一种燃料电池耗氢技术用于扁藻光解海水产氢的方法
阅读：2发布：2021-02-22
专利汇可以提供一种燃料电池耗氢技术用于扁藻光解海水产氢的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及光解 水 制氢的方法，具体地说是一种 燃料 电池 耗氢技术用于扁藻光解 海水 产氢的方法，以一种具有光解海水产氢功能的亚心型扁藻为体系产氢材料，在光反应器上外接 碱 性氢 氧 燃料电池 持续耗氢系统来维持体系内较低氢分压，依据 电路 中 电子 数量与氢 原子 数的一一对应关系，通过测量电池外电路 电流 变化来反映体系内氢浓度的变化，研究扁藻在CCCP胁迫调控下产氢的特征。在燃料电池持续耗氢下，扁藻产氢时间延长5倍，可连续产氢120h；总氢气产量达到54.4ml，是未用燃料电池持续耗氢系统最好水平的2.2倍。本发明对产氢过程进行高效、灵敏的实时检测，方法简便，抗干扰能 力 强，在产氢机理研究、工程研究中具有广泛应用前景。，下面是一种燃料电池耗氢技术用于扁藻光解海水产氢的方法专利的具体信息内容。
1.一种燃料电池耗氢技术用于扁藻光解海水产氢的方法，其特征在于： 以一种具有光解海水产氢功能的海洋绿藻-亚心型扁藻为体系产氢材料， 在光反应器上外接碱性氢氧燃料电池持续耗氢系统来维持体系内较低氢分 压，依据电路中电子数量与氢原子数的一一对应关系，通过测量电池外电 路电流变化来计算体系内氢浓度的变化，研究扁藻在CCCP胁迫调控下产氢 过程的特征。
2.按权利要求1所述的燃料电池耗氢技术用于扁藻光解海水产氢的方 法，其特征在于：具体操作过程为：
1)亚心型扁藻采用康维方营养盐培养，培养到对数生长后期后离心、 膜过滤收集或高密度培养至产氢藻液浓度400～800万cells/mL；
2)采用扁藻两步法光解水制氢的方法，取容积为500mL的搅拌式光 产氢反应器，装满步骤1)浓度的藻液，密封反应器瓶口，用氮气置换空气 5min，放置到25℃培养箱中暗培养以诱导可逆氢酶，藻液暗诱导时间为 4～24h；
3)暗诱导后，加入CCCP至浓度为7.5～15μM的藻液中，并使用缓冲液 调节藻液pH值为7～8.3，然后由光反应器两侧的光源光照光反应器，由光 反应器下部的磁力搅拌器搅拌藻液，使光反应器内的藻液产氢；光反应器 内的气体体积变化通过刻度气体取样管采用排水法收集计量，燃料电池耗 氢电流由数据采集记录系统自动检测记录。
3.按权利要求2所述的燃料电池耗氢技术用于扁藻光解海水产氢的方 法，其特征在于：所述步骤2)中的缓冲液可为碳酸氢钠溶液、磷酸缓冲溶 液、醋酸钠溶液或Tris-盐酸缓冲溶液。
4.按权利要求2所述的燃料电池耗氢技术用于扁藻光解海水产氢的方 法，其特征在于：所述步骤3)中光源为中光照强度9000LX，磁力搅拌器 的搅拌速度为150rpm。
5.按权利要求2所述的燃料电池耗氢技术用于扁藻光解海水产氢的方 法，其特征在于：所述碱性氢氧燃料电池具体为从外到内依次采用不锈钢 板、聚四氟垫圈、塑料分布板、电极、石棉膜的次序压制电池，电池阳极 为银材料制备的氧电极，阴极为钯材料制备的氢电极，电解液隔层采用饱 和KOH浸泡的石棉膜，在制备前，用电解液充分浸泡石棉膜，并用不锈钢 板、聚四氟板、电极、石棉进行预压后再压制电池，可以保证电池性能的 稳定性与重复性。
技术领域
本发明涉及光解水制氢的方法，具体地说是一种燃料电池耗氢技术用 于扁藻光解海水产氢的方法。
背景技术
绿藻产氢的主要问题是氧对氢酶抑制严重，因产氢的同时产氧，如不 能消除氧的抑制，产氢速率低且不能长期持续产氢。国外对耐氧菌株的筛 选进行了大量工作。美国国家可再生能源实验室(NREL)和加州大学的科 学家成功研究了淡水衣藻可逆氢酶两步法间接光水解制氢工艺，利用筛选 到的耐氧菌株衣藻的突变体Chlamydomonas reinhardtii CC-124，实现O2 和H2的产生在时间上或空间上分离，避免了可逆氢酶遇氧失活的难题。该 项研究用6×106细胞/mL的藻液，以每升藻液每小时产气2.0～2.5mL的速 度延续了70小时，气体的组成为87％的氢气，1％的二氧化碳，其余主要是 氮气和微量的氧气，使其产氢能力比直接光解水提高了100倍。从而为绿 藻制氢的实用化带来了较大的希望。
