技术领域
[0001] 本
发明属于医药技术领域。具体而言，本发明提供了一种金纳米-脂质体复合纳米颗粒及其药物组合物和应用。
背景技术
[0002] 目前，在多种
肿瘤的
基因治疗中，常用载体主要有病毒载体和非病毒载体。虽然病毒载体展现了优秀的基因
转染效率，但是它们可能引发突变和其它致癌作用。再者，病毒载体的重复使用可能诱发免疫缺失。而常用的非病毒载体包括
聚合物，纳米颗粒(
磁性纳米粒子、金纳米颗粒、具有不同表面修饰的
碳纳米颗粒)和商业
试剂(Lipofectamine2000,Lipofectamine3000)等，转染效率较低，不能对癌症起到很好的基因治疗效果。而目前金纳米颗粒的使用很大程度的用于肿瘤的光热治疗，在基因治疗方面的应用也仅用于载体。
[0003] CRISPR/Cas9系统是一个多功能的基因编辑平台，在治疗具有挑战性的
疾病(如癌症)时有潜在的优势。但由于常用的Cas9蛋白尺寸较大，目前的常用载体很难对其进行高效的递送，限制了其在
基础研究和治疗的应用。
[0004] 因此，寻找一种合适的载体将治疗肿瘤的药物(如CRISPR/Cas9系统)高效地递送到肿瘤病灶，就显得尤为重要。
发明内容
[0005] 因此，基于上述已有技术的
缺陷，本发明的目的是提供一种金纳米-脂质体复合纳米颗粒及其药物组合物和应用。
[0006] 针对上述发明目的，本发明是通过下述技术方案实现的：
[0007] 本发明提供一种金纳米-脂质体复合纳米颗粒，其中，所述纳米颗粒为由脂质体囊泡包裹的金纳米颗粒，所述脂质体囊泡的表面修饰有二硬脂酰基磷脂酰
乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)，所述金纳米颗粒表面修饰有穿膜肽和质粒，所述脂质体囊泡由二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、2,3-二油
氧基丙基三甲基
氯化铵(DOTAP)和胆固醇组成。
[0008] 优选地，根据前述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒，其中，所述穿膜肽为HIV-1-transactivator转录肽。更优选地，根据前述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒，其中，所述金纳米颗粒的粒径为10～20nm。
[0009] 再优选地，根据前述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒，其中，所述金纳米颗粒和所述质粒的摩尔比为0.1～1000：0.1～10000000，优选为0.1～100：1～100000，更优选为0.1～10:5000～100000，还优选为1～1000：50000。
[0010] 还优选地，根据前述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒，其中，所述脂质体囊泡中的二油酰磷脂酰乙醇胺、2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵和胆固醇摩尔比为0.1～4：0.1～8：0.1～9，优选为0.2～4：0.1～5：0.1～6。
[0011] 本发明提供一种前述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒的制备方法，其中，所述方法包括：(1)按照配比，将穿膜肽，质粒与金纳米颗粒混合后静止获得第一
混合液，(2)按照配比，将步骤(1)获得的第一混合液与脂质体囊泡混合后静止获得第二混合液，(3)按照配比，将步骤(2)获得的第二混合液与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇混合获得所述脂质体纳米颗粒。优选地，步骤(1)、(2)的静止时间和/或(3)的混合时间为15-30分钟。其中，步骤(1)中穿膜肽、质粒与金纳米颗粒可在
水、PBS或
葡萄糖溶液中进行混合。步骤(3)中所述混合
温度可为55℃。
[0012] 优选地，根据前述的制备方法，其中，步骤(2)中的所述脂质体囊泡的制备方法包括：(a)按照配比，将二油酰磷脂酰乙醇胺、2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵和胆固醇溶于氯仿与甲醇的混合液中，(b)旋转
蒸发步骤(a)获得的所述混合液至只剩磷脂膜，(c)在步骤(b)获得的所述磷脂膜中加入水、PBS或葡萄糖，(d)超声至形成所述脂质体囊泡。优选地，步骤(b)中的
旋转蒸发温度为30-35℃。
[0013] 本发明提供一种药物组合物，其中，所述药物组合物包括治疗肿瘤的药物和前述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒。优选地，所述治疗肿瘤的药物选自以下的一种或多种：核苷酸、核苷酸衍
生物、核酸、核酸衍生物、多肽和蛋白。其中，所述金纳米-脂质体复合纳米颗粒可作为所述药物的载体。
[0014] 优选地，根据前述的药物组合物，其中，
[0015] 所述治疗肿瘤的药物包括核酸时，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示或如SEQ ID NO：1所示的任意一种核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列，优选地，所述核酸选自脱氧核糖核酸、小干扰核糖核酸和导向核糖核酸中的一种或多种；
[0016] 所述治疗肿瘤的药物包括蛋白时，所述蛋白为Cas9。
