技术领域
[0001] 本
发明属于检测技术领域，尤其涉及土壤中抗生素残留检测方法。技术背景
[0002] 抗生素是由
微生物(包括细菌、
真菌、放线菌属)或高等动
植物在生长过程中所产生或由人工合成的具有抗病原体或其它活性的一类化学物质，能干扰细胞发育功能的化学物质(何良英等，2016；石奥，2016)。抗生素以前被称为抗菌素，事实上它不仅能杀灭细菌，而且对霉菌、衣原体、支原体、立克次氏体、螺旋体等其它致病微生物也有良好的抑制和杀灭作用。通俗地讲，抗生素就是用于
治疗各种非
病毒感染的药物(杨晓蕾，2012；杜
雪，2015)。
[0003] 半个多世纪以来，抗生素被广泛地应用在改善动物和人类生理健康等方面。其中兽用抗生素可治疗和
预防动物
疾病，还可刺激动物的生长发育，因此，抗生素在畜禽养殖和
水产养殖业中使用非常普遍(高丽红等，2013；隋倩文等，2015；曹慧等，2013)。兽用抗生素被动物摄入体内后，并不能完全地将其吸收降解，甚至90％是通过尿液和动物
粪便被排出体外(文一等，2015)。而随着“绿色食品”“无公害食品”的需求越来越高，以动物粪便为
有机肥的使用也越来越普遍，导致抗生素在土壤中不断积累，造成抗生素抗性基因(ARGs)污染日趋严重，对环境中的生物体包括人类将产生不良的影响(邹威等，2014；苏建强等，2013)。近年来，抗生素的滥用导致了潜在的环境问题，人们对抗生素的研究日趋重视，关于土壤环境中抗生素多残留检测的研究很多，但是由于抗生素在土壤环境介质中的残留浓度较低，并且土壤环境基质成分的复杂性会对其中抗生素的含量分析带来不可忽略的影响，基质效应也成为分析抗生素多残留和评价抗生素环境
风险的制约因素(许森，2015；王潇，2016)。
因此，为了评价抗生素在土壤中的环境影响，建立一种可靠的、准确的同时检测多类抗生素残留的分析方法尤为重要。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种土壤中抗生素残留检测方法，具有检测准确的特点。
[0005] 具体的方案如下：
[0006] 一种土壤中抗生素残留检测方法，包括以下内容：
[0007] 1)供试品样品制备：
[0008] 取待测土壤，加入提取剂，经超声、离心处理后取上清液；加热
蒸发所述上清液，得浓缩液；在浓缩液中加入复溶液，待残渣全部溶解后，调节至pH为8-10，再加入分散剂和萃取剂经离心取下层液体，然后经过滤即得供试品溶液；
[0009] 2)标准品样品制备：
[0010] 将抗生素标准品溶解于超纯水中，并利用超纯水稀释配制成浓度在0.1mg/L-100mg/L之间不同梯度浓度的抗生素标准溶液，然后过滤，得标准品溶液，取标准品溶液采用高效液相色谱-质谱法进行检测，绘制标准曲线，并求回归方程和相关系数；
[0011] 3)取上述标准品溶液和供试品样品注入超高效液相色谱-
串联质谱仪中进行检测；
[0012] 色谱条件包括：
[0013] 色谱柱：以十八烷基
硅烷键合硅胶为填充剂的C18色谱柱；
[0014] 流动相：采用A：
甲酸水溶液，B：乙腈作为流动相；
[0015] 梯度：0-2.5min，50％A+50％B；2.5-5min，60％A+40％B；5-8min，75％A+25％B；8-10min，60％A+40％B；
[0016] 质谱选用三重四级杆串联质谱。
[0017] 本发明一具体实施方式，所述抗生素选自包括磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺噻唑。
[0018] 本发明一具体实施方式，1)中，所述提取剂选自乙腈；复溶液选自pH为5-6的CaCl2溶液；分散剂选自甲醇；萃取剂选自一元
羧酸。
[0019] 本发明一具体实施方式，1)中，上清液的离心转速为3500-4500r/min；下层液体的离心转速为3000-3500r/min。
[0020] 本发明一具体实施方式，1)中，超声处理的条件为功率100-180W、时间35-50min。
[0021] 本发明一具体实施方式，2)中，标准曲线的浓度梯度为：0.1mg/L、1mg/L、5mg/L、15mg/L、45mg/L、80mg/L、100mg/L。
[0022] 本发明一具体实施方式，3)中，色谱条件还包括：
[0023] 检测器：紫外检测器或
二极管阵列检测器；
[0025] 流速：0.5-2ml/min；
[0026] 柱温：15-30℃；
[0027] 进样量：20μl。
[0028] 本发明一具体实施方式，3)中，质谱条件还包括：
[0029] 检测模式：多反应监测；
[0030] 扫描方式：正离子扫描；
[0032] 锥孔气流量：40L/h；
[0035] 本发明一具体实施方式，3)中，甲酸水溶液的浓度为0.1-0.5％。
[0037] 本发明本发明经过统计发现线性关系良好，相关系数γ＝0.9998；试验证明所建立的方法精
密度高、
稳定性强、重现性良好，能有效检测土壤中磺胺醋酰残留效价。
具体实施方式
[0038] 下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的
实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0039] 除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的
说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0040] 1、药剂：
[0041] 甲醇和乙腈(色谱纯，Fisher)；
[0042] 甲酸(98.0％，AcrosOrganics，USA)。
[0043] 2、仪器：
[0044] Acquity高效液相色谱仪；
[0045] C18色谱柱(1.8μm；2.1mm×100mm)购于美国Waters公司；
[0046] Qtrap4500三重四级杆串联质谱仪购于美国AB公司；
[0047] 高速冷冻离心机(HealForce，香港)；