目前，各国绿藻产氢研究集中于淡水衣藻，中科院大连化物所在国内 率先开展绿藻光解水制氢的研究工作，并于2001年筛选到一株具有光解海 水产氢功能的海洋绿藻。同时采用新型的解偶联剂调控间接法产氢工艺， 使产氢速率比野生株提高近百倍，产氢速率与美国加州大学的衣藻产氢研 究结果相近，但时间偏短。该项研究为绿藻产氢研究提供了一种新藻种， 能利用海水光解产氢，避免了淡水资源短缺的问题。绿藻光解水制氢的研 究目前还处于基础研究阶段，包括物质基础代谢和能量基础代谢在内的制 氢机制的研究仍需深入。现代生物技术(基因工程，代谢工程，蛋白质工 程)的介入有助于解决绿藻光解水制氢过程中许多关键问题和技术困难； 围绕高效率、低成本的绿藻光解水制氢进行深入的工程基础研究，将能加 快该项技术实用化的进程。目前两步法间接光解水制氢的研究也处于单个 步骤的机理研究和效率提高阶段，以燃料电池耗氢系统实时研究产氢过程 并进行示范的结果未见报导。
目前，各国绿藻产氢研究集中于淡水衣藻，中科院大连化物所在国内 率先开展绿藻光解水制氢的研究工作，并于2001年筛选到一株具有光解海 水产氢功能的海洋绿藻。同时采用新型的解偶联剂调控间接法产氢工艺， 使产氢速率比野生株提高近百倍，产氢速率与美国加州大学的衣藻产氢研 究结果相近，但时间偏短。该项研究为绿藻产氢研究提供了一种新藻种， 能利用海水光解产氢，避免了淡水资源短缺的问题。绿藻光解水制氢的研 究目前还处于基础研究阶段，包括物质基础代谢和能量基础代谢在内的制 氢机制的研究仍需深入。现代生物技术(基因工程，代谢工程，蛋白质工 程)的介入有助于解决绿藻光解水制氢过程中许多关键问题和技术困难； 围绕高效率、低成本的绿藻光解水制氢进行深入的工程基础研究，将能加 快该项技术实用化的进程。目前两步法间接光解水制氢的研究也处于单个 步骤的机理研究和效率提高阶段，以燃料电池耗氢系统实时研究产氢过程 并进行示范的结果未见报导。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、可提高产氢量，并可实时监测 研究的燃料电池耗氢技术用于扁藻光解海水产氢的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明在光反应器上外接碱性燃料电池持续耗氢系统来实现实时监测 扁藻在CCCP胁迫调控下产氢过程的特征并加以示范；具体为，以一种具有 光解海水产氢功能的海洋绿藻-亚心型扁藻(Platymonas subcordiformis) 为体系产氢材料，采用新型的解偶联剂调控间接法产氢工艺，在光反应器 上外接碱性氢氧燃料电池持续耗氢系统来维持体系内较低氢分压，依据电 路中电子数量与氢原子数的一一对应关系，通过测量电池外电路电流变化 来计算体系内氢浓度的变化，实时监测扁藻在CCCP胁迫调控下产氢过程的 特征并加以示范。并可保持体系内较低氢分压，消除产物抑制，提高产氢 量。参照产氢过程与PSII及体外氢酶活性变化的对应关系研究产氢机理。 克服了以往方法中色谱检测的离线、滞后缺点，实现了对产氢过程进行高 效、灵敏的实时检测，在产氢机理研究、工程示范中具有重要应用。本发 明克服了以往方法中色谱检测的离线、滞后缺点，实现了对产氢过程进行 高效、灵敏的实时检测及深入研究。
具体操作过程为：
1)亚心型扁藻采用康维方营养盐培养，培养到对数生长后期后离心、 膜过滤收集或高密度培养至产氢藻液浓度400～800万cells/mL。
2)采用扁藻两步法光解水制氢的方法，其流程如图2所示。取容积为 500mL的搅拌式光产氢反应器，装满步骤1)浓度的藻液，密封瓶口，用 氮气置换空气5min，放置到25℃培养箱中暗培养以诱导可逆氢酶，藻液 暗诱导时间为4～24h。
3)暗诱导后，向藻液中加入CCCP至CCCP浓度为7.5～15μM，并使用碳 酸氢钠溶液、磷酸缓冲溶液、醋酸钠溶液或Tris-盐酸缓冲溶液调节藻液 pH值为7～8.3，然后由光反应器外侧的光源光照光反应器，由光反应器下 部的磁力搅拌器搅拌藻液，使光反应器内的藻液产氢；光反应器在中光照 强度9000LX、150rpm的搅拌速度下搅拌光照放氢。
4)体外氢酶活性的测定在厌氧环境中进行。以50mmol磷酸缓冲液 (pH6.8)作反应缓冲液，以被连二亚硫酸钠(Na2S2O4)还原的甲基紫精 (Methyl viologen，简称MV)作电子供体。反应系统包括终浓度为10mM的 MV和100mM的连二亚硫酸钠及500μl藻液。在37℃水浴中振荡孵育20min后， 用气相色谱检测氢气组分含量。
按下式计算体外氢酶活性；
5)由光照反应器中取出10μl藻液，注入Water PAM叶绿素荧光仪的 测量杯中，再加入3ml无菌海水培养基，混匀后进行测量。通过ΔF/Fm’ 的变化，反映藻细胞光合系统II的化学活性的变化。
将天然产物粗提物溶解在裂解缓冲液中；
