac  14640
caaaaaagat gaagacggta actacctggt tgatgtgatt ctggatgaag ccgctaacaa  14700
aggtaccggt aaatggacca gccaaagtgc gctggatctc ggcgaaccgc tgtcgctgat  14760
taccgagtct gtgtttgcac gttatatatc ttctttgaaa gatcagcgtg ttgccgcctc  14820
taaagtactg tctggtccgc aaggacagcc agcaggcgac aaagctgagt tcattgaaaa  14880
agttcgccgt gcgctgtatt tgggcaaaat cgtttcttac gcccagggct tctctcagct  14940
gcgtgcggcg tctgaagagt acaactggga tctgaactac ggcgaaatcg cgaaaatttt  15000
ccgtgctggc tgtattatcc gtgcgcagtt cctgcagaaa atcaccgatg cttatgccga  15060
aaatccgcag atcgctaacc tgctgctggc tccgtacttc aagcaaattg ccgatgacta  15120
ccagcaggcg ctgcgtgatg tcgttgctta tgcagtacag aacggtatcc cggttccgac  15180
cttcgccgct gcggttgcct attatgacag ctaccgtgcc gctgttctgc ctgcgaacct  15240
gatccagg                                                           15248
表1大肠杆菌O36的O抗原基因簇中wzx基因、wzy基因和Orf8基因及其中的引物及PCR 数据
                                                                          产生正
                                                                                   PCR的
                 基因的        正向引物位置    反向引物位置    PCR产物    确大小
基因    功能 
                                                                                   退火温
                 碱基位置                                      长度       电泳带
                                                                                   度(℃)
                                                                          的组数
wzx     O-抗原    5982-7496    6084-6101       7138-7155       1089bp     0        53
        转运酶
                               6259-6277       6967-6984       730bp      0        53
wzy     O-抗原    9538-10659   9697-9714       10570-10587     891bp      0        53
        聚合酶
                               9814-9832       10428-10445     632bp      0        55
Orf8    糖基转    8631-9515    8656-8673       9330-9347       700bp      0        55
        移酶
                               8758-8775       9475-9492       635bp      0        53
表2 166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源
组号                 该组中含有的菌株                                               来源
1、野生型大肠杆菌    O1，O2，O5，O7，O8，O9，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O18，    IMVSa
                     O19ab，O20，O21，O22，O23，O24
2、野生型大肠杆菌    O4，O10，O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O34，O35，    IMVSa
                     O36，O37，O38，O40，O41，O42，O43
3、野生型大肠杆菌    O6，O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56，    IMVSa
                     O57，O58，O60，O61，O62，O53
4、野生型大肠杆菌    O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78，        IMVSa
                     O79，O80，O81，O82，O83，O68
5、野生型大肠杆菌    O84，O85，O86，O87，O88，O89，O90，O91，O92，O98，O99，        IMVSa
                     O101，O102，O103，O104，O105，O106，O97，
6、野生型大肠杆菌    O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113，           IMVSa
                     O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128，O117
7、野生型大肠杆菌    O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O136，O137，         IMVSa
