技术领域
[0001] 本
发明涉及环境自由基过氧化能力评价的电化学
传感器阵列制作方法。
背景技术
[0002] 环境持久性自由基是一类新型的环境
风险物质，并具有较高的反应活性。
生物机体危害性强。EPFRs是相对传统关注的短寿命自由基而提出的，指在环境中存在数十分钟到几个小时，具有顺磁
稳定性，可以诱发生物系统更多的氧化应激的有机物。在热带亚热带
土壤中过渡金属元素
铁含量丰富，而且该区域日照时间长，紫外线强烈，易激发产生EPFR。有学者观察到在红壤中
吸附的
苯酚类物质在日光照射下，可产生寿命长达5d的EPFRs，可能从固体颗粒上解离下来成为游离的自由基，通过径流和淋溶下渗等污染地表
水和
地下水等。生物细胞的各种膜相结构都含有丰富的不饱和
脂肪酸，极易受自由基的攻击，引起脂质过氧化(lipidperoxidation，LP)链式反应。EPFRs 极强的氧化能力可诱导生物体内多种脂质过氧化损伤，例如
生物膜的脂质过氧化，导体生物体的损伤，甚至可能是癌症诱因之一。
[0003] 目前国内外研究EPFRs的主要方法是
电子顺
磁性共振(EPR)和低温基质隔离，
电子顺磁共振(LTMI-EPR)等，EPR谱可以证明自由基的存在、分子结构等方面的信息，并通过检测EPR
信号的存在时间，而得的EPFRs
半衰期。利用脂质过氧化物(LPO)的
光谱分析法是广泛报道的药物、食品自由基和脂质过氧化损伤的测定方法，但用于环境自由基过氧化的测定未见发现。电子
顺磁性共振具有设备昂贵、使用成本高、检测条件苛刻等不足，难于普及，且不能对现场进行适时测定，更缺乏自由基过氧化能力的评价方法，制约了环境持久性自由基的研究、监测和治理。国内较少开展环境持久性自由基的监测和研究工作。因此，研究新型环境自由基的现场测定方法技术、尤其是发展自由基过氧化能力的评价方法具有重要价值。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种环境自由基过氧化能力的测定方法，针对现有环境自由基检测技术方法的不足，提供一种可利用常规分析仪器和常规材料、制备简单、成本较低、易于普及、可现场应用的环境持久性自由基过氧化能力和持久性评价方法；也提供了提供一种用于现场测定环境持久性自由基过氧化能力的新型仿生膜电化学丝网印刷
电极传感阵列的制作方法。
[0005] 针对上述目的，本发明提供一种环境自由基过氧化能力评价的电化学传感器阵列制作方法，所述测定方法包括：
[0006] (1)取市售包含有直径3mm
碳基
工作电极、碳基
对电极和氯化
银参比电极的丝网印刷电极，将一定量的碳
纳米材料超声分散液滴涂于丝网印刷电极的工作电极上，烘干，制得碳纳米基电极；
[0007] (2)在上述碳纳米基电极表面滴涂4.5-5.5μL浓度为10mg/mL 卵磷脂和4.5-5.5μL浓度为5mg/mL胆固醇环己烷，避光
真空干器 1-1.5h，干燥后置于0.1mol/LKCl溶液中，-0.2-1.0V电位范围以循环
伏安法扫描至稳定，自然干燥，制得仿生膜电极单元，置于真空袋中，抽真空，4℃保存；
[0008] (3)在供试污染土壤中加入淋洗液，并置于阳光下照射反应，停止光照，取上清液置比色管中，其中，收集当地降水为淋洗液，在 200.0g供试污染土壤中加入200.0mL淋洗液，使用翻转
振荡器振荡 4h，取出转移到1000mL烧杯，置于正午阳光下照射反应6h诱导自由基发生，停止光照，分取10mL上清液于8只25mL比色管中，所述比色管中供试液于具塞、分别放置一定时间，并设置1只未浸取土壤的淋洗液空白管，加入2mL pH＝7.4的0.75mol/L的0.75mol/L NaH2PO4和0.75mol/L Na2HPO4PBS缓冲液，所述双层磷脂膜丝网印刷电极单元，并加入2-3mL浓度为0.75mol/L的NaH2PO4和2-3mL浓度为 0.75mol/L的Na2HPO4缓冲液；放入步骤(1)所述碳纳米基电极，具塞于37.5℃恒温孵育使电极单元双层磷脂膜脂质过氧化20-
30min，将电极单元取出少量离子交换水冲洗，待测定；
[0009] (4)将碳纳米基电极接通电化学工作站，置于
