技术领域：
[0001] 本
发明涉及土壤功能微生物分离技术领域，尤其涉及一种利用土壤基质-膜系统分离土壤功能微生物的方法。背景技术：
[0002] 长期以来，人们利用纯培养技术对环境中的微生物进行调查研究和开发利用。研究表明自然界中的微生物分为可培养微生物和不可培养微生物。其中，可培养微生物能被目前的纯培养技术所培养，从而通过分子生物学技术手段准确了解微生物细胞的生命活动以及群落中各种微生物相互协调的规律，进而将可培养功能微生物准确地、高效地应用于环境修复。
[0003] 目前为了改善土壤环境
质量，对土壤功能微生物的研究越来越广泛，传统方法筛选出的多环芳
烃降解的微生物菌株主要为Pseudomonas，属于gamma-Proteobacteria，不能够适应贫营养的环境，对土壤环境改善有限。发明内容：
[0004] 本发明的目的是针对
现有技术的
缺陷，提供一种能够解决上述问题的利用土壤基质-膜系统分离土壤功能微生物的方法。
[0005] 实现本发明目的的技术方案是：一种利用土壤基质-膜系统分离土壤功能微生物的方法，包括以下步骤：
[0006] (1)系统的构建：取5g过筛网的土滴入600～1000μl灭菌高纯
水，制备泥浆；制作TCI(Tissue culture in-sert)倒扣于多孔板的板孔中央，将PC(聚
碳酸酯膜，φ25mm 0.22μm)膜灭菌后，制成菲负载的膜；将土壤中
微生物接种在PC膜上，并将PC膜移至倒扣的TCI上面，将多孔板的
盖子盖合在多孔板上，盖子四周用
封口膜封闭，置20℃恒温培养观察；
[0007] (2)扩大培养：取1/3接种微生物的PC膜置于500μl生理盐水中震荡2min，7920×g下离心10min，弃PC膜，使沉淀悬浮于生理盐水中形成悬浮液，吸取120μl上述悬浮液加入1000μl生理盐水中，混匀，再吸取120μl稀释后的菌液加入1000μl生理盐水中，如此制成10-1～10-7系列稀释梯度的菌液；取无菌96孔板，其列编号为1～12，行编号为A～H；1～3列加入土壤浸提液培养基，4～6列加入RAVAN培养基、7～9列加入LB培养基、10～12列加入
牛肉膏蛋白胨培养基，各培养基的加入量均为200μl/孔；将10-1～10-7稀释梯度的菌液依次加入A～G行，每行对应一个稀释级，菌液接种量为80μl/孔。第H行不接种菌液，作为空白对照；置于20℃恒温培养，每隔1d将96孔板置于多功能酶标仪上读取各孔在600nm处的吸光度值，以记录微生物的生长状况，扩大培养10～12d；
[0008] (3)分离：扩大培养10～12d后，在无菌条件下，在96孔板的每个微孔中加入10μl 10mg/ml的菲-甲醇溶液，待甲醇完全挥发后，在每个微孔中加入225μl四唑紫-
基础培养基；
从原培养板中的每孔中各取25μl菌液移至菲平板中，以分离菲降解菌群，并将菲降解菌落进行菌落PCR扩增，产物送基因公司测序，确定微生物种属，所述菲平板由下述步骤制成，将
400μl 2mg/ml菲-甲醇溶液涂于固体基础培养基表面，待甲醇在超净台上挥发殆尽得到菲平板；将96孔板置于20℃每隔1d在多功能酶标仪上读取各孔在590nm处的吸光度值，直至吸光度达到稳定，用板孔平均吸光度值 来表征微生物对菲的利用状况。
[0009]
[0010] 其中：Ri为第i孔的吸光度值；Ri0为第i孔在初始时刻的吸光度值。n为转接了菌液的孔数：对于BS2-1，n＝60；BS5-1，n＝72；BS6-1，n＝24。
[0011] 优选地，所述步骤(1)中筛网直径为2-3mm。
[0012] 优选地，所述步骤(1)中菲负载的膜的菲含量为0.06-0.08mg。
[0013] 优选地，所述步骤(2)中土壤浸提液由如下步骤制成，取10g土于100ml高纯水中，室温下6×g震荡0.5h，沉淀10min，取上清用0.45μm滤
膜过滤。
[0014] 优选地，所述步骤(2)中RAVAN培养基如下步骤制成，取
葡萄糖5g，蛋白胨5g，
酵母提取物5g，
醋酸钠5g，丙
酮酸2g，
柠檬酸三钠5g溶于1L去离子水，灭菌，使用前稀释100倍。
[0015] 优选地，所述步骤(2)中LB培养基由下述步骤制成，取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g溶于1L去离子水，灭菌，使用前稀释100倍。
[0016] 优选地，所述步骤(2)中牛肉膏蛋白胨培养基由下述步骤制成，取牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，溶于1L去离子水，灭菌，使用前稀释100倍。