                     O138，O139，O141，O142，O143，O144，O145，O140
8、野生型大肠杆菌    O145，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158，         IMVSa
                     O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166，O153                 b
9、野生型大肠杆菌    O168，O169，O170，O171，O172，O173，                           c
痢疾志贺氏菌         D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12，D13         d
10、鲍氏志贺氏菌     B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15， d
                     B16，B17，B18
11、福氏志贺氏菌     F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v：4)，F5(v：7)，F6，     d
                     DS，DR
12、野生型大肠杆菌   O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，O155，IMVSa
                     O124，O167，O162，O121，O127，O149，O119
13、野生型大肠杆菌   去除大肠杆菌O36的第2组菌
为了检测的方便，每12-19个菌分为一组，总共12组，第13组作为阴性对照
a.Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australia
b.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark
c.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自 于IMVS
d.中国预防医学科学院流行病学研究所
表3是大肠杆菌O36的O-抗原基因簇的结构表

galF    rmlB  rmlD  rmlA  rmlC  orf5    wzx    orf7  orf8  wzy    orf10  orf11  orf12    gnd
        1kb
        ——
表4是大肠杆菌O36的O-抗原基因簇中的基因的位置表
ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ACGCGTCCAA GAACGCGGTC    60
GAAAACCACT TCGACACCTC TTATGAATTA GAATCTCTTC TTGAACTGCG CGTGAAGCGT    120
CAACTACTGG CGGAAGTTCA GTCCATCTGC CCGCCGGGCG TGACCATTAT GAACGTACGT    180
CAGGGCGAAC CTTTAGGTTT AGGTCACTCC ATTTTGTGTG CACGACCCGC CATTGGTGAC    240
AACCCATTTG TCGTGGTGCT GCCAGACGCT GTGATCGACG ACGCCAGTGC CGATCCGCTG    300
CGTTACAACC TTGCTGCCAT GATTGCGCGT TTCAATGAAA CGGGCCGTAG CCAGGTGCTG    360
GCAAAACGTA TGCCGGGTGA CCTCTCTGAA TACTCCGTTA TTCAGACCAA AGAACCACTG    420
GATCGTGAAG GTAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTTATCG AAAAACCGGA TCAGCCGCAG    480
ACGCTGGACT CAGACATCAT GGCCGTTGGT CGCTATGTGC TTTCTGCAGA TATTTGGCCG    540
GAACTTGAAC GCACTCAGCC AGGTGCATGG GGACGTATCC AACTGACAGA TGCCATTGCC    600
GAACTGGCGA AAAAACAGTC TGTTGATGCA ATGCTGATGA CTGGTGACAG CTACGACTGC    660
GGTAAAAAAA TGGGCTATAT GCAGGCATTT GTGAAGTATG GACTACGCAA CCTGAAAGAA    720
GGGGCGAAGT TCCGTAAA G TATTGAGAAA CTGTTAAGCG AATAATGAAA ATCTGACCGG    780
ATGTAACGGT TGATAAGAAA ATCATAACGG CAGTGAAGAT TCGTGGCGAA AGTAATTTGT    840
TGCGAATATT CCTGCCGTTG TTTTATATAA ACAATCAGAA TAACAACGAG TTAGCAATAG    900
GATTTTAGTC AAAGTTTTCC AGGATTTTCC TTGTTTCCAG GGCGGATTGG TAAGACAATT    960
AGCGTTTGAA TTTTTCGGGT TAAGCGCGAG TGGGTAACGC TCGCTACATC GTAGGCATGC    1020
ATGCAGTGCT CTGGTAGCTG TAAAGCCAGG GGCGGTAGCG TGCATTAATA CCTCTATTAA    1080
TCAAACTAAG AGCCGCTAAT TTCACAGCAT GCTCTGAAGT AATATGGAAT AAAAAAGTGA    1140
AGATACTTGT TACTGGTGGC GCAGGATTTA TTGGTTCTGC AGTAGTTCGT CACATTATAA    1200
ATAATACGCA GGATAGTGTT GTTAATGTCG ATAAATTAAC GTACGCCGGA AACCTGGAAT    1260
CACTTGCTGA TGTTTCTGAT TCTGAACGCT ATGTTTTTGA ACATGCGGAT ATTTGCGATG    1320
       Orf1的起始
CTGCTGCA AT GGCGCGGATT TTTGCTCAGC ATCAGCCGGA TGCAGTGATG CACCTGGCTG  1380
CTGAAAAGCC ATGTGGATCA ATTACAGGCC CTGCGGCATT TATTGAAACC AATATTGTTG    1440
