该发明是运用高输出的方法，鉴定、定量和比较基因在不同组织中表达的组织特 异性和表达量。尤其适用于分析功能未知的基因。

人类大约有60,000到80,000个基因，每一个基因都编码一种蛋白质，每种蛋白质 在所表达的细胞中都具有一定的功能。为了分析这些基因在所表达细胞中的功能，研 究人员在传统方法的基础上已经开发出了许多先进的技术。近十余年来，人们用传统 的方法分析基因功能，即从研究蛋白质的生物学和生理学特性开始，然后发展到分析 确定基因的序列以及其转录与翻译的调控。近年来，分子生物学技术的飞速发展已经 改变了传统的分析新基因的方法。

有组织进行的研究工程，包括人类基因组工程，已经并将会持续地从人类基因组 中发现新的基因。实际上，通过人类基因组工程和表达序列标志(EST)工程实施的努 力，已经确定出36,000人类基因的序列。尽管在确定新基因序列方面有很大的进展， 但分析这些基因的功能的方法却远远落伍。虽然近年来一些新的方法已开发出来用 于分析基因的功能，如系列基因表达分析法(SAGE),RNA分化显示法(RDD)，表达分化 分析法(RDA)，分化蛋白染色法等，但基因功能分析的方法仍不能满足目前的需要。其 原因诸多，其中，至少是由于传统的方法有二方面的缺陷。其一，缺少快速、可定 量及可靠的方法，其二，不同单位的研究人员不能对不同的基因在不同组织中的表达 结果进行相互定量的比较和对比。

研究一个基因在某种组织中的功能涉及许多指标，如在何种组织表达，在生命发 展的何种阶段表达，基因表达的细胞学定位，在正常组织和疾病组织中表达的异同， 以及基因表达和蛋白翻译的异同等。目前，尚无一种高输出的筛选鉴定技术能使人们 快速地、方便地、可靠地以及定量地对上述指标进行分析。

因此，目前迫切需要新的高输出筛选鉴定系统，可以快速地获取并定量分析基因 表达和蛋白翻译的信息。这些方法将会对一个原来功能未知的基因提供生理功能相 关的有价值的信息，并且还将促使基因功能研究的速度迎头赶上新基因序列推出的速 度。

本发明是一个新的、高输出的方法，用于分析目标基因在多种不同组织中的表达 状况。更准确地说该发明的具体内容之一是指用于分析目标基因在多种不同组织中 表达状况的方法。这一方法包涵下述内容：

将多个不同的组织样品放置在一个载体上，如玻璃片，形成一个多种组织矩阵。

用分子分析的方法对该多种组织矩阵进行分析，确定目标基因是否在该多种组织 矩阵中表达。以及

经上述分析后便可确定目标基因在该多种组织矩阵上的何种组织中表达。

本发明的另一项具体内容是指在所用的多种组织矩阵中，至少有一组多个组织样 品是(1)人的组织样品，(2)选自脑，心，肝，肾，肺，胰腺，脾和肌肉等组织和/或 是(3)肿瘤组织样品或疾病组织样品。此外，在多种组织矩阵中，至少一种组织所处 的发展阶段早于至少另外一种组织所处的发展阶段。该发明的另一项内容是将多个组 织样品按预先确定顺序的模式放置在载体上形成多种组织的矩阵。

本发明的还有一项内容是指分析目标基因在多个不同组织的样品中表达状况的方 法，包括下列内容：

将多个不同组织的样品切片按先后顺序放置在载体上形成连续切片，至少按先后 顺序制成第一个和第二个的多种组织矩阵。

选择可用于多个不同组织样品的检测目标基因表达状况的方法对上述第一个和第 二个多种组织矩阵进行检测和分析。在检测时，对第一个和第二个多种组织矩阵用不 同的检测方法。以及，

经上述分析后，确定目标基因在第一个和第二个多种组织矩阵上的多个组织样品 里的任何一个组织中表达状况。

本发明的另一项内容是指在第一个和第二个多种组织矩阵中，至少有一组多个组 织样品是来源于1)．人的组织样品，2)．选自一组脑，心，肝，肾，肺，胰腺，脾和 肌肉等组织和/或3)．肿瘤组织样品或疾病组织样品。此外，在该多种组织矩阵中，至 少一种组织所处的发展阶段早于至少另外一种组织所处的发展阶段。该发明的另一 内容是将多个组织样品按预先确定的模式摆置在载体上以形成多种组织矩阵，该载体 多为测试载玻片。

本发明的另一项内容是指上述应用方法中的多种组织矩阵和分析系统。该系统应 用了多种组织矩阵来分析目标基因在多个不同的组织样品中的表达状况。该系统可 将由分子分析后的信息进行自动影像化处理、贮存和管理等，还能对这些信息进行计 算机处理并建档贮存。因此，这些系统中包含有成像设备，如CCD照象机，以及可用 于处理和定量分析基因表达结果的计算机软件。这些系统还能够确定mRNA和蛋白质 在组织样品中的表达部位。根据多种组织矩阵中所摆置的组织，人们可以建立一个 完整的基因表达信息的数据库。这种数据库可供参阅和查询任何一个或所有的基因在 所有组织或某些特殊组织，如正常组织和肿瘤组织或来源于同一物种的组织中的表达 模式。人们可以根据数据库中基因在各种组织中的表达模式来预测未知基因的功能。