[0017] 本发明的有益效果是：
[0018] 本发明提供的利用土壤基质-膜系统分离土壤功能微生物的方法，筛选得到的微生物主要为Sphingomonas属，与传统方法筛选出的菌株相比，其降解基因在菲的降解中起着更为重要的作用，筛出的主要微生物不但存在于污染的土壤中，其亦广泛存在于海洋、大气以及各种极端环境中，能够适应贫营养的环境，并且可以利用多种底物，其更适宜在土壤基质-膜这种模拟自然条件下生长，通过土壤基质-膜系统筛选得到的微生物资源在进一步富集并应用于改善土壤环境方面起到重要作用。具体实施方式：
[0019] 下面对本发明的较佳
实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
[0020] 实施例1
[0021] 一种利用土壤基质-膜系统分离土壤功能微生物的方法，包括以下步骤：
[0022] (1)系统的构建：取5g过筛网(筛网直径为2mm)的土滴入600μl灭菌高纯水，制备泥浆；制作TCI倒扣于多孔板的板孔中央(板孔中注入高纯水防止变干)，泥浆与TCI的膜间不能有气泡，将PC膜灭菌后，制成菲负载的膜(菲含量为0.08mg)；将土壤中微生物接种在PC膜上，并将PC膜移至倒扣的TCI上面(PC膜与TCI之间不能有气泡)，将多孔板的盖子盖合在多孔板上，盖子四周用封口膜封闭，置于20℃恒温培养观察；
[0023] 通过土壤基质-膜系统对土壤中菲降解微生物进行富集与筛选，运用
荧光显微镜观察微生物原位生长状态，分别在培养的第12d、24d将PC膜取出，在荧光显微镜下进行微菌落(Microcolony)的观察：在无菌湿润条件下，将PC膜三等分并用0.1％浓度琼脂糖
覆盖固定膜表面微生物并
风干；在盖玻片上滴8μl甘油缓冲液及2μl核酸染料100×Super Green II(北京泛博生化)混合均匀，将盖玻片盖在膜上，避光
染色10min，荧光显微镜(Leica公司)下观察(蓝光为激发光，被染色微生物发出绿色荧光，放大倍数1000倍)。在培养12d时，微菌落以几十个微生物聚集为主，微菌落生长状态未见明显差异；而培养24d后，PC膜上微菌落更大、微生物数量更多。
[0024] (2)扩大培养：微生物在PC膜上生长后，为进一步筛选多环芳烃降解微生物，需先将其在营养培养基中富集，由于微生物在不同培养基中生长的状态不同，因此本研究选取4种培养基进行扩大培养。具体操作步骤：取1/3接种微生物的PC膜置于500μl生理盐水中震荡2min，7920×g下离心10min，弃PC膜，使沉淀悬浮于生理盐水中形成悬浮液，吸取120μl上述悬浮液加入1000μl生理盐水中，混匀，再吸取120μl稀释后的菌液加入1000μl生理盐水中，如此制成10-1～10-7系列稀释梯度的菌液；取无菌96孔板，其列编号为1～12，行编号为A～H；1～3列加入土壤浸提液培养基，4～6列加入RAVAN培养基、7～9列加入LB培养基、10～12列加入牛肉膏蛋白胨培养基，各培养基的加入量均为200μl/孔；将10-1～10-7稀释梯度的菌液依次加入A～G行，每行对应一个稀释级，菌液接种量为80μl/孔。第H行不接种菌液，作为空白对照；置于20℃恒温培养，每隔1d将96孔板置于多功能酶标仪上读取各孔在600nm处的吸光度值，以记录微生物的生长状况，扩大培养10d；
[0025] 其中，所述土壤浸提液由如下步骤制成，取10g土于100ml高纯水中，室温下6×g震荡0.5h，沉淀10min，取上清用0.45μm滤膜过滤；RAVAN培养基如下步骤制成，取葡萄糖5g，蛋白胨5g，酵母提取物5g，醋酸钠5g，
丙酮酸2g，柠檬酸三钠5g溶于1L去离子水，灭菌，使用前稀释100倍；LB培养基由下述步骤制成，取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g溶于1L去离子水，灭菌，使用前稀释100倍；牛肉膏蛋白胨培养基由下述步骤制成，取牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，溶于1L去离子水，灭菌，使用前稀释100倍。
[0026] 对PC膜上的菲降解菌在4种不同培养基(土壤浸提液、RAVAN培养基、LB培养基、牛肉膏蛋白胨培养基)中分别进行富集，培养10d后，在不同培养基中生长的微生物数量均进入稳定期，微生物在RAVAN培养基中的生长速度最快，且稳定后微生物数量最多；在LB培养基中的生长速率较快，而在土壤浸提液与营养培养基的生长速度则最慢。这说明对于在土壤基质-膜系统中生长的微生物，0.01×RAVAN培养基最适合其生长。
