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寡肽以及生产寡肽缀合物的方法

阅读：563发布：2022-09-03

专利汇可以提供寡肽以及生产寡肽缀合物的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及寡肽及其缀合物。本发明还涉及这些寡肽缀合物用于治疗或诊断由淀粉样蛋白β沉积所介导的疾病的用途。最后，本发明还涉及用于获得偶联有兴趣物质的寡肽(功能性缀合物)的偶联方法。，下面是寡肽以及生产寡肽缀合物的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种寡肽，其式为P-C-Z或者Z-C-P,其中：
P是8至800个氨基酸的肽，所述P不含有还原的半胱氨酸残基，
C是半胱氨酸残基，
Z代表1至10个氨基酸的间隔序列，优选1至10个中性的或带负电的氨基酸的间隔序列，其中Z的所述氨基酸残基是相同的或不同的，并且其中Z不含半胱氨酸残基，特征在于所述半胱氨酸残基C通过带有所述感兴趣的物质的式(I)所示的马来酰亚胺化合物连接至感兴趣的物质：

其中：
-B、B’1、B’2和B”是相同的或不同的，其各自独立地是选自以下的单键或间隔序列：多元醇，比如聚乙二醇(PEG)，其优选具有2至12个氧乙烯(OE)单元；聚烯烃，其优选具有2至12个芳香环；聚烷基，其优选具有2至12个碳原子；乙烯基聚合物，比如聚(甲基丙烯酸烷基酯)，其优选具有2至12个甲基丙烯酸基团；聚醛，其优选具有2至12个羰基；聚酸酯，其优选具有2至12个酯基，
-D、D’和D”是相同的或不同的，其各自独立地是选自胺、酰胺、氨基醇、尿素、硫脲、氨基甲酸酯、碳酸酯、酯、醚、硫醚、芳基、杂芳基如三唑、肟基，
-A是单键或者螯合剂，
-SI是感兴趣的物质，
-X’是酸、胺、酰胺、酯、醚、烷基、烯基、炔基、芳基或者杂芳基官能团，以及-n＝1至100，优选地n＝1、2或者3。
2.根据权利要求1所述的寡肽，其特征在于Z由2个氨基酸的序列组成，优选由氨基酸序列S-A或者S-V组成。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的寡肽，其特征在于P包含肽P’，所述肽P’选自：骆骆驼科重链抗体的可变结构域(VHH)、常规抗体的Fab、F(ab)’2、Fv或者scFv片段、免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)、nanofitin、DARPin、anticalin、亲合体、affilin、avimer、单体和库尼茨结构域。
4.根据权利要求1至3任一项所述的寡肽，其特征在于式P-C-Z所示寡肽的所述氨基酸肽P在其C端有1至10个氨基酸的间隔序列Y，或者式Z-C-P所示寡肽的所述氨基酸肽P在其N端有1至10个氨基酸的间隔序列Y，其中所述氨基酸间隔序列Y的氨基酸残基是相同的或是不同的，以及其中所述氨基酸间隔序列Y不含半胱氨酸残基。
5.根据权利要求4所述的寡肽，其特征在于Y代表4个中性氨基酸的间隔序列，比如氨基酸序列G-G-G-S(SEQ ID NO.11)。
6.根据权利要求1至5任一项所述的寡肽，其特征在于式P-C-Z所示寡肽的所述氨基酸肽P在其N端有1至50个氨基酸的序列X，或者式Z-C-P所示寡肽的所述氨基酸肽P在其C端有1至50个氨基酸的序列X，其中所述氨基酸序列X的氨基酸残基是相同的或是不同的，以及其中所述氨基酸序列X不含半胱氨酸残基。
7.根据权利要求6所述的寡肽，其特征在于X包含标签和酶切位点，所述标签比如6×His标签(SEQ ID NO.9)，所述酶切位点比如氨基酸序列LVPRGS(SEQ ID NO.10)所示的凝血酶切位点。
8.根据权利要求3至7任一项所述的寡肽，其特征在于所述肽P’是VHH，以及所述寡肽的式是VHH-C-Z、VHH-Y-C-Z、X-VHH-C-Z、X-VHH-Y-C-Z、Z-C-VHH、Z-C-Y-VHH、Z-C-VHH-X或者Z-C-Y-VHH-X。
9.根据权利要求1至8任一项所述的寡肽，其特征在于所述感兴趣的物质是诊断化合物，优选所述诊断化合物选自：酶、荧光团、NMR或者MRI造影剂、放射性同位素和纳米颗粒。
10.根据权利要求9所述的寡肽，其特征在于所述诊断化合物是NMR或者MRI造影剂，所述NMR或者MRI造影剂选自：顺磁剂钆(Gd)、镝(Dy)和锰(Mn)、以及基于铁氧化物或铂铁的超顺磁剂、以及X-核比如18F、13C、23Na、17O、15N。
11.根据权利要求1至8任一项所述的寡肽，其特征在于所述感兴趣的物质是治疗化合物，所述治疗化合物选自：肽、酶、核酸、病毒和化学实体。
12.根据权利要求1至11任一项所述的寡肽，其特征在于式(I)所示马来酰亚胺化合物中的A是螯合剂，以及所述感兴趣的物质SI是NMR或者MRI造影剂。
13.根据权利要求1至12任一项所述的寡肽，其特征在于式(I)所示马来酰亚胺化合物的所述螯合剂A选自：1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)、1,4,7-三(羧甲基氮杂)环十二烷-10-氮杂乙酰胺(DO3A)、次氮基三乙酸(NTA)、D-青霉胺(Pen)、2,3-二巯基丁二酸(DMSA)、2,3-二巯基-1-丙磺酸(DMPS)、2,3-二巯基丙醇(BAL)、三乙烯四胺(Trien)、四硫代钼酸铵(TTM)阴离子、乙二胺四乙酸(EDTA)、2-(p-异硫氰酰苄基)-6-甲基-二乙三胺五乙酸(IB4M)或羟基吡啶酮(HOPO)。
14.根据权利要求1至13任一项所述的寡肽，其特征在于所述感兴趣的物质SI是钆(Gd)，以及所述螯合剂A是DOTA。
15.根据权利要求1至14任一项所述的寡肽，其特征在于所述马来酰亚胺化合物是式(I’)所示：

其中，B、B’1、B’2、B”、A、SI以及n是权利要求1和9至14中所限定的。
16.一种马来酰亚胺化合物，其特征在于是式(I’)所示：

其中，B、B’1、B’2、B”、A、SI以及n是权利要求1和9至14中所限定的。
17.权利要求9或10所述的寡肽作为诊断剂的用途。
18.权利要求11所述的寡肽作为治疗剂的用途。
19.位点特异性方法，所述方法用于偶联感兴趣的物质与式P-C-Z或Z-C-P所示的寡肽，其中：
P是8至800个氨基酸的肽，所述P不含有还原的半胱氨酸残基，
C是半胱氨酸残基，
Z代表1至10个氨基酸的间隔序列，优选1至10个中性的或带负电的氨基酸的间隔序列，其中Z的氨基酸残基是相同的或不同的，并且其中Z不含半胱氨酸残基，
特征在于，所述方法包括权利要求1和9至16中所限定的寡肽和式(I)所示马来酰亚胺化合物之间的缀合步骤。
20.根据权利要求19所述的位点特异性方法，其特征在于所述的缀合步骤是在范围4至
7.5的pH下进行的，优选在PBS/NaCl/咪唑缓冲液中进行。
21.根据权利要求19或20所述的位点特异性方法，其特征在于Z由2个氨基酸的序列组成，优选由氨基酸序列S-A或者S-V组成。
22.根据权利要求19至21所述的位点特异性方法，其特征在于P包含肽P’，所述肽P’选自：骆骆驼科重链抗体的可变结构域(VHH)、常规抗体的Fab、F(ab)’2、Fv或者scFv片段、免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)、nanofitin、DARPin、anticalin、亲合体、affilin、avimer、单体和库尼茨结构域。
23.根据权利要求19至22任一项所述的位点特异性方法，其特征在于式P-C-Z所示寡肽的所述氨基酸肽P在其C端有1至10个氨基酸的间隔序列Y，或者式Z-C-P所示寡肽的所述氨基酸肽P在其N端有1至10个氨基酸的间隔序列Y，其中所述氨基酸间隔序列Y的氨基酸残基是相同的或是不同的，以及其中所述氨基酸间隔序列Y不含半胱氨酸残基。
24.根据权利要求23所述的位点特异性方法，其特征在于Y代表4个中性氨基酸的间隔序列，比如氨基酸序列G-G-G-S(SEQ ID NO.11)。
25.根据权利要求19至24任一项所述的位点特异性方法，其特征在于式P-C-Z所示寡肽的所述氨基酸肽P在其N端有1至50个氨基酸的序列X，或者式Z-C-P所示寡肽的所述氨基酸肽P在其C端有1至50个氨基酸的序列X，其中所述氨基酸序列X的氨基酸残基是相同的或是不同的，以及其中所述氨基酸序列X不含半胱氨酸残基。
26.根据权利要求25所述的位点特异性方法，其特征在于X包含标签和酶切位点，所述标签比如6×His标签(SEQ ID NO.9)，所述酶切位点比如氨基酸序列LVPRGS(SEQ ID NO.10)所示的凝血酶切位点。
27.根据权利要求19至26任一项所述的位点特异性方法，其特征在于所述肽P’是VHH，以及所述寡肽的式是VHH-C-Z、VHH-Y-C-Z、X-VHH-C-Z、X-VHH-Y-C-Z、Z-C-VHH、Z-C-Y-VHH、Z-C-VHH-X或者Z-C-Y-VHH-X。
28.根据权利要求19至27所述的位点特异性方法，其特征在于所述感兴趣的物质SI是权利要求9至11中所限定的。
29.一种带有半胱氨酸残基的寡肽，所述半胱氨酸残基通过式(I)所示的马来酰亚胺化合物连接至感兴趣的物质，其特征在于所述寡肽是根据权利要求19至28任一项所述的位点特异性方法获得的。
30.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1至15所限定的寡肽。
31.一种重组表达盒，其包含在转录启动子的控制下的权利要求30所述的多核苷酸，所述转录启动子允许在宿主细胞中调节所述多核苷酸的转录。
32.一种重组载体，其包含权利要求30所述的多核苷酸或者权利要求31所述的重组表达盒。
33.一种宿主细胞，其包含权利要求31所述的重组表达盒或者权利要求32所述的重组载体。
34.一种试剂盒，其包含权利要求1至15所限定的寡肽以及感兴趣的物质。

说明书全文

寡肽以及生产寡肽缀合物的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及针对淀粉样蛋白β的抗体及其缀合物。本发明还涉及这些抗体缀合物治疗或者诊断由淀粉样蛋白β沉积所介导的疾病的用途。最后，本发明还涉及获得偶联有感兴趣的物质的VHH(功能缀合物)的偶联方法，以及更通常地，涉及偶联有感兴趣的物质的寡肽。

[0002] 所有痴呆症病例的约70％是由于阿尔茨海默氏病(AD)，它与对认知重要的脑区和神经回路的选择性损伤相关。阿尔茨海默氏病的特征是神经纤维缠结，尤其是在海马的锥
体神经元中，以及大量的主要含有淀粉样蛋白沉积的致密核心和漫射晕的淀粉样蛋白斑
块。

[0003] 细胞外神经炎性斑块含有大量占主要地位的纤维状肽称为“淀粉样蛋白β”、“A-β”、“淀粉样蛋白P”、“AP4”、“Aβ”、“βA4”、“P-A4”或者“AP”；参见Selkoe(1994),Ann.Rev.Cell Biol.10,373-403；Koo(1999),PNAS 96卷,pp.9989-9990；US 4,666,829或者Glenner(1984),BBRC 12,1131。这种β淀粉样蛋白源自“阿尔茨海默前体蛋白/β-淀粉样蛋白前体蛋白”(APP)。APP是完整的膜糖蛋白(参见Sisodia(1992)PNAS卷89,pp.6075)并且通过质膜蛋白酶α分泌酶在Aβ序列内被内蛋白水解(endoproteolytically)切割。其它分泌酶活性，特别是β分泌酶和γ分泌酶活性导致淀粉样蛋白β的胞外释放，其中包含不同大小的蛋白，比如39个氨基酸(Aβ39)、40个氨基酸(Aβ40)、42个氨基酸(Aβ42)或43个氨基酸(Aβ
43)；参见Sinha(1999),PNAS 96,11094-1053；Price(1998),Science 282,1078-1083；WO
00/72880或者Hardy(1997),TINS 20,154。注意到Aβ具有若干天然存在的形式，由此人的形式被称为上述的Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42和Aβ43。形式Aβ42具有氨基酸序列(从N端开始)：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID NO.12)。在Aβ41、Aβ40、Aβ39中，分别缺失C端氨基酸A、IA和VIA。在Aβ43的形成中，额外的苏氨酸残基被包含在上述序列的C端(SEQ ID NO.12)。APP基因的突变可导致Aβ序列的修饰和聚集的Aβ积累增加。

[0004] 这些细胞外神经炎斑块的主要成分是水溶形式的Aβ40或者Aβ42。然而，最初的焦点在于将水不溶的纤维状淀粉样蛋白作为AD病理学的中心结构，这在过去15年中得以发展。这是由于几个突出的发现，比如，在人类大脑中发现寡聚Aβ的水溶性级分(Kuo Y.M.等人,1996,J Biol Chem,271,4077-81)。这些分离的可溶性寡聚物对培养的神经元是有毒
的。然后，确认了寡聚Aβ的存在和毒性，并提出了这些结构的名称ADDL(Aβ衍生的扩散配体)(Lambert M.P.等人,1998,Proc Natl Acad Sci U.S.A.,95,6448-53)。根据条件，ADDL组
合物可以主要包含三聚体-六聚体，较大的结构高达24聚体。ADDL显示重要的区域选择性神经毒性，幸免了小脑中的神经元，而选择性杀死海马CA1区和内嗅皮质的神经元(Klein
W.L.等人,2001,Trends in Neurosciences,24,219-224)。此外，寡聚物能够在大鼠体内
(Walsh D.M.等人,2002,Nature,416,535-9)以及在海马切片中(Wang H.W.等人,2002,
Brain Res.,924,133-40；Wang Q.等人,2004,J Neurosci.,24,3370-8)抑制海马的长时程
增强(LTP)。已经表明，认知缺陷直接归因于少量可溶寡聚形式的淀粉样蛋白β；三聚体，以及在更小的程度上，二聚体和四聚体尤其活跃(Cleary J.P.等人,2005,Nat Neurosc.,8,
79-84；Townsend M.等人,2006,J Physiol,572,477-92)。

[0005] 在阿尔茨海默氏病发作之前很长一段时间(最长30年)就已出现淀粉样蛋白斑块(Sperling R.A.,2011,Alzheimer's and Dementia,7:280-92；Villemagne V.L.,2013,
Lancet Neurol.,12:357-67)并且根据淀粉样蛋白级联假说，淀粉样蛋白负责导致AD所有
损害的事件的级联(Hardy J.A.,1992,Science,256:184-5)。因而，淀粉样蛋白的早期检测对于阿尔茨海默氏病的随访及其治疗是重要的。淀粉样蛋白斑块的成像对在动物模型中筛
选新药也是重要的。

[0006] 淀粉样蛋白沉积也和血管病变(淀粉样蛋白血管病)有关。在其它疾病例如唐氏综合征的过程中，淀粉样蛋白以类似的形式积累。

[0007] 已开发几种方法用以检测淀粉样蛋白疾病的病变，特别是阿尔茨海默氏病。迄今为止，在人体中，应用最广泛的方法是基于正电子发射断层扫描(PET)成像。例如，可以在患
11
者体内评价淀粉样蛋白的负荷，但在动物中使用PET放射性配体如 C-PIB(Klunk W.E.,
2004,Ann Neurol.,55:306-19)或18F-AV-45(Doraiswamy P.M.,2012,Neurology,79:1636-
44)则更加困难。对化合物进行放射性标记的需要是基于PET的方法的主要缺点。在人类中，这会导致暴露于电离辐射。在临床前研究中，因为只有有限数量的中心允许操纵放射性化
11
合物，PET检查不能用于新药大规模的评估和用于常规诊断。此外，同位素如 C(20分钟)的半衰期短，当使用基于11C的配体比如PIB时，需要在现场有一个回旋加速器。基于18F的配体具有更长的半衰期(110分钟)，但这种半衰期仍然相对较短。这需要强大的有关放射性示踪物的供应、处理和管理后勤，放射性示踪物的保质期有限，需要谨慎的部署。此外，PET成像分辨率低，妨碍其在小的脑尺寸AD动物模型中用于常规临床前研究中的应用。综上所述，可以说，应找到在患者和在疾病的动物模型中在体内AD和唐氏综合征脑部病变中没有延迟成
像的新替代物。