6)所有数据点以时间为横坐标作图，得到电流、氢酶活性和PSII活 性随时间变化的关系曲线，如图4所示。由电流变化曲线依据电子数与消 耗的氢原子数的一一对应关系积分计算产氢量，并参照氢酶活性和PSII活 性随时间变化的关系曲线研究产氢机理。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1.本发明方法灵敏度、准确度与精密度高，抗外界环境及认为因素的 干扰能力强。
2.应用范围宽。本发明由于将检测与示范功能融为一体，既可以用于 绿藻产氢过程的检测研究，检测其产氢能力与其他检测结果互为参照，进 而指导机理研究的深入；同时在光反应器上外接碱性燃料电池持续耗氢系 统来维持体系内较低氢分压，消除产氢反应的产物抑制现象，提高产氢量。 也可以准确定量得到产氢体积，并可以对整个绿藻产氢过程进行实验室示 范，确定技术经济参数，为产氢工程研究提供重要数据；由于使用了配套 自动化数据采集、处理系统，可以用作高通量筛选绿藻产氢能力的仪器平 台。
3.简便省时。本发明操作步骤仅包括绿藻分离、暗诱导、耗氢系统连 接、光照调控产氢和检测，各步操作简便，目前现有技术方法均需多次采 样、离线检测，费力费时。
4.应用方便。可根据本发明检测方法开发出相应的标准系统，即标准 检测系统和产氢示范系统，其应用方便快捷，结果的可比性强。
总之，本发明方法可对扁藻光解海水产氢过程进行高效、灵敏检测， 方法简便，抗干扰能力强，在绿藻光解水产氢的机理研究、工程研究及其 示范中具有广泛应用前景。
附图说明
图1为本发明绿藻光解水制氢系统简图；
其中：1、磁力搅拌器；2、光源；3、光反应器；4、排气口；5、燃料 电池；6、演示器；7、刻度气体取样管；8、水槽；
图2为本发明绿藻光解水制氢的流程图；
图3为本发明碱性氢氧燃料电池的结构示意图；
图4为本发明减轻氢抑制提高产氢量的效果图谱；
图5为本发明不同量的CCCP调控产氢过程检测与氢酶活性、光系统II 活性联合检测图谱之一；
图6为本发明不同量的CCCP调控产氢过程检测与氢酶活性、光系统II 活性联合检测图谱之二；
图7为本发明不同缓冲溶液调节产氢pH值的效果图谱之一；
图8为本发明不同缓冲溶液调节产氢pH值的效果图谱之二。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明在光反应器上外接碱性燃料电池持续耗氢系统来实现实时监测 扁藻在CCCP胁迫调控下产氢过程的特征并加以示范；具体为，以一种具有 光解海水产氢功能的海洋绿藻-亚心型扁藻(Platymonas subcordiformis) 为体系产氢材料，采用新型的解偶联剂调控间接法产氢工艺，在光反应器 上外接碱性氢氧燃料电池持续耗氢系统来维持体系内较低氢分压，依据电 路中电子数量与氢原子数的一一对应关系，通过测量电池外电路电流变化 来计算体系内氢浓度的变化，实时监测扁藻在CCCP胁迫调控下产氢过程的 特征并加以示范。并可保持体系内较低氢分压，消除产物抑制，提高产氢 量。参照产氢过程与PSII及体外氢酶活性变化的对应关系研究产氢机理。 克服了以往方法中色谱检测的离线、滞后缺点，实现了对产氢过程进行高 效、灵敏的实时检测，在产氢机理研究、工程示范中具有重要应用。本发 明克服了以往方法中色谱检测的离线、滞后缺点，实现了对产氢过程进行 高效、灵敏的实时检测及深入研究。
具体操作过程为：
1)亚心型扁藻采用康维方营养盐培养，培养到对数生长后期后离心、 膜过滤收集或高密度培养至产氢藻液浓度400～800万cells/mL。
2)采用扁藻两步法光解水制氢的方法，其流程如图2所示。取容积为 500mL的搅拌式光产氢反应器，装满步骤1)浓度的藻液，密封瓶口，用 氮气置换空气5min，放置到25℃培养箱中暗培养以诱导可逆氢酶，藻液 暗诱导时间为4～24h。
3)暗诱导后，向藻液中加入CCCP至CCCP浓度为7.5～15μM，并使用碳 酸氢钠溶液、磷酸缓冲溶液、醋酸钠溶液或Tris-盐酸缓冲溶液调节藻液 pH值为7～8.3，然后由光反应器外侧的光源光照光反应器，由光反应器下 部的磁力搅拌器搅拌藻液，使光反应器内的藻液产氢；光反应器在中光照 强度9000LX、150rpm的搅拌速度下搅拌光照放氢。
4)体外氢酶活性的测定在厌氧环境中进行。以50mmol磷酸缓冲液 (pH6.8)作反应缓冲液，以被连二亚硫酸钠(Na2S2O4)还原的甲基紫精 (Methyl viologen，简称MV)作电子供体。反应系统包括终浓度为10mM的 MV和100mM的连二亚硫酸钠及500μl藻液。在37℃水浴中振荡孵育20min后， 用气相色谱检测氢气组分含量。