[0027] (3)分离：PC膜上的微生物在96孔板中扩大培养12d后，可将菌液接种至以菲为唯一碳源的新板中，以筛选菲降解微生物。为了观察微生物生长状况，在基础培养基中加入四唑紫(tetrazolium violet)，当菲被降解时，四唑紫与微生物体内的酶结合显紫色并在590nm处显示吸收峰：在无菌条件下，在96孔板的每个微孔中加入10μl 10mg/ml的菲-甲醇溶液，待甲醇完全挥发后，在每个微孔中加入225μl四唑紫-基础培养基(当菲被降解时，四唑紫与微生物体内的酶结合显紫色并在590nm处显示吸收峰)；从原培养板中的每孔中各取
25μl菌液移至菲平板中，以分离菲降解菌群，并将菲降解菌落进行菌落PCR扩增，产物送基因公司测序，确定微生物种属，所述菲平板由下述步骤制成，将400μl 2mg/ml菲-甲醇溶液涂于固体基础培养基表面，待甲醇在超净台上挥发殆尽得到菲平板；将96孔板置于20℃每隔1d在多功能酶标仪上读取各孔在590nm处的吸光度值，直至吸光度达到稳定，用板孔平均吸光度值R来表征微生物对菲的利用状况。
[0028] 为避免菲平板分离选择微孔的随机性，更好的评价利用土壤基质-膜系统分离土壤功能微生物的方法对于功能微生物筛选的效果及比较不同培养基之间的差异，进一步对菲平板分离后的混合菌群进行PCR-DGGE分析，为解决96孔板中菌液体积有限的问题，采用热裂解法提取DNA：取96孔板微孔中的菌悬液100μl于离心管中，7920×g离心5min，弃上清液，用无菌水清洗残留在菌体上的培养液，重复两次；在离心管中加入50μl高纯水使菌体重悬；将菌液在99℃水浴中12×g震荡加热10min以使细胞壁破裂，7920×g条件下离心10min，上清液可用作PCR模板。
[0029] PCR使用带GC夹子的引物357f(CCTACGGGAGGCAGCAG)和下游引物518r(ATTACCGCGGCTGCTGG)。反应体系：rTaq 25μl(Taq酶1.25U/25μl，dNTP Mixture 0.4mM，2×PCR Buffer 3mM Mg2+)，Primer 357f 1μl，Primer 518r 1μl，模板10～100ng，加dH2O补足至50μl；反应条件：94℃5min；9个循环：94℃30s，61℃30s(－0.5℃per cycle)，72℃1min；19个循环：94℃30s，56℃30s(－0.5℃per cycle)，72℃1min；最后72℃延伸7min，4℃hold。
[0030] 使用Bio-Rad DcodeTM突变检测系统对PCR产物进行DGGE分析。变性剂梯度为40％(40％甲叉双丙烯酰胺4ml，50×TAE 0.4ml，去离子甲酰胺3.2ml，尿素3.36g，去离子水补足至20ml)～60％(40％甲叉双丙烯酰胺4ml，50×TAE 0.4ml，去离子甲酰胺4.8ml，尿素5.02g，去离子水补足至20ml)，变性
温度60℃，
电泳电压80V，时间15h，1×SYBR-Gold(美国Invitrogen公司)溶液避光染色40min，然后用去离子水漂洗干净，置于Bio-Rad Gel DocTM成像系统中观察。
[0031] 将DGGE图谱中具有代表性的明亮条带切下置于已灭菌的200μl离心管中，加入50μl灭菌高纯水，于4℃下放置过夜，使DNA从胶中溶出；吸取2μl上述DNA胶
浸出液作为模板，使用不加GC夹子的引物按照前述PCR条件再次进行扩增；取1μl扩增产物进行电泳检测，确定产物为一条明亮条带、无非特异条带后，送至北京诺赛基因研究公司进行纯化与测序。测序结果使用NCBI核酸
数据库(http://www.nibi.nlm.nih.gov/blast)与已知序列进行比对以确定条带所属微生物的种属。
[0032] 实施例2
[0033] 一种利用土壤基质-膜系统分离土壤功能微生物的方法，包括以下步骤：
[0034] (1)系统的构建：取5g过筛网(筛网直径为3mm)的土滴入800μl灭菌高纯水，制备泥浆；制作TCI倒扣于多孔板的板孔中央(板孔中注入高纯水防止变干)，泥浆与TCI的膜间不能有气泡，将PC膜灭菌后，制成菲负载的膜(菲含量为0.06mg)；将土壤中微生物接种在PC膜上，并将PC膜移至倒扣的TCI上面(PC膜与TCI之间不能有气泡)，将多孔板的盖子盖合在多孔板上，盖子四周用封口膜封闭，置于20℃恒温培养观察；