GTACTTATGT CCTTTTGGAA GCGGCTCGCA ATTACTGGTC TGCTCTTGAT GGCGACAAGA    1500
AAAATAGCTT CCGTTTTCAT CATATTTCTA CTGACGAAGT CTATGGCGAT CTGCCTCATC    1560
CTGACGAAGT AAATAATAAA GAACAATTAC CCCTCTTTAC TGAGACGACA GCTTACGCGC    1620
CTAGTAGTCC TTATTCCGCA TCAAAAGCAT CCAGCGATCA TTTAGTCCGT GCGTGGAAAC    1680
GTACCTATGG TTTACCGACC ATTGTGACTA ACTGTTCGAA TAACTACGGT CCTTATCACT    1740
TTCCGGAAAA ATTGATTCCA CTAGTAATTC TTAATGCTCT GGAAGGTAAG GCATTACCTA    1800
TTTATGGCAA AGGGGATCAA ATTCGTGACT GGCTGTATGT TGAAGATCAT GCGCGTGCGT    1860
TATATATCGT CGTAACCGAA GGTAAAGCGG GTGAAACTTA TAACATTGGT GGACACAACG    1920
AAAAGAAAAA CATCGATGTA GTGCTCACTA TTTGTGATTT GTTGGATGAG ATTGTACCGA    1980
AAGAGAAATC TTACCGTGAG CAAATTACTT ATGTTGCCGA TCGCCCGGGA CACGATCGCC    2040
GTTATGCGAT TGATGCAGAG AAGATTAGCC GCGAATTGGG CTGGAAACCG CAGGAAACGT    2100
TTGAGAGCGG GATTCGTAAA ACGGTGGAAT GGTACCTGTC CAATACAAAA TGGGTTGATA    2160
                                                        Orf1的终止
ATGTGAAAAG TGGTGCTTAT CAATCGTGGA TTGAACAGAA CTATGAGGGC CGCCAG TAAT  2220
Orf2的起始
GAATATTCTC CTTTTCGGCA AAACAGGGCA GGTCGGTTGG GAACTACAGC GTGCTCTGGC   2280
ACCTTTGGGT AATTTGATTG CTCTTGATGT TCACTCCACT GATTATTGTG GTGATTTTAG    2340
TAATCCTGAA GGTGTAGCTG AAACCGTCAA AAAAATTCGC CCTGATGTTA TTGTTAATGC    2400
TGCGGCTCAT ACCGCAGTAG ATAAGGCTGA GTCAGAACCC GAATTTGCAC AATTACTCAA    2460
TGCGACCAGC GTTGAATCAA TTGCAAAAGC GGCTAATGAA GTTGGGGCCT GGGTAATTCA    2520
TTACTCAACT GACTACGTAT TTCCGGGGAC CGGTGAAATA CCATGGCAGG AGGCGGATGC    2580
AACCGCACCG CTAAATGTTT ACGGTGAAAC CAAGTTAGCT GGAGAAAAAG CATTACAAGA    2640
GCATTGTGCG AAGCACCTAA TTTTCCGTAC CAGCTGGGTC TATGCAGGTA AAGGAAATAA    2700
CTTCGCCAAA ACGATGTTGC GTCTGGCAAA AGAGCGTGAA GAATTAGCCG TTATTAATGA     2760
TCAGTTTGGT GCGCCAACAG GTGCTGAACT GCTGGCTGAT TGTACGGCAC ATGCAATTCG     2820
TGTGGCACTG AATAAACCAG AAGTCGCAGG CTTGTACCAT CTGGTAGCCA GTGGTACCAC     2880
AACCTGGCAC GATTATGCTG CGCTGGTTTT TGAAGAGGCG CGCAAAGCAG GCATTCCCCT     2940
TGCACTCAAC AAGCTCAACG CAGTATCAAC AACAGCCTAT CCTACACCAG CTCGTCGTCC     3000
GCATAACTCT CGCCTTAATA CAGAAAAATT TCAGCAGAAC TTTGCGCTTG TTTTGCCTGA     3060
                                                       Orf2的终止
CTGGCAGGTT GGTGTGAAAC GCATGCTCAA CGAATTATTT ACGACTACAG CAATT TAATA   3120
                                                       Orf3的起始
GTTTTTGTAT CTTGTTCGTG ATGGTGGAAC AAGATAAATT AAAAGGAATG ATGGA ATGAA   3180
AACGCGTAAA GGTATTATTT TAGCGGGTGG TTCTGGTACA CGTCTTTATC CTGTGACTAT     3240
GGCTGTCAGT AAACAGCTAT TACCTATTTA TGATAAACCG ATGATCTATT ATCCGCTCTC     3300
TACACTGATG TTGGCGGGTA TTCGCGATAT TCTAATTATA AGTACGCCAC AGGATACTCC     3360
TCGTTTTCAA CAACTGTTGG GTGACGGGAG CCAGTGGGGC CTGAATCTTC AGTACAAAGT     3420
GCAACCAAGT CCAGATGGTC TTGCGCAAGC ATTTATCATC GGTGAAGAAT TTATCGGTGG     3480
TGATGATTGT GCTTTGGTTC TTGGTGATAA TATTTTTTAC GGTCACGATC TGCCGAAGTT     3540
AATGGATGCC GCTGTTAACA AAGAAAGTGG TGCAACGGTG TTTGCCTATC ACGTTAATGA     3600
TCCTGAACGC TATGGTGTCG TTGAGTTTGA TAAAAACGGT ACGGCAATTA GCCTGGAAGA     3660
AAAACCGCTA CAGCCAAAAA GTAATTATGC GGTAACTGGG CTTTATTTCT ATGATAACGA     3720