[0008] 除了PET成像，核磁共振(NMR)成像或者磁共振成像(MRI)也可用于检测AD脑病变。在过去十年中，已经做了很多努力来开发能够通过MRI进行斑块检测的新方法。无造影剂的规程允许观察淀粉样蛋白斑块内由于循环铁自然发生的沉积而导致的一些Aβ沉积。然而，在淀粉样蛋白沉积中的铁积累在人体中较低(Dhenain M.,2002,NMR Biomed.,15:197-
203)，并且只发生在疾病晚期阶段或者小鼠局灶性脑区(Dhenain M.,2009,Neurobiol
Aging 30:41-53)。有几个规程都是基于采用特定的造影剂。比如，一些小组开发了使用Aβ衍生肽的造影剂，其磁性标记有钆(Gd)或单晶硅铁氧化物纳米颗粒(MION)(Wadghiri,
Y.Z.,2003,Magn Reson Med.,50:293-302；Poduslo,J.F.,2002,Neurobiol Dis.,11:315-
329)。用这些方法已经实现了离体和体内检测，但仍需要穿透血脑屏障(BBB)，不能以高效且再现的形式进行，并且可能是有害的(例如，使用甘露醇瞬时打开血脑屏障)。因此，这些方法受到必须打开血脑屏障的困扰，因此未在非实验的情况下使用过。借助靶向淀粉样蛋
白斑块的抗体，其它小组开发的方法靶向淀粉样蛋白(Ramakrishnan,M.,2008,Pharm
Res.,25:1861-1872)。最近通过MRI检测淀粉样蛋白斑块的方法基于使用小抗体片段，其中的小抗体片段展示出增加的穿过BBB的潜能(多胺修饰的Fab片段)并且靶向淀粉样蛋白斑
块。这些抗体连接至造影团(contrastophore)，从而允许通过MRI对其检测(Ramakrishnan,M.,2008,Pharm Res.,25:1861-1872)。然而，抗体像其它大的血浆蛋白一样，如白蛋白，不容易穿过BBB，其通常保持只局限于循环的血浆部分中。增强抗体分子穿过BBB的递送的一
个潜在机制是阳离子化，其中表面的羧基缀合有伯氨基，而抗体的等电点(pI)被提高
(Bickel U等人,2001,Adv Drug Deliv Rev.,46:247-279)。阳离子化的蛋白的正电荷结合
细胞表面上的负电荷，并且这种相互作用触发阳离子化的蛋白通过吸收介导的内吞作用进
入细胞。相对于免疫球蛋白的阳离子化，最近的研究已经表明，在体外通过分离的脑毛细血管，这种过程导致增强的吸收介导的内吞作用，以及在体内，这种内吞作用过程导致阳离子化IgG进入脑的净转胞吞作用。阳离子化抗体应用的主要限制是其抗原结合性能的下降。实际上，阳离子化的单克隆抗体的亲和性受到影响，因为通常参与抗原结合的精氨酸和赖氨
酸由阳离子化处理而被修饰(Triguero D.等人,1991,J Pharmacol Exp Ther.258:186-
192)。

[0009] 常规的免疫球蛋白是异四聚体，由两条重链和两条轻链组成，组合分子量约150kDa。在骆骆驼科(Camelidae)成员中，相当比例的血清抗体是同源二聚体IgG，分子量约
80kD(Hamers-Casterman C.等人,1993,Nature,363:446-448)。这些重链免疫球蛋白(Ig)
包含三个结构域，其可变区被称为VHH。重组VHH(约12至14kD的尺寸)构成完整的抗原结合
结构域并显示出广阔的抗原结合谱。扩大它们的高变区，并表现出独特的特性，如三至四个(与常规抗体VL相互作用的)疏水框架残基被更多亲水性氨基酸取代。为了稳定扩大的CDR，除了常规的二硫键以外，在单峰骆驼CDR1和CDR3之间，在美洲驼的CDR2和CDR3之间，VHH可具有额外的二硫键((Harmsen,M.M和De Haard H.J.,2007,Appl Microbiol Biotechnol.,
77:13-22；Muyldermans S.,2001,J Biotechnol.,74:277-302)。扩展的CDR3环可以采取凸面构象，而常规的互补位被限制在凹的或者平面结构(Muyldermans S.,2001,J
Biotechnol.,74:277-302)。这些特征允许VHH识别对于常规抗体而言免疫原性较差的独特
表位(Lafaye P.等人,2009,Mol Immuno.,46:695-704；Wernery U.,2001,J Vet Med B
Infect Dis Vet Public Health.,48:561-568)。尽管VHH被定义为单价抗体，默认排除任
何亲合力效果，然而测量的其体外生物活性如IC50，可类似于常规的二价抗体分子(Thys B.等人,2010,Antiviral Research.,87:257-264)。

[0010] 有人提议，同源二聚体VHH提供了体内免疫诊断的新前景。已经描述了如噬菌体展示的方法从免疫的骆驼或者美洲驼的VHH库中选择抗原特异性VHH。VHH基因克隆至噬菌体
展示载体中，通过筛选获得抗原结合物，选择的VHH在细菌中表达。与常规抗体片段(Fab或者scFv)相比，重组VHH具有许多优点，因为只克隆了一个结构域，且因为这些VHH表达良好，高度溶于水性环境并且在高温下是稳定的。由于VHH的尺寸小，约12-14kDa，它们迅速通过肾脏过滤，肾脏过滤的截断值约60kDa，导致在血液中快速清除。此外，小尺寸导致快速的组织穿透。VHH血清半衰期短，约2小时，相较于scFv的4h和IgG的50h而言，这对于使用成像的体内诊断而言是有利的，并且有利于偶联至感兴趣物质的VHH进行靶向从而用于治疗疾病，因为人们可以预期非特异结合的VHH将从组织中迅速消除。

[0011] Li T.等人(2012,Faseb J.,26:3969-3979)获得针对GFAP(一种特异于星形细胞的中间丝蛋白)的VHH。在活的小鼠中采用颈动脉内注射，作者证实这些天然VHH发挥“转换体(transbody)”的作用，因为它们天然地能够穿过BBB而在脑组织中的扩散，渗透到星形细胞中，并特异性结合GFAP表位(又参见国际申请WO 2010/004432)。

[0012] 更一般地，具有至少8.5等电点的VHH能够通过微胞饮作用(micropinocytosis)和吸收介导的内吞作用而迁移穿过BBB。这样的VHH可用于肽载体的制备将感兴趣的物质递送
穿过哺乳动物血脑屏障(国际申请WO 2009/004495和WO 2010/004432)。

[0013] 国际申请WO 2004/044204公开了能够在体外特异性结合淀粉样蛋白β肽42(Aβ42)的骆骆驼科单链抗体(VHH)可变片段的文库制备。已经通过用Aβ42免疫羊驼Lama pacos而
获得这些VHH。这些VHH当中，已经描述了一个特定的VHH，称为VHH V31-1，通过ELISA特异性识别纤维状形式的Aβ42肽(Aβ42)的羧基端，以及通过免疫组织化学识别神经元内Aβ42沉积。然而，在国际申请WO 2009/004494中，WO 2004/044204的发明人已清楚地通过免疫组织化学显示，不同于WO 2004/044204中描述的，VHH V31-1不识别水溶纤维状形式的Aβ42，但特异性识别Aβ42的水溶性低分子量寡聚物(即，单-、二-、四-和十二聚体)(还参见Lafaye P.等人,2009,Mol Immunol.,46:695-704)。在国际申请WO 2009/004494中，WO 2004/
044204的发明人进一步研究WO 2004/044204中公开的两种VHH，即VHH 61-3和VHH L1-3。他们通过免疫组织化学显示，染色的AD脑组织切片显示非常微弱的神经元内对VHH 61-3的免
疫反应，对VHH L1-3无法检测到神经元内的免疫反应。

[0014] Rutgers K.S.等人(2011,Neurobiol.Aging,32:1774-83)报道，通过噬菌体展示从未免疫的和免疫的库中筛选特异于淀粉样蛋白β的8个美洲驼来源的重链抗体片段
(VHH)，通过噬菌体ELISA、免疫组织化学和表面等离子体共振确定其对淀粉样蛋白β的亲和性和特异性。作者表明在体外8个VHH识别不同的淀粉样蛋白β表位，这与不同的免疫原相一致。作者还表明，这些VHH中的三个识别血管的和实质的(parenchymal)淀粉样蛋白β沉积，而剩下的5个VHH特异性识别血管的淀粉样蛋白β(未结合到实质的淀粉样蛋白β)。作者认
为，血管的和实质的淀粉样蛋白β沉积在表位的存在/可用性方面是异质的
(heterogeneous)，并且特异于淀粉样蛋白β的VHH可以用作体内成像的试剂来区分血管的
及实质的淀粉样蛋白β沉积。

[0015] Nabuurs R.J.A.等人(2012年，PLoS One，7：e38284)进一步在体内表征了Rutgers等人公开的两种VHH，即VHH ni3A和pa2H。作者发现，和Rutgers等人报道相反的是两种VHH对实质的和血管淀粉样蛋白β沉积均显示亲和性。事实上，Rutgers K.S等人报道在人体组织上进行的免疫组织化学中ni3A特异性地仅仅靶向血管淀粉样蛋白β。Nabuurs R.J.A.等人进一步报道，对于用于体内成像而言，VHH ni3A和pa2H的脑摄取太低。

[0016] 因此，需要提供通过体内神经成像来诊断淀粉样蛋白β沉积介导的疾病特别是阿尔茨海默氏病和唐氏综合征、以及监测这类疾病的疾病进展的手段和方法。也有必要提供
用于治疗这些疾病的手段和方法。

[0017] 在产生本发明的研究框架内，本发明人用Aβ42免疫羊驼。他们已获得称为R3VQ和R3VE的两种VHH。R3VQ和R3VE分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，两种均包含氨基酸序列SEQ ID NO.1所示的CDR1(互补决定区1)、氨基酸序列SEQ ID NO.2所示的CDR2
和氨基酸序列SEQ ID NO.3所示的CDR3。R3VQ和R3VE相差仅一个第7位的氨基酸序列：R3VQ
和R3VE的残基7分别是谷氨酰胺(Q)和谷氨酸(E)。VHH R3VQ和R3VE氨基酸序列的前三个氨
基酸残基(M-A-E)和最后两个氨基酸残基(S-S)可以被删除，而不改变这些VHH的性质。缺乏这些氨基酸残基的VHH R3VQ和R3VE被无差别分别称为R3VQ和R3VE。R3VQ和R3VE具有类似的
性质。

[0018] 当体外通过ELISA和免疫组织化学评估时，R3VQ和R3VE对Aβ有相似的结合特性。VHH R3VQ能够特异性识别淀粉样蛋白β的纤维状形式，但不识别寡聚(即，非-纤维)形式。采用免疫组织化学技术，发明人已发现这种VHH(以及VHH R3VE)特异性地标记存在于人AD脑
组织样本以及来自携带淀粉样蛋白沉积的专用小鼠模型的脑切片中的淀粉样蛋白斑块。

[0019] VHH R3VQ也能在体内穿过哺乳动物未被破坏(non-compromised)的血脑屏障。

[0020] 此外，按照以下两种策略，将VHH R3VQ缀合至感兴趣的物质，如MRI造影剂和螯合剂：

[0021] -第一个策略是利用非位点特异性的方法，并且包括螯合剂和根据本发明的VHH或者VHH衍生物的赖氨酸残基的缀合步骤，其中螯合剂如1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,
10-四乙酸(DOTA)，随后是将获得的配体和感兴趣的物质进行螯合的步骤，其中感兴趣的物质如MRI造影剂、如顺磁剂钆(Gd)。当通过IHC和MRI体内评估时，R3VQ-N-(DOTA/Gd)n'缀合物(图9，化合物2)能够识别脑室内注射后小鼠中的淀粉样蛋白斑块。

[0022] -第二个策略是使用位点特异性的方法，其涉及通过硫代加成，用携带感兴趣的物质的巯基反应性化合物对VHH R3VQ进行缀合(缀合步骤)，更一般地是对在C-或N端包含半
胱氨酸残基的任何VHH进行标记，其中携带感兴趣的物质的巯基反应性化合物优选为携带
感兴趣的物质的马来酰亚胺化合物。

[0023] 非位点特异性缀合需要初始缓冲液的交换，而R3VQ-SH 3与马来酰亚氨基(DOTA/Gd)3 4之间的位点特异性缀合可以直接在PBS/氯化钠/咪唑缓冲中实施。在温和的条件可
以有效控制半胱氨酸上的特异性硫代加成，所述策略允许减少反应的步骤数并改进工艺的
总产率，而没有A.Papini等人Int.J.Pept.Protein Res.,1992,39,348-355；B.Rudolf等
人,J.Organomet.Chem,1996,522,313-315；J.Paulech等人,Biochim.Biophys.Acta,2013,
1834,372-379中先前提到的任何潜在副反应。因而，令人惊讶地，以如此显著的方式改善了总产率，而在VHH赖氨酸或组氨酸上没有任何副反应，并且整体保持了VHH的功能和三维结
构。

[0024] 重组蛋白经常和His-标签一起表达，His-标签允许通过固定化金属亲和性色谱(IMAC)将其纯化。当使用Ni2+次氮基三乙酸树脂时，它们通常在含有500mM咪唑的PBS缓冲液中被洗脱。在非位点特异性的方法中(图9A)，咪唑的氮可以促进NHS酯的水解(即降解反应
物)，并由此干扰缀合(G.T.Hermanson,Bioconjugate Techniques,Academic Press,2013；
P.Cuatrecasas等人,Biochemistry,1972,11,2291-2299)。因此，缓冲液交换步骤必须包括在上游亲和性纯化和缀合之间的过程中从而除去咪唑。总产率范围从60至67％。还在缓冲
液交换(图9B，方法1)之后进行第一位点特异性实验(图9B)，以70％的产率产生缀合物
R3VQ-S-(DOTA/Gd)3 5。如以前几个小组所报道的，其中显示了组氨酸侧链烷基化，预期咪唑和马来酰亚胺基团之间副反应(A.Papini等人；B.Rudolf等人；J.Paulech等人)。尽管如此，在亲和柱洗脱缓冲液中马来酰亚胺(DOTA/Gd)3 4可直接缀合至R3VQ-SH VHH 3(图9B，
方法2)，马来酰亚胺试剂的过量有限，尽管咪唑过量很多摩尔。这第二个策略给出83％的总产率。

发明内容

[0025] 因此，本发明提供一种针对淀粉样蛋白β纤维状形式的分离的骆骆驼科重链抗体的可变结构域(称为VHH)，特征在于其氨基酸序列从N端到C端包含氨基酸序列SEQ ID NO.1
(对应着CDR1)、氨基酸序列SEQ ID NO.2(对应着CDR2)以及氨基酸序列SEQ ID NO.3(对应
着CDR3)。

[0026] 在一个优选的实施方式中，所述VHH包含选自以下的氨基酸序列或者由选自以下的氨基酸序列组成：

[0027] -SEQ ID NO.4，对应R3VQ的全长形式，

[0028] -SEQ ID NO.5，对应R3VE的全长形式，

[0029] -SEQ ID NO.6，对应R3VQ的短形式，以及

[0030] -SEQ ID NO.7，对应R3VE的短形式，

[0031] 优选地，选自SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6。

[0032] 如此处所用，术语“分离的”涉及VHH，其已经从它的天然环境中分离出来。在一些实施方式中，例如通过电泳(如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(如，凝胶过滤、离子交换或者反相HPLC)所确定的，VHH被纯化至高于95％或者99％的纯度。针对综述抗体纯度评价的方法，参见例如Flatman等人，2007，J.Chromatogr.B 848:79-87。

[0033] 如此处所用，术语“VHH”涉及来自骆驼科(骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼等)重链抗体的可变抗原结合结构域(参见Nguyen V.K.等人，2000，The EMBO Journal，19，921-930；Muyldermans S.，2001，J Biotechnol.，74，277-302以及综述Vanlandschoot P.等人，
2011，Antiviral Research 92，389-407)。VHH也可称为纳米抗体(Nanobody)(Nb)。

[0034] 有利的是，根据本发明的VHH具有碱性的等电点，优选8.5至9.5。

[0035] 本发明包括如上述所限定的天然、重组或合成的VHH。

[0036] 如此处所用，术语“重组”涉及采用遗传工程的方法(克隆、扩增)来生产所述VHH。

[0037] 如此处所用，术语“合成”涉及通过体外化学的或者酶促的合成来生产所述VHH。

[0038] 根据本发明的VHH能够是单体的形式或者同源多聚体的形式，如同源二聚体或同源三聚体。

[0039] 本发明还提供一种分离的骆骆驼科血清，优选羊驼血清，其包含根据本发明的VHH。

[0040] 本发明还提供式P-C-Z或者Z-C-P所示的寡肽，优选P-C-Z，其中：

[0041] -P是8至800个氨基酸的肽，所述P不含有还原的半胱氨酸残基，

[0042] -C是半胱氨酸残基，

[0043] -Z代表1至10个氨基酸的间隔序列，优选1至10个中性的或带负电的氨基酸的间隔序列，其中Z的氨基酸残基是相同的或不同的，并且其中Z不含半胱氨酸残基，

[0044] 所述半胱氨酸残基C通过式(I)所示的带有所述感兴趣物质的马来酰亚胺化合物连接至感兴趣的物质：

[0045]

[0046] 其中：

[0047] -B、B’1、B’2和B”是相同的或不同的，其各自独立地是选自以下的单键或间隔序列：多元醇，比如聚乙二醇(PEG)，其优选具有2至12个氧乙烯(OE)单元；聚烯烃，其优选具有2至
12个芳香环；聚烷基，其优选具有2至12个碳原子；乙烯基聚合物，比如聚(甲基丙烯酸烷基酯)，其优选具有2至12个甲基丙烯酸基团；聚醛，其优选具有2至12个羰基；聚酸酯，其优选具有2至12个酯基，

[0048] -D、D’和D”是相同的或不同的，其各自独立地是选自胺、酰胺、氨基醇、尿素、硫脲、氨基甲酸酯、碳酸酯、酯、醚、硫醚、芳基、杂芳基、肟基，

[0049] -A是单键或者螯合剂，

[0050] -SI是感兴趣的物质，

[0051] -X’是酸、胺、酰胺、酯、醚、烷基、烯基、炔基、芳基或者杂芳基，以及

[0052] -n＝1至100，优选地n＝1、2或者3。

[0053] 在本发明的意义之内：

[0054] -烷基选自(C1-C12)烷基，并且优选(C1-C6)烷基，比如甲基、乙基、n-丙基、异丙基、n-丁基、仲丁基、叔丁基和异丁基自由基；

[0055] -烯基选自2至12个优选2至6个碳原子的烃链，有至少一个碳碳双键。烯基的示例包括乙烯、丙烯、异丙烯、2,4-戊二烯；

[0056] -炔基选自2至12个优选2至6个碳原子的烃链，有至少一个碳碳三键；

[0057] -芳基表示衍生自至少一个简单芳香环的任何官能团或者取代基；芳香环对应着具有离域π系统的任何平面环形化合物，在所述离域π系统中环的每一个原子包括p轨道，所述p轨道彼此重叠。更具体地说，术语芳基包括但不限于苯、联苯、1-萘、2-萘、蒽基、芘基、及其取代的形式。本发明的芳基优选地包括4至12个碳原子，更优选地5或者6个碳原子；