按下式计算体外氢酶活性；
5)由光照反应器中取出10μl藻液，注入Water PAM叶绿素荧光仪的 测量杯中，再加入3ml无菌海水培养基，混匀后进行测量。通过ΔF/Fm’ 的变化，反映藻细胞光合系统II的化学活性的变化。
将天然产物粗提物溶解在裂解缓冲液中；
6)所有数据点以时间为横坐标作图，得到电流、氢酶活性和PSII活 性随时间变化的关系曲线，如图4所示。由电流变化曲线依据电子数与消 耗的氢原子数的一一对应关系积分计算产氢量，并参照氢酶活性和PSII活 性随时间变化的关系曲线研究产氢机理。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1.本发明方法灵敏度、准确度与精密度高，抗外界环境及认为因素的 干扰能力强。
2.应用范围宽。本发明由于将检测与示范功能融为一体，既可以用于 绿藻产氢过程的检测研究，检测其产氢能力与其他检测结果互为参照，进 而指导机理研究的深入；同时在光反应器上外接碱性燃料电池持续耗氢系 统来维持体系内较低氢分压，消除产氢反应的产物抑制现象，提高产氢量。 也可以准确定量得到产氢体积，并可以对整个绿藻产氢过程进行实验室示 范，确定技术经济参数，为产氢工程研究提供重要数据；由于使用了配套 自动化数据采集、处理系统，可以用作高通量筛选绿藻产氢能力的仪器平 台。
3.简便省时。本发明操作步骤仅包括绿藻分离、暗诱导、耗氢系统连 接、光照调控产氢和检测，各步操作简便，目前现有技术方法均需多次采 样、离线检测，费力费时。
4.应用方便。可根据本发明检测方法开发出相应的标准系统，即标准 检测系统和产氢示范系统，其应用方便快捷，结果的可比性强。
总之，本发明方法可对扁藻光解海水产氢过程进行高效、灵敏检测， 方法简便，抗干扰能力强，在绿藻光解水产氢的机理研究、工程研究及其 示范中具有广泛应用前景。
附图说明
图1为本发明绿藻光解水制氢系统简图；
其中：1、磁力搅拌器；2、光源；3、光反应器；4、排气口；5、燃料 电池；6、演示器；7、刻度气体取样管；8、水槽；
图2为本发明绿藻光解水制氢的流程图；
图3为本发明碱性氢氧燃料电池的结构示意图；
图4为本发明减轻氢抑制提高产氢量的效果图谱；
图5为本发明不同量的CCCP调控产氢过程检测与氢酶活性、光系统II 活性联合检测图谱之一；
图6为本发明不同量的CCCP调控产氢过程检测与氢酶活性、光系统II 活性联合检测图谱之二；
图7为本发明不同缓冲溶液调节产氢pH值的效果图谱之一；
图8为本发明不同缓冲溶液调节产氢pH值的效果图谱之二。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行进一步地说明：
本发明使用解偶联剂CCCP胁迫调控扁藻产氢，使用碱性氢氧燃料电池 外接10～40欧姆电阻持续发电耗氢，检测并记录电阻两端电压计算得到电 流，对电流曲线积分计算获得通过电路的电量值，由电子数与消耗的氢原 子数的一一对应关系，计算总产氢量。解偶联剂采用羰基氰化物间氯苯腙 (CCCP)；解偶联剂CCCP胁迫调控扁藻产氢采用申请人已申报的专利技术 (申请号03110981.0，发明名称：一种海洋绿藻两步法生物光解水制氢方 法)，所用的碱性氢氧燃料电池及数据采集处理系统为实验室自行组装研 制，其他试剂均为商业化的试剂。
实施例1
如图1所示为光生物产氢系统示意图，其中3为光反应器，采用玻璃 材料制造，光反应器3内的气体体积变化通过刻度气体取样管7在水槽8 中采用排水法收集计量，燃料电池耗氢电流由数据采集记录系统自动检测 记录。亚心型扁藻采用康维方营养盐培养，培养到对数生长后期后离心收 集至产氢藻液浓度800万cells/mL。采用扁藻两步法光解水制氢的方法， 取容积为500mL的搅拌式光产氢反应器，装满藻液，密封瓶口，用氮气置 换空气5min，放置到25℃培养箱中暗培养以诱导可逆氢酶。藻液经过24h 时间的暗诱导后，光照前加入CCCP至浓度为15μM并调节pH值为7.0。光 反应器3在中光照强度9000LX的光源2光照下、磁力搅拌器1为150rpm 的搅拌速度下搅拌藻液，使光反应器内的藻液光照产氢，在光反应器上外 接燃料电池持续耗氢，外电路电阻分别为40欧姆和10欧姆，结果见表1。 在燃料电池5持续耗氢下，产氢时间延长，可连续产氢120h；总氢气产量 达到54.4ml，是未用燃料电池持续耗氢系统最好水平的2.2倍。燃料电池 持续耗氢维持体系内较低氢分压，消除了反应中的氢抑制现象，提高产氢 量。