电解杯中加入 1-2mL电化学探针溶液和9-10mL浓度为0.1mol/L的KCl溶液，以电化学方法测定电化学探针在自由基暴露电极单元的电化学响应；
[0010] (5)环境自由基持久性评价，计算不同放置时间的脂质过氧化残留率，脂质过氧化残留率: ，式中，P为脂质过氧化残留率(％)， i0、it和ib分别为放置时间为0、放置t时刻和空白样中电化学探针的
电流值，以P随时间的变化评价环境自由基持久性。
[0011] 优选地，所述碳纳米材料为具有羟基或羧基官能团的单壁、多壁碳
纳米管、还原
石墨烯、或者所述
碳纳米管和
石墨烯的混合物。
[0012] 优选地，所述碳纳米材料在使用前需进行超声分散，超声时间 240-300min。
[0013] 优选地，步骤(2)中
循环伏安法扫描的条件为：扫描速度为 50-60mv/s，
采样间隔为10-12mv。
[0014] 优选地，步骤(1)中烘干
温度为100-105℃。
[0015] 优选地，步骤(3)中阳光下照射反应的时间为5-7h。
附图说明
[0016] 图1为本发明中碳纳米管-磷脂双层膜平台上磷脂双层膜对环境自由基响应过程；
[0017] 图2为本发明中环境自由基传感阵列原理图。
[0018] 具体施方式
[0019] 下面将结合本发明
实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围
[0020] 请参阅图1-2，本实用新型提供一种技术方案：包括环境自由基脂质过氧化测定的电极单元及电化学体系、用于评价环境自由基持久性系的传感器阵列。本发明环境自由基脂质过氧化测定的丝网印刷电极单元及电化学体系构成和工作原理参见发明原理图1。所述环境自由基脂质过氧化测定的电极单元及电化学体系包括环境自由基发生体系、在碳纳米材料上构建的自组装仿生双层磷脂膜电极单元及电化学测定体系。环境自由基通常是环境溶液中的
金属离子与某些有机污染物在阳
光激发下产生的结果，因此，环境自由基发生体系包括污染环境溶液体系及光照条件。电化学测定体系包括亲水的电化学探针及多种电化学分析方法。本发明电极单元的工作原理是完好的仿生双层磷脂膜阻碍了亲水的电化学探针到达电极单元表面发生电化学反应，当电极单元暴露于阳光照射的污染溶液诱导环境自由基反应，产生的自由基可对电极单元的仿生膜造成过脂质过氧化损伤，导致膜破损产生空隙，为电化学亲水性探针提供了到达电极表面产生电化学反应的通道，由此产生电化学响应，可据电化学响应强弱评价土壤自由基脂质过氧化能力。所述环境自由基持久性评价传感器阵列构成和工作原理参见发明原理图2，包括由若干前述测定自由基脂质过氧化的电极单元组成。污染溶液体系在光照条件下产生自由基，停止光照并分离以中止自由基发生反应，环境自由基随着放置时间衰减，以传感器阵列中的各电极单元分别测定上清液的脂质过氧化随时间的残留水平，以此评价环境自由基持久性。
[0021] 本发明提供了一种环境自由基过氧化能力的测定方法，本发明克服
现有技术的不足，提供一种环境自由基脂质过氧化测定的电化学传感器阵列，以及快速简单、成本较低、易于普及、可现场应用的环境持久性自由基过氧化能力和持久性评价方法。本发明的新颖性在于，尽管双层磷脂膜仿生膜传感器一直是当前在医学生物最活跃的前沿领域，但本发明所述用于现场环境自由基过氧化能力的测定的仿生膜电化学传感阵列和电化学方法却没有什么发现。
[0022] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)所述传感器阵列使用常规的方法和材料制备，使用低成本小型电化学分析仪器，普通实验室均可应用本发明开展环境持久自由基的研究工作。(2)所述传感器阵列基于环境自由基发生体系设计，仿生双层磷脂膜界面反应更接近真实生物膜的自由基脂质过氧化，碳纳米材料基体对测定具有明显催化增敏效应。(3)采用传感器阵列设计可测定环境自由基的脂质过氧化随时间的残留水平，实现环境自由基持久性评价。(4)所述传感器阵列使用市售丝网印刷电极的简单加工，可批量生产，可实现环境自由基的高通量高筛选。