[0058] -杂芳基表示衍生自至少一个如上限定的芳香环的任何官能团或者取代基，并且含有选自P、S、O和N的至少一个杂原子。术语杂芳基包括但不限于呋喃、吡啶、吡咯、噻吩、咪唑、吡唑、噁唑、异噁唑、三唑、噻唑、异噻唑、四唑、吡哒唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、苯并呋喃、异苯并呋喃、吲哚、异吲哚、苯并噻吩、苯并[c]噻吩、苯并咪唑、吲唑、苯并噁唑、苯并异噁唑、苯并噻唑、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、嘌呤和吖啶。本发明的芳基和杂芳基包括优选地4至12个碳原子，更优选5或者6个碳原子；

[0059] 根据本发明的酸、胺、酰胺、酯、醚和硫醚基团优选具有1至12更优选1至6个碳原子。

[0060] 根据优选的实施方式，A是螯合剂，以及感兴趣的物质SI是NMR或者MRI造影剂。

[0061] 有利的是，螯合剂A选自1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)、1,4,7-三(羧甲基氮杂)环十二烷-10-氮杂乙酰胺(DO3A)、次氮基三
乙酸(NTA)、D-青霉胺(Pen)、2,3-二巯基丁二酸(DMSA)、2,3-二巯基-1-丙磺酸(DMPS)、2,3-二巯基丙醇(BAL)、三乙烯四胺(Trien)、四硫代钼酸铵(TTM)阴离子、乙二胺四乙酸(EDTA)、
2-(p-异硫氰酰苄基)-6-甲基-二乙三胺五乙酸(IB4M)或羟基吡啶酮(HOPO)。

[0062] 有利的是，感兴趣的物质SI是钆，以及螯合剂是DOTA。

[0063] 根据一个尤其优选的实施方式，本发明的马来酰亚胺化合物可以是式(I’)所示：

[0064]

[0065] 其中，B、B’1、B’2、B”、A、SI以及n是上述所限定的。

[0066] 通过固相方法，优选使用Fmoc化学，以及更优选在Fmoc-Gly-Wang树脂上合成式(I)或(I’)的马来酰亚胺化合物。

[0067] 式(I’)的马来酰亚胺化合物：

[0068]

[0069] 其中，B、B’1、B’2、B”、A、SI以及n如上述所限定的，也属于本发明的一部分。

[0070] 有利的是，氨基酸间隔序列Z的氨基酸残基选自：丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺，优选地丙氨酸、缬氨酸和丝氨酸。

[0071] 在一个优选的实施方式中，寡肽具有式P-C-Z或者Z-C-P，优选地P-C-Z，其中：

[0072] -P是8至800个氨基酸的肽，所述P不含有还原的半胱氨酸残基，

[0073] -C是半胱氨酸残基，

[0074] -Z代表

[0075] a)2至10个氨基酸的间隔序列，优选2个氨基酸的间隔序列，其中Z的氨基酸残基选自：丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)和甘氨酸(G)，更优选丝氨酸(S)、丙氨酸(A)和缬氨酸(V)，其中Z的至少两个氨基酸残基是不同的，或

[0076] b)2至10个氨基酸的间隔序列，优选2至10个中性的或带负电的氨基酸的间隔序列，其中Z包括二肽丝氨酸-丙氨酸(S-A)或丝氨酸-缬氨酸(S-V)，并且其中Z不包含半胱氨
酸残基。

[0077] 有利的是，半胱氨酸残基C是立体上可接触的。

[0078] 有利的是，当Z如a)中所限定的，则氨基酸间隔序列Z包含1个或者至少1个丝氨酸。

[0079] 有利的是，当Z如a)中所限定的，则氨基酸间隔序列Z仅由丝氨酸和丙氨酸残基组成，或者仅由丝氨酸和缬氨酸残基组成。

[0080] 在这种寡肽的一个优选实施方式中，氨基酸间隔序列Z由2个氨基酸的序列组成，如氨基酸序列S-A或者S-V。

[0081] 按照递增的优选顺序，氨基酸肽P还可以是50至800、100至800、100至700、100至500、100至400、100至300、或100至250个氨基酸的肽。

[0082] 有利的是，氨基酸肽P包含肽P’或者由肽P’组成，其能够选择性地结合抗原。P’优选地选自：骆骆驼科重链抗体的可变结构域(VHH)、常规抗体的Fab片段、常规抗体的F(ab)’2片段、常规抗体的Fv片段、常规抗体的scFv片段、免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)、nanofitin、DARPin、anticalin、亲合体、affilin、avimer、单体(monobody)和库尼茨结构域。

[0083] 常规抗体的Fab、F(ab)’2、Fv和scFv片段是本领域技术人员公知的。IgNAR综述于Dooley H.等人，2006，Dev Comp Immunol.，30:43-56。Nanofitin(如affitin)综述于Mouratou B.等人，2007，Proc Natl Acad Sci U.S.A.，104：17983-8。DARPin综述于Binz H.K.等人，2003，J.Mol.Biol.，332：489-503。Anticalin综述于Skerra A，2008，FEBS J.，
275:2677–83。Affibody综述于Nord K.等人，1997，Nature Biotechnol.，15:772–777。
Affilin综述于Ebersbach H.等人，2007，J.Mol.Biol.，372:172–185。Avimer综述于
Silverman J.等人，2005，Nature Biotechnol.，23:1556–1561。单体(或adnectin)综述于Koide A.等人，1998，J.Mol.Biol.，284:1141–51。库尼茨结构域综述于Lehmann A.，2008，Expert opinion on biological therapy，8:1187–99。

[0084] 在一个优选的实施方式中，P’是VHH，比如根据本发明的VHH。

[0085] 式P-C-Z的寡肽的氨基酸肽P在其C端具有1至10个氨基酸的间隔序列Y，优选地，1至10个中性的或者带负电的氨基酸的间隔序列，其中所述氨基酸间隔序列Y的氨基酸残基
是相同的或不同的，并且其中所述氨基酸间隔序列Y不含半胱氨酸残基。

[0086] 式Z-C-P的寡肽的氨基酸肽P在其N端具有1至10个氨基酸的间隔序列Y，优选地，1至10个中性的或者带负电的氨基酸的间隔序列，其中所述氨基酸间隔序列Y的氨基酸残基
是相同的或不同的，并且其中所述氨基酸间隔序列Y不含半胱氨酸残基。

[0087] 有利的是，氨基酸间隔序列Y的氨基酸残基选自丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺，优选丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸和甘氨酸。

[0088] 优选，氨基酸间隔序列Y代表4个中性氨基酸的间隔序列，比如氨基酸序列G-G-G-S(SEQ ID NO.11)。

[0089] 式P-C-Z的寡肽的氨基酸肽P还在其N端具有1至50个氨基酸的序列X，其中所述氨基酸序列X的氨基酸残基是相同的或不同的，并且其中所述氨基酸序列X不包含半胱氨酸残
基。

[0090] 式Z-C-P的寡肽的氨基酸肽P还在其C端具有1至50个氨基酸的序列X，其中所述氨基酸序列X的氨基酸残基是相同的或不同的，并且其中所述氨基酸序列X不包含半胱氨酸残
基。

[0091] 氨基酸序列X包含标签和酶切位点，所述标签比如6×His标签(SEQ ID NO.9)，所述酶切位点比如氨基酸序列LVPRGS(SEQ ID NO.10)所示的凝血酶切位点。

[0092] 在一个优选的实施方式中，根据本发明的寡肽具有式P’-C-Z、P’-Y-C-Z、X-P’-C-Z、X-P’-Y-C-Z、Z-C-P’、Z-C-Y-P’、Z-C-P’-X或者Z-C-Y-P’-X，其中P’优选是VHH，比如根据本发明的VHH。

[0093] 本发明还提供一种分离的式P-C-Z或者Z-C-P的寡肽，优选地如上述所限定的P-C-Z，其中：

[0094] -P是8至800个氨基酸的肽，所述P不含有还原的半胱氨酸残基，

[0095] -C是半胱氨酸残基，

[0096] -Z代表1至10个氨基酸的间隔序列，优选1至10个中性的或带负电的氨基酸的间隔序列，其中Z的氨基酸残基是相同的或不同的，并且其中Z不含半胱氨酸残基。

[0097] 本发明还提供一种VHH衍生物，其由包含根据本发明的VHH的多肽组成，只要包含在所述多肽之中的所述VHH能够结合淀粉样蛋白β的纤维状形式。

[0098] 在一个具体的实施方式中，所述VHH衍生物从N端至C端包含氨基酸标签比如6×His标签、酶切位点比如凝血酶切位点、VHH、氨基酸间隔序列、半胱氨酸和第二氨基酸间隔序列。这种VHH衍生物对应着具有式X-P’-Y-C-Z的根据本发明的寡肽，其中P’是VHH。

[0099] 在一个优选的实施方式中，所述VHH衍生物具有氨基酸序列SEQ ID NO.8(R3VQ-SH)。

[0100] 本发明还提供一种分离的多核苷酸，其编码根据本发明的寡肽、VHH或者VHH衍生物。

[0101] 编码根据本发明的VHH衍生物的多核苷酸的示例是序列SEQ ID NO：17(编码R3VQ-SH的核苷酸序列)。

[0102] 一种根据本发明的多核苷酸，其是通过重组DNA技术和/或化学DNA合成的公知方法获得的。

[0103] 本发明还提供一种重组表达盒，其包含在转录启动子控制下的根据本发明的多核苷酸，转录启动子允许在宿主细胞中调节所述多核苷酸的转录。所述多核苷酸还可以连接
至适当的控制序列，控制序列允许在宿主细胞中调节其翻译。

[0104] 本发明还提供一种重组载体(例如，重组表达载体)，其包含根据本发明的多核苷酸。有利的是，所述重组载体是包含根据本发明的表达盒的重组表达载体。

[0105] 如此处所用，术语“载体”涉及能够扩增与其连接的另一核酸的核酸分子。术语包括作为自我复制的核酸结构的载体，以及并入宿主细胞基因组的载体，其中所述载体引入所述宿主细胞中。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。这种载体此处被称为
“表达载体”。

[0106] 本发明还提供一种宿主细胞，其包含根据本发明的重组表达盒或重组载体。宿主细胞是原核或真核宿主细胞。

[0107] 术语“宿主细胞”涉及在其中引入有外源性核酸的细胞，包括这些细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括初始的转化细胞及其衍生后代，而不考虑传代次数。在核酸含量方面，后代可能不完全和母细胞相同，但可能包含突变。在原始转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或者生物活性的突变后代也包括在此处。

[0108] 一种表达氨基酸序列SEQ ID No.4所示的VHH R3VQ的原核宿主细胞，其于2013年11月12日以I-4818的编号保藏在法国巴黎邮编15，Dr Roux街75724的国家培养物和微生物
保藏中心(CNCM)。

[0109] 一种表达氨基酸序列SEQ ID No.8所示的VHH R3VQ-SH的原核宿主细胞，其于2013年11月12日以I-4819的编号保藏在法国巴黎邮编15，Dr Roux街75724的国家培养物和微生
物保藏中心(CNCM)。

[0110] 本发明还提供一种用于在如上述所限定的宿主细胞中生产根据本发明的式P-C-Z或Z-C-P所示寡肽的方法，包括步骤：

[0111] -提供含有根据本发明的重组表达盒或重组载体的宿主细胞，

[0112] -培养所述宿主细胞，

[0113] -以及，任选地，纯化式P-C-Z或Z-C-P所示寡肽。

[0114] 用于纯化寡肽的方法是本领域公知的，比如色谱(如离子交换色谱、凝胶渗透色谱和反相色谱)。

[0115] 本发明还提供了一种诊断或者治疗剂，其包含直接或者间接、共价或非共价连接至感兴趣的物质的根据本发明的VHH、VHH衍生物或寡肽。

[0116] 根据本发明的感兴趣的物质能够或不能穿透哺乳动物或者人类血脑屏障。如果感兴趣的物质穿透所述血脑屏障，则利用根据本发明的VHH、VHH衍生物或寡肽可以允许增强
所述感兴趣的物质穿过血脑屏障的递送。

[0117] 在一个实施方式中，所述感兴趣的物质是诊断或者治疗化合物。

[0118] 在另一个实施方式中，所述感兴趣的物质是包含诊断或者治疗化合物的脂质体或者聚合实体(A.J.L.Villaraza等人，Chem Rev.2010，110，2921-2959)。

[0119] 有利的是，所述诊断化合物选自：

[0120] -酶，比如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸酶或者β-半乳糖苷酶；

[0121] -荧光团，比如绿色荧光蛋白(GFP)、在光谱紫外(UV)部分的波长处激发的蓝色荧光染料(例如AMCA(7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸)；Alexa 350)、在蓝光处激发的绿
色荧光染料(如FITC、Cy2、Alexa 488)、在绿光处激发的红色荧光染料(例如罗丹明、
德克萨斯红、Cy3、Alexa 染料546、564和594)、或者远红光激发的染料(如Cy5)，通过
电子探测器(CCD相机、光电倍增管)进行可视化；

[0122] -放射性同位素，如可用于PET成像的18F、11C、13N、15O、68Ga、82Rb、44Sc、64Cu、86Y、89Zr、124I、152Tb，或者可以用于SPECT/闪烁扫描研究的67Ga、81mKr、99mTc、111In、123I、125I、133Xe、201Tl、155Tb、195mPt，或者可用于放射自显影或原位杂交的14C、3H、35S、32P、125I，或者可用于标记化合物的211At-、212Bi-、75Br-、76Br-、131I-、111In、177Lu-、212Pb-、186Re-、188Re-、153Sm-、90Y；

[0123] -NMR或者MRI造影剂，比如顺磁剂钆(Gd)、镝(Dy)和锰(Mn)，以及基于铁氧化物的超顺磁剂(如MION、SPIO或者USPIO)或基于铂铁的超顺磁剂(SIPP)，以及X-核比如18F、13C、
23Na、17O、15N；

[0124] -纳米颗粒，比如金纳米颗粒(B.Van de Broek等人，ACSNano，卷5，No.6，4319-4328，2011)或者量子点(A.Sukhanova等人，Nanomedicine，8(2012)516-525)。

[0125] 在一个优选的实施方式中，所述诊断化合物是MRI造影剂，更优选地钆。

[0126] 当诊断剂用于检测，它可以包括用于闪烁扫描研究的放射性原子，例如99Tc或者123 13 9 123 111
I，或者用于核磁共振(NMR)成像(还称为MRI)的自旋标记，比如 C、F、Fe、Gd、 I、 In、Mn、15N或者7O。

[0127] 有利的是，所述治疗化合物选自：肽、酶、核酸、病毒和化学实体。它可以是止痛化合物、抗炎化合物、抗抑郁化合物、抗惊厥化合物、细胞毒性化合物或者抗神经退行性化合物。

[0128] 如上述所限定的感兴趣的物质可以直接且共价地或者非共价地连接至根据本发明的VHH、VHH衍生物或者寡肽，或者连接至所述VHH、VHH衍生物或者寡肽的末端之一(N或者C端)，或者连接至所述VHH、VHH衍生物或者寡肽的氨基酸之一的侧链。感兴趣的物质还可以通过间隔序列的方式间接且共价地或者非共价地连接至所述VHH或VHH衍生物，或者连接至
所述VHH或VHH衍生物的末端之一，或者连接至所述VHH或VHH衍生物的氨基酸之一的侧链。
传统的将感兴趣的物质连接至肽尤其是抗体的方法，是本领域中已知的(比如，参见
TERNYNCK and AVRAMEAS，1987，“Techniques immunoenzymatiques”Ed.INSERM，Paris或者G.T.Hermanson，Bioconjugate Techniques，2010，Academic出版社)。

[0129] 许多化学交联方法是本领域已知的。交联剂可能是同双功能的(即，有两个官能团进行相同的反应)或异双功能的(即，有两个不同的官能团)。大量的交联剂是市售可获得
的。它们使用的详细说明很容易从商业供应商获得。多肽的交联和缀合物制备的一般参考
是：WONG，Chemistry of protein conjugation and cross-linking，CRC Press(1991)。

[0130] 使用本领域公知的常规的有机化学技术，根据本发明的VHH、VHH衍生物或者寡肽可标记有特异性的放射性同位素或者NMR或MRI造影剂或荧光团或纳米颗粒或酶，参见例如
March，J.ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY：REACTIONS，MECHANISMS，AND STRUCTURE(第三版，
1985)或者G.T.Hermanson，Bioconjugate Techniques，2010，Academic出版社。

[0131] 此外，通过本领域公知的多种方法，直接通过重氮碘对重氮化的氨基衍生物进行碘化(参见Greenbaum，1936，F.Am.J.Pharm.，108:17)、或者通过将不稳定的重氮化胺转换成稳定的三氮烯、或者通过将非放射性卤代前体转换成稳定的三烷基锡衍生物，随后三烷
基锡衍生物转化成碘代化合物，根据本发明的VHH、VHH或者寡肽衍生物还可以标记有任何
合适的放射性碘同位素，例如但不限于131I、125I、或者123I。参见Satyamurthy和Barrio，
1983，J.Org.Chem.，48：4394；Goodman等人，1984，J.Org.Chem.，49:2322，以及Mathis等人，
1994，J.Labell.Comp.and Radiopharm.，905；Chumpradit等人，1991，J.Med.Chem.，34：
877；Zhuang等人，1994，J.Med.Chem.37:1406；Chumpradit等人，1994，J.Med.Chem.37:
4245。