本发明是新型的高输出方法体系，用于分析目标基因在多个不同组织中的表达模 式。所阐述的方法可使人们以高输出的方式在大量的不同组织中鉴定未知基因的表 达模式，因此可提供有关基因表达产物功能的信息。这些方法还可提供蛋白质表达的 部位以及是否在任何目标组织中有变异蛋白质的表达等。因此该方法可以以高输出的 方式同时对大批量的不同组织进行基因转录、蛋白质翻译及基因突变等分析。该方法 还提供了标准程序，讲述如何准备多种组织矩阵，操作方法和数据分析方法。以便获 得一致的、可比的定量结果，从而保证对比分析的准确性。基因表达的数据还可实现 自动化贮存和分析，从而可以将所获基因表达的结果进行定量比较与对比分析。

本发明的具体内容之一是把多个不同的组织样品排列在一种载体上形成一种多种 组织矩阵，从而可对目标基因在不同组织中的表达进行分析。这儿所用的术语“多 种组织矩阵”及语法上与其相同的术语意指一种载体，其上面载有多个不同的组织，且 常常是以一种预先确定的模式进行排列。这样便容易使组织样品与基因表达分析数 据之间的关系相互对应。本发明中多种组织矩阵的载体有多种，例如玻璃，象显微 镜的载玻片(也称测试载玻片)，塑料，聚合物象聚丙烯，聚苯乙烯，尼龙，纤维素以 及其它类似物。但是以使用玻璃为最好。多组织矩阵最少含有2种组织样品，通常 多于5种。也可能多于10种，25种，倾向于使用50种以上组织样品。一个载体上能加 载不同组织的数量的上限取绝于是否足以把相邻组织从物理空间上分开，以及分辩目 标基因在相邻组织中的表达。绝大多数情况下，在24×16mm2面积上，多种组织矩阵 含有少于384种组织，以少于216种组织为好。当该多种组织矩阵上含有少于96种不同 组织时效果最佳。

组织处理及在载体上的摆置可用常规的组织学方法，这些众所周知的方法可参见 有关文献(如Ausubel等所著的“Current Protocols in molecular Biolgy”John Wiley and Sons出版，纽约1987)。通常，组织样品可以通过对常规来源的组织进行切片而 获得，切片厚度范围为0.5-20微米，常用1-10微米，最好是5微米厚。将组织切片按 先后按顺序放置到载体上。可使用常规的方法将组织放置到载体上，并进行固定。然 后可用石腊包埋，存放起来供日后使用。

从本质上来讲，任何组织，包括动物和植物，都可被用在本发明的多种组织矩阵 中，只要组织中含有DNA转录的产物(RNA)或翻译的蛋白质。以使用哺乳类组织样品为 好。如能使用来源于人正常和疾病的组织样品则效果更佳。多种组织矩阵上的组织 种类和排列法可以变化很大，取决于使用的目的及研究者想要获得的信息。例如，可 以排列在本发明的多种组织矩阵上的组织样品种类包括，但不限于此，(1)多种正常 组织如来源于脑，心，肝，肾，肺，胰腺，脾，肌肉等的组织，(2)来源于不同发育 和分化阶段的组织，如来源不同年令的皮肤组织，(3)多种成对的肿瘤组织及正常邻 近组织，如成对的乳癌及正常组织，成对的前列腺肿瘤及正常组织，成对的肺肿瘤及 正常组织，成对的脑瘤组织及正常组织。诸如此类。(4)来源于相同器官但组织种 类不同的多种组织，如肺鳞癌，肺腺癌及肺小细胞癌，(5)来源于相同组织种类但发 育阶段不同的多种肿瘤组织，如高分化，中分化及低分化肺癌，(6)来源于相同分化 阶段但不同级别的多种组织样品，(7)原发肿瘤组织和转移性肿瘤组织，(8)多种病 理组织，如自身免疫性和遗传性疾病，(9)来源于相同器官但不同个体或不同种系的 多种组织样品，(10)来源于相同器官不同部位的多种组织，(11)用于测试多种基因 的来源于同一个体同一器官的多个组织样品，(12)处理前和处理后的同一器官的多 个组织样品。如上所述，取决于应用的目的及研究的需要，普通技术员可以准备许多 不同组合的多种组织矩阵。