[0023] 图1中：a1～a3是非环境自由基暴露电极示意、电极表面结构的扫描电镜(SEM)及循环
伏安图，b1～b3是环境自由暴露电极示意、电极表面结构的扫描电镜(SEM)及循环伏安图；从图可以看出，非环境自由基暴露电极电极表面结构完整(a2)，阻碍探针
试剂接触电极纳米层(a1)，几乎不产生电化学响应(a3)，环境自由基暴露后电极表面出现过氧化损伤(b2)，为探针试剂抵触电极纳米层提供通道(b1)，从而产生灵敏的电化学响应(b3)。
[0024] 图2中：境自由基持久性评价传感器阵列包括由若干前述测定环境自由基的电极单元组成。污染溶液体系在光照条件下产生自由基，停止光照并分离以中止自由基发生反应，环境自由基随着放置时间衰减，以传感器阵列中的各电极单元分别测定上清液的过氧化能力随时间的残留水平，以此评价环持久性境自由基。
[0025] 下面结合附图详细说明本发明的优选实施方式。
[0026] 实施例1
[0027] 将碳纳米材料涂覆于丝网印刷电极，烘干制得碳纳米基电极；在上述碳纳米基电极表面滴涂4.5μL浓度为10mg/mL卵磷脂和4.5μL浓度为5mg/mL胆固醇环己烷，避光真空干器1h，干燥后置于 0.1mol/LKCl溶液中，-0.2V电位范围以循环伏安法扫描至稳定，待干燥后置于真空袋中，抽真空，4℃保存；在供试污染土壤中加入淋洗液，并置于阳光下照射反应，停止光照，取上清液置比色管中，并加入2mL浓度为0.75mol/L的NaH2PO4和2mL浓度为0.75mol/L的 Na2HPO4缓冲液；放入所述碳纳米基电极，具塞于37.5℃恒温孵育使电极单元双层磷脂膜脂质过氧化20min，将电极单元取出少量离子交换水冲洗，待测定；将碳纳米基电极接通电化学工作站，置于电解杯中加入1mL电化学探针溶液和9mL浓度为0.1mol/L的KCl溶液，以电化学方法测定电化学探针在自由基暴露电极单元的电化学响应。
[0028] 实施例2
[0029] 将碳纳米材料涂覆于丝网印刷电极，烘干制得碳纳米基电极；在上述碳纳米基电极表面滴涂5.5μL浓度为10mg/mL卵磷脂和5.5μL浓度为5mg/mL胆固醇环己烷，避光真空干器1.5h，干燥后置于 0.1mol/LKCl溶液中，1.0V电位范围以循环伏安法扫描至稳定，待干燥后置于真空袋中，抽真空，4℃保存；在供试污染土壤中加入淋洗液，并置于阳光下照射反应，停止光照，取上清液置比色管中，并加入3mL浓度为0.75mol/L的NaH2PO4和3mL浓度为0.75mol/L的Na2HPO4缓冲液；放入所述碳纳米基电极，具塞于37.5℃恒温孵育使电极单元双层磷脂膜脂质过氧化30min，将电极单元取出少量离子交换水冲洗，待测定；将碳纳米基电极接通电化学工作站，置于电解杯中加入 2mL电化学探针溶液和10mL浓度为0.1mol/L的KCl溶液，以电化学方法测定电化学探针在自由基暴露电极单元的电化学响应。
[0030] 实施例3
[0031] 将碳纳米材料涂覆于丝网印刷电极，烘干制得碳纳米基电极；在上述碳纳米基电极表面滴涂5μL浓度为10mg/mL卵磷脂和5μL浓度为 5mg/mL胆固醇环己烷，避光真空干器1.2h，干燥后置于0.1mol/LKCl 溶液中，0.5V电位范围以循环伏安法扫描至稳定，待干燥后置于真空袋中，抽真空，4℃保存；在供试污染土壤中加入淋洗液，并置于阳光下照射反应，停止光照，取上清液置比色管中，并加入2.5mL浓度为0.75mol/L的NaH2PO4和2.5mL浓度为
0.75mol/L的Na2HPO4缓冲液；放入所述碳纳米基电极，具塞于37.5℃恒温孵育使电极单元双层磷脂膜脂质过氧化25min，将电极单元取出少量离子交换水冲洗，待测定；将碳纳米基电极接通电化学工作站，置于电解杯中加入1.5mL 电化学探针溶液和9.5mL浓度为0.1mol/L的KCl溶液，以电化学方法测定电化学探针在自由基暴露电极单元的电化学响应。
[0032] 以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干
变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