CGTTGTAGAA ATGGCGAAAA ATCTTAAGCC TTCTGCCCGC GGTGAACTGG AAATTACCGA     3780
TATTAACCGT ATCTACATGG AACAAGGGCG TTTATCTGTT GCCATGATGG GACGTGGATA     3840
TGCATGGTTA GACACGGGGA CACATCAAAG CCTGATTGAG GCAAGCAACT TCATTGCTAC     3900
AATTGAAGAG CGTCAAGGGT TGAAAGTTTC CTGTCCAGAA GAAATTGCTT ACCGTAAAGG     3960
GTTTATCAAT GCTGAGCAGG TGAAAATATT AGCTGAACCG TTGAAGAAAA ATGCTTATGG     4020
                              Orf3的终止Orf4的起始
TCAGTACCTG CTAAAAATGA TTAAAGGTTA T TAATAAA AT GAACGTAATT AAAACAGAGA 4080
TTCCAGACGT ATTAATTTTC GAACCGAAAG TTTTTGGTGA CGAGCGCGGT TTCTTTTTCG     4140
AGAGCTTTAA CCAGAAGGTT TTTGAGGAAG CTGTAGGCCG CAAAGTTGAA TTTGTCCAGG     4200
ATAACCATTC GAAGTCTTGT AAAGGTGTTT TACGCGGACT GCATTATCAG TTAGAACCTT     4260
ATGCACAAGG AAAGTTGGTG CGCTGCGTTG TTGGTGAAGT TTTTGACGTA GCTGTTGATA     4320
TTCGTAAATC GTCGCCTACC TTTGGTAAAT GGGTTGGGGT GAATTTATCT GCTGAGAATA     4380
AGCGGCAATT GTGGATCCCT GAGGGATTTG CGCATGGGTT TTTGGTGCTG AGCGACGAGG     4440
CAGAATTTGT TTATAAGACA AACAATTATT ATTATCAAAA GCATGAAAGA AGCATTCTTT     4500
GGAACGATAA AATTCTCAAC GTAGAATGGC CATTTACTTC TAACTTAATT CTTTCTTCAA     4560
                                        Orf4的终止
AAGATATGAG CGCGTCATTA TTCACTGTTG CAGAAAAATT T TAATTGGTT TTGGAAATAA   4620
Orf5的起始
A ATGTCTATA CAAAATGTAA TAGATAATGG TTACTGCGTC GGATGTGGTG CTTGTAAATT   4680
GGCTCTTGGA GAGTCAGTGG AAATAAAAAT GTATGAAGAT GGCTTTTATA ATGCTTCGAT     4740
AAAACCTAAT GCAAATATTG AAATTGCCGA GAAAATTTGT CCATTTTCTG ATAGTTCAAC     4800
AAATGAAACT ATCTTAGGCG CATCACTTTA TGGAGATAAA AAATTTGACA AGCGTGTAGG     4860
ATATTTTGAC GACATTTATA TTGGGTATGT AGTTGATAAT CAGGACCGAC TAACTTCCAG     4920
TTCAGGTGGA CTTACTACCT GGTTTGCTAA AAAGTTATTA ATAAATAAAG AGGTTGATGC     4980
GGTAATTCAT GTAGGGCATG GGACGCATAT GTTGGACTAC ATTATTACTG AGAATATTTT     5040
AGATCTTGAT TTACAGAATA ATAAAAAATC CAGATATTAT CCTGTAAGTT TTTCTGAATT     5100
GATAAATAAA ATAAACCAAT CAGATAAAAA ATACCTTTTC ATTGGCATTC CATGTTTTGT     5160
TAAATCAATA AGATTAGCGC AGAAAGAAGG AATGGTTCAG AATATTAAAT TTGTGATTTC     5220
ATTACTCTGC GGACATATGA AGTCCAAAGA TTTCGCTACG AGTCTTGCGT GGCAGATTGG     5280
CGTTAAACCT GATGATCTGG GTAGTGTAGA CTTTCGTGTC AAGGAGGATA ATAAAAAAGC     5340
AAATGATTAT AATATAGAAG TTGAAGATAC TTGTAATAAG AAATATATGC ATCAAAGCTC     5400
TTCGTTGTTT GGCACTAATT GGGGGCTAGG CTTTTTCAAA CATCATGCAT GTGATTTTTG     5460
TGATGACATT GCAGGTGAAT TGGCGGATGC AACTTTAGGT GATGCTTGGT TACCGAAGTA     5520
TATAAATGAT TCACAAGGTA CTAATATACT TATTGTAAGA AACGATGTTT TAAATAAATT     5580
ACTTGAACAA TATCAAGAAG AAATAGTGCT TGAAACTGCG AATGTCGAGG ATTTTTATGA     5640
AAGTCAAGCT GGGAATTTTC GTAATCGACG TGAAGGGTTA CTTGTTCGTG TCCAAAATGA     5700
AAAAAAATGG ACTCCTAGAA AAAGGTTGGA AATTATTAAC TCCGATATTC CATTACAACG     5760
TCGTAAATTG TATTTAGTTC GTCAGAAGTT AAGTGAACAA AGTATAAAGA AATTTCAAAT     5820
AGCTAAAAAG ATAGGTTCAA TATATTCATT CAAATTGTTA ATGGTTCCTG ATATTTTTAG     5880
ATATAAAATG ATTGAGAAGA ATTTAATATC GGCGTTAAAA GAAACTATAA GAATAGTGGC     5940
                                 Orf5的终止 Orf6的起始
GCCAAGAAAA CTTGTAAAAA TATTCAAAAA ACGG TAGCTT T ATGCATAGG CAAGTTTTTC 6000