表1燃料电池持续耗氢下两次扁藻产氢过程的比较 藻细胞密度 (cells/ml) 叶绿素含量 (μg/ml) 电流积分面积 (mA*h) 外电路电 阻(Ω) 总氢气产 量(ml) 30h氢气产 量(ml) 1 2 8×106 8×106 30.61 35.75 62.67(120h) 91.53(120h) 40 10 37.6 54.4 28.8 43
对比实施例：亚心型扁藻采用康维方营养盐培养，培养到对数生长后 期后离心、膜过滤收集或高密度培养至产氢藻液浓度800万cells/mL。采 用扁藻两步法光解水制氢的方法，其流程如图2示。取容积为500mL的搅 拌式光产氢反应器，装满藻液，密封瓶口，用氮气置换空气5min，放置到 25℃培养箱中暗培养以诱导可逆氢酶。藻液经过24h时间的暗诱导后，光 照前加入CCCP至浓度为15μM并使用碳酸氢钠溶液调节pH值为7.0。系统 在中光照强度9000LX、150rpm的搅拌速度下搅拌藻液，使光反应器内的藻 液光照产氢。产氢系统不外接燃料电池耗氢检测系统。产氢时间持续24小 时，总产氢量为25ml。
实施例2
亚心型扁藻采用康维方营养盐培养，培养到对数生长后期后离心、膜 过滤收集或高密度培养至产氢藻液浓度600万cells/mL。采用扁藻两步法光 解水制氢的方法，其流程如图2示。取容积为500mL的搅拌式光产氢反应器， 装满藻液，密封瓶口，用氮气置换空气5min，放置到25℃培养箱中暗培 养以诱导可逆氢酶。藻液经过20h时间的暗诱导后，光照前加入CCCP至浓度 为15μM并使用碳酸氢钠溶液调节pH值为8.2。系统在中光照强度9000LX、 150rpm的搅拌速度下搅拌藻液，使光反应器内的藻液光照产氢。在光反应 器上外接燃料电池持续耗氢，外电路电阻为10欧姆，系统的气体体积变化 通过刻度气体取样管采用排水法收集计量，燃料电池耗氢电流由数据采集 记录系统自动检测记录，产氢量28ml。
相应的氢酶活性的测定与光合系统II化学活性的检测方法为，氢酶活 性的测定在厌氧环境中进行。以50mmol磷酸缓冲液(pH6.8)作反应缓冲液， 以被连二亚硫酸钠(Na2S2O4)还原的甲基紫精(Methyl viologen，简称MV) 作电子供体。反应系统包括终浓度为10mM的MV和100mM的连二亚硫酸钠及 500μl藻液。在37℃水浴中振荡孵育20min后，用气相色谱检测氢气组分含 量。
按下式计算体外氢酶活性；
由光照反应器中取出10μl藻液，注入Water PAM叶绿素荧光仪的测量 杯中，再加入3ml无菌海水培养基，混匀后进行测量。通过ΔF/Fm’的变 化，反映藻细胞光合系统II的化学活性的变化。
所有数据点以时间为横坐标作图，得到电流、氢酶活性和PSII活性随 时间变化的关系曲线，如图5所示。
实施例3
亚心型扁藻采用康维方营养盐培养，培养到对数生长后期后离心、膜 过滤收集或高密度培养至产氢藻液浓度600万ce11s/mL。采用扁藻两步法光 解水制氢的方法，其流程如图2示。取容积为500mL的搅拌式光产氢反应器， 装满藻液，密封瓶口，用氮气置换空气5min，放置到25℃培养箱中暗培 养以诱导可逆氢酶。藻液经过20h时间的暗诱导后，光照前加入CCCP至浓度 为7.5μM并使用碳酸氢钠溶液调节pH值为8.2。系统在中光照强度9000LX、 150rpm的搅拌速度下搅拌藻液，使光反应器内的藻液光照产氢。在光反应 器上外接燃料电池持续耗氢，外电路电阻为10欧姆，系统的气体体积变化 通过刻度气体取样管采用排水法收集计量，燃料电池耗氢电流由数据采集 记录系统自动检测记录，产氢量5.1ml。
相应的氢酶活性的测定与光合系统II化学活性的检测方法为，氢酶活 性的测定在厌氧环境中进行。以50mmol磷酸缓冲液(pH6.8)作反应缓冲液， 以被连二亚硫酸钠(Na2S2O4)还原的甲基紫精(Methyl viologen，简称MV) 作电子供体。反应系统包括终浓度为10mM的MV和100mM的连二亚硫酸钠及 500μl藻液。在37℃水浴中振荡孵育20min后，用气相色谱检测氢气组分含 量。
按下式计算体外氢酶活性；
由光照反应器中取出10μl藻液，注入Water PAM叶绿素荧光仪的测量 杯中，再加入3ml无菌海水培养基，混匀后进行测量。通过ΔF/Fm’的变 化，反映藻细胞光合系统II的化学活性的变化。
所有数据点以时间为横坐标作图，得到电流、氢酶活性和PSII活性随 时间变化的关系曲线，如图6所示。
实施例4