[0017] 在一些实施方案中，在所述药物组合物中，所述治疗肿瘤的药物为CRISPR/Cas9系统。其中，所述CRISPR/Cas9系统中sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，可以促进细胞凋亡(Gen Bank id:568815582:23678822-23690367)。
[0018] 本发明提供前述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒或前述的药物组合物在制备用于治疗肿瘤的药品或医疗产品中的应用。优选地，所述肿瘤为黑色素瘤、
前列腺癌或
乳腺癌。
[0019] 在采用前述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒作为载体的转染过程中，可以采用激光照射的方法提高细胞摄入率和转染效率。具体地，所述激光照射的时间可以为1～20分钟，所述激光照射的强度可以为10-100mW～24-48W/cm2，
激光器为500-540nm。
[0020] 本发明提供的金纳米-脂质体复合纳米颗粒作为载体具有较高的转染效果。通过采用所述金纳米-脂质体复合纳米颗粒，在不需要任何其他转染试剂的情况下，可以高效地将CRISPR/Cas9系统递送到细胞内，通过激光照射，提高了细胞摄入率和转染效率，从而达到多种肿瘤的基因治疗效果。本发明提供的药物组合物对于多种肿瘤具有较好的治疗效果。
附图说明
[0021] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0022] 图1示出了本发明提供的金纳米-脂质体复合纳米颗粒的制备以及治疗流程；
[0023] 图2示出了
实施例1所制备的纳米颗粒；其中，附图标记A为所述纳米颗粒的结构，附图标记B为质粒，金纳米颗粒与穿膜肽摩尔比50000：1：10制备的纳米颗粒；附图标记C为质粒，金纳米颗粒与穿膜肽摩尔比50000：1000：1000制备的纳米颗粒。
[0024] 图3示出了实施例1所述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒作为载体对黑色素瘤的治疗；
[0025] 图4示出了在不同照射时间和激光强度下，实施例8制备的金纳米-脂质体复合纳米颗粒的体外转染效果；
[0026] 附图标记说明：
[0027] 1、金纳米颗粒；2、穿膜肽；3、质粒；4、脂质体囊泡。
具体实施方式
[0028] 下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
[0029] 以下实施例中，除具体指明的试验材料、条件以及操作方法外，实施例中所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的。因此，本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
[0030] 以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
[0031] 试剂：十六烷基三甲基溴化铵CTAB，氯金酸，
硼氢化钠，
硝酸银，
硫酸，
抗坏血酸，二油酰磷脂酰乙醇胺，2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵，胆固醇，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)，氯仿，甲醇，购自上海西格玛奥德里奇；
[0032] sgPLK-1a质粒，穿膜肽HIV-1-transactivator转录肽：唯尚立德。
[0033] 实施例1：
[0034] 本实施例用于说明本发明提供的金纳米-脂质体复合纳米颗粒的制备方法。
[0035] 1.金纳米颗粒的制备
[0036] 通过
种子生长法制备得到金纳米颗粒分散液的过程如下：
[0037] (1)金种制备
[0038] 取十六烷基三甲基溴化铵CTAB溶液，搅拌条件下加入氯金酸(HAuCl4)的水溶液后，加入硼氢化钠(NaBH4)溶液，搅拌3min，得到金种备用；
[0039] 其中，CTAB的物质的量：氯金酸的物质的量：硼氢化钠的物质的量＝7500:24.8:6；
[0040] (2)生长液制备
[0041] 取CTAB溶液，加入氯金酸(HAuCl4)的水溶液、硝酸银水溶液、硫酸和抗坏血酸水溶液；
[0042] 其中，CTAB的物质的量：氯金酸的物质的量：硝酸银的物质的量＝5.5×104：278.3：1.3；
[0043] CTAB的物质的量：硫酸的物质的量：抗坏血酸的物质的量＝103：102：5.5；
[0044] (3)金纳米颗粒分散液的制备
[0045] 取步骤1制备的金种，加入到步骤2制备的生长液中，在30℃下生长12～15h，得到金纳米颗粒分散液。
[0046] 2.金纳米-脂质体复合纳米颗粒的制备
[0047] 二油酰磷脂酰乙醇胺、2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵和胆固醇摩尔比为1：1：0.8。
[0048] 所述制备方法具体如下：
[0049] (1)按照配比，将质粒，金纳米颗粒与穿膜肽(质粒，金纳米颗粒与穿膜肽摩尔比50000：1～1000：10～1000)混合后静止获得第一混合液，静止15-30分钟，[0050] (2)按照配比，将步骤(1)获得的第一混合液与脂质体囊泡(摩尔比1：1000-200：
