技术领域
[0001] 本
发明属于制药领域，具体涉及聚乙二醇化黑色素纳米颗粒及其制备方法与用途。
背景技术
[0002]
铁过载病，又称血色病，是由于长期反复输血、地中海贫血、骨髓造血活跃、富含铁食物摄入过多等因素引起的
疾病，其可引起组织器官的功能异常、甚至危及生命。铁螯合剂或去铁剂通过动员贮库使过量的铁从尿液或
粪便排泄，可以用来
治疗铁过载病。目前，已有100多种铁螯合剂，临床上最常用的铁螯合剂是去铁胺。去铁胺与Fe3+螯合比为1:1，
给药方式为皮下或静脉注射，但由于去铁胺的体内
半衰期短，需频繁给药才能达到治疗效果，且
副作用多，易导致生长迟缓、内分泌功能障碍和周围神经病变等。
[0003] 黑色素是一种天然的色素，不仅广泛地存在于人和高等动物的
皮肤、毛发和眼球组织中，而且在一些
植物和昆虫的皮中也可以大量存在。目前，研究较多的有鱿鱼墨黑色素和泰和乌鸡黑色素等，其
生物相容性好，无毒安全。鱿鱼墨黑色素具有很强的阳离子螯合特性，主要通过如羧基和去质子化羟基等阴离子起作用，黑色素与
金属离子的结合能够起着保护细胞的功能。
[0004] 但是，自然界获得的黑色素，虽然能够与铁离子等金属离子螯合，但是由于其不易溶解于
水，并不能作为治疗铁过载病的药物。因此，研究新型的螯合作用较强、体内半衰期较长、毒副作用较小的铁螯合剂具有重要意义。
发明内容
[0005] 为此，本发明所要解决的是现有的铁螯合剂的体内半衰期较短、毒副作用较大的技术问题，从而提出一种聚乙二醇化黑色素纳米颗粒的制备方法，进而提出上述制备方法制备得到的聚乙二醇化黑色素纳米颗粒及用途。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：
[0007] 本发明提供一种聚乙二醇化黑色素纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
[0008] (1)取黑色素溶于
碱的水溶液，搅拌下加入酸调节至pH7.0，离心，洗涤，
冷冻干燥，得
水溶性黑色素纳米颗粒，备用；
[0009] (2)用端部含
氨基的聚乙二醇对所述水溶性黑色素纳米颗粒进行
表面处理；
[0010] 所述碱选自碱金属氢
氧化物、碱土金属氢氧化物、碱金属
碳酸盐、碱土金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐、碱土金属碳酸氢盐、碱金属
醋酸盐、碱金属
磷酸盐、碱金属醇盐、氨气、
氨水、胺中的至少一种；
[0011] 所述酸选自氢卤酸、
硫酸、
硝酸、磷酸、乙酸中的至少一种。
[0012] 本发明上述聚乙二醇化黑色素纳米颗粒的制备方法中，所述表面处理的步骤为：
[0013] 取所述水溶性黑色素纳米颗粒的水溶液，加入NH4OH溶液调节至pH9.0，加入pH＝9的端部含氨基的聚乙二醇的水溶液，离心，洗涤，冷冻干燥，即得。
[0014] 本发明上述聚乙二醇化黑色素纳米颗粒的制备方法中，所述端部含氨基的聚乙二醇为NH2-PEG2000-NH2。
[0015] 本发明上述聚乙二醇化黑色素纳米颗粒的制备方法中，所述碱为氢氧化钠，所述酸为
盐酸。
[0016] 本发明还提供一种利用上述制备方法制备得到的聚乙二醇化黑色素纳米颗粒。
[0017] 本发明上述聚乙二醇化黑色素纳米颗粒中，所述聚乙二醇化黑色素纳米颗粒的粒径为1～100nm。
[0018] 本发明上述聚乙二醇化黑色素纳米颗粒中，所述聚乙二醇化黑色素纳米颗粒的粒径为1～10nm。
[0019] 本发明上述聚乙二醇化黑色素纳米颗粒中，所述聚乙二醇化黑色素纳米颗粒为球形。
[0020] 本发明上述聚乙二醇化黑色素纳米颗粒在制备金属螯合剂中的用途。
[0021] 本发明上述聚乙二醇化黑色素纳米颗粒在制备治疗铁过载疾病的药物中的用途。
[0022] 本发明的上述技术方案相比