本发明的多种组织矩阵常规上按连续的方式进行制作，这样相邻的组织在其构 成、结构及组织形态方面是相同的，因此当使用连续的多种组织矩阵进行不同基因的 表达分析时，人们可以同时进行mRNA(如在第一个连续的多种组织矩阵上用原位杂交 法检测)，蛋白质(如在第二个连续的多种组织矩阵上用免疫组织化学法检测)和DNA (如在第三个连续的多种组织矩阵上用原位多聚酶链式反应法检测)，这样可以定量 地比较和对比同一多种组织矩阵上的不同组织样品间差异(因为多种组织矩阵上的每 一种组织都经历相同的基因分析条件)以及不同但是连续的多种组织矩阵上的相同和 不同组织样品间的基因表达差异(因多种组织矩阵为连续切片)。通过采用两个或多 个连续多种组织矩阵分析基因的表达，可以容易而快速地获得有关基因表达、基因调 节以及蛋白质分布区域的重要信息。然而同一基因在同一个多种组织矩阵上的mRNA 及蛋白质表达的分析也是本发明的范围之一。例如，通过原位杂交及免疫组化探测 mRNA及蛋白质在同一多种组织矩阵上的表达异同。

多种组织矩阵制做好后，对该组织矩阵上的任何组织样品，可用一个或多个矩阵 来分析和检测任何目标基因在其中的表达。这儿术语“能够检测目标基因的分析” 意指各种为人已知的现有的技术或将来开发出的技术。这些技术可以在RNA或蛋白质 水平上对组织细胞进行基因表达的定量分析。这些已知的技术包括原位杂交(采用核 酸探针检测mRNA在组织样品中的存在，从而使人们可以鉴定mRNA在哪里表达，表达量 如何)。(参阅Bancroft及Steves著的“Theory and Practice of Histological Techniques Churchill Livin Stone出版，纽约，1996)，原位免疫组织化学(采用 抗体检测蛋白质在组织样品中的存在，从而使人们可以鉴定蛋白质在那里表达，表达 量如何。)(参阅Harlow和Lane著的”Antibodies:A Laboatory Manual”Cold Spring Habor Laboratory,New York,1988)。原位多聚酶链式反应(用核酸探针来放大 扩增另一种存在于样品中的核酸分子，如RNA或DNA，从而可使人们鉴定基因是否发生 突变)[(参阅Poljak等著的Anticancer Res 17(3c):2201-2206(1997)]，常规的 分化蛋白质染色(适用于任何一种现有的蛋白染色)以及诸如此类(例如参阅 Maniatis等著的Molecalar Cloning:A Laboratory Manual，第二版(1989)以及 Ausubel等著的Short Protocols in Molecular Biolgy。所引用文献在文中已注明)。 一般来讲，当采用2个或更多个多种组织矩阵时，每一个多种组织矩阵可用一种不同 的分析方法来研究基因的表达，这样便可获得有关mRNA和蛋白质在所分析组织中表达 的可定量的数据。 

为了进行上述基因表达的分析，研究者首先必须知道一部分目标基因的核酸序 列。如上所述，有许多已被研究或尚未研究的基因序列都已是现成可用的。它们都 是很好的研究对象，可采用本发明阐述的方法去研究。一旦选定研究的目标基因，普 通技术员都可容易地设计和准备特异性的核酸探针来进行基因表达分析研究。例如， 原位杂交和原位多聚酶链式反应分析方法中寡核苷酸探针可用磷酸三酯，亚磷酸盐， 磷酸淀粉化学法，用固相技术EP266,032 4月4日1998或通过脱氧核苷H磷酸盐中介质 [(参见Froehlew等著的NaCl.Acids Res.14:5399(1986)]进行化学合成。寡 核苷合成后，可用聚丙烯酰胺凝胶纯化。对用于本发明的寡核苷酸探针的设计并无 特殊要求，以确保基因表达研究结果准确可靠为原则。

基因表达分析方法如免疫组化法，可使人们检测目标蛋白质在细胞中的存在与定 位。这种检测需要抗目标基因编码的蛋白质的抗体。在这方面，一个只有一般技术 的人员就可快速容易地制备抗目标基因编码蛋白的多克隆或单克隆抗体。例如，采用 周知的重组克隆DNA技术，把目标基因克隆到重组表达的载体上，然后进行体外表达 及纯化。一旦纯化完毕，蛋白的多克隆抗体可以通过将该蛋白质及佐剂多次进行动物 的皮下或腹腔注射而制备。把目标蛋白或一部分片段与另一种免疫源性蛋白质相结合， 如血蓝素(KLH)，血清蛋白，牛甲状腺蛋白或大豆胰蛋白酶抑制因子等。这种蛋白 结合需用一种双重功能试剂或衍生剂，如硫酸琥珀酸酰胺酯(通过半胱氨酸基团结合)， N-羟安非他命(通过赖氨酸结合)，谷氨醛，脱水琥珀酸，SOCl2或R1N=C=NR(这儿R 和R1表示不同的烷基团)。然后，多克隆抗体可以用常规的技术从免疫血清中纯化出 来。

抗目标蛋白质的单克隆抗体是由一些几乎相同的抗体分子所组成。除了个别抗体 分子会发生一些自然变异以外，每种单克隆抗体中所包含的诸多抗体分子是相同的。 例如，目标基因的单克隆抗体可以通过用由Kohler和Milstein描述的杂交瘤法 [(Nature 256:495(1975)]或可以通过重组DNA方法(Cabilly等，US专利号 4816,567)。此处引用这些文献作为参考。对产生的单克隆抗体的亲合性的测定可用 Munson和Pollard的Scatchard分析法[(参见Anal.107:220(1980)]。