[0049] 3、色谱条件：
[0050] 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18色谱柱；
[0051] 流动相：采用A：甲酸水溶液(0.1％)，B：乙腈作为流动相；
[0052] 流动相梯度：0-2.5min，50％A+50％B；2.5-5min，60％A+40％B；5-8min，75％A+25％B；8-10min，60％A+40％B；
[0053] 检测器：紫外检测器或二极管阵列检测器；
[0054] 检测波长：250-350nm；
[0055] 流速：0.5-2ml/min；
[0056] 柱温：15-30℃；
[0057] 进样量：20μl。
[0058] 4、质谱条件：
[0059] 质谱选用三重四级杆串联质谱(ABSCIEX4500Q)；
[0060] 离子喷雾电压：4.5kV；
[0061] 离子源温度：400℃；
[0062] 离子源气体1(GS1)，50psi；离子源气体2(GS2)50psi；
[0063] 采用正离子检测模式；
[0064] 脱溶剂气流量：900L/h；
[0065] 锥孔气流量：40L/h。
[0066] 5、样品制备
[0067] 1)供试品样品制备：
[0068] 取待测土壤，加入提取剂乙腈，在功率为100-180W超声处理35-50min并在转速为3500-4500r/min离心处理后取上清液；加热蒸发所述上清液，得浓缩液；在浓缩液中加入pH为5-6的CaCl2溶液，待残渣全部溶解后，调节至pH为8-10，再加入分散剂甲醇和萃取剂一元羧酸经转速为3000-3500r/min离心取下层液体，然后经过0.22微米滤
膜过滤即得供试品溶液；
[0069] 2)标准品样品制备：
[0070] 将抗生素标准品溶解于超纯水中，并利用超纯水稀释配制成浓度为0.1mg/L、1mg/L、5mg/L、15mg/L、45mg/L、80mg/L、100mg/L的抗生素标准溶液，然后过滤，得标准品溶液，取标准品溶液采用高效液相色谱-质谱法进行检测，以色谱峰面积为纵坐标、以磺胺类抗生素标准溶液浓度为横坐标将高效液相色谱法检测绘制成标准曲线，绘制标准曲线，并求回归方程和相关系数；
[0071] 6、流动相梯度选择：
[0072] 1)：0-4min，50％A+50％B；4-6min，60％A+40％B；6-8min，75％A+25％B；8-10min，60％A+40％B；
[0073] 2)：0-2.5min，50％A+50％B；2.5-5min，60％A+40％B；5-8min，75％A+25％B；8-10min，60％A+40％B；
[0074] 3)：0-1.5min，50％A+50％B；1.5-3.5min，60％A+40％B；3.5-6min，75％A+25％B；6-10min，60％A+40％B；
[0075] 1)梯度下得到的峰有严重的拖尾现象；2)梯度基本达到分离目标物的要求；3)梯度下的目标物不能很好的分离，比如磺胺醋酰未与杂质峰分离开，可导致积分不准确，影响分析结果。
[0076] 因此本试验选用2)洗脱梯度条件。
[0077] 实施例1
[0079] 土壤1：壤质
砂土pH4.28，有机质含量42.4g/Kg；
[0080] 土壤2：沙质壤土pH5.32，有机质含量45.1g/Kg。
[0081] 两种土壤的回收率和RSD(n＝3)，如表1：
[0082] 表1
[0083]
[0084] 结果表明，不同土壤均可达到满意的准确度和精密度，回收率在54-62％之间，RSD<15％。
[0085] 实施例2
[0086] 实际样品检测
[0087] 对当地一茄子地土壤中的磺胺醋酰进行检测
[0088] 仪器：高效液相色谱串联质谱仪；
[0089] 色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18色谱柱；流动相：采用A：甲酸水溶液(0.1％)，B：乙腈作为流动相；流动相梯度：0-2.5min，50％A+50％B；2.5-5min，60％A+40％B；5-8min，75％A+25％B；8-10min，60％A+40％B；进样量：20μL；
[0090] 质谱条件：检测模式:多反应监测正离子扫描；离子喷雾电压：4.5kV；离子源温度：400℃；离子源气体1(GS1)，50psi；离子源气体2(GS2)50psi；脱溶剂气流量：900L/h；锥孔气流量：40L/h。
[0091] 供试品溶液和标准品溶液参照上述5中所述方法制备。
[0092] 根据内标法计算磺胺醋酰残留效价。
[0093] 磺胺醋酰检出浓度分别为2.1μg·kg-1。
[0094] 结果分析：
[0095] 精密度
[0096] 取浓度为2mg/L的磺胺醋酰抗生素标准溶液，每次进样20μL，连续进样5次，按上述的色谱条件进行测定，记录峰面积，计算精密度。根据5次峰面积计算出其相对偏差值为0.15％，表明该方法精密度良好。
[0097] 稳定性
[0098] 取浓度为2mg/L的磺胺醋酰抗生素标准溶液，在室温下放置，分别在0h、5h、8h、14h、24h进样，每次进样20μL，按上述色谱条件进行测定，比较测定结果的稳定性。稳定性试验的5次进样的峰面积计算出其相对偏差值为0.21％，表明磺胺抗生素溶溶液在室温下放至24h比较稳定。
[0099] 重现性
[0100] 取吸附剂处理过样品，按上述中的方法处理样品，共做5个平行样，按上述色谱条件进行测定，计算相对标准偏差，比较重现性。重现性试验的5次进样的峰面积计算出其相对偏差值为1.43％，表明该方法具有良好的重现性。
[0101] 本发明经过统计发现线性关系良好，相关系数γ＝0.9998；试验证明所建立的方法精密度高、稳定性强、重现性良好，能有效检测土壤中磺胺醋酰残留效价。
[0102] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何
修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