亚心型扁藻采用康维方营养盐培养，培养到对数生长后期后离心、膜 过滤收集或高密度培养至产氢藻液浓度600万cells/mL。采用扁藻两步法光 解水制氢的方法。取容积为500mL的搅拌式光产氢反应器，装满藻液，密 封瓶口，用氮气置换空气5min，放置到25℃培养箱中暗培养以诱导可逆 氢酶。藻液经过24h时间的暗诱导后，光照前加入CCCP至浓度为15μM并使 用醋酸钠溶液调节pH值为7.23。系统在中光照强度9000LX、150rpm的搅拌 速度下搅拌藻液，使光反应器内的藻液光照产氢。在光反应器上外接燃料 电池持续耗氢，外电路电阻为10欧姆，产氢量52.3ml，结果见图7。
实施例5
亚心型扁藻采用康维方营养盐培养，培养到对数生长后期后离心、膜 过滤收集或高密度培养至产氢藻液浓度600万cells/mL。采用扁藻两步法 光解水制氢的方法。取容积为500mL的搅拌式光产氢反应器，装满藻液， 密封瓶口，用氮气置换空气5min，放置到25℃培养箱中暗培养以诱导可 逆氢酶。藻液经过22h时间的暗诱导后，光照前加入CCCP至浓度为15μM 并使用磷酸缓冲溶液或调节pH值为7.61。系统在中光照强度9000LX、 150rpm的搅拌速度下搅拌藻液，使光反应器内的藻液光照产氢。在光反应 器上外接燃料电池持续耗氢，外电路电阻为10欧姆，产氢量35.1ml，结果 见图8。
实施例6
亚心型扁藻采用康维方营养盐培养，培养到对数生长后期后离心、膜 过滤收集或高密度培养至产氢藻液浓度600万cells/mL。采用扁藻两步法 光解水制氢的方法。取容积为500mL的搅拌式光产氢反应器，装满藻液， 密封瓶口，用氮气置换空气5min，放置到25℃培养箱中暗培养以诱导可 逆氢酶。藻液经过22h时间的暗诱导后，光照前加入CCCP至浓度为15μM 并使用Tris-盐酸缓冲溶液或调节pH值为7.77。系统在中光照强度 9000LX、150rpm的搅拌速度下搅拌藻液，使光反应器内的藻液光照产氢。 在光反应器上外接燃料电池持续耗氢，外电路电阻为10欧姆，产氢量 19.25ml，结果见图8。
以燃料电池检测产氢过程的依据是电子数与消耗的氢原子数的一一对 应关系，积分电流变化曲线计算产氢量，具体计算方法为：氢气量 L；N0＝6.02×1023，Ne＝∫Idt/qe，I为电流值，qe＝1.6 ×10-19，为电子电量。
碱性氢氧燃料电池的制备工艺经多次试验可以保证电池性能的稳定性 与重复性以及密封要求，具体为从外到内采用不锈钢板、聚四氟垫圈、塑 料分布板、电极、石棉膜的次序压制电池，电池结构如图3所示，电池阳 极为银材料制备的氧电极，阴极为Pd材料制备的氢电极，电解液隔层采用 饱和KOH浸泡的石棉膜。在制备前，用电解液充分浸泡石棉膜，并用不锈 钢板、聚四氟板、电极、石棉进行预压后再压制电池，可以保证电池性能 的稳定性与重复性。
燃料电池采用单级或多级形式，外电路电阻可依据实际情况自由变化， 耗氢能力增强有利于体系氢分压保持在较低水平，减轻反应的氢抑制现象， 产氢反应平衡右移，促进产氢量的增大。
康维方营养盐，其配比及使用见表2。
表2康威方营养盐配比及使用 配比 A液 FeCl3·6H2O 1.3g 用去离子水稀 释到1000ml MnCl2·4H2O 0.36g H3BO3 33.6g EDTA 4 5.0g NaH2PO4·H2O 20.0g NaNO3 100g B液 ZnCl2 0.21g 用去离子水稀 释到10ml，用 1M盐酸滴入澄 清之。将B液倒 入A液 CoCl2·6H2O 0.20g (NH4)6Mo7O24·4H2O 0.09g CuSO4·5H2O 0.20g 使用量 每升海水加入A、B混和液1ml。
本发明使用解偶联剂CCCP胁迫调控扁藻产氢，使用碱性氢氧燃料电池 外接10～40欧姆电阻持续发电耗氢，检测并记录电阻两端电压计算得到电 流，对电流曲线积分计算获得通过电路的电量值，由电子数与消耗的氢原 子数的一一对应关系，计算总产氢量。解偶联剂采用羰基氰化物间氯苯腙 (CCCP)；解偶联剂CCCP胁迫调控扁藻产氢采用申请人已申报的专利技术 (申请号03110981.0，发明名称：一种海洋绿藻两步法生物光解水制氢方 法)，所用的碱性氢氧燃料电池及数据采集处理系统为实验室自行组装研 制，其他试剂均为商业化的试剂。
实施例1