为了检测多种组织矩阵上的任何组织样品是否有mRNA和蛋白质存在，可以用许多 为人周知的技术来进行。例如，在免疫组织化学分析法中所用抗体，一方面与目标 蛋白质结合，其本身还可以与另外一个带酶的抗体(第二抗体)结合。第二抗体所带 的酶如碱性磷酸酶能把一种底物如5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/氮兰四唑(BCIP/NBT)分 解为一种产物，可直接观察或用其它方法可对这种产物进行测定。许多这种酶-底物 系统已广泛为人周知并被常规性地使用着。用常规方法可将同位素或萤光素标记在核 酸探针上，在探针所杂交之处就有了可检测的信号。    

本发明的分析系统可用于分析目标基因在多个不同组织样品中的表达状况。多种 组织矩阵为整个系统的构成部份之一。该系统的另一个构成部份是检测目标基因表达 状况的方法。可用这些检测方法来分析目标基因在多种组织矩阵的表达状况。例如，当 多种组织矩阵被用于一些基因表达的检测方法时，如原位杂交法，免疫组织化学法， 原位多聚酶链式反应法或蛋白质染色法，通常依颜色或放射性等信号便可对基因表达 产物进行测定。使用分光光度计，放射性检测仪，计算机影像化设备和萤光体影像仪 等探测仪器或设备可对上述信号进行观察和定量分析。

这些系统还可结合其它方法如图像摄影(CCD照像机)，计算机图像贮存及一些计 算机分析软件程序。这些方法能够定量比较及处理从上述的基因表达分析中所获得 的数据，并可确定mRNA和蛋白质在组织样品中表达的具体部位。从上述方法所获得 图像信息可由计算机贮存分析，因此不仅可实现实验数据的可永久性保存及重建性， 还能使用可靠的标准图像信息进行定量比较和对比分析，从而不再担心人为因素给分 析所带来的偏差。因此，对上述分子生物学分析所得到的基因表达信息进行自动化 图像处理，信息建档，贮存及管理，将提供一种高输出型的基因表达分析的崭新手段。

此外，根据在多种组织矩阵中使用的组织样品，人们将能够开发一个含有任何和 全部基因表达信息的完整的基因表达数据库。该数据库将供人们参阅，搜寻基因在所 有组织或某些组织中，如正常组织、肿瘤组织或源于同一物种的组织中的表达模式。 根据从该数据库得到的基因在各种组织中表达模式的信息，人们可以对任何未知基因 产物的功能进行预测。该数据库亦可用于基因表达信息的贮存、搜寻、比较、分析、 通信以及传送。

图1展示了该发明具体内容之一的流程图。如图所示，对功能未知的基因来说， 通过分析其一段基因序列在多种组织矩阵上各种组织中的表达模式而得到重要的信 息，如基因在什么种类的组织中发生突变(如肿瘤或其它疾病组织)，基因在什么地方 编码其蛋白质等等。这些信息可通过上述的分子分析方法而获得并用机械的设施如 显微镜，CCD照像机，扫描机等进行存贮，从而消除了人为因素给分析结果所带来误 差。这些结果还可存入计算机的程序中进行分析、比较、对比及其它操作处理。从 这些分析中，人们可以构建非常详尽的基因表达数据库。根据该数据库中基因表达的 模式，蛋白质在细胞或组织中的分布信息，人们可对功能未知基因的功能作出有价值 的预测。有关发明的详情将会在后面的非限制性样例中加以说明。 1．组织样品在测试载物片上的摆置

把所得到的组织样品(例如动物，人或植物，正常或非正常组织)切片按一定顺序 摆置在测试载物玻璃片上。根据检测人员想要了解的信息，测试载物玻璃片上的组 织类型的数量及摆置的顺序是可变的。通常需要准备多张同样的测试组织切片，以便 用不同的分子分析方法对同样的测试组织切片进行分析。由于所用的测试组织切片是 相同的，由每一个个别测试组织切片上所得到的结果可相互进行比较。

组织样品需要先在4％甲醛中固定4小时后再进行组织切片处理。将组织切成小块， 并按一定顺序包埋在石蜡中。用传统方法把组织用切片机切成5μm厚的样品，并摆置 在载物玻璃片上。

按上述制备的测试组织切片可用于不同分子分析技术，如原位杂交、免疫组织 化学、原位多聚酶链式反应、或联合使用这些方法进行基因表达分析。 2．原位杂交 (a)切片预处理程序

将石蜡包埋的组织切片浸于二甲苯中2-3次进行脱蜡，每次10分钟。依次浸于100％ 乙醇，95％乙醇和70％乙醇中各2次进行水化，每次2分钟。用KIMWIPE纸在切片边缘沾 吸去乙醇，然后将切片放于紫外交联仪中，于120,000microjoules下交联30秒。将 切片浸于PBS中2次再水化，每次5分钟。再浸于0.02M HCl中10分钟后，转入0.1％(v/v) Triton-X-100％PBS中90秒。再用PBS洗3次，每次3分钟。