现有技术具有以下优点：
[0023] 本发明聚乙二醇化黑色素纳米颗粒的制备方法，通过优化选择表面处理步骤所用的聚乙二醇的具体种类、制备水溶性黑色素纳米颗粒步骤所用的碱和酸、各步骤的具体操作等，使得所制备的聚乙二醇化黑色素纳米颗粒的粒径为1～10nm，在水等
溶剂中分散性良好，可以与Fe3+螯合；ICR小鼠模型实验结果表明，其具有超强的铁排泄效率和良好的安全性，半衰期长达23h，减少了给药次数，延长了给药间隔，提高了用药的方便性，可以作为制备治疗铁过载疾病的药物。
附图说明
[0024] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体
实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
[0025] 图1(a)是本发明实验例中在含有Fe3+的
血浆中加入黑色素后的血浆
稳定性效果图；
[0026] 图1(b)是本发明实验例中在含有Fe3+的血浆中加入聚乙二醇化黑色素纳米颗粒后的血浆稳定性效果图；
[0027] 图2(a)是本发明实验例中正常小鼠的
肺部图；
[0028] 图2(b)是本发明实验例中注射聚乙二醇化黑色素纳米颗粒后小鼠的肺部图；
[0029] 图2(c)是本发明实验例中注射黑色素后小鼠的肺部图；
[0030] 图3是本发明实验例中聚乙二醇化黑色素纳米颗粒的平均血药浓度时间曲线图(n＝6)；
[0031] 图4是本发明实验例中各组小鼠的体重变化图；
[0032] 图5是本发明实验例中各组小鼠的尿粪铁含量比率图；
[0033] 图6是本发明实验例中小鼠的组织铁含量比率图；
[0034] 图中，PEGMN表示聚乙二醇化黑色素纳米颗粒，DFO表示去铁胺。
具体实施方式
[0035] 实施例1
[0036] 本实施例一种聚乙二醇化黑色素纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
[0037] (1)取20mg黑色素溶于10mL的0.1mol/L氢氧化钠的水溶液，搅拌下加入0.1mol/L盐酸调节至pH7.0，用离心
过滤器(MWCO＝30kDa)离心，洗涤，冷冻干燥，得水溶性黑色素纳米颗粒，备用；
[0038] (2)用NH2-PEG2000-NH2对所述水溶性黑色素纳米颗粒进行表面处理，即取5mL1mg/mL所述水溶性黑色素纳米颗粒的水溶液，加入28wt％NH4OH溶液调节至pH9.0，加入pH＝9的NH2-PEG2000-NH2的水溶液，搅拌12h，用离心过滤器(MWCO＝30kDa)离心，洗涤，冷冻干燥，即得。
[0039] 实施例2
[0040] 本实施例一种聚乙二醇化黑色素纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
[0041] (1)取20mg黑色素溶于10mL的0.1mol/L碳酸钠的水溶液，搅拌下加入0.1mol/L硫酸调节至pH7.0，用离心过滤器(MWCO＝30kDa)离心，洗涤，冷冻干燥，得水溶性黑色素纳米颗粒，备用；
[0042] (2)用NH2-PEG2000-NH2对所述水溶性黑色素纳米颗粒进行表面处理，即取5mL1mg/mL所述水溶性黑色素纳米颗粒的水溶液，加入28wt％NH4OH溶液调节至pH9.0，加入pH＝9的NH2-PEG2000-NH2的水溶液，搅拌12h，用离心过滤器(MWCO＝30kDa)离心，洗涤，冷冻干燥，即得。
[0043] 实施例3
[0044] 本实施例一种聚乙二醇化黑色素纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
[0045] (1)取20mg黑色素溶于10mL的0.1mol/L