如图1所示为光生物产氢系统示意图，其中3为光反应器，采用玻璃 材料制造，光反应器3内的气体体积变化通过刻度气体取样管7在水槽8 中采用排水法收集计量，燃料电池耗氢电流由数据采集记录系统自动检测 记录。亚心型扁藻采用康维方营养盐培养，培养到对数生长后期后离心收 集至产氢藻液浓度800万cells/mL。采用扁藻两步法光解水制氢的方法， 取容积为500mL的搅拌式光产氢反应器，装满藻液，密封瓶口，用氮气置 换空气5min，放置到25℃培养箱中暗培养以诱导可逆氢酶。藻液经过24h 时间的暗诱导后，光照前加入CCCP至浓度为15μM并调节pH值为7.0。光 反应器3在中光照强度9000LX的光源2光照下、磁力搅拌器1为150rpm 的搅拌速度下搅拌藻液，使光反应器内的藻液光照产氢，在光反应器上外 接燃料电池持续耗氢，外电路电阻分别为40欧姆和10欧姆，结果见表1。 在燃料电池5持续耗氢下，产氢时间延长，可连续产氢120h；总氢气产量 达到54.4ml，是未用燃料电池持续耗氢系统最好水平的2.2倍。燃料电池 持续耗氢维持体系内较低氢分压，消除了反应中的氢抑制现象，提高产氢 量。
表1燃料电池持续耗氢下两次扁藻产氢过程的比较 藻细胞密度 (cells/ml) 叶绿素含量 (μg/ml) 电流积分面积 (mA*h) 外电路电 阻(Ω) 总氢气产 量(ml) 30h氢气产 量(ml) 1 2 8×106 8×106 30.61 35.75 62.67(120h) 91.53(120h) 40 10 37.6 54.4 28.8 43
对比实施例：亚心型扁藻采用康维方营养盐培养，培养到对数生长后 期后离心、膜过滤收集或高密度培养至产氢藻液浓度800万cells/mL。采 用扁藻两步法光解水制氢的方法，其流程如图2示。取容积为500mL的搅 拌式光产氢反应器，装满藻液，密封瓶口，用氮气置换空气5min，放置到 25℃培养箱中暗培养以诱导可逆氢酶。藻液经过24h时间的暗诱导后，光 照前加入CCCP至浓度为15μM并使用碳酸氢钠溶液调节pH值为7.0。系统 在中光照强度9000LX、150rpm的搅拌速度下搅拌藻液，使光反应器内的藻 液光照产氢。产氢系统不外接燃料电池耗氢检测系统。产氢时间持续24小 时，总产氢量为25ml。
实施例2
亚心型扁藻采用康维方营养盐培养，培养到对数生长后期后离心、膜 过滤收集或高密度培养至产氢藻液浓度600万cells/mL。采用扁藻两步法光 解水制氢的方法，其流程如图2示。取容积为500mL的搅拌式光产氢反应器， 装满藻液，密封瓶口，用氮气置换空气5min，放置到25℃培养箱中暗培 养以诱导可逆氢酶。藻液经过20h时间的暗诱导后，光照前加入CCCP至浓度 为15μM并使用碳酸氢钠溶液调节pH值为8.2。系统在中光照强度9000LX、 150rpm的搅拌速度下搅拌藻液，使光反应器内的藻液光照产氢。在光反应 器上外接燃料电池持续耗氢，外电路电阻为10欧姆，系统的气体体积变化 通过刻度气体取样管采用排水法收集计量，燃料电池耗氢电流由数据采集 记录系统自动检测记录，产氢量28ml。
相应的氢酶活性的测定与光合系统II化学活性的检测方法为，氢酶活 性的测定在厌氧环境中进行。以50mmol磷酸缓冲液(pH6.8)作反应缓冲液， 以被连二亚硫酸钠(Na2S2O4)还原的甲基紫精(Methyl viologen，简称MV) 作电子供体。反应系统包括终浓度为10mM的MV和100mM的连二亚硫酸钠及 500μl藻液。在37℃水浴中振荡孵育20min后，用气相色谱检测氢气组分含 量。
按下式计算体外氢酶活性；
由光照反应器中取出10μl藻液，注入Water PAM叶绿素荧光仪的测量 杯中，再加入3ml无菌海水培养基，混匀后进行测量。通过ΔF/Fm’的变 化，反映藻细胞光合系统II的化学活性的变化。
所有数据点以时间为横坐标作图，得到电流、氢酶活性和PSII活性随 时间变化的关系曲线，如图5所示。
实施例3
亚心型扁藻采用康维方营养盐培养，培养到对数生长后期后离心、膜 过滤收集或高密度培养至产氢藻液浓度600万ce11s/mL。采用扁藻两步法光 解水制氢的方法，其流程如图2示。取容积为500mL的搅拌式光产氢反应器， 装满藻液，密封瓶口，用氮气置换空气5min，放置到25℃培养箱中暗培 养以诱导可逆氢酶。藻液经过20h时间的暗诱导后，光照前加入CCCP至浓度 为7.5μM并使用碳酸氢钠溶液调节pH值为8.2。系统在中光照强度9000LX、 150rpm的搅拌速度下搅拌藻液，使光反应器内的藻液光照产氢。在光反应 器上外接燃料电池持续耗氢，外电路电阻为10欧姆，系统的气体体积变化 通过刻度气体取样管采用排水法收集计量，燃料电池耗氢电流由数据采集 记录系统自动检测记录，产氢量5.1ml。