将蛋白酶K[100ug/ml/Tris-EDTA(TE)]预热至37℃，然后加于组织切片上，于37 ℃保温10-20分钟。用2mg/ml/Glycine/PBS洗切片5分钟。用KIMWIPE纸沾吸去切片周 围多余液体后，把切片放于紫外交联仪中，按上述条件交联。用4％副甲醛处理组织 切片1分钟，再用PBS洗2分钟。然后将切片浸于冷却好的20％乙醇(2-8℃)15秒。用PBS 洗切片2次，每次5分钟。然后将切片晾干。 (b)杂交和洗脱

将切片放入预杂交液(50％甲酰胺，0.6M NaCl,10mM Tris-Cl,pH7.5,1mM EDTA, 5ug/ml Heparin,10mM Dithiothreitol(DTT),10％PEG及1x Denharts溶液)中， 在50℃下，预杂交至少1小时。预杂交期间，准备荧光标记探针，每种组织样品用25 μl杂交液(探针浓度为300-600ng/ml即可适合于多数杂交)。探针用标准方法标记，并 用预杂交液稀释。杂交液含有50％甲酰胺，0.6M NaCl,10mM Tris-Cl,pH7.5,1mM EDTA, 5ug/ml Hepain,10mM Dithiothreitol(DTT),10％PEG及1x Denharts溶液，载体 DNA和0.5mg/ml tRNA。于70℃放置10分钟将探针变性，然后放于冰上，再用12,000xg 短暂离心。将杂交液加在组织上，并将切片放于保湿盒中，在50℃下杂交过夜。

杂交后，在严格的洗脱条件下洗切片。典型的洗法如下：室温下1× SSC/0.1％(v/v)SDS洗两次，每次5分钟。再用0.2×SSC/0.1％(v/v)SDS于50℃下洗两 次，每次10分钟。如用RNA探针，可用RNaseA处理以减少背景，因RNaseA处理只可 把单链及未杂交的物质清除掉。将切片浸于2×SSC中，以便下一步处理。 (c)封闭、抗体孵育和洗脱

用检测缓冲液(100mM Tris-Cl,pH9.5,100mM NaCl和50mm MgCl2)洗切片5分钟。 将切片放于封闭缓冲液中(0.5％(w/v)RPN300(Amersham Intenational PLC, Buckinghamshire,England)溶于TBS(100mM Tris-Cl pH7.5,400mM NaCl)封闭1 小时。将切片浸于TBS中1分钟。如果需要时，用KIMWIPE吸去切片周围多余的缓冲液。 用0.5％(w/v)BSA/TBS(牛血清白蛋白第五组份溶于TBS)，以1:1000(抗体∶缓冲液) 比例稀释抗体(与碱性磷酸酶交连)。抗体最终浓度为1mg/ml。将100ml抗体稀释液加 于组织切片上，并反应1小时。再用TBS洗3次，每次5分钟。 (d)检测

与抗体反应之后，用检测缓冲液洗测试玻璃片5分钟，如需要时，用KIMWIPE纸 上吸去周围多余的缓冲液。将1片碱性磷酸酶底物(5-bromo-4-chloro-3-indolyl- phosphale/nitro blue tetrazolium BCIP/NBT；Sigma FAST  B-5655,Sigma化 学公司，St.Louis,Mo)溶于10ml水中，将该水溶液加于切片上反应4-24小时。用 蒸馏水浸泡测试玻璃片2次，每次2分钟。把盖玻片盖于组织上。 3．免疫组织化学

将测试玻璃片(载有石蜡包埋组织)放于65℃1小时，再浸于二甲苯2-3次，每次10 分钟。于100％乙醇中2次，每次2分钟。再将玻片分别浸于95％,70％,50％和30％乙醇 中，每种液体中浸2分钟。于缓冲液A(0.25M Tris-Cl,pH7.5)中浸5分钟，再转入缓 冲液B(0.25M Tris-HCl,pH7.5,0.5％BSA和2％胎牛血清)中5分钟。将第一抗体用缓 冲液B稀释到10μg/ml，并取50μg加于组织切片上(第一抗体直接与目标蛋白结合)， 于湿盒中反应过夜。然后用缓冲液A洗切片5分钟。用KIMWIPE上吸去周围多余液体。 将第二抗体(与第一抗体结合，如抗鼠IgG碱性磷酸酶复合物)用缓冲液B稀释至 5μg/ml，并加于组织切片上，于保湿盒中反应30分钟，或更长，然后用缓冲液A洗片 5分钟。将1片碱性磷酶底物BCIP/NBT(Sigma化学公司St.Louis MO)溶于10ml水中， 每种组织加50μl，反应5-30分钟，再用蒸馏水洗切片，晾干。 4原位多聚酶链式反应(PCR) (a)准备组织样品