[0132] 尤其是，通过任意的本领域公知的多种技术，根据本发明的VHH、VHH衍生物或者寡肽可以标记有123I以便用于SPECT。参见，例如Kulkarni，1991，Int.J.Rad.Appl.&Inst.(Part B)18：647。

[0133] 根据本发明的VHH或VHH衍生物还可以被放射标记有已知的金属放射性标记，比如锝99m(99mTc)。修饰取代基从而引入结合这种金属离子的配体，这可以由放射标记领域的普通技术人员实现，而无需过度实验。根据本发明的金属标记的VHH或者VHH衍生物，然后可以用于检测淀粉样蛋白β沉积。制备99mTc放射性标记的衍生物是本领域公知的。参见例如
Zhuang等人，1999，Nuclear Medicine&Biology，26:21 7-24；Oya等人，1998，Nuclear Medicine&Biology，25：135-40；Horn等人，1997，Nuclear Medicine&Biology，24:485-98。

[0134] 本发明还涉及用于获得直接或者间接偶联有感兴趣的物质的根据本发明的VHH或者VHH衍生物(功能性缀合物)的偶联方法。

[0135] 根据第一种策略，通过使用非位点特异性方法，将根据本发明的VHH或者VHH衍生物缀合至感兴趣的物质。所述非位点特异性方法包括将感兴趣的物质和根据本发明的VHH
或者VHH衍生物进行缀合的步骤。

[0136] 当感兴趣的物质是金属时，如NMR或者MRI造影剂(例如，顺磁剂钆(Gd)、镝(Dy)和锰(Mn)，以及基于铁氧化物或者铂铁的超顺磁剂，以及X-核，比如18F、13C、23Na、17O、15N，或者比如金属放射性同位素(例如，90Y、177Lu、64Cu、99mTc、111In、212Pb、212Bi)，非位点特异性的方法采用螯合剂，并包括以下步骤：

[0137] (i)将以酯或酸酐形式激活的螯合剂，优选以酯形式激活的螯合剂，和根据本发明的VHH或者VHH衍生物的赖氨酸残基进行缀合，以及

[0138] (ii)将步骤(i)的配体和感兴趣的物质进行螯合。

[0139] 替代采用螯合剂的非位点特异性方法的方法，是这样一种方法，在其中感兴趣的物质用螯合剂进行“预螯合”，这种方法包括以下步骤：

[0140] (i’)将感兴趣的物质和以酯或酸酐形式激活的螯合剂，优选以酯的形式激活的螯合剂，进行螯合，以及

[0141] (ii’)将步骤(i’)的预螯合的感兴趣的物质和根据本发明的VHH或者VHH衍生物的赖氨酸残基进行缀合。

[0142] 步骤(i)或(ii’)的缀合期间，温度可以从1变化到40℃，并且优选从4至20℃。溶液可以搅拌1至6小时。优选地，步骤(i)或(ii’)缀合期间的pH保持在7至8.5。

[0143] 在有咪唑或者没有咪唑的PBS/NaCl中进行缀合步骤(i)或(ii’)，优选存在咪唑。

[0144] 缀合步骤(i)或(ii’)期间，以酯或酸酐形式激活的螯合剂可以溶解在缓冲液中，如磷酸盐缓冲(PBS)溶液。在一个优选的实施方式中，以酯或酸酐形式激活的螯合剂和VHH
或者VHH衍生物的赖氨酸残基的氨基官能团之间的摩尔比范围从1至10，优选是4。

[0145] 缀合步骤(i)和螯合步骤(ii)之间、或者螯合步骤(i’)和缀合步骤(ii’)之间，可以有通过渗透过滤或者透析进行的缓冲液交换步骤。有利的是，溶液是渗透过滤的，例如采用VivaspinTM装置。这种缓冲液交换步骤期间，在范围从1至5℃的温度冷却介质。这种缓冲液交换步骤期间，例如用醋酸钠溶液交换缓冲溶液，优选搅拌0至6个小时，更优选2至3小时。

[0146] 螯合步骤(ii)或(i’)期间，溶液搅拌1至4小时，优选2至3小时。优选，在1至60℃进行螯合步骤，更优选在4℃。

[0147] 然后，可以有通过渗透过滤或者透析进行的第二缓冲液交换步骤。有利的是，溶液是渗透过滤的，例如采用VivaspinTM装置。此第二缓冲液交换步骤期间，在范围从1至5℃的温度冷却介质。第二渗透过滤步骤期间，例如用混合物PBS/NaCl交换缓冲溶液，并且通过相同的方法进行浓缩(渗透过滤)。

[0148] 根据赖氨酸的数量，每VHH或者VHH衍生物的感兴趣的物质平均密度可以从0至赖氨酸的数目+1之间变化。优选，每VHH或者VHH衍生物的感兴趣的物质平均密度可以从0至5
之间变化。

[0149] 根据本发明的非位点特异性方法适用于根据本发明的VHH或者VHH衍生物，并且可以扩展至其它VHH。

[0150] 根据第二策略，通过位点特异性方法将根据本发明的寡肽，优选地包括根据本发明的VHH衍生物，缀合至感兴趣的物质。位点特异性方法有以下优点：

[0151] -标记的寡肽是化学上明确的，因为这种方法提供明确的缀合物，这是针对人类使用的一个基本特征(质量控制、安全性…)，

[0152] -方法简便且标准，因为用感兴趣的物质来标记寡肽可以在单一步骤中进行，反应时间短且程序简单。无需在线监测，并且在标记程度和结合性能之间不用实现权衡。对于进一步的优化、实验重复性和生产规模的扩大有关键的优势，

[0153] -该方法不影响寡肽的关键性质：例如，当P包含VHH或由VHH组成，在最终样本中缀合物的pI维持在8.5以上，从而应当允许穿过BBB。此外，不存在可能和缀合物竞争靶标的剩余未标记寡肽；反应时间短且处于生理性pH的温和条件防止寡肽免于潜在的降解和/或活性损失，

[0154] -该方法具有通用性，因为它允许灵活且模块化的方法，在其中可分别制备各种寡肽和造影剂、或其它感兴趣的分子，然后在单一步骤中进行组合。因此，轻易获得一组缀合物用于优化以及通过IHC和MRI进行的下游评价，以及上述所有，

[0155] -该方法允许提高总产率，同时降低反应步骤数，在VHH的赖氨酸或组氨酸上没有副反应，并且整体维持VHH的功能与三维结构。

[0156] 根据本发明的位点特异性方法包括根据本发明的寡肽和感兴趣的物质之间的缀合步骤，其中感兴趣的物质带有巯基反应官能团，比如上述限定的带有感兴趣的物质的式
(I)或(I’)的马来酰亚胺化合物。

[0157] 可以在范围从0至20℃的温度，优选4℃，例如从2至4小时，进行寡肽的半胱氨酸和巯基反应性化合物之间的硫代加成，其中巯基反应性化合物比如式(I)或(I’)的马来酰亚胺化合物。

[0158] 优选在范围从4至7.5，更优选在6.8的pH，实现寡肽的半胱氨酸和巯基反应性化合物之间的硫代加成，其中巯基反应性化合物比如式(I)或(I’)的马来酰亚胺化合物。低于pH＝4反应不工作，而超过7.5则反应不是特异性的(在赖氨酸上反应)。为了调节pH，缀合步骤(i)或(ii’)可以在有或没有咪唑的PBS/NaCl中进行，优选存在咪唑。鉴定马来酰亚胺化合物对蛋白的硫代加成的特定条件是出乎意料的，因为其允许节省步骤并提高过程的总产
率，其中蛋白直接洗脱自纯化柱。

[0159] 然后，可以有通过渗透过滤或者透析进行缓冲液交换步骤。有利的是，溶液是渗透过滤的，例如采用VivaspinTM装置。然后，通过相同的方法浓缩溶液(渗透过滤)。

[0160] 然而，当缀合步骤(i)或(ii’)在有咪唑的PBS/NaCl中进行时，优选不进行随后的渗透过滤或者透析步骤(为了不除去咪唑)。

[0161] 无论是对于非特异性的方法还是特异性的方法，感兴趣的物质如上述所限定的。

[0162] 根据一个优选的实施方式，感兴趣的物质是上述所限定的治疗或者诊断化合物，优选诊断化合物选自：上述所限定的荧光团、放射性同位素、和NMR或MRI造影剂。

[0163] 本发明人发现，当感兴趣的物质是NMR或MRI造影剂时，合成的缀合物保留了未标记的VHH的关键功能特性。

[0164] 根据优选的实施方式，感兴趣的物质是NMR或MRI造影剂，比如顺磁剂钆(Gd)、镝(Dy)和锰(Mn)，以及基于铁氧化物的超顺磁剂(如MION、SPIO或者USPIO)或基于铂铁的超顺磁剂(SIPP)，以及X-核比如18F、13C、23Na、17O、15N，以及更优选感兴趣的物质是NMR或MRI造影剂，其选自顺磁剂钆(Gd)、镝(Dy)和锰(Mn)。

[0165] 螯合剂选自：1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)、1,4,7-三(羧甲基氮杂)环十二烷-10-氮杂乙酰胺(DO3A)、次氮基三乙酸(NTA)
(Chong等人，2008，19，1439)、D-青霉胺(Pen)、2,3-二巯基丁二酸(DMSA)、2,3-二巯基-1-丙磺酸(DMPS)(O.Andersen，Chem.Rev.，1999，99，pp.2683-2710)、2,3-二巯基丙醇(BAL)、三乙烯四胺(Trien)、四硫代钼酸铵(TTM)阴离子(G.J.Brewer，F.K.Askari，J.Hepatol.，
2005，42，pp.S13-S21)、乙二胺四乙酸(EDTA)、2-(p-异硫氰酰苄基)-6-甲基-二乙三胺五乙酸(IB4M)(Nwe等人，J.Inorg.Biochem，2011，105，722)、羟基吡啶酮(HOPO)(Villaraza等人，Chem.Rev.，2010，110，2921)。

[0166] 当感兴趣的物质是钆时，优选DOTA是螯合剂。

[0167] 本发明的另一个目的是根据本发明所限定的带有半胱氨酸残基的寡肽，其中半胱氨酸残基通过马来酰亚胺化合物连接至至少一种感兴趣的物质，所述寡肽是根据本发明的
位点特异性方法获得的。

[0168] 本发明还提供通过本发明的非位点特异性方法获得的缀合至感兴趣物质的VHH或者VHH衍生物，以及缀合至巯基反应性化合物的VHH，其中巯基反应性化合物比如根据本发
明的位点特异性方法获得的携带感兴趣的物质的式(I)的马来酰亚胺化合物。

[0169] 如果感兴趣的物质是肽，可以通过遗传工程将根据本发明的VHH或者VHH衍生物以及所述感兴趣的物质制备成融合多肽，其包含根据本发明的VHH或者VHH衍生物以及合适的
肽。可方便地在已知的合适宿主细胞中表达这种融合多肽。

[0170] 通过注射，比如静脉内、动脉内、鞘内(通过脊髓液)、腹腔内、肌肉内或者皮下注射、或通过滴鼻，将根据本发明的VHH、VHH衍生物、寡肽、治疗或诊断剂可施用至受试者(哺乳动物或人)。

[0171] 当根据本发明的VHH施用至人受试者时，那么可以进行人源化以便降低在人中的免疫原性。用于生产人源化抗体或其片段的方法是本领域公知的(Vincke C.等人，2009，J Biol Chem.，284，3273-84)。

[0172] 在诊断或者监测淀粉样蛋白β沉积介导的疾病中，如阿尔茨海默氏病(AD)和唐氏综合征，根据本发明的诊断剂可用于脑成像。

[0173] 本发明还提供一种试剂盒，其包含根据本发明的VHH、VHH衍生物或者寡肽以及上述所限定的感兴趣的物质。

[0174] 特别是，本发明还提供用于脑成像、或用于诊断或者监测淀粉样蛋白β沉积介导的疾病如阿尔茨海默氏病和唐氏综合征的试剂盒，其至少包含上述所限定的VHH或VHH衍生物和诊断剂。

[0175] 本发明还提供根据本发明的诊断剂用于诊断或者监测受试者中由淀粉样蛋白β沉积介导的疾病如阿尔茨海默氏病和唐氏综合征的用途。

[0176] 如此处所用，“受试者”是哺乳动物，优选人，最优选疑似患有淀粉样蛋白β沉积介导的疾病如阿尔茨海默氏病和唐氏综合征的人。

[0177] 本发明还提供在受试者中体外或者离体诊断淀粉样蛋白β沉积介导的疾病如阿尔茨海默氏病和唐氏综合征的方法，包括步骤：

[0178] a)用根据本发明的诊断剂体外接触来自所述受试者的适当生物样本，以及

[0179] b)在所述生物样本中，确定淀粉样蛋白β沉积比如淀粉样蛋白斑块的存在或者不存在，

[0180] 所述淀粉样蛋白β沉积的存在表明所述受试者患有淀粉样蛋白β沉积介导的疾病，如阿尔茨海默氏病和唐氏综合征。

[0181] 可以通过确定VHH抗原复合物(即，针对淀粉样蛋白β的纤维状形式的VHH)的存在或者不存在，来进行步骤b)。

[0182] 本发明还提供在受试者中体外或者离体监测淀粉样蛋白β沉积介导的疾病如阿尔茨海默氏病和唐氏综合征的进展或消退(regression)方法，包括步骤：

[0183] a)用根据本发明的诊断剂体外接触来自所述受试者的适当生物样本，

[0184] b)在所述生物样本中，确定淀粉样蛋白β的纤维状形式的量，以及

[0185] c)将步骤b)确定的量和所述受试者先前获得的淀粉样蛋白β的纤维状形式的量进行比较，

[0186] 淀粉样蛋白β的纤维状形式的量显著增加，构成了淀粉样蛋白β沉积介导的所述疾病的进展的标志，淀粉样蛋白β的纤维状形式的显著降低构成了淀粉样蛋白β沉积介导的所述疾病的消退的标志。

[0187] 如此处所用，术语“显著增加”和“显著降低”分别指的是，相较于来自所述受试者适当生物样本中所先前确定的并用作参考量的淀粉样蛋白β的纤维状形式的量，在适当的生物样本中淀粉样蛋白β的纤维状形式的量更高或量更低。

[0188] 还可以通过确定VHH抗原复合物的存在或不存在来进行步骤b)。

[0189] 所述适当的生物样本可以是脑活检或者尸脑组织。

[0190] 根据本发明的方面，其涉及在脑活检或尸检脑组织中检测淀粉样蛋白β沉积的方法，所述方法可包括用根据本发明的诊断剂溶液孵育福尔马林固定的组织。孵育后，诊断化合物标记组织中的淀粉样蛋白β沉积，通过任何标准的方法可以检测或观察染色的或标记
的淀粉样蛋白β沉积。这样的检测手段包括显微技术，比如明场、荧光、激光共聚焦和交叉极化显微镜。定量活检或尸组织中的淀粉样蛋白β的量的方法，涉及例如根据本发明的诊断
剂、或其水溶性、无毒的盐和活检或者尸组织匀浆进行孵育。由本领域公知的方法获得组合并进行匀浆。尽管其它诊断化合物比如酶、荧光团或者NMR或MRI造影剂也可以使用，有利
地，诊断化合物是放射性同位素标记的化合物。

[0191] 本发明还提供一种在受试者体内成像淀粉样蛋白β沉积的方法，包括步骤：

[0192] a)在受试者中施用可检出量的根据本发明的诊断剂，受试者优选是人，以及

[0193] b)通过成像方法，检测所述受试者中的诊断剂。

[0194] 根据本发明的这种方法允许确定受试者脑中淀粉样蛋白沉积的存在和位置，受试者优选是人。

[0195] 如此处所用，“可检出量”指的是所施用的诊断剂的量足以能够检测诊断剂对淀粉样蛋白β的结合。

[0196] 如此处所用，“成像有效量”指的是所施用的诊断剂的量足以能够成像所述诊断剂对淀粉样蛋白β的结合。

[0197] 用于检测体内淀粉样蛋白β沉积的成像方法包括非侵入性神经影像学技术，比如磁共振波谱(MRS)或成像(MRI)、或者伽马成像比如正电子发射断层扫描(PET)或单光子发
射计算机断层扫描(SPECT)。

[0198] 出于体内成像的目的，可用的检测仪器的类型是选择给定标记的主要因素。例如，基于钆、铁或者锰的造影剂，可以用来通过磁共振波谱(MRS)或成像(MRI)来检测连接至所述感兴趣的物质的根据本发明的VHH或VHH衍生物。放射性同位素比如19F还特别适合本发明方法中的体内成像。所使用的仪器的类型将指导对感兴趣的物质的选择。例如，所选的放射性核素必须具有能够被给定类型仪器检测到的衰变类型。另一个考虑涉及造影剂的或者放
射性核素的半衰期。对于放射性同位素，半衰期应该足够长，从而在脑的最大摄取时它仍然能够被检测到，但是也要足够短从而受试者不维持有害的辐射。可以使用伽马成像检测根
据本发明的放射性标记的VHH或者VHH衍生物，其中检测发射的适当波长的伽马辐射。伽马
成像方法包括，但不限于，SPECT和PET。优选的是，对于SPECT检测，所选择的放射性同位素将缺乏颗粒发射，但将产生140至200keV范围的大量光子。对于PET检测，放射性标记将是正电子发射的放射性核素，比如19F，其湮灭而形成两个511keV的伽马射线，伽马射线被PET相机检测到。

[0199] 通常，可检测的诊断剂的剂量将取决于以下考虑的不同而不同，比如患者年龄、条件、性别和疾病程度、禁忌症、如果有，伴随的治疗和其它变量，由本领域的技术人员调整。对受试者的施用可以是局部的或者系统性的，并通过静脉内、动脉内、鞘内(通过脊髓液)等实施。根据检查的身体部位，施用还可以是皮内或者腔内。足够的时间过去之后，以便于化合物与淀粉样蛋白β结合，例如30分钟至48小时，通过常规成像技术比如MRS/MRI、SPECT、平面闪烁成像、PET、和任何新兴的成像技术等来检查所研究的受试者区域。具体的规程将有必要地取决于如上所述的患者特定因素，并且取决于所检查的身体部位、所用的施用方法
和标记类型；具体程序的确定对于技术人员而言是常规的。