碳酸氢钠的水溶液，搅拌下加入0.1mol/L乙酸调节至pH7.0，用离心过滤器(MWCO＝30kDa)离心，洗涤，冷冻干燥，得水溶性黑色素纳米颗粒，备用；
[0046] (2)用NH2-PEG2000-NH2对所述水溶性黑色素纳米颗粒进行表面处理，即取5mL1mg/mL所述水溶性黑色素纳米颗粒的水溶液，加入28wt％NH4OH溶液调节至pH9.0，加入pH＝9的NH2-PEG2000-NH2的水溶液，搅拌12h，用离心过滤器(MWCO＝30kDa)离心，洗涤，冷冻干燥，即得。
[0047] 实施例4
[0048] 本实施例一种聚乙二醇化黑色素纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
[0049] (1)取20mg黑色素溶于10mL的0.1mol/L磷酸钠的水溶液，搅拌下加入0.1mol/L磷酸调节至pH7.0，用离心过滤器(MWCO＝30kDa)离心，洗涤，冷冻干燥，得水溶性黑色素纳米颗粒，备用；
[0050] (2)用NH2-PEG2000-NH2对所述水溶性黑色素纳米颗粒进行表面处理，即取5mL1mg/mL所述水溶性黑色素纳米颗粒的水溶液，加入28wt％NH4OH溶液调节至pH9.0，加入pH＝9的NH2-PEG2000-NH2的水溶液，搅拌12h，用离心过滤器(MWCO＝30kDa)离心，洗涤，冷冻干燥，即得。
[0051] 实验例
[0053] BH5300S型
原子吸收
光谱仪(北京博晖创新光电技术股份有限公司)；
[0054] Milli-Q Advantage A10超纯水系统(美国Millipore)；
[0055] 5415R型低温超速离心机(德国Eppendorf)；
[0056] 黑色素(Sigma-Aldrich)；
[0057] 右旋糖酐铁(Sigma-Aldrich)；
[0058] FeCl3、HNO3均为分析纯，水为超纯水；
[0059] ICR小白鼠(江苏常州卡文斯实验动物有限公司)。
[0060] 2、实验方法
[0061] 2.1血浆稳定性实验
[0062] 取两份200μL正常小鼠的血浆，均加入一定量的FeCl3使血浆中Fe3+的浓度为100μg/mL，然后分别加入一定量的黑色素和聚乙二醇化黑色素纳米颗粒使血浆中其浓度均为100μg/mL，震荡，离心。
[0063] 2.2生物相容性实验
[0064] 取ICR小鼠6只，尾静脉注射右旋糖酐铁(150mg/kg)200μL/20g建立铁过载模型小鼠，一周后分为两组(N＝3)，分别尾静脉注射黑色素和聚乙二醇化黑色素纳米颗粒(100mg/kg)200μL/20g，观察。
[0065] 2.3半衰期的测定
[0066] 取ICR小鼠6只，尾静脉注射89Zr标记的黑色素溶液(200μL/20g)，使剂量达到25mg/kg。然后在各个时间点(0.25，0.5，1，1.5，2.5，3.5，4，6，15，24和48h)通过断尾取血20μL，以伽玛计数仪测定各个时间点的
放射性活度来计算各时间点的血药浓度，以药动学
软件DAS2.0分析药动学参数。
[0067] 2.4铁的排泄和组织铁含量的测定
[0068] 取50只ICR小鼠，其中40只通过尾静脉注射右旋糖酐铁(150mg/kg)200μL/20g建立铁过载模型，一周后以每组10只随机分成四组：聚乙二醇化黑色素纳米颗粒低剂量组、聚乙二醇化黑色素纳米颗粒高剂量组、去铁胺组和模型组，另外10只作为正常组。
[0069] 聚乙二醇化黑色素纳米颗粒低剂量组一次性尾静脉注射聚乙二醇化黑色素纳米颗粒(35mg/kg)200μL/20g，聚乙二醇化黑色素纳米颗粒高剂量组一次性尾静脉注射聚乙二醇化黑色素纳米颗粒(100mg/kg)200μL/20g；去铁胺组注射去铁胺(150mg/kg)200μL/20g，隔天给药共5次，给药总剂量为750mg/kg；模型组和正常组注射等体积的生理盐水。