将测试切片浸于二甲苯中15分钟，进行脱蜡，然后浸于100％乙醇中5分钟。重复 上述步骤一次，并将切片空气干燥1-5分钟。再将样品放于100℃,90秒后，置于室温 冷却。

每张组织切片上依次加0.5ml 100％乙醇和0.5ml 75％乙醇进行水化，再加蛋白酶 K/PBS液(50μg/50ml)于组织切片上，在室温下反应30分钟。弃掉蛋白酶K/PBS液， 用新鲜PBS液洗切片2次(每次0.5ml)。分别用75％和100％乙醇处理切片进行脱水。晾 干切片，95℃放置120秒，然后重放回室温，使之冷却至室温。根据所要检测的是RNA 或是DNA，可以用DNaseI和或RNase A处理组织样品。干燥的组织样品可用100％乙醇 和75％乙醇进行水化，然后用20μl DNase I液(20-40单位/样品和RNAsin(0.7μl)或 RNase A(约5μl)处理组织样品，将切片放于保温盒中，于37℃，反应2-12小时。用 TBS(200μl/组织样品)洗切片2次，用DEPC(溶于75％乙醇)洗两次(200μl/组织样品)然 后用TBS洗2次(200μl/组织样品)。将切片分别依次浸于75％乙醇和100％乙醇进行脱 水，然后晾干。于95℃温育120秒，使DNase I失活，然后冷却至室温。 (b)原位反转录检测RNA

每2张组织切片需准备100μl反应混合物。首先将一片KIMWIPE纸和4ml水放置于复 盖有保鲜膜的PTC-100加热板上(MJ.Research,Watertown,Massachusetts)，然后 加热至70℃,5分钟，以达到平衡。依次用100％乙醇和70％乙醇处理2张组织切片，以 使其重新水化。在100μl DEPC水中加入2.5μl外部反义引物(3’引物，总用量50μm)。 取出5μl该溶液加于一张组织切片上。将测试组织切片放于预热至70℃的湿润的 KIMWIPE纸上，保温120-150秒，使引物退火。然后将组织切片放于保湿盒中并降温至 室温。用保鲜膜复盖PTC-100加热板，并调温至37℃。按下列配方制备cDNA反应液(每 2个组织切片需制备100μl),2μl 5×第一链缓冲液(250mM TrisCl,PH8.3,375mM KCl, 15mM MgCl2),10μl 10×DTT,20μl 4种dNTP混合液(2.5MM),3μl RNasin(1000u/ml), 4μl MMLV反转录酶(200u/μl)和43μl DEPC水。加16μl cDNA反应液于盖玻片上，倒 置组织切片于该盖玻片上使组织接触cDNA反应液。将带盖玻片的组织切片竖放于PCR 保湿盒中，于37℃保温30分钟进行延伸反应。然后于50℃,10秒，37℃,5分钟和92 ℃,5分钟进行5个循环的反应。用刀片移去盖玻片，用TBS洗组织切片2次，最后用75％ 乙醇洗一次(500μl/组织切片)。 (c)原位第一扩增

每2个组织切片需准备100μl扩增反应液。按下列配方在0.5ml离心管中制备扩增 反应液，10μl 10×含MgCl2的耐热酶(Taq Polymerase)缓冲液，2μl 4种dNTP混合液 (每种2.5mM),2μl外向5’有义引物(50pg/μl),2μl外向3’反义引物(50Pg/μl),84μl 水。将反应液加热至45℃并加入1-2ul耐热酶(总量5-0个单位)。将16ul含有耐 酶的反应液滴于盖玻片上，倒置组织切片于盖玻片上使组织与反应液充分接触。把组 织切片/盖片竖放于预热至45℃的PCR板上。用指甲油封闭盖玻片/组织切片边缘2次， 待指甲油干后，将组织切片/盖片置于45℃加热板上10分钟。按下列条件进行PCR反应： 94℃,4分钟后，按94℃,50秒；50℃,2分钟，72℃,1分钟进行45个循环。 (d)原位标记多聚酶链式反应

用刀片小心移去盖玻片，用TBS洗组织切片2次，再用75％乙醇洗2次。按下列配 方制备DIG(地高辛)-PCR反应液(2个组织切片需制备100ul):10X含镁耐热酶缓冲 液10ul(200mM Tris-Cl,PH8.4,500mM KCl),10XDIG标记混合液(1mM dATP,dCTP, dGTP,6.5mM UTP,0.65mM dTTP,0.35mM DIG-11-dUTP,alkalilabile，内部5’有 义引物2ul(50pg/ul)，内部3’反义引物(50pg/ul)2ul和76ul水。将反应液加热至95 ℃后，加入1-2ulTaq耐热酶(5U/ul)。取16ul含耐热酶反应液滴于盖玻片上，倒置组 织切片于盖玻片上，使组织与反应液充分接触。将组织切片/盖玻片竖放于预热至45 ℃的PCR板上。盖玻片/组织切片边缘需用指甲油封闭，并置于10分钟使其干燥。94℃, 4分钟后，按94℃,50秒；50℃,2分钟；72℃,1分钟，进行10个循环反应。 (e)染色