相应的氢酶活性的测定与光合系统II化学活性的检测方法为，氢酶活 性的测定在厌氧环境中进行。以50mmol磷酸缓冲液(pH6.8)作反应缓冲液， 以被连二亚硫酸钠(Na2S2O4)还原的甲基紫精(Methyl viologen，简称MV) 作电子供体。反应系统包括终浓度为10mM的MV和100mM的连二亚硫酸钠及 500μl藻液。在37℃水浴中振荡孵育20min后，用气相色谱检测氢气组分含 量。
按下式计算体外氢酶活性；
由光照反应器中取出10μl藻液，注入Water PAM叶绿素荧光仪的测量 杯中，再加入3ml无菌海水培养基，混匀后进行测量。通过ΔF/Fm’的变 化，反映藻细胞光合系统II的化学活性的变化。
所有数据点以时间为横坐标作图，得到电流、氢酶活性和PSII活性随 时间变化的关系曲线，如图6所示。
实施例4
亚心型扁藻采用康维方营养盐培养，培养到对数生长后期后离心、膜 过滤收集或高密度培养至产氢藻液浓度600万cells/mL。采用扁藻两步法光 解水制氢的方法。取容积为500mL的搅拌式光产氢反应器，装满藻液，密 封瓶口，用氮气置换空气5min，放置到25℃培养箱中暗培养以诱导可逆 氢酶。藻液经过24h时间的暗诱导后，光照前加入CCCP至浓度为15μM并使 用醋酸钠溶液调节pH值为7.23。系统在中光照强度9000LX、150rpm的搅拌 速度下搅拌藻液，使光反应器内的藻液光照产氢。在光反应器上外接燃料 电池持续耗氢，外电路电阻为10欧姆，产氢量52.3ml，结果见图7。
实施例5
亚心型扁藻采用康维方营养盐培养，培养到对数生长后期后离心、膜 过滤收集或高密度培养至产氢藻液浓度600万cells/mL。采用扁藻两步法 光解水制氢的方法。取容积为500mL的搅拌式光产氢反应器，装满藻液， 密封瓶口，用氮气置换空气5min，放置到25℃培养箱中暗培养以诱导可 逆氢酶。藻液经过22h时间的暗诱导后，光照前加入CCCP至浓度为15μM 并使用磷酸缓冲溶液或调节pH值为7.61。系统在中光照强度9000LX、 150rpm的搅拌速度下搅拌藻液，使光反应器内的藻液光照产氢。在光反应 器上外接燃料电池持续耗氢，外电路电阻为10欧姆，产氢量35.1ml，结果 见图8。
实施例6
亚心型扁藻采用康维方营养盐培养，培养到对数生长后期后离心、膜 过滤收集或高密度培养至产氢藻液浓度600万cells/mL。采用扁藻两步法 光解水制氢的方法。取容积为500mL的搅拌式光产氢反应器，装满藻液， 密封瓶口，用氮气置换空气5min，放置到25℃培养箱中暗培养以诱导可 逆氢酶。藻液经过22h时间的暗诱导后，光照前加入CCCP至浓度为15μM 并使用Tris-盐酸缓冲溶液或调节pH值为7.77。系统在中光照强度 9000LX、150rpm的搅拌速度下搅拌藻液，使光反应器内的藻液光照产氢。 在光反应器上外接燃料电池持续耗氢，外电路电阻为10欧姆，产氢量 19.25ml，结果见图8。
以燃料电池检测产氢过程的依据是电子数与消耗的氢原子数的一一对 应关系，积分电流变化曲线计算产氢量，具体计算方法为：氢气量 L；N0＝6.02×1023，Ne＝∫Idt/qe，I为电流值，qe＝1.6 ×10-19，为电子电量。
碱性氢氧燃料电池的制备工艺经多次试验可以保证电池性能的稳定性 与重复性以及密封要求，具体为从外到内采用不锈钢板、聚四氟垫圈、塑 料分布板、电极、石棉膜的次序压制电池，电池结构如图3所示，电池阳 极为银材料制备的氧电极，阴极为Pd材料制备的氢电极，电解液隔层采用 饱和KOH浸泡的石棉膜。在制备前，用电解液充分浸泡石棉膜，并用不锈 钢板、聚四氟板、电极、石棉进行预压后再压制电池，可以保证电池性能 的稳定性与重复性。
燃料电池采用单级或多级形式，外电路电阻可依据实际情况自由变化， 耗氢能力增强有利于体系氢分压保持在较低水平，减轻反应的氢抑制现象， 产氢反应平衡右移，促进产氢量的增大。
康维方营养盐，其配比及使用见表2。
表2康威方营养盐配比及使用 配比 A液 FeCl3·6H2O 1.3g 用去离子水稀 释到1000ml MnCl2·4H2O 0.36g H3BO3 33.6g EDTA 4 5.0g NaH2PO4·H2O 20.0g NaNO3 100g B液 ZnCl2 0.21g 用去离子水稀 释到10ml，用 1M盐酸滴入澄 清之。将B液倒 入A液 CoCl2·6H2O 0.20g (NH4)6Mo7O24·4H2O 0.09g CuSO4·5H2O 0.20g 使用量 每升海水加入A、B混和液1ml。
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