GAAACGTATT TCTAAATGTG ACGACATTTT TATTAAATGT AGTTACTGGA TTATATTTAA     6060
CTCCATTTTT GATTAAATAT TTAGGGTTGG AAGTGTATGG TATACTTCCT TTAGCATTGT     6120
TTTTAACCTT TTATATTGGC GTGATAACTC AGGCCCTTAC GGCATCAGTA AATCGATTTT     6180
TTATTGCAAA TTTACAAACT AATAACATTA AAGAGGCTAA TGTTGTTTTT AACACTGCTT     6240
TTTGTATCAT AGTTACATAT TCGGTATTGC AGTTTGCTCT CCTATACTAT CCTATACAAA     6300
ATATAGACCA GTATTTTTCT ATACCGACGC ATAGCAGAGA TGATGCCCGG AGATTGTTTG     6360
AATCAGTTTT ACTCAGCTTC TCTCTTGCGC TTTTAACATC CATTTTTAGT GTTTCGCTTT     6420
TTGCATTAAA CAGGTTGGAT TTGATTCAAT GCGTCCAGTT AATCAAAATT ATTATAAAGT     6480
TCATTACCAT AATATTATTC TTTGAACATC ATTGCATAGG TATCCAGTTT GTAGGAATAG     6540
CAATGATTCT GTCAGAGTTA ATAGCTTTAA TTTTGACGAT TTGTTTATGG AGAAAATTGA     6600
CACCGGAAAT AAATTTAAAA CTATTTTACT TCAGTAAAAA GAAAGTAGGA GAGCTTTCAA     6660
AGTTTGCAAT GTGGTTGATT ATTGATCAGG TTGGATATGT TCTTTTTATT AAAATGGATT     6720
TATTATTGGT AAACAAATTC TTTGGGGCGA AGGAATCTGG GCGCTATTCA ATTGCAACGC     6780
AATTTAGTGA TTTACTAAGA TCATTTGCAG GGCTTATGGC GGGAGTTCTT GCACCTGTAA     6840
TAATGATACT ACACGCCAAG AATGAATTAG AAAGAATTGT AACCGTTACC AAAACGTTTG     6900
TGATGATTCT ATCGCTGACA ATAGCGATAC CAATTTCTAT AATCTGTGTA TTTTCTCAAG     6960
AGCTGATTCA TTTCTGGCTA GGACAAGATA TAAATATCCA AACTTTAATT TGGATTGTGA     7020
CTTTTCCATT AATAATTAAT TTGGGCGTCT TACCATTATT TTCTATAAAT GTAGCGTTTA     7080
AAAAAGTTAA ACTACCTAGT GTTCTAAATA TCGTATTGGC ACTAGTTGGC GTATTTGTCT     7140
CAATTATACT TATTCGAAAT ACTGAACTGG GTTTACTTGC AGTAGCGGCT GGGTTTGGTT     7200
TTTCCCTGAC CCTCAAAAAT GCGGTATTTA TACCTATTTA CGCGGCACTA AATTTAAGAA     7260
TAGATAAATT AACATTTCTA ACTGTACATG TAAGAACTAT TTTATTTACA TTTTTTTATG     7320
TATGTTTTCT GATTTTAGTT AAGTCAAAAC TGTCTAGTAA TCTTTACGGG TTTTTAGCTG     7380
AATTAACAGT GCTTATTATA TTTGGCTTTA TAATTAGTAT CTTTTTTTAT TCTCGGGATG     7440
                                                Orf7的起始Orf6的终止
AAAGGAAGTA TATTACTAAT ACACTTTCAG ATAAATTAAA AGCGAAGGTA AA ATGAAAAA   7500
TAAAATTGGT ATTCTAAATT TTCAATATTC GGATCATAAT TATGGTGCAG TCTTACAAGC     7560
TGTTGCACTA GAAAATGTTT TAAAACAGCT AGGGAAAAAT GCTGAACATA TTAATTTTAT     7620
TCCAAAGAAG AAAGGTAACA AAAATATCAA ACAATTTATA ATTGAATTTT TAGCTTCTAT     7680
TGGTTTAAAA CCTTTCATTT ATCGGGTATT TAACAAAAAA GTTATTATAA AAAATAAAGT     7740
TGAAGGATCT GAGATTTTTG AGGATTTCAG GAATAAATAT TTGAACAGAA CAAAAGCGTT     7800
TCATTCCCTC AATGACCTTA TGGAATTAGA GGATAGTTAC AGTTCTGTTA TCGTTGGAAG     7860
TGATCAAGTC TGGCGCCCCA AAATGTACTC AGACCTTACA GAAATTGAAA TTTATTTCCT     7920
TTCTTTTATT TCACAGAAAA CAAAAAAAAT TTCTTATGCA GCAAGTTTTG GTGTTGAGCG     7980
ATGGGAATAT GACAAAAATG ATAATGTGAC ACATAAAGCA CAAAAATATC TGAACAAATT     8040
TAATTCTATT TCTGTTAGAG AAAAATCAGG AGTAGACATT TGTAATAGTG TATTTGATAT     8100
TAGAGCTGAG CATGTTCTGG ATCCAACACT ATTGATCGGA CGTGATTTTT TCGACAATCT     8160
TATTAAAGAC AAACAACCAT TAGTTCAAAA GACAATAAGT TATTATAAGT TAGATCTTTG     8220
TGAGTCTTTT TTAGCGGGAA TAGAGCATCT TGCTAATCTA ACCGGCTATG AGACTAATAA     8280
TATTTACTAC AAACAACTGA ATAATGGGAG TTATGAATAT TATCCAGTTT TAGATTGGCT     8340
AAGCATGATT AATTCATCTT CGATAATAAT AACAGACTCT TTTCATTGTG TATGCTTCTC     8400