制备2％BSA(溶于PBS)，并加热至55℃。小心用刀片移去盖玻片，并用TBS洗组 织切片2次，再用预热至55℃的2％BSA/PBS洗10分钟。再用含有3％山羊血清(0.5ml/ 切片)的TBS洗组织切片两次，30分钟。再与含有与碱性磷酸酶偶联的山羊抗地高辛抗 体(1ul/1000ul可用于两张切片，150units/200ul)的3％山羊血清/TBS液中反应30分 钟。用TBS洗组织切片2次10分钟，再用TNM(100mM Tris,100mM NaCl,50mM MgCl, PH9.5)洗2次5分钟。然后于显色检测液中反应30分钟至12小时，(显色检测液配方为： 33ul BCIP,3.3ul NBT,1000ul TNM，可用于2张组织切片)。用水终止显色反应，吸 干组织切片。 5．影像化信息的建档：

以上对组织样品进行的分子分析所得到的图像可以用显微镜(NIKON E600，放大 倍数为10X,40X，孔径为0.5和0.85),CCD或精密照相机和计算机图像分析系统(Compix Inc.,Tualatin,Oregon)处理并进行资料保存。操做程序见制造商指南。所有图像 以TIFF格式进行存储，用Word文字处理软件编辑并打印。打印机是位于美国加州的San Jose的ALPS生产的彩色打印机，型号为MD-2010。

在测定mRNA或基因表达产物蛋白质的过程中，使用连续的多种组织矩阵，人们可 以得到有关诸如基因表达状况及基因的生理功能等一系列有价值的定性和定量的信 息。例如，通过本文所述方法人们可以迅速地和方便地检测到目标基因在组织中表达 的特异性和表达水平。因此，人们就可检测到目标基因在一种或多种目标组织中它的 mRNA和蛋白质表达的特有的模式。这样的数据可以提示基因可能具有的功能。例如，某 一未知基因仅在肿瘤组织中表达而在相应的正常组织中不表达，这一基因就很可能是 致癌基因。相反，如该基因仅在正常组织中表达而在相应的肿瘤组织中不表达，则这 一基因就很可能是肿瘤抑制基因。使用本发明所述方法，人们还可以比较在一系列不 同的组织中，目标基因的mRNA和/或蛋白质在组织中的表达水平和部位，从而提供了 基因的功能和基因表达的调节机制等一系列有价值的信息。例如，在细胞表面表达 的蛋白可能是新的细胞受体，在胞浆中表达的蛋白可能和信息认别有关或是一种结构 蛋白，而位于胞核中的蛋白则可能是转录蛋白因子。

此外，在检测中如发现mRNA的表达水平很高，但蛋白的表达水平很低，提示在蛋 白翻译过程中进行了表达的调节。如果mRNA表达水平和蛋白质表达水平相符，调节机 制则可能在基因的转录水平上。

人们还可在正常组织、疾病组织和恶性肿瘤组织之间比较某一基因的表达情况， 从而揭示该基因在疾病发展中的作用。在不同的组织中比较不同的基因的表达情况， 还能提供关于几个蛋白质之间相互关系的信息。

因此，本发明提供了一种前所未有的用于分析基因表达的方法，即用高输出的 方法对所得结果进行定量的比较。

本发明还提供了适用于上述方法的多种组织矩阵和用多种组织矩阵在多个不同的 组织样品中对目标基因的表达状况进行分析的一系列系统。这些系统是由CCD照象机 系统、计算机及相应软件所组成的。这些系统可定量地对基因表达的信息资料进行 处理，还能对mRNA和蛋白质在组织样品中的表达位置进行定位。根据所采用多种组织 矩阵中的组织样品的构成，人们可以开发和建立一个对所有基因或任何一个基因的完 整的基因表达数据库。使用该数据库，人们可以查阅某些基因在所有组织或某些组 织，如在正常组织，肿瘤组织或源于同一物种的不同组织中的表达状况。从这一数 据库中，基于基因在各种组织中表达的状况不同，人们还可以预测未知基因产物的功 能。

前文所详细描述的各种具体方法都可以用于实施本项发明。一旦掌握合了解了这 些具体的方法，人们便足以懂得如何利用本发明的硕果设计出类似的可靠的产品和方 法来获取同样的信息。然而，虽然本文有详细的描述，但是本发明的全部内容并非局 限于此。本发明的保护范围只是由下述的法律声明条款来决定的。本文所有引用的文 献作为参考。

