一种土壤中噬菌体提取富集的方法
专利汇可以提供一种土壤中噬菌体提取富集的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种 土壤 中 噬菌体 提取富集的方法，首先将鲜土以一定比例与 柠檬酸 钾 缓冲液混合，放置于低温孵化一段时间，然后提取液将通过超声震荡处理从土壤颗粒中提取土壤噬菌体。土壤悬浊液经多次离心操作后取得上清液，经灭菌滤膜依次过滤除菌后，使用 切向流过滤 / 超滤 技术缩小滤液体积，进行噬菌体富集。使用聚乙二醇沉淀的方式回收噬菌体，低温放置过夜，第二天经离心、TE缓冲液溶解后再次过滤膜除菌，使用核酸酶消化样品中的杂质DNA和RNA。最终得到的浓缩液可以进行后续DNA提取及样品固定等操作。，下面是一种土壤中噬菌体提取富集的方法专利的具体信息内容。
1.一种土壤中噬菌体提取富集的方法，其特征在于包括以下步骤：按比例，将300g处理后的鲜土与1L 1wt.%柠檬酸钾缓冲液混合，放置于4℃低温孵化15分钟，使土壤样品分散，将其在冰浴环境下超声处理后，离心取上清，然后通过0.45μm和0.22μm无菌滤膜依次进行过滤除菌；除菌滤液使用切向流过滤技术进行浓缩后得到的噬菌体富集液，再使用聚乙二醇沉淀的方式回收噬菌体并用1×TE缓冲液重悬，再次过0.22μm无菌滤膜除菌后使用DNase I和RNase核酸酶降解样品中的游离DNA和RNA，去除宿主菌污染，最终得到噬菌体浓缩液。
2.根据权利要求1所述土壤中噬菌体提取富集的方法，其特征在于所述鲜土去除杂质。
3.根据权利要求1所述土壤中噬菌体提取富集的方法，其特征在于所述1%柠檬酸钾缓冲液每升含有：10g C6H5K3O7，1.92g Na2HPO4·12H2O，0.24g KH2PO4，pH=7。
4.根据权利要求1所述土壤中噬菌体提取富集的方法，其特征在于超声处理具体方式为：冰浴超声处理3分钟，且每经过1分钟超声，都需将提取液从冰浴拿出，手动摇晃30s；超声条件为100 W，47 kHz。
5.根据权利要求1所述土壤中噬菌体提取富集的方法，其特征在于经超声处理后的离心操作为：7000rpm离心10分钟取得上清液，将上清液转移至新鲜瓶中并再以7000rpm离心
15分钟。
6.根据权利要求1所述土壤中噬菌体提取富集的方法，其特征在于富集噬菌体所使用的切向流过滤技术，使用膜包为：Sartorius Vivaflow50 30000MWCO PES膜，流速条件为：
200mL/min。
7.根据权利要求1所述土壤中噬菌体提取富集的方法，其特征在于富集噬菌体所使用的切向流过滤技术需要将除菌滤液缩小体积至30mL。
8.根据权利要求1所述土壤中噬菌体提取富集的方法，其特征在于所述富集液使用的聚乙二醇(PEG)沉淀回收噬菌体的具体方法为：加入固体氯化钠至富集液终浓度为0.5mol/L，搅拌使其溶解后冰浴1小时，冰浴后于4℃下8000rpm离心10分钟，收集上清；上清液加入固体PEG 8000至终浓度为10wt.%后，在室温下使用磁力搅拌器搅拌至溶解，而后4℃过夜放置。
9.根据权利要求1所述土壤中噬菌体提取富集的方法，其特征在于所述PEG沉淀后溶解所用的1 x TE缓冲液配方为：1M pH=8.0 Tris-HCl Buffer，1mL；0.5M pH=8.0 EDTA，
0.2mL；向烧杯中加入80mL的ddH2O均匀混合；将溶液定容到100mL后，高温高压灭菌；室温保存。
10.根据权利要求1所述土壤中噬菌体提取富集的方法，其特征在于核酸酶降解的具体方法为：将DNase I Buffer:DNase I: RNase按质量比20:2:1混合后，保证DNase I加入回收液的终浓度为20 U/mL，37℃酶消解30分钟后，70℃灭活10分钟。
一种土壤中噬菌体提取富集的方法
技术领域
背景技术
发明内容
10分钟。
进行纯化并再度缩小体积，便于进行后续操作。
图3为使用本方法对不同性质土壤进行噬菌体提取富集后核酸提取结果图；
图4为本方法中切向流过滤技术使用装置示意图。
具体实施方式
在南京农业大学校内采集草地土（共三个样品，编号草地-1、草地-2、草地-3），于4℃下运回实验室。土壤中植物根系、石子等杂质去除后，将300g土壤样品与1L 1%柠檬酸钾缓冲液混合，柠檬酸钾缓冲液每升含有：10g C6H5K3O7，1.92g Na2HPO4·12H2O，0.24g KH2PO4，pH=