1000)混合后静止获得第二混合液，静止15-30分钟，(3)按照配比，将步骤(2)获得的第二混合液与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(摩尔比1000：1-200：1)混合获得所述脂质体纳米颗粒，55℃下混合15-30分钟。
[0051] 其中，步骤(2)中的所述脂质体囊泡的制备方法包括：
[0052] (a)按照配比，将二油酰磷脂酰乙醇胺、2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵和胆固醇溶于氯仿与甲醇的混合液中，
[0053] (b)旋转蒸发步骤(a)获得的所述混合液至只剩磷脂膜，旋转蒸发温度为30-35℃，[0054] (c)在步骤(b)获得的所述磷脂膜中加入水，
[0055] (d)超声至形成所述脂质体囊泡。
[0056] 附图2示出了实施例1所制备的纳米颗粒；其中，附图标记A为所述纳米颗粒的结构，附图标记B为质粒，金纳米颗粒与穿膜肽摩尔比50000：1：10制备的纳米颗粒；附图标记C为质粒，金纳米颗粒与穿膜肽摩尔比50000：1000：1000制备的纳米颗粒。
[0057] 实施例2～10
[0058] 本实施例用于说明本发明提供的金纳米-脂质体复合纳米颗粒的制备方法。
[0059] 采用实施例1所述制备方法制备所述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒。
[0060] 其中，金纳米颗粒、质粒和穿膜肽摩尔比以及二油酰磷脂酰乙醇胺、2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵和胆固醇摩尔比如下表：
[0061]
[0062] 试验例1：
[0063] 本试验例用于说明发明提供的金纳米-脂质体复合纳米颗粒治疗黑色素瘤。
[0064] 采用实施例11制备的复合纳米颗粒进行试验。
[0065] 具体实验方法如下：
[0066] (1)按照配比(质粒，金纳米颗粒与穿膜肽摩尔比30000：1：100)，将质粒，穿膜肽与金纳米颗粒混合后静止获得第一混合液，静止15-30分钟，
[0067] (2)按照配比，将步骤(1)获得的第一混合液与脂质体囊泡混合后静止获得第二混合液(摩尔比1：5)，静止15-30分钟，
[0068] (3)按照配比，将步骤(2)获得的第二混合液与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇混合获得所述脂质体纳米颗粒(摩尔比800：1)，55℃下混合15-30分钟。
[0069] 其中，步骤(2)中的所述脂质体囊泡的制备方法包括：
[0070] (a)按照配比，将二油酰磷脂酰乙醇胺、2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵和胆固醇溶于氯仿与甲醇的混合液中，
[0071] (b)旋转蒸发步骤(a)获得的所述混合液至只剩磷脂膜，旋转蒸发温度为30-35℃，[0072] (c)在步骤(b)获得的所述磷脂膜中加入水，
[0073] (d)超声至形成所述脂质体囊泡。
[0074] 试验方法：实验采用雌性裸鼠(年龄6-8周，重量18-20g)，植入黑色素瘤细胞后1-2周，采用肿瘤原位注射的方式。实验组分为8组，每组四只。
给药16天，每两天给药一次，每只每次注射10μg。注射后3小时激光照射20分钟。
[0075] 试验结果如图3，本发明所提供方法可以达到较好的转染效果，能更好的起到对肿瘤的治疗效果。肿瘤的体积和重量，与对照组相比，有明显的降低。
[0076] 试验例2：
[0077] 本试验例用于说明发明提供的金纳米-脂质体复合纳米颗粒使用不同照射时间和激光强度的体外转染对比。
[0078] 采用实施例12制备的复合纳米颗粒进行试验。
[0079] 具体实验方法如下：
[0080] (1)按照配比，将质粒，穿膜肽与金纳米颗粒混合后静止获得第一混合液(质粒，金纳米颗粒与穿膜肽摩尔比10000：1：80)，静止15-30分钟，
[0081] (2)按照配比，将步骤(1)获得的第一混合液与脂质体囊泡混合后静止获得第二混合液(摩尔比2：5)，静止15-30分钟，
[0082] (3)按照配比，将步骤(2)获得的第二混合液与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇混合获得所述脂质体纳米颗粒(摩尔比200：1)，55℃下混合15-30分钟。
[0083] 其中，步骤(2)中的所述脂质体囊泡的制备方法包括：
[0084] (a)按照配比，将二油酰磷脂酰乙醇胺、2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵和胆固醇溶于氯仿与甲醇的混合液中，
[0085] (b)旋转蒸发步骤(a)获得的所述混合液至只剩磷脂膜，旋转蒸发温度为30-35℃，[0086] (c)在步骤(b)获得的所述磷脂膜中加入水，
[0087] (d)超声至形成所述脂质体囊泡。
[0088] 实验分别采用sgPLK-1a的质粒。514nm激光器照射不同时间以及不同功率之后，
培养箱中转染3小时，质粒浓度1μg/mL。
[0089] 试验结果如图4，从试验结果可见，与没有激光照射的实验组相比，经过激光照射，可以提高转染效率。
[0090] 尽管在此，已对本发明进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，所属领域技术人员可进行各个条件的适当变化。可以理解的是，本发明不限于所述实施方案概括和具体实例，其权利归于
权利要求的范围，并包括所述每个因素的等同替换。