AATTTTATTT AATAAAAGCT TCTATTGTTG TCTTAATAAA GAAAGAGGAG CATCGAGGCT     8460
TGAAAGTTTA TTGAATGAAC TGGGGTTGCA AGACAGATTA ATCTCTGAAG AAGAACTATC     8520
GAGAATTTAT ACAATAGTTG ATATCAATTA TTCTCCTGTA GAAGATATTT TGAATAAGCA     8580
                                   Orf7的终止      Orf8的起始
CAGGAAACAG TCAATAGAAT TTTTAGTTTC AGCAAT TGAT GGATAATTAA  ATGAGTCATA 8640
TAATTCCAGT AGTTATTATG ACACGGAATG AAGGTGCTTA CCTTTTGAAA TGTGTCCAAT     8700
CAATCATTAA TACTGTTACT ATACCCTATC ATATATATAT TATTGATAAC AATTCTTCAA     8760
CATTGGAGCA AGAAGAAGTT CTAAAAATTA TTGAATATAA GTTTAATGAT AAAGTAAATA     8820
TTATTAGAAA TCGTACTAAC AGGTGGGTTC TGGGTTTAAA TAAGACACTT ATTGAATTGA     8880
GTAAAAATAA AGAACAACCC TATTTCTTTT TAACTGATGG TGATATTGAC TTTTCAAGAT     8940
GCACCGCTAA GCCATGTTGG TTATCATATT TGGTTACCCA TATGAATTCT AATGTATCTC     9000
TGGGGAAAAT TGGCTTATCT CTCAATTGGG ATTACATTTC AACTACAAAA GAATTGGCGG     9060
CTGTTTATGA ACAGGAGAGA AGTCTATATA ATGAAAGTAA AAAAATAAAT GATTTATATG     9120
TGTCTCCTGT TGATACAACA GCGGCATTAT TTCGATGGGA TTGGTCTATA GAAGGAAGAC     9180
CAAGCTTATA TCCAGACCAT ATTAGATACC TTAGACCAGA ACTTTATTCA TGTCGAACAC     9240
CATTAGATAT TAATGTAGAG CATATGGGAT GGTATAAATA TTGTGCAGAA TCTGGAGATA     9300
CAAAAAATTT AGAGGAAAAA ATAGTCTGCT TCACTATGGT TGGTGGTGAT GTTAAAAACG     9360
AAATTTTAGA TAAGGTTCGT TTTTTCTATA AGGTTATATA TAAATCATTG TCTGGTCCAG     9420
TAAAAAAAGC ATGGTATTTC AGGAGATATT ATTATCTTTT GAAATATTTT CTTTTTAAGG     9480
                                 Orf8的终止            Orf9的起始
GCGTTCGCAG ATTCGATGGT CAAAACTGTC TT TGAAATGT AATGTAATTA TTGGA GTGTA 9540
ACTTTGTATA TATTTCGAAG TGAGTTTGTA CTAGCGATAT TTATTTTTCA TTTGTTATTC     9600
ATAATATTGG CCTTATATGC ACGAAAACTT GATAATAAGG TATTAGATTA TATATTTCTT     9660
ATATTGGCAA CTACATTAGC CTTAATTATT TCACTCTTTA GACCTGGCTT TGGAGTTGAT     9720
GAACCTTCTT ATCTTGAGGC ATTTATTAAT TTCAAAAATA ATGCTGACAC ATTTCCATTC     9780
GATTATTCAT TTAAAGTATT ATATGAAATA TTATCTAATA CGGGCATACA AATTGAGTAT     9840
TTCAATAACA CAGTCAGCTC TTTATATATT ATTTTACTTA GTATAACGGC GATAGTAACA     9900
TCGAGTAAAA ATAATAAGTG TTTTTATTTC TTGATGTTAT TGTTCAGTTT TACTTCATTA     9960
GATCTAATGT TTAATGCTTA CAGGCAAGCA TTTGCATTTA TATTTATTTA TAACTCTTTA     10020
TTTCTTTTTT TGAGAGAAAA GAAAATCAAG GGGGCTTTAT TAGCTGTAAT CTCTTTTGGG     10080
TTTCATTGGT CAGCAGTTAT CCTGATCTTA TTTTATTTTT TATCGAGGTT TCTTAAGAAT     10140
AAATATTCTT ACCTTATTTT ACTTTTATTA TTTCCATTTG TATTAATCTC GATGTTTTAT     10200
CCATTAGGTT TGATGGGGAT AGGATATAAT GTGTTGTTAT TTCTTCCTTT GAATGAATTA     10260
TTCAAAGCTC ATGTGTTAGC GTATTTAGAA GTTGATAACA TTTCTAGCGC GTCGTTTTAT     10320
ATACTTAATC TCTTTGGTCG ACTACCATTG GCTATATCGG TATTAACTTT TTATGCTTTT     10380
ATACTGATTT TTTACAAAAA AATAAGAATG AAGCGTATAA TAGCAATGAT TGTCTTGATG     10440
GCTGTTTATT GTCTAGTGTT TATGGAGATG GCATATAGTT TTAGAAATTA TTATTGGGTT     10500
CTACCATTTT TCCCTATTAT TGCTTTAGAT TACGCAGAAT CTAATCAAGC GAAAATTCAT     10560
TCAAGAATGA TAGGCATTGC TGCTCTTCAT ATCTTGATAG CATTGCCTAC TTTTTACAGT     10620
                                     Orf9的终止         Orf10的起始
TCAGGTATAA ACTCTATGAT TTTCAATACT GGCAAT TAGT ATTGAATATG GAAAAAAA AT 10680