[0200] 本发明还提供作为诊断剂的连接至诊断化合物的根据本发明的寡肽。

[0201] 本发明还提供一种药物组合物，其包含上述所限定的治疗剂和药学上可接受的载体。

[0202] 如此处所用，“药学上可接受的载体”旨在包含与药学施用兼容的任何和所有溶剂、分散介质、涂料、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。合适的载体描述于最新版本的Remington's Pharmaceutical Sciences中，这是本领域标准的参考文本。这些载体或者稀释剂的优选示例包括，但不限于，水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。还可使用脂质体、阳离子脂质体和非水载体比如固定油。用于药物活性物质的这种介质和试
剂的使用是本领域公知的。除非任何传统介质或试剂和上述限定的治疗剂不兼容，其在本
发明组合物中的使用就可以考虑。

[0203] 本发明还提供根据本发明的VHH、VHH衍生物、治疗剂或者药物组合物作为药物，特别是用于治疗由淀粉样蛋白β沉积介导的疾病，比如阿尔茨海默氏病和唐氏综合征。

[0204] 本发明还提供预防或治疗由淀粉样蛋白β沉积介导的疾病比如阿尔茨海默氏病和唐氏综合征的方法，包括向有需求的受试者施用根据本发明的治疗剂或药物组合物。

[0205] 如此处所用，术语“治疗”包括出于治疗、治愈、缓解、减轻、改变、弥补、改善、提高或者影响疾病、疾病症状或者患病倾向的目的，向患者施用根据本发明的VHH、VHH衍生物、治疗剂或药物组合物，其中所述患者患有疾病、疾病症状或者患病倾向。

[0206] 术语“预防”是指由淀粉样蛋白β沉积介导的疾病比如阿尔茨海默氏病的进展得以降低和/或消除，或者由淀粉样蛋白β沉积介导的疾病比如阿尔茨海默氏病的发作得以延迟或消除。

[0207] 另一方面，本发明涉及根据本发明的VHH或VHH衍生物用于制备将上述限定的感兴趣物质递送穿过哺乳动物血脑屏障的肽载体的用途，所述哺乳动物血脑屏障优选是人血脑
屏障。

[0208] 本发明还提供作为治疗剂的根据本发明的连接至治疗化合物的寡肽。

[0209] 除了前述特征，本发明还包括其它特征，将通过以下描述得以显现，这涉及用于说明本发明的实施例以及附图。

附图说明

[0210] 图1显示使用VHH R3VQ在人石蜡切片上进行的淀粉样蛋白斑块的免疫组织化学染色。6F3D(Akiyama H.等人，1996，Neurosci lett.，206:169-72)用作参考抗Aβ抗体。

[0211] 图2显示使用VHH R3VQ在新鲜人AD脑组织上进行的淀粉样蛋白β斑块的免疫组织化学染色(A和B)。4G8(Wisniewski T.等人，1996，B.Biochem J.，313:575-80)用作参考抗Aβ抗体(C和D)。

[0212] 图3显示使用VHH R3VQ在新鲜脑转基因TauPS2APP小鼠组织上进行的淀粉样蛋白斑块的免疫组织化学染色(A)。4G8用作参考抗Aβ抗体(B)。

[0213] 图4显示在人脑提取物上以及在Aβ42上进行的Western印记，以VHH R3VQ显色(无酚红的Ham’s F12介质(Gibco)或者含有蛋白酶抑制剂[200μg/ml PMSF、2μg/ml胃酶抑素A、
4μg/ml亮抑酶肽、30μg/ml苄脒盐酸盐]的缓冲液A[PBS，pH 7.4、0.32M蔗糖、50mM Hepes、
25mM MgCl2、0.5mM DTT])。

[0214] 图5A显示立体定向注射VHH R3VQ之后，在转基因TauPS2APP小鼠石蜡包埋的切片中淀粉样蛋白β斑块的免疫组织化学染色。

[0215] 图5B显示图5A插图的放大。

[0216] 图6A显示立体定向注射R3VQ-N-(DOTA/Gd)1-2 2e之后，在转基因TauPS2APP小鼠石蜡包埋的切片中淀粉样蛋白β斑块的免疫组织化学染色。

[0217] 图6B显示图6A插图的放大。

[0218] 图6C显示远离注射部位之处，存在于丘脑中的淀粉样蛋白β斑块的标记。

[0219] 图6D显示图6C插图的放大。

[0220] 图6E显示在相同小鼠上用4G8抗体标记淀粉样蛋白斑块而进行的对照。

[0221] 图7A：将转基因TauPS2APP小鼠的脑浸入抗AβVHH-Gd 2e(R3VQ-N-(DOTA/Gd)1-2造影剂(0.02mg/ml，相当于0.01mM Gd)溶液之后，体外MR图像显示低信号的点(白色箭头)。

[0222] 图7B显示在相同小鼠上淀粉样蛋白斑块的MRI检测，通过Gd染色进行显色。

[0223] 图7B显示在相同小鼠上淀粉样蛋白斑块的MRI共定位，通过Gd染色进行显色(箭头)。

[0224] 图7C显示相同小鼠上淀粉样蛋白β斑块的免疫组织化学染色(箭头)。

[0225] 图7D是转基因TauPS2APP小鼠的脑浸入采用R3VQ-N-(DOTA/Gd)1-2 2e相同浓度的钆溶液(0.01mM)的对照。

[0226] 图8A：脑室内注射之后，抗AβVHH-Gd 2e(R3VQ-N-(DOTA/Gd)1-2；以1μg/μl的1μl/侧)显示海马中离体MR图像上低信号的点(白箭头)。

[0227] 图8B显示在相同小鼠上进行的淀粉样蛋白斑块的MRI共定位，通过Gd染色进行显色(箭头)。

[0228] 图8C显示在相同小鼠上进行的淀粉样蛋白β斑块的免疫组织化学染色(箭头)。

[0229] 图8D是转基因TauPS2APP小鼠注射采用R3VQ-N-(DOTA/Gd)1-2相同浓度的钆溶液(0.1mM)的对照。

[0230] 图9显示通过非位点特异性方法(A)和位点特异性方法(B)进行的标记的VHH(R3VQ)的合成。VHH 1和3在PBS/NaCl/咪唑缓冲液中洗脱自亲和柱。通过非位点特异性方法在缓冲液交换之后进行1的缀合(A)，以及，有缓冲液交换(方法1)或者没有缓冲液交换(方
法2)时通过位点特异性方法进行3的缀合(B)。连接位点显示在蛋白上。标记分别产生多分
散混合物(2f显示为示例，以及2e)和化学上明确的缀合物(5显示为示例)。n’＝每VHH的
DOTA/Gd的平均量(随机分布在不同位置)。m＝每VHH的DOTA/Gd的精确量(位于单个位点)。
总产率(括号里显示的)包括从亲和柱洗脱缓冲液中的蛋白开始的所有步骤(净肽含量)。马
来酰亚胺-(DOTA/Gd)3化合物4(C)的固相合成描述于图9(C)。通过传统的固相肽方法采用
Fmoc化学和HATU/DIEA作为偶联剂制备4。总产率表示在括号中。DOTA结构式显示在插图中。

[0231] 图10显示(A)抗AβVHH A7、B10、R3VE、R3VQ和F12的氨基酸序列比对；CDR1、CDR2、CDR3下划线显示，(B)R3VQ-SH 3的氨基酸序列，(C)R3VE-SH的氨基酸序列。

[0232] 图11显示VHH R3VQ-S-(DOTA/Gd)3的性质分析和评价(化合物5图9)，其是通过位点特异性缀合获得的。(A)HPLC/MS。(B)IEF。(C)iv注射之后，在脑中通过IHC检测评价VHH的BBB的穿过。和未缀合的蛋白R3VQ-SH的比较显示在A、B中。

[0233] 图12显示用R3VQ-S-(DOTA/Gd)3体外孵育之后淀粉样蛋白斑块的MRI检测。然而，在阴性对照PS2APP小鼠脑中没有检测到对比异常(A)，用R3VQ-S-(DOTA/Gd)3体外孵育
PS2APP小鼠脑之后，显示若干低信号的点(B，白色箭头)。这些低的信号和淀粉样蛋白斑块共定位，其中淀粉样蛋白斑块通过Gd染色程序所突出显示，对于通过MRI检测淀粉样蛋白斑块而言Gd染色程序是金标准阳性对照(C，白色箭头)。在7T光谱仪上实现实验。

[0234] 图13显示iv注射R3VQ-S-(DOTA/Gd)3之后淀粉样蛋白斑块的离体MRI检测。用PBS(阴性对照，A-B)或者R3VQ-S-(DOTA/Gd)3以20mg/kg(C)或50mg/kg(D)iv注射小鼠，5小时后处死。在提取的固定的脑中于11.7T时获得MR图像。相较于注射的脑而言(C和D，白色箭头)，阴性对照不显示强烈的对比异常(A和B)。相较于20mg/kg而言，50mg/kg时这些低信号的点
更强且更多。这些低信号的点和淀粉样蛋白斑块共定位，其中淀粉样蛋白斑块通过阳性对
照程序进行显色(E和F，白色箭头)。

[0235] 图14显示通过位点特异性缀合获得的VHH R3VQ-S-AF488的性质的体外分析和评价。淀粉样蛋白斑块上的(A)HPLC/MS。(B)SDS-PAGE。(C)IEF。(D)IHC。和未缀合的蛋白R3VQ-SH的比较显示于A、B、C。

[0236] 图15显示在2岁的PS2APP小鼠皮质表面局部脑输注R3VQ-S-AF488之后，淀粉样蛋白斑块和CAA的体内成像。箭头表示CAA的标记。标尺＝50μm。

[0237] 图16显示使用双光子显微镜的R3VQ-S-AF 488体内成像。(A)在2岁的PS2APP小鼠中iv注射R3VQ-S-AF488之后的脑中体内成像，其中采用距离皮质表面360μm深的投影体积
进行最大强度投影(MIP)重建。T0代表iv注射前的基线成像。标尺为50μm。空箭头显示血管Aβ，实箭头表示实质的Aβ沉积。(B)在2岁的PS2APP小鼠中iv注射R3VQ-S-AF488之后，注射后
3.5小时的脑体内成像。空箭头显示血管Aβ，实箭头表示实质的Aβ沉积。(C)在接受了iv注射R3VQ-S-AF488的PS2APP小鼠中，采用抗His mAb进行的淀粉样蛋白斑块的免疫组织化学染
色。在整个脑观察到由R3VQ的淀粉样蛋白斑块的免疫染色。(D)PS2APP小鼠中iv 10mg/kg和iv 50mg/kg的R3VQ-S-AF488之间淀粉样蛋白斑块的免疫染色的比较，显示对IHC信号的剂
量依赖效应。

[0238] 图17显示使用双光子显微镜的R3VE体内成像：碱性pI对于VHH穿过BBB是关键的。(A)R3VQ和R3VE化合物的IEF分析。对于VHH和缀合物而言，R3VE都比R3VQ碱性弱(对于R3VE-S-AF488而言，pI在7.5左右)。(B)相较于接受R3VQ-S-AF488的小鼠，只在接受静脉注射剂量
10mg/kg的R3VE-S-AF488的小鼠中观察到脑淀粉样蛋白血管病。(C)在iv注射有R3VQ-S-
AF488 10mg/kg和R3VE-S-AF488 10mg/Kg的小鼠中，采用抗His mAb的组织学染色的比较。

[0239] 图18显示在2岁的PS2APP小鼠中iv注射mAb 4G8-AF488(10mg/Kg)之后脑的体内成像。仅在血管中观察到mAb 4G8的存在。血管外信号是人为的，因为在参考通道中也观察到了(红色)。

具体实施方式

[0240] 实施例1：产生偶联至钆造影剂的抗-AβVHH及其体外/体内评价

[0241] 材料和方法

[0242] 1.VHH R3VQ的生产、选择和纯化

[0243] 抗原的制备以及在羊驼内体液免疫反应的诱导

[0244] Aβ42肽(Aβ42)(1mg Bachem)溶解在900μL H2O中并涡旋。添加100μL PBS 10×，在使用之前将混合物在室温孵育一个月。250μL混合物和250μL弗氏完全佐剂混合用于首次免疫，和250μL弗氏不完全佐剂用于随后的免疫。一只年轻的成年雄性羊驼(Lama pacos)在第0、21和35天用250μg免疫原进行免疫。在第50天，取血清样本，通过ELISA使用Aβ42作为抗原监测免疫反应。

[0245] 文库构建与筛选

[0246] 在第50天收集250ml免疫动物的血液，通过在Ficoll(Pharmacia)不连续梯度上离心来分离外周血淋巴细胞，并保存于-80℃直至进一步使用。按照之前在Lafaye P.等人
(1995，Res Immunol.，146:373-382)中描述的获得总RNA和cDNA，并且使用CH2FORTA4和
VHBACKA6引物通过PCR扩增编码VHH结构域的DNA片段，所述引物分别退火至VH基因的3′和
5′侧翼区域。使用特异于长铰链同二聚抗体的引物VHBACKA4和VHFOR36或者引物VHBACKA4
和LHH(5′GGACTAGTTGCGGCCGCTGGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG-3′)(SEQ ID NO.13)，扩增的产物用作第二轮PCR的模板。引物互补于扩增产物的5′和3′端，以及在VHH基因的末端并入
SfiI和NotI限制性位点。消化PCR产物并连接至噬菌体表达载体pHEN1。获得的文库包含两
个子文库，一个源自没有铰链的VHH DNA编码基因，另一个来自长铰链抗体基因。使用两个子文库生产和分离噬菌体，并随后合并。

[0247] 按照先前描述的(Lafaye P.等人，2009，Mol Immunol.46:695-704)，平行地用生物素化的Aβ1-42、Aβ1-40或者Aβ1-16肽针对反应性进行文库筛选。通过与各生物素化的肽在37℃下轻微搅动孵育1小时、然后在37℃下用链霉亲和素珠和混合物孵育15’，进行文库(1013转导单位)筛选。在三轮筛选中的每一轮分别使用不同的阻断剂：2％脱脂乳、1:4稀释的Licor、以及4％BSA。在每轮筛选降低所用的生物素化肽的浓度，分别用100nM、50nM和
10nM。使用HRP/抗M13单克隆抗体缀合物(GE Healthcare)通过标准的ELISA程序筛选噬菌
体克隆用于检测(见下面)。

[0248] VHH表达

[0249] 使用NcoI和NotI限制性位点，在载体pHEN1中所选纳米抗体的编码序列亚克隆至含有6-组氨酸标签的修饰细菌表达载体pET23。用IPTG(0.5mM)在16℃过夜诱导后，转化的
大肠杆菌BL21(DE3)LysS细胞在细胞质中表达VHH。根据制造商的说明，通过IMAC从细胞质
提取物使用带有Ni2+的HiTrap粗提柱(GE Healthcare)分离纯化的VHH，随后是配有
Superdex 75柱的尺寸排阻色谱(GE Healthcare)。在50mM磷酸钠缓冲液、300mM NaCl和
500mM咪唑缓冲液中洗脱VHH(特别是R3VQ(His)-NH2；化合物1，在图9中)。

[0250] 2.VHH R3VQ生化性质的描述

[0251] 免疫印迹

[0252] Aβ42肽重悬于含有8M尿素的 LDS样本缓冲液(Invitrogen)中。用NuPAGE Novex 4–12％Bis–tris凝胶(Invitrogen)通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离之后，半干转移到Hybond-C(Amersham)上，使用Xcell II印记模块(Invitrogen)进行Western印记。免疫化学反应之前，在4％脱脂乳溶液中封闭膜。用VHH进行膜的免疫印迹，用兔抗His标签
(eBioscience)多克隆抗体随后是过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白(Abcam)显色。最
后，使用化学发光试剂盒(GE Healthcare)对过氧化物酶活性进行可视化。

[0253] ELISA

[0254] 在4℃通过用稀释于PBS中的1μg/ml生物素化的A-β40或者A-β42(优选地A-β40)孵育过夜，来包被链霉亲和素包被的微滴定板(Thermo Scientific，丹麦)。用PBS中的0.1％Tween 20缓冲液洗板。VHH R3VQ稀释于PBS中的缓冲液0.5％明胶0.1％Tween 20。37℃孵育2h之后，分别在添加兔抗His标签多克隆抗体(eBiosciences)以及随后的过氧化物酶标记
的羊抗兔免疫球蛋白(Abcam)之前再次洗板，最后根据制造商规程用OPD(o-邻苯二胺盐酸
盐，Dako)显色。

[0255] 通过ELISA确定解离常数

[0256] 按照之前描述的(Friguet B.等人，1985，Immunol Methods，77:305-19)，确定VHH的结合亲和性。简言之，在4℃在溶液中，将各种浓度的Aβ肽(Aβ片段1–16、10–20、15-25、22–35和29–40)和已知量的VHH过夜孵育，直至到达平衡。通过初始ELISA校准确定所用VHH浓
度。各混合物(100μl)转移至之前包被有抗原的微滴定板的孔，在4℃孵育20分钟。用PBS中
0.1％Tween20的缓冲液洗板，通过添加β-半乳糖苷酶-缀合的羊抗兔Ig(Biosys，Compiè
gne，法国)和4-甲基伞形酮(methylumbelliferyl)α-D半乳糖苷(Sigma)检测结合的VHH。在
355nm激发之后，在460nm读取荧光(Fluoroskan，Labsystem，芬兰)。通过回归曲线的斜率估计KD，其中回归曲线是通过结合抗体的分数倒数相对于抗原摩尔浓度的倒数作图而获得
的。