[0070] 每天记录各组小鼠体重，第8天开始以代谢笼收集尿液和粪便；21天后眼眶
采血，分离血清及血浆储存于-20℃，解剖各组小鼠以收集各个器官(心、肝、脾、肺、肾、胰腺)，生理盐水冲洗，称重，储存于10％的福尔
马林中。
[0071] 尿液、粪便和各个器官中铁的含量用原子吸收光谱法来测定。取各个器官一部分称重，然后加入500μLPBS匀浆，接着加入800μL浓硝酸在电热板上于70℃消解。最终用来测定的样品(5mL)中HNO3的浓度为1％，铁标准溶液中HNO3的浓度也为1％。
[0072] 3、实验结果与分析
[0073] 3.1血浆稳定性实验结果
[0074] 在含有Fe3+的血浆中分别加入黑色素和聚乙二醇化黑色素纳米颗粒后震荡离心。
[0075] 如图1(a)所示，聚乙二醇化黑色素纳米颗粒组的血浆均匀存在；如图1(b)所示，黑色素组的血浆产生沉淀。
[0076] 3.2生物相容性实验结果
[0077] 图2(a)所示为正常小鼠的肺部；图2(b)是注射聚乙二醇化黑色素纳米颗粒后小鼠的肺部图；图2(c)所示为注射黑色素后小鼠的肺部图。
[0078] 各组铁过载模型小鼠在给药后，黑色素组小鼠立刻死亡，聚乙二醇化黑色素纳米颗粒组小鼠无异常。解剖后发现黑色素组小鼠肺部变黑，可能是由于栓塞而亡。
[0079] 3.3药时曲线及主要药动学参数
[0080] 根据各个时间点的血药浓度得到血药浓度-时间曲线，如图3所示。
[0081] 以DAS2.0程序对血药浓度数据进行拟合，确定其在体内符合二室模型，主要药动学参数如表1所示。
[0082] 由图3和表1可知，聚乙二醇化黑色素纳米颗粒的消除半衰期t1/2β为23.803±1.735h，远高于去铁胺的5min。
[0083] 表1聚乙二醇化黑色素纳米颗粒的主要药动学参数
[0084]
[0085] 注：t1/2α表示的为分布半衰期，t1/2β表示的为消除半衰期。
[0086] 3.4各组小鼠的体重变化
[0087] 各组小鼠的体重变化如图4所示。结果表明，各组小鼠的体重在给药前后的21天内均有增长的趋势，各组之间无显著差(P>0.05)。
[0088] 3.5小鼠的尿粪铁排泄
[0089] 以原子吸收光谱法来测定各组小鼠尿液和粪便中的铁含量，以模型组为标准(1.0)计算各组铁含量的比率，结果如图5所示。结果表明，与模型组相比，去铁胺和聚乙二醇化黑色素纳米颗粒治疗组的尿粪铁含量显著提高，而聚乙二醇化黑色素纳米颗粒高剂量组尿粪铁含量显著地高于去铁胺组。
[0090] 3.6不同组织的铁含量
[0091] 以原子吸收光谱法来测定各组小鼠各个组织(心、肝、脾、肺、肾、胰腺)的铁含量，以模型组为标准(1.0)计算各组铁含量的比率，结果如图6所示。
[0092] 结果表明，相比于模型组，去铁胺和聚乙二醇化黑色素纳米颗粒治疗组的组织铁含量显著下降，而聚乙二醇化黑色素纳米颗粒高剂量组的铁含量显著地低于去铁胺组。
[0093] 4、实验结论
[0094] 聚乙二醇化黑色素纳米颗粒生物相容性好，无毒安全，其血浆半衰期长达23h，相比于传统的治疗药物去铁胺的半衰期5min显著提高。
[0095] 以铁过载小鼠模型的实验结果可知，聚乙二醇化黑色素纳米颗粒可显著降低组织铁含量且尿粪铁含量的显著升高，说明聚乙二醇化黑色素纳米颗粒可有效的清除体内的铁。与去铁胺需频繁给药才能达到治疗效果相比，聚乙二醇化黑色素纳米颗粒(剂量大于35mg/kg)仅需一次给药即可达到优于去铁胺的疗效、且无明显的毒副作用，可以作为制备治疗铁过载疾病的药物。
[0096] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的
基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