GTGTTCATTA AAAGTTAGCG CTTTACTCGT TAGTTACAAT CCAGATATTA ATAGATTAAG    10740
TGAGGTTCTT AATAGTATTC ATTCTCAAGT AGATCATCTA GTTTTAGTTG ATAATGGTTC     10800
AAAAAATAAA AATGATATAC TTGCTCTCAT TGCCGATTAT GAGGGGGTTT ATACACTGCT     10860
TAATGATAAT AATATAGGTT TAGCCTCTGC TCAAAATGTT GGTATTGATT ATATTATTGA     10920
CAATAACCTT TCCGATTTTA TCGTGTTCTT CGACCAAGAT AGTGTATTGC AGTCAGGTTT     10980
TATTAGTGCG CTACTCGAAA CGTATACTAA TTTAGTAACT CAGAATATTA AATTAGCAGC     11040
AGTAGGACCA TCATTTATTG ATCCTGTAAA TAATAAACAA TATCCTGCGA CTGTTTATGC     11100
AGGACCATTT ATTAAACGAG TAGATCTTGA AAGAAAACCT GTAGAAGCTA CCTTCATAAT     11160
TGCTTCTGGA TGCTTTGTTG CCATTGAGGC ATTGAAAAAA ATTGGGAAAA TGAAGGATGA     11220
ATTGTTTATA GACTATATCG ATGTTGAATG GTGTCTCAGA GCTAGGAGTT TAGGATACAA     11280
AATATATATT TCACCTAAAG CTGTAATGAA ACATACTATT GGAGATAATC GAGTATCTAT     11340
CTTTGGGCGA ACAATATCTG TTCATTCACC ATTACGTCGA TATTATCTTG TAAGGAATAG     11400
CTTTTATATG ATTAGATTGG ATTATATACC AATTGGATAT AAAATTAGAG AAATATTTTT     11460
TAATGTAGTT CGTATTTGTA TCAGCTTAGC TCTATCTGAT GATAAAAAAA AGATACTTCA     11520
TTATACAATA ACTGCAATTA AAGATGGTGT TAGTAAAAAA TTCGGACCTT GTAAAAAAAT     11580
Orf10的终止Orf11的起始
ACTC TAATT A TGATCAAAAT AGCTCATATT CAATTATTGC CAATGCTTAG TGGTGTTCAG 11640
AGAGTGTGTT TGGATGAGCT CTCAAGATTG GACAAAAAAA AATATCAAAG ATACTTAATT     11700
TGTAAAGAAC CAGGTAAACT CAGTGATGAG GCTACTGCTA TTGGCGTTCA ATGTATCTTT     11760
CTTCCCGAGC TTCAGCGCAA TATCAGCTTT AAGATGGACT TAATAGCGTT GTACAAATTA     11820
TATCGGATAA TAAAGATATA TAAATTCGAT ATTGTTCATA CACACTCTTC TAAGCCAGGT     11880
GTTTTAGGGC GTATTGCAGC CAGGCTGAAT GGTGTTAAAC TGATACTTCA CACTGTGCAC     11940
GGTTTTTCTT TTCCTGCTGC ACAAAATAGG TTCCAATATT ATATATTTTG GATCATGGAA     12000
AAAATTGGCT CAATATGTGG AGATAAATTA ATATGTCTGC ATAAAGATGA TGCAGTGATT     12060
GCTCAGGAAA AATTATTTAT TCATAAGAAT AAAATTTCCA TAATTGAAAA TGGCGTCGAC     12120
ACTAACAAAT TCAAGAAGAG AAATAATAAT GAAATAGATA AATTATCTAC ATATTTTAAC     12180
ATAGATAGAA ATTCGGATGT TGTGGTCGGG ATGATAGGTA GACTGTGGCC ACAAAAAAAC     12240
CCCATGCTTT TATTATATGC AGCAAAAAAT ATAATCAACA ATAATAAAAG AGTAAAATTC     12300
TTGTTTGTCG GCGATGGTGA GTTAAAAGAC TCAATGAACG ATTATATTAT TCAAAATAAA     12360
CTTACCCAGA ATATTACCAT TTGTGGCTGG TGTAATGATG TTAGTTCTTA TTTGAATATA     12420
TTTGATATTT TTGTATTACC ATCTTTATGG GAGGGTATGC CTTTGGCAAT TTTAGAAGCC     12480
GAAAGTAGTT CGTTGCCCTG TATTGTTTCA AATATCCCGG GAAACAGGAG TATAATCAGG     12540
CATACAGTTG ATGGCTATCT CTTTTCATTA GATAACCCAT CTGAACTTGA ATCTTACATT     12600
AATATATTAA TTGAGGATAA AGAAAGACGT ATTATCTTGG GTAATAACGC CAGAGTCAAA     12660
ATTCTTGAAA GCTATAAAAT AGAAAATAGG ATTTTGAAAT TAGATGAACT GTATAGTTCA     12720
               Orf11的终止         Orf12的起始
ATTTCTTTAA AAGAA TAGCG TTGTATGTTG AGGGGAT ATG CGGATAAAAA TACTCGACCA 12780
TATGAAAGGT GCTGCTATTT TAGCTGTGGT ATTTATTCAT TCTTCAGGTT ATCTTGCTGT     12840
TTCTAATATA GGAACATTTG AATGGTACAT CGGTATAATA TCGCGGCAAT TTGTTAATTT     12900
TGCAGTGCCT ATTTTTTTAT TTATATCTGG TTTTTTATCT TTTTCTCGAG ATATACATGA     12960
TACACCATAC TATCTCAAGA AAAAATTATT AAGAATTATT ATACCTTATC TCTCATGGTC     13020