7，放置于4℃低温孵化15分钟，使土壤样品分散，将其在冰浴环境下进行短暂超声处理，过程具体为：每经过1分钟超声，都需将提取液从冰浴拿出，手动摇晃30s；超声总时间为3分钟，超声条件为100 W、47 kHz。由于土壤质地较细、不易离心，遂使用8000rpm离心10分钟取得上清液，将上清液转移至新鲜瓶中并再以8000rpm离心15分钟，然后通过0.45μm和0.22μm无菌滤膜依次进行过滤除菌。除菌滤液使用切向流过滤技术进行浓缩，将1L除菌浸提液体积缩小至约30mL，切向流过滤技术所使用膜包为：Sartorius Vivaflow50 30000MWCO PES膜，流速条件为：200mL/min。噬菌体富集液后，使用聚乙二醇沉淀的方式回收噬菌体：先加入固体氯化钠至富集液终浓度为0.5mol/L，搅拌使其溶解后冰浴1小时；于4℃下8000rpm离心10分钟，收集上清；上清液加入固体PEG 8000至终浓度为10%后，在室温下使用磁力搅拌器慢慢搅拌至溶解， 4℃过夜放置；第二天离心液体，得到噬菌体颗粒沉淀，用1 2mL的1×~
TE缓冲液溶解沉淀。（1×TE缓冲液配方为：1M pH=8.0 Tris-HCl Buffer，1mL；0.5M pH=8.0 EDTA，0.2mL；向烧杯中加入80mL的ddH2O均匀混合；将溶液定容到100mL后，高温高压灭菌，室温保存）；再次过0.22μm无菌滤膜除菌后加入DNase I Buffer:DNase I:RNase质量比=
20:2:1混合，保证DNase I加入回收液的终浓度为20 U/mL。37℃酶消解30分钟、70℃灭活10分钟，去除宿主菌污染，最终得到浓缩液。将浓缩液进行噬菌体核酸试剂盒进行DNA提取，取
1μL提取液使用Qubit荧光定量计进行DNA浓度测定，测定浓度显示为：2.16、5.71、2.33 ng/ μL。后续可随机扩增后建库测序，得到土壤噬菌体群落结构等信息。
7000rpm离心10分钟取得上清液，将上清液转移至新鲜瓶中并再以7000rpm离心15分钟，然后通过0.45μm和0.22μm无菌滤膜依次进行过滤除菌。除菌滤液使用切向流过滤技术进行浓缩，将1L除菌浸提液体积缩小至约30mL， 切向流过滤技术所使用膜包为：Sartorius Vivaflow50 30000MWCO PES膜，流速条件为：200mL/min。噬菌体富集液后，使用聚乙二醇沉淀的方式回收噬菌体：先加入固体氯化钠至富集液终浓度为0.5mol/L，搅拌使其溶解后冰浴1小时；于4℃下8000rpm离心10分钟，收集上清；上清液加入固体PEG 8000至终浓度为10%后，在室温下使用磁力搅拌器慢慢搅拌至溶解， 4℃过夜放置；第二天离心液体，得到噬菌体颗粒沉淀，用1 2mL的1×TE缓冲液溶解沉淀。再次过0.22μm无菌滤膜除菌后加入DNase I ~
Buffer:DNase I:RNase质量比=20:2:1混合，保证DNase I加入回收液的终浓度为20 U/mL。
37℃酶消解30分钟、70℃灭活10分钟，去除宿主菌污染，最终得到浓缩液。将浓缩液进行噬菌体核酸试剂盒进行DNA提取，取1μL提取液使用Qubit荧光定量计进行DNA浓度测定，测定浓度均值为：0.84、0.31、1.1ng/ μL。后续可随机扩增后建库测序，得到土壤噬菌体群落结构等信息。
4℃条件下送回实验室。将土壤进行去杂质处理后，将300g土壤样品与1L1%柠檬酸钾缓冲液混合，放置于4℃低温孵化15分钟，使土壤样品分散，将其在冰浴环境下超声处理，超声过程具体为：每经过1分钟超声，都需将提取液从冰浴拿出，手动摇晃30s；超声总时间为3分钟，超声条件为100 W、47 kHz。7000rpm离心10分钟取得上清液，将上清液转移至新鲜瓶中并再以7000rpm离心15分钟，然后通过0.45μm和0.22μm无菌滤膜依次进行过滤除菌；除菌滤液使用切向流过滤技术进行浓缩，将1L除菌浸提液体积缩小至约30mL， 切向流过滤技术所使用膜包为：Sartorius Vivaflow50 30000MWCO PES膜，流速条件为：200mL/min。噬菌体富集液后，使用聚乙二醇沉淀的方式回收噬菌体：先加入固体氯化钠至富集液终浓度为0.5mol/L，搅拌使其溶解后冰浴1小时；于4℃下8000rpm离心10分钟，收集上清；上清液加入固体PEG
8000至终浓度为10%后，在室温下使用磁力搅拌器慢慢搅拌至溶解， 4℃过夜放置；第二天离心液体，得到噬菌体颗粒沉淀，用1 2mL的1×TE缓冲液溶解沉淀。再次过0.22μm无菌滤膜~
除菌后加入DNase I Buffer：DNase I:RNase质量比=20:2:1混合，保证DNase I加入回收液的终浓度为20 U/mL。37℃酶消解30分钟、70℃灭活10分钟，去除宿主菌污染，最终得到浓缩液。将浓缩液进行噬菌体核酸试剂盒进行DNA提取，使用Qubit荧光计进行DNA浓度测定，测定浓度显示分别为：0.81、0.72、0.72、0.76、0.93、1.65ng/ μL ，后续可随机扩增后建库测序，得到土壤噬菌体群落结构等信息。
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