[0257] 序列分析

[0258] 通过GATC Biotech测序VHH的编码DNA，用DNA strider处理序列。

[0259] 确定pI

[0260] 通过等电聚焦使用IEF 2-9凝胶(Invitrogen)确定VHH的pI。使用在正极施加样品的NEPGHE(非平衡pH梯度凝胶电泳)，因为其允许在包括pH 8.5至10.5的碱性凝胶范围进行
最佳蛋白分析。规程详见SERVAGel IEF 3-10说明手册。

[0261] 3.VHH R3VQ偶联至MRI造影剂以及合成造影剂的MRI性质的描述

[0262] 用1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)(螯合剂)将VHH R3VQ缀合至钆(MRI造影剂)。采用基于非位点特异性和位点特异性偶联的两个策略：

[0263] -第一策略包括步骤：(i)将螯合剂DOTA缀合至VHH(R3VQ-NH2 1)的赖氨酸残基，和(ii)随后与MRI造影剂即钆(Gd)进行螯合(参见图9A)。如反相高效液相色谱/质谱(RP-
HPLC/MS)所示，其产生缀合物R3VQ-N-(DOTA/Gd)n 2的复合多分散混合物，其中Gd和Gd:VHH化学计量范围的分布随机。通过改变DOTA缀合步骤的条件，用不同的DOTA/Gd密度制备多种缀合物(总产率60-67％)。通过IHC和MRI进行体内评价时，在脑室内注射之后R3VQ-N-
(DOTA/Gd)n缀合物能够识别小鼠中的淀粉样蛋白斑块。

[0264] -第二策略采用位点特异性方法，其涉及用马来酰亚胺化合物标记VHH R3VQ(参见图9B)。Cys-工程化的R3VQ(R3VQ-SH 3)从N至C端含有6-组氨酸标签、凝血酶切位点、R3VQ VHH序列随后是G3S间隔序列和三个额外的氨基酸CSA，Cys-工程化的R3VQ(R3VQ-SH 3)克隆
至载体pET23，从而允许高水平的表达。通过SDS-PAGE和RP-HPLC/MS显示单结构域产物纯化至同质(homogeneity)。R3VQ-SH的pI值在8.5-9的范围。使用9-芴甲氧羰基(Fmoc)化学通过固相肽合成来制备马来酰亚胺-(DOTA/Gd)3化合物4。当通过硫代加成缀合至马来酰亚胺-
(DOTA/Gd)3化合物，RP-HPLC/MS显示R3VQ-SH完全转化成明确的化合物R3VQ-S-(DOTA/Gd)3
5，其中产率是70％。相较于未标记的R3VQ-SH之一，R3VQ-S-(DOTA/Gd)3的pI略降低。在竞争性抑制实验中，确定R3VQ-SH和R3VQ-S-(DOTA/Gd)3的结合特性，实验涉及结合至ELISA板的Aβ40和可溶的Aβ40。对于R3VQ-SH和R3VQ-S-(DOTA/Gd)3给出50％结合抑制的Aβ40浓度计算得1μg/ml，表明添加DOTA/Gd不影响VHH结合特性。此外，根据转基因B6PS2APP小鼠中VHH-特异性免疫反应性的分布，抗原修复(retrieval)预处理之后R3VQ-SH在小鼠石蜡切片中显示
良好的免疫检测Aβ斑块的能力。

[0265] 3.1常规合成方法

[0266] 除非另有指明，氨基酸衍生物和试剂分别购自Novabiochem和Sigma-Aldrich。用6N HCl在110℃水解化合物20小时之后，通过定量氨基酸分析(AAA)使用Beckman 6300分析
仪确定肽和VHH溶液(净蛋白含量)的浓度。在连接有UV检测器2487(220nm)和Q-TofmicroTM
光谱仪(Micromass)且带有电喷雾离子(正模式)源(Waters)的Alliance 2695系统上进行
RP-HPLC/MS分析。在自动上样器上样本冷却至4℃。用乙腈+0.025％甲酸(A)/水+0.04％TFA+0.05％甲酸(B)进行线性梯度，持续10或者20min。所用的柱是XBridgeTM BEH300C18(3.5μm，2.1x100mm)(Waters)(梯度10-100％A)。源温度维持在120℃，去溶剂化温度为400℃。锥电压是40V。在添加有B的各自缓冲液中以0.4-1mg/ml的浓度注射样本。预期的Mr值对应着N端缺失Met和一个二硫键的蛋白平均质量。在相同光谱仪上以正模式通过直接注入(源温度
和去溶剂化温度分别维持在80℃和250℃)来记录Mr分析。以5μM的浓度，样本溶解在含
0.1％甲酸的水/乙腈(1/1)中。使用带有UV检测器的Agilent 1200 泵系统在220nm分析4的
纯度。所用的柱是Kromasil C18( 5μm，4.6x250mm)(AIT)，用乙腈(VWR)(C)/水+0.1％
TFA(VWR)(D)进行梯度20min。

[0267] 3.2.非位点特异性方法

[0268] 指明相对于反应基团的所有试剂的摩尔当量(5NH2每R3VQ和平均1的DOTA/R3VQ缀合物)。总产率(参见下表2)包括从亲和柱洗脱缓冲液中的蛋白1开始的所有合成步骤。通过终产物2a-f的实际量除以预期的量(净蛋白含量)来计算它们。

[0269] 洗脱自亲和柱的R3VQ(His)-NH2VHH 1在含有300mM NaCl的PBS缓冲液(PBS/NaCl)中透析。溶于PBS/NaCl(120μl)中的1，4，7，10-四氮杂十二烷-1，4，7，10-四乙酸单(N-羟基琥珀酰亚胺酯)(DOTA-NHS)(274μg，相对于氨基而言4eq)添加至1(480μl，0.60mg/ml)，在室温搅拌溶液。每15min取得等份(10μl)，用100mM Tris缓冲液pH 7.3(90μl)稀释，通过HPLC/MS分析来监测反应进程。3h之后，溶液冷却至4℃，使用Vivaspin 500离心过滤装置(3,
000MWCO PES)(Sartorius)，将缓冲液交换为0.4M乙酸Na缓冲液pH 5。在相同缓冲液(5μl)中的GdCl3(149μg，相对于平均DOTA基团而言45eq)添加至获得的DOTA-VHH缀合物(480μl)。
在室温搅拌溶液2.5小时。采用上述相同的Vivaspin装置，在4℃将缓冲液交换为PBS/NaCl，浓缩溶液以提供R3VQ(His)-N-(DOTA/Gd)0-2缀合物2f(105μl，1.48mg/ml)。总产率是67％。

[0270] 使用相同规程获得缀合物2e，除了DOTA-NHS是分批(portionwise)添加至1以外(每45min 0.5eq，相对于氨基而言总共5.5eq)。在室温搅拌溶液8h15。总产率是60％。

[0271] R3VQ(His)-NH21

[0272] AAA：Ala 15.8(16)，Arg 9.1(9)，Asp+Asn 13.4(13)，Glu+Gln 16.0(15)，Gly 13.4(14)，His 5.7(7)，Ile 3.1(3)，Leu 8.4(8)，Lys 4.1(4)，Phe 4(4)，Pro 6.1(7)，Ser
11.3(13)，Thr 10.0(11)，Tyr 4.8(5)，Val 11.1(11).

[0273] MS：15753.0996(C681H1053N209O216S4calcd 15752.3949)

[0274] R3VQ(His)-N-(DOTA/Gd)0-22f

[0275] AAA：Ala 16.0(16)，Arg 10.0(9)，Asp+Asn 12.8(13)，Glu+Gln 15.0(15)，Gly 13.8(14)，His 6.7(7)，Ile 3.0(3)，Leu 8.2(8)，Lys 4.5(4)，Phe 4(4)，Pro 8.5(7)，Ser
10.5(13)，Thr 10.1(11)，Tyr4.8(5)，Val 11.1(11).

[0276] MS：16293.1328((DOTA/Gd)1：C697H1076N213O223S4Gd calcd 16293.0263)

[0277] 16833.5586((DOTA/Gd)2：C713H1099N217O230S4Gd2calcd 16833.6576)

[0278] 3.3位点特异性方法

[0279] R3VQ-SH3的生产

[0280] 用NcoI和XhoI限制性位点，将Cys的工程化VHH(R3VQ-SH 3)编码序列克隆至修饰细菌表达载体pET23。用IPTG(0.5mM)在16℃过夜诱导后，转化的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS
细胞在细胞质中表达3。根据制造商的说明，通过IMAC从细胞质提取物使用带有Ni2+的
HiTrap粗提柱(GE Healthcare)分离纯化的VHH。在含有500mM咪唑的PBS/NaCl缓冲液中洗
脱3。

[0281] AAA：Ala 16.1(16)，Arg 10.2(10)，Asp+Asn 13.6(13)，Glu+Gln 11.9(11)，Gly 19.1(20)，His 6.0(7)，Ilc 3.1(3)，Leu 8.5(8)，Lys 2.2(2)，Phe 4(4)，Pro 4.3(4)，Ser
15.5(18)，Thr 9.5(10)，Tyr4.8(5)，Val 12.9(12).

[0282] MS：15723.4268(C671H1041N213O217S5calcd 15724.2820).

[0283] 马来酰亚胺-(DOTA/Gd)3 4的合成

[0284] 在固相上，分步从Fmoc-Gly-Wang树脂进行4的合成(143mg，0.093mmol)。使用2-(1H-9-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)(分别1.06和2.9eq)/二异丙基乙胺(DIEA)(分别2.2和6eq)作为偶联剂，以及二甲基甲酰胺(DMF)(Applied
Biosystems)作为溶剂，人工并入构建块1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三-叔丁基-乙酸-10-(N-α-Fmoc-N-ε-乙酰胺-L-赖氨酸)[Fmoc-Lys(DOTA(OtBu)3))-OH](1.1eq)
(Macrocyclics)和6-马来酰亚胺己酸(3eq)。用DMF中的DIC(3eq)并入Fmoc-Gly-OH(3eq)。
通过Kaiser测试(E.Kaiser等人(1980)Anal.Biochem.34，595-598)监测用Lys、Gly和马来
酰亚胺衍生物进行的偶联步骤，分别在3h、2h和1h内完成。用DMF中的20％哌啶除去Fmoc保护。第三赖氨酸衍生物之后，最后和6-马来酰亚胺己酸的偶联在四分之三的产物
(0.07mmol)上进行。在4℃肽-树脂悬浮于10ml TFA(Applied Biosystems)/水/三异丙基硅
烷(95/2.5/2.5v/v/v)中，在RT搅拌4h。树脂过滤后，浓缩溶液，用二乙醚沉淀粗产物。离心之后，沉淀物溶于水，冻干至119mg粗DOTA-肽的产率，这是通过NMR、MS和RP-HPLC(梯度10-
40％C，保留时间9.2min)分析的。

[0285] 1H NMR(D2O)：δ6.69(s，2H，CH Mal)，4.18(m，2H，2CHα)，4.08(m，1H，CHα)，3.87-3.78(m，6H，CH2Gly)，3.74-3.48(b，24H，CH2CO DOTA)，3.34(t，2H，CH26-Mal，J5，6＝0,
017Hz)，3.30-2.99(b，48H，CH2CH2N DOTA)，3.06(b，6H，CH2ε)，2.14(m，2H，CH22-Mal)，1.74-
1.53(m，6H，CH2β)，1.49-1.34(m，10H，CH2δ，CH23-Mal，CH25-Mal)，1.29-1.18(m，6H，CH2γ)，
1.16-1.06(m，2H，CH24-Mal).

[0286] 13C NMR(D2O)：δ177.11(1C，CONH Mal)，175.15，174.63，174.36(3C，CO Lys)，173.26(2C，CO Mal)，172.93(1C，COOH Gly)，171.48，171.21(2C，CO G1y)，163.04-162.68(4C，CONH DOTA)，134.22(2C，CH Mal)，120.59，117.69，114.79，111.90(TFA)，55.20-53.10(12C，CH2CO DOTA)，54.04，53.80，53.47(3C，CHα)，52.20-46.80(24C，CH2CH2NDOTA)，42.38，
41.00(3C，CH2Gly)，39.10(3C，CH2ε)，37.37(1C，CH26-Mal)，35.04(1C，CH22-Mal)，30.48，
30.24，30.23(3C，CH2β)，27.67，27.33，24.67(3C，CH23-Mal，CH25-Mal，CH2δ)，25.43(1C，CH24-Mal)，22.43，22.33，22.15(3C，CH2γ).

[0287] MS：[M+H]+1925.9888，[M+K]+1963.9391(C82H136N22O31calcd[M+H]+1927.1195，[M+K]+1965.2098).

[0288] DOTA-肽中间体(99mg)溶于0.4M乙酸Na缓冲液pH 5(41ml)，添加Gd(OAc)3.xH2O(123mg，相对于DOTA而言2eq)。在95℃搅拌25min之后，冷却溶液并加载至C18反相柱(2g，直径1.5cm)。用4体积的水洗柱，用三体积的水/乙腈1/1洗脱产物，冻干后获得79mg产物。通过反相快速色谱(30x200mm)纯化粗DOTA/Gd肽，使用梯度为乙腈+0.1％TFA/缓冲液D持续
40min，从5/95至35/65(20ml/min，保留时间18min)。主馏分冻干后，获得61mg的4，总产率
44％(总产率包括所有合成步骤，在基于加载在树脂上的第一Gly残基分离的产物4的净肽
含量上进行计算)。通过MS和RP-HPLC(梯度5-35％C，保留时间12.2min，纯度＞90％)分析4。

[0289] MS：2388.8889(C82H127N22O31Gd3calcd 2388.7901)。

[0290] R3VQ-S-(DOTA/Gd)3 5的合成

[0291] 洗脱自亲和柱的R3VQ-SH VHH 3在含有300mM NaCl的PBS缓冲液(PBS/NaCl)中透析。在水溶液(135μl)中的4(1.35mg，相对于每VHH的1巯基而言3eq)添加至3(1.5ml，PBS/NaCl pH 6.8中2mg/m1)，溶液在4℃搅拌3h。然后，使用Vivaspin 2000离心过滤装置(3,
000MWCO PES)(Sartorius)渗透溶液。用缓冲液B(20μl)稀释3和5的等份(20μl)用于RP-
HPLC/MS分析。此外，3和5的等份(10μl)稀释于100mM Tris缓冲液pH 7.3(90μl)用于ELISA分析。以70％的产率获得1ml的5(2.36mg/ml)。通过终产物5的实际量除以其预期的量(净蛋白含量)来计算。

[0292] 还在亲和柱洗脱缓冲液(含有500mM咪唑的PBS/NaCl)中直接进行相同反应，得到83％的总产率。因此，当缀合物直接在亲和柱洗脱缓冲液(PBS/NaCl/咪唑)中进行时，改善用于获得R3VQ/Gd缀合物的过程：i)步数降低至2，以及ii)总产率提高直至83％。这种过程改善还用另一VHH进行了验证(数据未显示)。

[0293] AAA：Ala 14.9(16)，Arg 10.2(10)，Asp+Asn 12.2(13)，Glu+Gln 11.1(11)，Gly 24.6(23)，His*(7)，Ilc 3.1(3)，Leu 8.5(8)，Lys 11.7*(5)，Phe 4(4)，Pro 4.8(4)，Ser
14.9(18)，Thr 9.1(10)，Tyr 5.0(5)，Val 12.6(12)。[*不能确定His，因为和铵共洗脱。因为在分析条件下和马来酰亚胺衍生物共洗脱，而高估了Lys]。

[0294] MS：18113.7383(C753H1168N235O248S5Gd3calcd 18113.0720)。

[0295] SDS-PAGE电泳

[0296] 使用NuPAGE Novex 4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)根据制造商说明进行聚丙烯酰氨凝胶电泳(PAGE)。

[0297] pI的确定

[0298] 通过等电聚焦使用IEF 2-9凝胶(Invitrogen)确定VHH的pI。使用在正极施用样品的NEPGHE(非平衡pH梯度凝胶电泳)，因为其允许在包括pH 8.5至10.5的碱性凝胶范围进行
最佳蛋白分析。规程详见SERVAGel IEF 3-10说明手册。

[0299] ELISA

[0300] 在4℃通过用稀释于PBS中的1μg/ml生物素化的A-β40或者A-β42(优选地A-β40)孵育过夜，来包被链霉亲和素包被的微滴定板(Thermo Scientific，丹麦)。用PBS中的0.1％Tween 20缓冲液洗板。对于非位点特异性策略，R3VQ-NH21、R3VQ-N-(DOTA/Gd)1-2 2e稀释于0.5％明胶0.1％Tween 20的PBS缓冲液中。37℃孵育2h之后，分别在添加兔抗His标签多克
隆抗体(eBiosciences)以及随后的过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白(Abcam)之前再次
洗板，最后根据制造商规程用OPD(o-邻苯二胺盐酸盐，Dako)显色。对于位点特异性策略，R3VQ-SH 3和R3VQ-S-(DOTA/Gd)3 5稀释于前述相同的缓冲液中，和生物素化A-β40或者A-β
42(优选地A-β40)孵育之后，加入单克隆抗His标签抗体(H1029-Sigma)，随后是过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体(ab97265-Abcam)，以及通过相同底物显色。

[0301] 亲和性确定

[0302] 通过测量能够对固定化的A-β40或者A-β42(优选地A-β40)识别给出50％抑制的可溶A-β40或者A-β42(优选地A-β40)肽的量，来确定3和5的结合性质。简言之，在4℃，将各种浓度的A-β40或者A-β42(优选地A-β40)和确定量的3或5过夜孵育，直至到达平衡。通过初始ELISA校准推定所用VHH的浓度。各混合物(100μl)转移至之前包被有抗原的微滴定板的孔，在4℃孵育15分钟。用含有0.1％Tween 20的PBS洗板后，通过添加抗His mAb(H1029-Sigma)随后是β-半乳糖苷酶羊抗鼠Ig和4-甲基伞形酮β-D半乳糖苷检测未结合的VHH。在355nm激发之后，在460nm读取荧光(Fluoroskan，Labsystem，芬兰)。