[0035] 通过土壤基质-膜系统对土壤中菲降解微生物进行富集与筛选，运用荧光显微镜观察微生物原位生长状态，分别在培养的第12d、24d将PC膜取出，在荧光显微镜下进行微菌落(Microcolony)的观察，观察过程同实施例1。同样可见，在培养12d时，微菌落以几十个微生物聚集为主，微菌落生长状态未见明显差异；而培养24d后，PC膜上微菌落更大、微生物数量更多。
[0036] (2)扩大培养：微生物在PC膜上生长后，为进一步筛选多环芳烃降解微生物，需先将其在营养培养基中富集，由于微生物在不同培养基中生长的状态不同，因此本研究选取4种培养基进行扩大培养。具体操作同实施例1，扩大培养12d；
[0037] (3)分离：PC膜上的微生物在96孔板中扩大培养10d后，可将菌液接种至以菲为唯一碳源的新板中，以分离筛选菲降解微生物，分离过程同实施例1，
[0038] 同样，为避免平板分离选择微孔的随机性，更好的评价利用土壤基质-膜系统分离土壤功能微生物的方法对于功能微生物筛选的效果及比较不同培养基之间的差异，进一步对菲平板分离后的混合菌群进行PCR-DGGE分析，分析过程同实施例1。
[0039] 其他条件同实施例1。
[0040] 实施例3
[0041] (1)系统的构建：取5g过筛网(筛网直径为2mm)的土滴入1000μl灭菌高纯水，制备泥浆；制作TCI倒扣于多孔板的板孔中央(板孔中注入高纯水防止变干)，泥浆与TCI的膜间不能有气泡，将PC膜灭菌后，制成菲负载的膜(菲含量为0.075mg)；将土壤中微生物接种在PC膜上，并将PC膜移至倒扣的TCI上面(PC膜与TCI之间不能有气泡)，将多孔板的盖子盖合在多孔板上，盖子四周用封口膜封闭，置于20℃恒温培养观察；
[0042] 通过土壤基质-膜系统对土壤中菲降解微生物进行富集与筛选，运用荧光显微镜观察微生物原位生长状态，分别在培养的第12d、24d将PC膜取出，在荧光显微镜下进行微菌落(Microcolony)的观察，观察过程同实施例1。同样可见，在培养12d时，微菌落以几十个微生物聚集为主，微菌落生长状态未见明显差异；而培养24d后，PC膜上微菌落更大、微生物数量更多。
[0043] (2)扩大培养：微生物在PC膜上生长后，为进一步筛选多环芳烃降解微生物，需先将其在营养培养基中富集，由于微生物在不同培养基中生长的状态不同，因此本研究选取4种培养基进行扩大培养。具体操作同实施例1，扩大培养12d；
[0044] (3)分离：PC膜上的微生物在96孔板中扩大培养12d后，可将菌液接种至以菲为唯一碳源的新板中，以分离筛选菲降解微生物，分离过程同实施例1，
[0045] 同样，为避免平板分离选择微孔的随机性，更好的评价利用土壤基质-膜系统分离土壤功能微生物的方法对于功能微生物筛选的效果及比较不同培养基之间的差异，进一步对菲平板分离后的混合菌群进行PCR-DGGE分析，分析过程同实施例1。
[0046] 其他条件同实施例1。
[0047] 对本发明微孔板中的菌液经菲平板培养分离后，进行菌落PCR，PCR产物送测序公司测序，测序采用双向测序后拼接的方法，以确保测序结果的准确性。将拼接后的序列(约170bp长)提交至NCBI数据库比对，根据结果可确定该菌种所在的属和系统发育中的
位置。
结果显示，土壤基质-膜系统筛选得到的微生物主要为alpha-Proteobacteria，与百色油田区土壤中主要的微生物类群一致，其降解基因在菲的降解中起着较为重要的作用，筛出的主要微生物为Sphingomonas属，其不但存在于污染的土壤中，其亦广泛存在于海洋、大气以及各种极端环境中，能够适应贫营养的环境，可以改善土壤环境。且继续培养后出现了新的优势菌属：Phenylobacterium(BS2-1)、Sphingomonas(BS5-1)、Burkholderia(BS6-1)，这些微生物则能够耐受污染物毒性的抗逆微生物，或以污染物为生长基质的降解微生物，可以在污染物的自然降解过程中发挥重要作用。
[0048] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明
专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干
变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