TTGTTTTTAC TTCTTTCTTG TATTCATATT TAATAACCAA AGTTTCGCTG TCAAAAATAT     13080
TATAGCTCAG TTGATTCTTG GTACGGGAAT AGGTGTGGGA TATTTTGTGA TCGTTTTAGT     13140
GCAATTTATT ATGCTGACAC CGTTAATTAA TGCGATTACA TCTATAAAAA TACATATTAT     13200
GATTATATGT GGTTTTACTA TCATAGGTGT GGGGATTAAT TATATGTCTG TGAAGATTGA     13260
TTGCTTGAAA CTGTTTTCAC AGTTTCCTTA TTCCGCCATT CCTTTTTTTG TATGGTATCC     13320
TTTTTATCAT TTGGGCTTTG TTTTCAATAA GTATAATATA TCTTGTTCAA AGTGGTCTAA     13380
TAGTTCCATC TTATTTTGGA TTTTATCTTT TTCACTTACA TTAGCCATTT CTGAAGGGAT     13440
ATTTTGGGGT TATACTGGGA ACTATTCATT TGCTGTGTCT CAACTTAAAC TATCATCTTT     13500
GGTTCTCTCT TTATGCGTTT GTATGGTTGT TTATTTTTAT CTAAACCATG ATATAAATTA     13560
TAAATACCTT TCTCAATTAG GGACAATGTC CTACGGGATT TATCTTACTC ATATGTTGTT     13620
TGTTTGGTTC TATCATTATC TCTTTTCGTA TACGAGTGTG TTTATAAGGC ATTTAGTTAT     13680
CTCGTGTGGC TTTATCTTTA TATTAAGTAC AATATCATCA GTTACCTTAG TTTTTTTTAT    13740
                                        Orf12的终止
AAGAAAAATT TTGGGGAGAT ATTCCGTATA TATTGTAGGG  TAGGTGATTG CTTGATATTT  13800
ATACTGTTTT AAGAAGAAGC CTAATTTATC TCAATACTGG GCATTTCACT AGAGCTGTAT    13860
TAGTATATTT GTCACATTCT CATCCGTATT TCTAATGTAT TTTTCAGAGC AGGAGACTTA    13920
AATGTCAAAG CAACAGATCG GCGTCGTCGG TATGGCAGTG ATGGGGCGCA ACCTTGCGCT    13980
CAACATCGAA AGCCGTGGTT ATACCGTCTC TATTTTCAAC CGTTCCCGTG AAAAGACGGA    14040
AGAAGTGATT GCCGAAAATC CAGGCAAAAA ACTGGTTCCT TACTATACGG TGAAAGAGTT    14100
TGTTGAATCT CTGGAAACGC CTCGTCGCAT CCTGTTAATG GTGAAAGCAG GTGCAGGCAC    14160
GGATGCTGCT ATTGATTCCC TCAAACCATA TCTCGATAAA GGCGACATCA TCATTGATGG    14220
TGGTAATACC TTCTTCCAGG ACACCATTCG TCGTAATCGT GAGCTTTCTG CAGAAGGTTT    14280
TAACTTCATT GGTACCGGTG TTTCCGGCGG TGAAGAAGGT GCGCTGAAAG GTCCTTCCAT    14340
TATGCCTGGT GGGCAGAAAG AAGCCTATGA ACTTGTTGCG CCGATCCTGA CCAAAATCGC    14400
CGCAGTGGCT GAAGACGGGG AGCCATGCGT TACCTATATT GGTGCCGATG GTGCAGGTCA    14460
CTATGTGAAG ATGGTTCACA ACGGTATTGA ATACGGTGAT ATGCAGCTGA TTGCTGAAGC    14520
CTATTCTCTC CTGAAAGGCG GCCTGAATCT CTCTAACGAA GAACTGGCAC AGACCTTTAC    14580
CGAGTGGAAT AACGGTGAAC TGAGTAGCTA CCTGATCGAC ATCACCAAAG ATATCTTCAC    14640
CAAAAAAGAT GAAGACGGTA ACTACCTGGT TGATGTGATT CTGGATGAAG CCGCTAACAA    14700
AGGTACCGGT AAATGGACCA GCCAAAGTGC GCTGGATCTC GGCGAACCGC TGTCGCTGAT    14760
TACCGAGTCT GTGTTTGCAC GTTATATATC TTCTTTGAAA GATCAGCGTG TTGCCGCCTC    14820
TAAAGTACTG TCTGGTCCGC AAGGACAGCC AGCAGGCGAC AAAGCTGAGT TCATTGAAAA    14880
AGTTCGCCGT GCGCTGTATT TGGGCAAAAT CGTTTCTTAC GCCCAGGGCT TCTCTCAGCT    14940
GCGTGCGGCG TCTGAAGAGT ACAACTGGGA TCTGAACTAC GGCGAAATCG CGAAAATTTT    15000
CCGTGCTGGC TGTATTATCC GTGCGCAGTT CCTGCAGAAA ATCACCGATG CTTATGCCGA    15060
AAATCCGCAG ATCGCTAACC TGCTGCTGGC TCCGTACTTC AAGCAAATTG CCGATGACTA    15120
CCAGCAGGCG CTGCGTGATG TCGTTGCTTA TGCAGTACAG AACGGTATCC CGGTTCCGAC    15180
CTTCGCCGCT GCGGTTGCCT ATTATGACAG CTACCGTGCC GCTGTTCTGC CTGCGAACCT    15240
GATCCAGG                                                             15248
以上仅是本发明较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡依本发明技术实 质对以上实施例作修改、等同变化与修饰，均属本发明技术方案的范围内。