[0303] 免疫组织化学

[0304] 在石蜡冠状脑切片(5微米厚)上进行免疫组织化学，所述切片获自淀粉样变性的转基因小鼠模型(PS2APP小鼠)。用薄片切片机(Microm HM340E)制备切片。在二甲苯中对切片脱石蜡(5分钟，3次)，通过乙醇(100％×2，90和70％；5分钟/步)再水化和接触水。然后，用98％甲酸预处理5分钟，最后浸在水中5分钟。用3％过氧化氢和20％甲醇中和内源的过氧化物酶，以及用TBS-0.5％tween pH8BSA 2％对非特异性结合位点封闭30min。在下面的步
骤中，步骤之间将切片用TBS-tween漂洗3次，5min/次。然后，切片和稀释于TBS-tween中2μg/ml的一抗R3VQ-SH在4℃孵育过夜。然后，在室温用小鼠单克隆抗His标签抗体(H1029-
Sigma)处理切片2小时，最后根据制造商规程用Dako REALTM系统Peroxidase/DAB试剂盒
(Glostrup，丹麦)显色。水洗后，用Harris苏木精复染切片，并在水中再漂洗。封片
(mounting)之前，在分级的乙醇溶液中(70、90和100％)进行切片脱水，在二甲苯中清洗。

[0305] 3.4合成造影剂的MRI性质

[0306] 在配有运行控制台(console running)VnmrJ 2.3界面的7T-光谱仪(Agilent，USA)上评价造影剂的MRI性质。光谱仪配有700mT/m的啮齿动物梯度插件(rodent gradient insert)。鸟笼式正交线圈(直径：23mm)用于发射和接收。对于浓度0.2、0.15、0.1、0.05、
0.025、0.01和0mmol/l而言，根据R1(即1/T1)和R2(即1/T2)作为造影剂浓度的函数的线性
拟合，通过用如下等式来确定纵和横向弛豫r1和r2(每单位浓度试剂的弛豫速率的变化，表示作为MRI造影剂的“有效性”)：R1(C)＝R1(0)+r1x C，其中R1(C)是含有浓度C的造影剂的管中的R1，R1(0)是没有造影剂的管中的R1，以及C是造影剂的浓度。R2(C)＝R2(0)+r2x C用于计算r2。在血细胞比容管中进行样本成像。

[0307] T1计算基于七个连续的2D多-片旋转回声图像，其中采用了二十个TR值(TR＝0.021、0.04、0.06、0.08、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、3、4、
5sec)，TE＝14ms，Nex＝4，FOV＝10x10mm2，Mtx＝64x64，1切片，切片的厚度＝3mm，带宽＝
50kHz)。根据指数回归曲线(S＝1-exp(-TR/T1))计算驰豫时间的参数图谱，其中S是信号强度，TR是重复时间和T1是纵向的驰豫时间(ImageJ，MRI分析计算器，Karl Schmidt)。

[0308] 通过使用16个回声时间(TE＝10至160msec)；TR＝3300ms；Nex＝2；带宽＝100kHz，FOV＝10x10mm2，Mtx＝64x64，1切片，切片厚度＝3mm，T2计算基于2D多-回声多-切片旋转回声图像。根据指数回归曲线(S＝exp(-TE/T2))计算驰豫时间的参数图谱，其中S是信号强度，TE是回声时间和T2是纵向的驰豫时间(ImageJ，MRI分析计算器，Karl Schmidt)。

[0309] 4.通过免疫组织化学、生物化学和体外MRI体外描述VHHR3VQ和VHH R3VQ缀合物

[0310] 受试者

[0311] 来自AD患者(Braak V和VI期)的人皮质脑组织获自NeuroCEB脑库。该库和脑捐献计划有关，由患者协会财团(consortium of patients associations)(包括法国阿尔茨海
默氏病协会)运行，并根据法国法律的要求由研究和大学部(Ministry of Research and
Universities)宣布。根据法国生物伦理法，对脑捐献获得明确的书面同意。

[0312] 在B6TgPS2APP(Richards J.G.，2003，J Neurosci.，23:8989-9003)和APP/PS1dE9(Garcia-Alloza M.，2006，Neurobiol Dis.，24:516-24)转基因小鼠上进行临床前实验。严格按照EEC(86/609/EEC)和法国国立委员会(法令87/848)针对实验动物护理和使用的推荐进行动物实验规程。使用高剂量戊巴比妥钠(100mg/kg)处死动物，然后用10％缓冲的福尔
马林灌注固定。而后，摘除其脑，浸入福尔马林至少24小时，并储存在4℃。

[0313] 组织提取物

[0314] 根据Gong，Y.等人(2003，Proc Natl Acad Sci U S A，100:10417-10422)进行组织提取。在20体积无酚红的Ham’s F12介质(Gibco)或含有蛋白酶抑制剂(200μg/ml PMSF、2μg/ml胃酶抑素A，4μg/ml亮抑酶肽、30μg/ml苄脒盐酸盐)的缓冲液A(PBS，pH 7.4、0.32M蔗糖、50mM Hepes、25mM MgCl2、0.5mM DTT)中匀浆来自AD脑的额皮质(0.2g)，以100,000x g离心1h。沉淀在10体积的无酚红的Ham’s F12介质中或缓冲液A加蛋白酶抑制剂中再匀浆，并再离心。确定组合上清的蛋白浓度。然后，使用Centricon-10浓缩仪将蛋白的等份浓缩至
60μl或更小的体积。

[0315] 免疫印迹

[0316] 脑提取物或者A-β42肽重悬于含有8M尿素的 LDS样本缓冲液(Invitrogen)中。用NuPAGE Novex 4–12％Bis–tris凝胶(Invitrogen)通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离之后，半干转移到Hybond-C(Amersham)上，使用Xcell II印记模块
(Invitrogen)进行Western印记。免疫化学反应之前，在4％脱脂乳溶液中封闭膜。用VHH进行膜的免疫印迹，用兔抗His标签(eBioscience)多克隆抗体随后是过氧化物酶标记的羊抗
兔免疫球蛋白(Abcam)显色。最后，使用化学发光试剂盒(GE Healthcare)对过氧化物酶活
性进行可视化。

[0317] 免疫组织化学

[0318] 在固定的组织(石蜡包埋的或者冷冻切片)上、或者在未固定的新鲜组织(冷冻切片)上进行免疫组织化学。采用标准IHC规程并根据各组织条件进行调整。因为大多免疫染
色实验是使用石蜡切片进行的，此处给出石蜡包埋材料的详细规程。脑组织的免疫染色在4μm厚的石蜡切片上进行。使用人和小鼠组织(人AD患者，TauPS2APP小鼠[Grueninger F.等人，2010，Neurobiol Dis.，37:294-306]和PS2APP转基因小鼠[Richards，J.G.，等人2003，Journal of neuroscience 23，8989-9003])。二甲苯中对切片进行脱石蜡，通过乙醇
(100％，90％和70％)进行再水化，各个溶液5min，最后带至流动的自来水中进行10min。然后，在98％甲酸中孵育5分钟，在流动的自来水下再次洗涤，对于内源的过氧化物酶采用3％过氧化氢和20％甲醇进行淬灭，最后在水中洗涤。在TBS+0.5％tween中2％牛血清白蛋白中对切片孵育30min来封闭非特异性结合。然后应用适当稀释的一抗(5-10μg/ml的VHH His或者Strep标签)，在室温在潮湿室中过夜孵育切片。用TBS-Tween洗涤切片，并在室温与TBS-Tween中的1/1000二抗兔抗His标签或者自制的生物素化抗strep mAb C23-21孵育1小时。
然后，根据制造商说明用Dako REALTM检测系统Peroxidase/DAB的试剂进行切片的孵育。进行发色(DAB)显示，直至获得良好信噪比(大约5min)。用TBS-Tween洗涤后，切片用苏木精复染。为了标记斑块，将生物素化的4G8(Wisniewski T等人，1996，B.Biochem J.，313:575-
80)mAb(1/10000)或6F/3D(Akiyama H.等人，1996，Neurosci let.，206:169-72)mAb(1/
200)用作平行的阳性对照。

[0319] 体外MRI

[0320] 在B6TgPS2APP(Richards J.G.，2003，J Neurosci.，23:8989-9003)和APP/PS1dE9(Garcia-Alloza M.，2006，Neurobiol Dis.，24:516-24)转基因小鼠(n＝2，雌性)的脑上进行MRI。在配有运行控制台VnmrJ 2.3界面的7T-光谱仪(Agilent，USA)上记录MRI。光谱仪配有700mT/m的啮齿动物梯度插件。鸟笼式线圈(RapidBiomed，GmbH，德国)和小鼠的脑表面线圈(RapidBiomed GmbH，德国)分别用于发射和接收。

[0321] 膜在Triton 0.2％的PBS溶液中透化4小时后，脑样本和待测试造影剂浸在磷酸盐缓冲液(PBS)溶液中，成像之前在4℃储存至少24小时。针对扫描，脑置于装有
(3M，Cergy-Pontoise，法国)的紧闭塑料管中，其中是一种提供MR图像黑色背景
的基于全氟碳化物的质子流体。

[0322] MR图像基于3D梯度-回声序列，其用于(FLASH)获取T2*w图像(TR＝40ms，TE＝15ms，FA＝20°，Bw＝50kHz，Nex＝16，矩阵＝512x512x128，FOV＝13x13x13mm2，对于11h
39min的总Tacq而言产生25x25x100μm3的分辨率)。

[0323] Gd染色方法：淀粉样蛋白斑块检测的金标准方法

[0324] 这种方法用于在体外过程之后产生MR图像上所见低信号点之间的共定位，其是一种显示淀粉样蛋白斑块的金标准方法(Petiet A.等人，2012，Neurobiol Aging，33:1533-
44)。简言之，体外实验之后，样本浸入1:200稀释的PBS和0.5M钆特酸葡甲胺的溶液(2.5mM)中，在成像之前在4℃储存至少24小时。在和体外实验所用的相同条件下获得MR图像。

[0325] 5.VHH R3VQ和VHH R3VQ缀合物的体内评价

[0326] 受试者

[0327] 在之前描述的授权之下，VHH R3VQ和VHH R3VQ缀合物的体内评价在TauPS2APP(Grueninger F.等人，2010，Neurobiol Dis.，37:294-306)转基因小鼠上进行。

[0328] VHH的体内立体定位注射

[0329] 采用每注射2μl的VHH以0.5μl/min的速率，在TauPS2APP(n＝2雌性)转基因麻醉小鼠上进行立体定位注射。用异氟烷(1-2％)和空气(1L/min)混合物麻醉小鼠。将其置于立体定位框架中，用Dremel头颅双侧穿孔。Blunt Hamilton注射器用于注射MR造影剂。各个小鼠在各半球额皮质和海马中接收4次注射。额皮质的立体定位坐标是距离前囱前+0.86mm，距离中线横向±1.5mm，距离硬脑膜垂直-0.65mm。海马中的立体定位坐标是距离前囱后-
2.18mm，距离中线横向±1.5mm，距离硬脑膜垂直-1.8mm。注射后的2或24小时，麻醉小鼠，心脏内灌注PBS中的4％多聚甲醛(pH 7.6)。摘除脑，然后按照相同的固定方式(fixative)在4℃进行过夜固定。制备4μm厚的石蜡切片。使用上述标准的免疫组织化学方法的任一检测脑组织中VHH的存在。

[0330] 淀粉样变性小鼠模型中VHH的颈动脉内灌注

[0331] 在麻醉的TauPS2APP小鼠(n＝2，雌性)中进行颈动脉内的VHH施用。通过腹腔内一次性注射盐酸氯胺酮(Imalgen，1/10稀释的溶液50μl)和二甲苯(Rompun，1/40稀释的溶液
50μl)的混合物来进行麻醉。暴露颈总动脉，并用细的硅胶管(PP25_100FT；Portex，
Ashford，UK)进行插管。使用蠕动泵(型号PHD 2000；Harvard Apparatus，Boston，MA，USA)以恒定的速率将VHH输注至颈动脉中。

[0332] 侧尾静脉(lateral tail vein)注射

[0333] 将小鼠放在适当的倒扣烧杯中，留有孔以供尾穿出。注射前保温动物，尾浸入温水以便引起静脉的血管舒张。在动物尾静脉中插入导管(27G，Microflex，Vygon，法国)之后，进行MR图像前的注射，以便确保造影剂的施用适当。溶于200μl PBS的2mg VHH、VHH R3VQ-DOTA或者VHH R3VQ-S-(DOTA/Gd)3注射至侧尾静脉。

[0334] 体内MRI

[0335] 如前所述(参见体外MRI章节)，在配有运行控制台VnmrJ 2.3界面的7T-光谱仪(Agilent，USA)上进行体内MRI。MRI试验期间，用异氟烷(0.75-1.5％)和卡波金(95％O2-
5％CO2)混合物麻醉动物，监测动物呼吸率。卡波金用于降低来自循环血液的信号(Thomas
等人，2003)。

[0336] 使用高分辨率3D-梯度回声序列记录MR图像(29*29*117μm3，FOV：15*15*15mm3，Mtx＝512*512*128，TR＝30ms，TE＝15ms，翻转角＝20°，Nex＝1，带宽＝25kHz，获取时间：32min(Petiet，A.等人，2012，Neurobiol Aging，33:1533-44)。

[0337] T1计算基于七个连续的2D多-切片旋转回声图像，其中采用了5个TR值(TR＝0.4、0.75、1.5、2.5和5s，TE＝14ms，Nex＝1，FOV＝25x25mm2，Mtx＝128x128，6切片，切片的厚度＝1mm，带宽＝50kHz)。根据指数回归曲线(S＝1-exp(-TR/T1))计算驰豫时间的参数图谱，其中S是信号强度，TR是重复时间和T1是纵向的驰豫时间(ImageJ，MRI分析计算器，Karl
Schmidt)。根据脑的额部分中皮质区测量驰豫时间。

[0338] 离体MRI

[0339] 体内脑室注射VHH-S-(DOTA/Gd)3(1μg/侧)6h之后，灌注小鼠(PFA 4％)，进行离体MR图像之前提取其脑。针对各步骤，通过使用等同的Gd溶液(即0.1mM)进行对照。

[0340] 结果

[0341] 1.特异性抗AβVHH的文库构建、和选择

[0342] 通过PCR扩增VHH，并克隆至载体pHEN1。后续的转化产生约108克隆的文库。采用生物素化的Aβ1-42、Aβ1-40或者Aβ1-16肽经过3次筛选循环，通过噬菌体展示选择显示最佳亲和性的VHH。通过ELISA，从Aβ42筛选中测试了46个独立的克隆，从Aβ40中测试了192个克隆以及从Aβ16中测试了192个克隆。从Aβ42、Aβ40和Aβ16筛选中分别发现46/46、110/192和163/192的阳性。测序这些阳性克隆，分别鉴定45、65和118VHH序列。最后，选择VHH的3个家族(A7/B10、F12和R3VQ)(参见下表1)。分别对生物素化Aβ1-42、Aβ1-40或Aβ1-16进行筛选后，A7/B10VHH发现了11、64和117次。对生物素化Aβ1-42和Aβ1-40筛选后，VHH R3VE/Q分别发现34和1次，而Aβ16筛选后VHH F12发现了一次。

[0343] 这些VHH亚克隆至载体pET23或者载体pASK IBA2以便允许VHH分别和His-标签或者Streptavidin-标签进行高水平表达。获得细菌培养物的1–2mg/l产率。通过SDS-PAGE显示单结构域产物纯化至同质(数据未显示)；其pI值在8.5以上。随后用两种造影剂进行实
验。

[0344] R3VQ保存在4℃或者用甘油长期保存在-20℃。没有甘油时的冷冻不稳定。

[0345] DLS实验显示R3VQ在纯化之后是单聚体的并且不聚集。

[0346] 抗AβVHH A7、B10、R3VE、R3VQ和F12的氨基酸序列比对显示在图10。

[0347] 2.VHH R3VQ识别淀粉样蛋白斑块

[0348] VHH R3VQ对Aβ和淀粉样蛋白损伤的免疫反应

[0349] 检验了人AD脑和转基因TauPS2APP小鼠中VHH特异性免疫反应性的分布。抗原修复预处理之后，R3VQ显示出良好的对人石蜡切片中Aβ斑块和脑淀粉样蛋白血管病(CAA)的免
疫检测能力(图1)。用野生型小鼠没有观察到标记。比较石蜡包埋的组织上的结果，显示在自由活动式的振动切片机上，以及更重要的是在来自AD人脑和来自小鼠脑切片的新鲜组织
上而无需任何抗原恢复预处理，可以轻易实现用R3VQ进行的Aβ免疫检测(数据未显示)(图
2-3)。显著地，采用冷冻切片机上获得的自由活动式切片观察到强的背景信号和低的信/噪比，对于R3VQ IHC排除了采用这种材料。对于VHH A7/B10和F12没有检测到淀粉样蛋白斑块的免疫标记，不再用这些VHH进行实验。

[0350] 为了确认脑组织上VHH R3VQ的免疫反应性，在获自AD患者的脑提取物上进行western-印记免疫分析。用VHH R3VQ免疫检测到四条主要的带，对应着40至55kDa的Aβ寡聚物。平行地，用Aβ42肽，R3VQ识别6至17kDa的三条带，对应着单体、二聚体和三聚体(图4)。

[0351] R3VQ识别Aβ42的中间区域

[0352] 在采用Aβ42的抑制分析中，显示VHH R3VQ特异于纤维状的合成Aβ42肽。VHH R3VQ的KD为17nM。为了进一步确定VHH R3VQ识别的表位，针对Aβ40和对应着不同Aβ片段的肽(1–16、10–20、15-25、22–35和29–40)确定了50％抑制(IC50)所需浓度。VHH R3VQ不识别片段1–
16也不识别29–40。VHH R3VQ对Aβ16-35的IC50是16nM，表明VHH R3VQ识别位于Aβ42中央部分的表位。使用Roche提供的H4稳定克隆通过流式细胞术，R3VQ不识别APP(数据未显示)。

[0353] 立体定位注射之后，VHH R3VQ体内标记淀粉样蛋白斑块

[0354] 将2μg的VHH R3VQ立体定位注射至小鼠脑左半球的海马或皮质内(2只小鼠)。注射后2h或者24h之后，处死动物，收集脑切片。观察到淀粉样蛋白斑块的免疫染色，表明VHH R3VQ在体内标记纤维状Aβ。此外，注意到皮质中的棕色圈，这表明VHH R3VQ扩散至脑组织(图5A和5B)。

[0355] VHH R3VQ体内穿过BBB

[0356] 体内测试VHH R3VQ穿过BBB的能力。通过左颈动脉注射4mg的VHH，持续60分钟。注射后，在麻醉小鼠并灌注固定的1小时之前，允许将VHH输注至脑组织。在皮质、海马和丘脑观察到淀粉样蛋白斑块的免疫染色。在注射的皮质对侧的右半球这种染色微弱。

[0357] 实验显示未标记的R3VQ：1)在缓慢的颈动脉输注之后能够穿过BBB，2)体内特异性识别淀粉样蛋白斑块，以及3)对于MRI研究而言是良好的候选。

[0358] VHH R3VQ和已知VHH针对淀粉样蛋白β之间的比较

[0359] 下表1总结了通过用肽Aβ42、偶联至卵清蛋白的肽Aβ1-10或者纤维状形式的Aβ42免疫羊驼获得的VHH对淀粉样蛋白β的标记。除VHH R1.3、R1.5和R3.3通过核糖体展示进行选择之外，通过噬菌体展示进行VHH的选择。

[0360] 表1：通过用肽Aβ42、偶联至卵清蛋白的肽Aβ1-10或者纤维状形式的Aβ42免疫羊驼获得的VHH对淀粉样蛋白β的标记。VHH L1-3、L35、61-3、V31-1公开在Lafaye P.等人，2009，Molecular Immunology，49:695-704中。通过以上公开的方法获得其它VHH。

[0361]

[0362]

[0363] 结果显示，在受试的27种VHH当中，只有VHH R3VE/Q能够标记淀粉样蛋白血管病和淀粉样蛋白斑块，但是不标记淀粉样蛋白寡聚物。

[0364] 3.偶联至MRI造影剂的抗体

[0365] 非位点特异性方法：

[0366] 用NHS-激活的DOTA缀合至VHH赖氨酸残基。用Gd进行随后的螯合，从而在蛋白上产生具有各种DOTA/Gd比例的缀合物(表2)。通过HPLC/MS监测两个步骤，从而允许优化过程。
在室温几乎能够实现充分的螯合。

[0367] 由于没用甘油而在-20℃储存不稳定，两种起始缀合物(2a和b)没有显示Aβ结合活性。通过改变实验条件，在0.5-1mg的规模制备了4种新缀合物，回收良好(64-74％)。相较于第二系列(2e和f)，第一系列(2c和d)具有更高的DOTA/Gd密度。相较于ELISA中原始VHH 1Aβ的识别，2c和2d的结合低(～10％)，而2e和2f的结合几乎不受影响(50至100％)。这种差异可能是由于DOTA/Gd的整体密度更低和/或VHH的固有稳定性。

[0368] 表2：R3VQ(His)-N-(DOTA/Gd)缀合物的描述

[0369]

[0370]

[0371] a在室温进行反应。

[0372] b通过MS确定的。括号中是微量化合物。

[0373] 位点特异性方法：

[0374] 这种策略涉及用马来酰亚胺-(DOTA/Gd)3化合物4标记Cys-工程化的R3VQ VHH(R3VQ-SH 3)(SEQ ID NO 8)(参见图9B)。

[0375] DOTA表示为单酰半簇(moiety)。总产率表示在括号内。

[0376] 当通过硫代加成缀合4时，RP-HPLC/MS显示3完全转化成明确的化合物R3VQ-S-(DOTA/Gd)3 5，其中产率是79％。相较于未标记的R3VQ-SH之一，5的pI略微降低。在竞争抑制实验中确定R3VQ-SH和R3VQ-S-(DOTA/Gd)3的结合特性，实验涉及结合至ELISA板的Aβ40
和可溶的Aβ40。对于R3VQ-SH和R3VQ-S-(DOTA/Gd)3给出50％结合抑制的Aβ40浓度计算得1μg/ml，表明添加DOTA/Gd不影响VHH结合特性。此外，根据转基因B6.PS2APP小鼠中VHH-特异性免疫反应性的分布，抗原修复预处理之后R3VQ-SH在小鼠石蜡切片中显示良好的免疫检
测Aβ斑块的能力。

[0377] 用C端Cys残基构建R3VQ-SH，用于偶联至马来酰亚胺-DOTA/Gd(图9)。每L培养物表达15mg的纯化蛋白。然而，此前已经实现了多种构建体，并总结在以下：

[0378] -Strep-R3VQSSfree-Cys-Thr-His从C端至N端含有strep标签、VHH R3VQ其中Cys突变为Val和Ser、Cys、凝血酶切位点和his标签。这种蛋白以很低的产率表达(μg蛋白/l)。

[0379] -Tag-R3VQSSfree-Cys和His标签-R3VQSSfree-Cys从C端至N端含有标签(Strep或者His标签)、VHH R3VQ其中Cys突变为Val和Ser、以及Cys；两种蛋白以很低的产率表达(μg蛋白/l)。

[0380] -Tag-R3VQSSfree-Cys-Ser-Ala从C端至N端含有标签(Strep或者His标签)、VHH R3VQ其中Cys突变为Val和Ser、Cys、Ser、以及Ala。这些蛋白以很低的产率表达(μg蛋白/l)。

[0381] -Tag-Thr R3VQSSfree-Cys-Ser-Ala从C端至N端含有标签(Strep或者His标签)、凝血酶切位点、VHH R3VQ其中Cys突变为Val和Ser、Cys、Ser以及Ala。这些蛋白以很低的产率表达(μg蛋白/l)。

[0382] 4.用缀合有Gd造影剂的VHH R3VQ检测淀粉样蛋白斑块

[0383] 立体定位注射之后R3VQ-N-(DOTA/Gd)(1-2)体内标记淀粉样蛋白斑块

[0384] 将2μg的VHH R3VQ-N-(DOTA/Gd)1-2(2e)立体定位注射至小鼠脑左半球的海马或皮质(2只小鼠)。注射后4h，处死动物，收集脑切片。观察到淀粉样蛋白斑块的免疫染色，表明R3VQ-N-(DOTA/Gd)n在体内标记纤维状Aβ(图6A和6B)。图6C和6D显示标记存在于丘脑淀粉
样蛋白β斑块，其远离注射位点。在相同小鼠上用4G8抗体标记淀粉样蛋白斑块来进行对照(图6E)。

[0385] 体外成像

[0386] 浸入R3VQ-N-(DOTA/Gd)1-2溶液(2e造影剂的终浓度为0.02mg/ml，相当于0.01mM Gd)的TauPS2APP小鼠的脑成像，显示多个低信号的点(n＝2；图7A，箭头)，而这在相同条件中的对照小鼠脑的图像中不能被检测到(数据未显示)，低信号的点和Gd染色方法所显示的
淀粉样蛋白斑块共定位(图7B，箭头)。即便石蜡程序中所导致的失真不允许MRI和IHC之间
点对点的配准(point-to-point registration)，IHC仍证实了VHH-DOTA/Gd的大规模扩散
以及在相同区域中标记淀粉样蛋白斑块(图7C，箭头)。此外，在相同条件中的对照小鼠脑的图像中(n＝2；数据未显示)或在浸入相同浓度钆溶液的TauPS2APP小鼠脑中(即0.01mM；图
7D)没有检测到低信号的点。

[0387] 脑内、颈动脉内或者IV注射之后的离体成像

[0388] 脑室内注射后，在海马中抗AβVHH-Gd 2e(R3VQ-N-(DOTA/Gd)1-2)在离体图像上显示低信号的点(图8A，箭头)，这对应着淀粉样蛋白斑块，正如通过Gd染色在相同小鼠上所确定的(图8B，箭头)。即便石蜡程序中所导致的失真不允许MRI和IHC之间点对点的配准，IHC证实了相同区域内淀粉样蛋白斑块的标记(图8C，箭头)。此外，在和R3VQ-N-(DOTA/Gd)1-2所用的相同浓度(0.1mM)钆溶液注射的转基因TauPS2APP小鼠中没有检测到低信号的点。

[0389] 通过体外MRI评价R3VQ-S-(DOTA/Gd)3

[0390] 通过上述的位点特异性方法合成R3VQ-S-(DOTA/Gd)3。HPLC/MS、pI和IHC分析证实了R3VQ-S-(DOTA/Gd)3的生化特性(即，通过HPLC/MS进行的纯度、pI以及对Aβ的IHC反应性)(参见图11)。

[0391] 如上述，用0.1mg/ml的R3VQ-S-(DOTA/Gd)3体外孵育来自PS2APP小鼠的脑之后，评价R3VQ-S-(DOTA/Gd)3诱导MR造影改变(contrast modification)的能力(Richards，J.G.,
等人，2003，Journal of neuroscience：official journal of Society for
Neuroscience 23，8989-9003)(n＝2)。相较于阴性对照条件下的PS2APP小鼠的脑，7T获取的图像显示皮质中低信号的点(图12A和B)。为了证实这些低信号的点作为淀粉样蛋白斑块
的性质，脑进行Gd染色方法，其中Gd染色用作MRI检测淀粉样蛋白斑块的金标准方法(图
12C)。分析Gd染色方法之后获得的图像，允许将Gd染色所检测的淀粉样蛋白斑块和R3VQ-S-(DOTA/Gd)3所显示的低信号的点进行共配准(co-registration)(图12，白箭头)。这些结果表明R3VQ-S-(DOTA/Gd)3被动地扩散至尸检组织中并靶向淀粉样蛋白沉积，从而允许通过
MRI进行体外检测。

[0392] 外周(静脉)注射之后通过离体MRI评价R3VQ-S-(DOTA/Gd)3

[0393] 如上述，18月龄的PS2APP小鼠尾静脉中静脉注射(20mg/kg和50mg/kg)之后，然后研究R3VQ-S-(DOTA/Gd)3通过MRI显示淀粉样蛋白斑块的能力。在注射后5小时脑提取之后，获得静脉注射R3VQ-S-(DOTA/Gd)3的PS2APP小鼠在11.7T时取得的MR图像。不同于对照条件
的MR图像(用PBS注射的PS2APP小鼠)(图13A和B)，接受静脉注射R3VQ-S-(DOTA/Gd)3的离体
脑上获得的图像显示了多个低信号的点(图13C和D)。这些低信号的点和对比异常配准，其
中对比异常对应着金标准Gd染色方法所检测的淀粉样蛋白斑块(图13E和F)。根据双光子结
果，50mg/kg剂量时的这些点更强，表明R3VQ的脑穿透及其标记脑Aβ损伤的能力是剂量依赖性的。

[0394] 实施例2：偶联至荧光团试剂的抗AβVHH的产生及其体外/体内评价

[0395] 1.材料和方法

[0396] 此处除非另有指明，材料和方法和实施例1中所述相同。

[0397] 2.体内靶向Aβ-阳性损伤

[0398] 用AF488荧光团缀合R3VQ-SH

[0399] 为了实现R3VQ VHH和荧光团之间的偶联，如前所述进行位点特异性缀合。简言之，额外的半胱氨酸残基插入R3VQ序列的C端部分(称为R3VQ-SH)，从而允许马来酰亚胺-Alexa488(AF488)的C端硫代加成。由此，获得明确的缀合物，称为R3VQ-S-AF488，在VHH上
带有单个的AF488(图14)。

[0400] SDS-PAGE和HPLC/MS分析显示预期的分子量(698Da的增加)，其对应着分子上添加AF488。这些数据证实缀合物的标记和纯度(图14A和B)。

[0401] 使用IEF 3-10凝胶通过NEPHGE分析R3VQ-SH和R3VQ-S-AF488的等电点(pI)。和R3VQ的pI相似，R3VQ-SH的pI在8.5至9.5(图14C)。AF488添加至R3VQ-SH稍稍降低了其pI，在
8.3附近。然而，仍然是碱性的(图14C)。通过DLS测量R3VQ-SH和R3VQ-S-AF488的水力半径
(RH)。尺寸随着时间的分布显示对于R3VQ-SH的平均RH为2.66±0.0788nm，以及对于R3VQ-S-AF488的平均RH为2.34±0.106nm，表明二者在溶液中是单聚的形式。使用来自PS2APP小鼠
脑的切片，通过IHC体外证实了通过R3VQ-S-AF488进行的淀粉样蛋白斑块的免疫染色(图
14D)。

[0402] 局部脑输注之后的R3VQ-S-AF488扩散(双光子成像)

[0403] 在PS2APP小鼠上进行穿颅术，以获得右后皮质上的颅窗。剥离硬脑膜后，将15μg(10μl)的R3VQ-S-AF488直接施加至暴露的脑。通过双光子显微术跟踪R3VQ-S-AF488扩散约
2小时。脑实质中检测到淀粉样蛋白斑块和CAA的典型特异性染色，表明皮质周输注之后
R3VQ-S-AF488能够扩散并体内检测细胞外和血管Aβ阳性损伤(图15)。

[0404] 静脉注射之后R3VQ-S-AF488的扩散(双光子成像)

[0405] 首先通过MRI检测受试小鼠血脑屏障(BBB)的完整性(参见以下的对照实验)以确保没有可能会人为地提高静脉注射(iv)的VHH脑渗透的渗漏(leakage)。

[0406] 50-mg/kg剂量的R3VQ-S-AF488注射至一只小鼠的尾静脉。注射之后，使用双光子显微术在脑窗持续记录3.5小时的脑中缀合物的溢出和染色(z＝距离表面达360μm深)。图
16A显示相同区域内R3VQ-S-AF488在长达30min之内随着时间的体内成像重构(最大强度投
影-MIP)。在iv注射后几秒，观察到树枝状管的强染色，20min后剧烈降低，只有少数毛细管仍保留染色。这表明缀合的VHH在循环中半衰期短(10-20min)。注射后立即形成绿色荧光
“云”，并扩散至实质空间，表明和R3VQ立体定位注射之后所观察到的球面扩散的相似性(参见以上)。在iv注射后30min，开始显示淀粉样蛋白斑块。还观察到血管Aβ(CAA)。红色通道中没有信号，表明荧光信号是特异性的(数据未显示)，并不是因为常规的自发荧光。进一步的成像显示注射后斑块中Aβ沉积的体内染色以及管的维持长达3.5小时(图16B)，表明R3VQ-
S-AF488的脑半衰期扩展至数小时。静脉注射R3VQ-S-AF488后4小时，收集脑，制备5μm厚的石蜡切片。然后，用抗His mAb进行IHC以便确认R3VQ-S-AF488的扩散和淀粉样蛋白斑块标
记。整个脑观察到R3VQ-S-AF488的淀粉样蛋白斑块的免疫染色，其伴有棕色背景，这可以对应着VHH的扩散圈(图16C)。用更低剂量的R3VQ-S-AF488(10mg/kg)进行其它实验，观察到了Aβ沉积的体内检测，但是强度降低。这些结果表示R3VQ的脑渗透及其标记脑Aβ损伤的能力是剂量依赖性的，其被IHC证实了(图16D)。

[0407] VHH的碱性pI是其迁移穿过BBB能力的关键因素

[0408] 还制备了马来酰亚胺-AF488缀合的R3VE，其pI是7.5左右(图17A和B)(VHH R3VE如上述)。将10mg/kg剂量的R3VE-S-AF488静脉注射至PS2APP小鼠。注射后45分钟，只观察到脑淀粉样蛋白血管病，而没有标记淀粉样蛋白斑块(图17C)。R3VE-S-AF488静脉注射后4小时，收集脑，制备5μm厚的石蜡切片。然后，用抗His mAb进行IHC以便检测脑中固有R3VE-S-
AF488的存在(图17D)。相较于采用相同剂量的R3VQ-S-AF488获得的结果(参见上述以及图
16D)，在整个脑只观察到非常有限的淀粉样蛋白斑块标记，表明VHH表面存在的正电荷发挥这些抗体穿过BBB的脑渗透作用。

[0409] 对照实验

[0410] 在无淀粉样蛋白的小鼠中的评价

[0411] R3VQ-S-AF488静脉注射至野生型无淀粉样蛋白的C57BL/6小鼠。使用双光子显微术分析，脑实质中没有观察到特异性体内染色(数据未显示)。

[0412] 和常规IgG抗体的比较

[0413] PS2APP小鼠中iv注射mAb 4G8-AF488仅允许通过双光子成像检测CAA，而不能检测淀粉样蛋白斑块，这表明这种标准抗Aβ免疫球蛋白没有显著的溢出(图18)。

[0414] 用于双光子成像的在小鼠中血脑屏障完整性的评价

[0415] 使用DOTAREM iv注射(0.2ml Gd 500mM)测试用于双光子实验的PS2APP小鼠(2岁)的BBB渗透。这种MRI造影剂不能穿过BBB，除非病理情况导致局部的屏障渗漏。这种MRI检验也用于人类，在BBB破裂的区域显示信号的提高(V.M.Runge等人，American Journal of
Roentgenology 1994，162，431-435；M.A.Ibrahim等人，Investigative radiology，1998，
33，153-162)。测试小鼠中信号变化的缺失表明它们BBB的完整性。另两只年龄配对的
PS2APP小鼠用相同方法也进行MRI-评价，没有观察到BBB的破裂(数据未显示)。

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