如前所述，传统的以及现有的基因功能分析方法有二方面的缺陷：其一，缺少速 度，难以定景，可靠性差。其二，由不同研究人员所得的基因表达结果难以进行相互 定量比较和对比。所以，导致基因功能的分析研究远远落伍于新基因序列发现推出方 面的进展。本发明使用由多种不同组织组成的多种组织矩阵可以对基因的表达进行高 输出的筛选鉴定，并且还将基因表达的图象信息进行电子化数据化处理，从而开创了 一种基因功能分析的全新手段。其优点有：1)高输出的筛选鉴定：如使用多种组织矩 阵，可以一次性地做到同时对目标基因在所有的人体主要器官中的表达水平及表达区 域进行鉴定；2)定量化的比较对比分析：由于多种组织加载于同一载体上，所有组织 的分析处理条件都一致，所以所获的不同组织间的结果是可定量比较的。此外，许多 载体上的组织样品来源相同，制做条件一样，因此不同载体间的基因表达分析结果也 是可以进行定量比较对比的；3)功能未知基因的预测性：由于能高输出地获得目标基 因序列在大量不同组织中表达模式，大大提高了对未知基因产物的功能的可预测性； 4)实现基因表达数据库的建立：由于实现大规模地对基因表达模式的分析，并且对结 果进行电子化数据化处理，自然导致了数据库的建立。随着这种高输出基因功能分析 方法的广泛应用，其潜在的优点和积极效应势必将会不断地展现出来。 图1．基因表达、变异和蛋白质定位高输出分析系统(GEMPLA)

图1所示的是本发明中具体内容之一的流程图。mRNA表示信使核糖核酸，DNA表 示脱氧核糖核酸。CCD照像机是带电偶合装置(Charged-Coupled Device)的照像机， 或称为光电转换照像机。 图2．β-肌动蛋白(β-Actin)基因在大鼠脑中的表达和分析    

图2所示的是β-肌动蛋白mRNA和蛋白质在大鼠脑中表达的水平高低和位置。用原位 杂交和免疫组织化学方法可显示其特有的基因表达模式。图例放大率为100倍。 图3．β-肌动蛋白和细胞角蛋白(Cytokeratin)基因在人乳腺癌细胞中的表达和分析

图3所示的是通过原位杂交和免疫组织化学分析法对β-肌动蛋白和细胞角蛋白的 mRNA和蛋白质在肿瘤细胞中表达的特有模式的分析结果。图例放大率为100和400倍。 图4．β-肌动蛋白mRNA在不同组织中表达水平的定量分析

图4所示的是通过原位杂交法对β-肌动蛋白mRNA在哺乳类不同组织样品中的表达水 平的定量分析的分析结果。图例放大率为400倍。 图5．β-肌动蛋白蛋白质在不同组织中表达水平的定量分析

图5所示的是通过免疫组织化学法对β-肌动蛋白蛋白质在不同哺乳类组织样品中 的表达水平的定量分析的结果。图例放大率为400倍。 图6．细胞角蛋白蛋白质在不同组织中表达水平的定量分析

图6所示的是通过免疫组织化学法对细胞角蛋白蛋白质在不同哺乳类组织样品中 的表达水平的定量分析，图例放大率为400倍。 图7．C-jun蛋白质在人结肠癌组织中的核定位分析

图7所示的是通过免疫组织化学法对C-jun转录因子蛋白质在人结肠癌组织细胞中 的表达部位的定位分析结果。 图8．MAP蛋白质激酶在正常人乳腺组织中的细胞质定位分析

图8所示的是通过免疫组织化学法对MAP蛋白质激酶在正常人乳腺组织细胞中表达 部位的定位分析结果。 图9．erb-2受体在人乳腺肿瘤组织表达的细胞膜定位分析

图9所示的是通过免疫组织化学法对erB-2受体在人乳腺组织样品中的表达部位的 定位分析。 图10．β-肌动蛋白和细胞角蛋白在不同组织中表达水平的定量分析及比较    

图10所示的是通过原位杂交法及免疫组化法对β-肌动蛋白mRNA和蛋白质以及细胞 角蛋白蛋白质在不同哺乳类组织样品中表达水平的分析结果。图例放大率为400倍。 图11．β-肌动蛋白在不同成人及胎儿组织中表达水平的定量分析

图11所示的是通过原位杂交法对β-肌动蛋白mRNA在不同成人及胎儿组织中表达水 平的分析结果。这些组织是摆置在同一张多种组织矩阵切片上的。 例1 β-肌动蛋白基因在大鼠脑组织中表达的分析

β-肌动蛋白在大鼠脑组织中的表达模式是用原位杂交和免疫组织化学法进行的。 采用三张大鼠脑的连续测试切片。两张用于原位杂交和免疫组织化学分析，第三张用 于对照处理。所用的探针是人的β-肌动蛋白，基因银行中的编号为M10278。用于免疫 组织化学的β-肌动蛋白抗体购于位于美国印弟安那州Indianapolis的Boerhringer Mannheim公司(产品目录为1378996)。对照样品的处理与处理样品的条件一致，只 是未使用探针或抗体。

上述的分子分析结果见图2。特别指出的是，如图2所示，在大鼠脑组织的相同区 域，β-肌动蛋白mRNA与β-肌动蛋白蛋白质表达模式出现互不关联现象。原位杂交显示 β-肌动蛋白mRNA主要分布在脑的神经纤维区(神经纤维区在组织样品中呈深染色)， 而在皮质区其表达水平则很低(皮质区在组织样品中呈浅色)。与此形成鲜明对照， 免疫组织化学分析显示β-肌动蛋白蛋白质主要分布在皮质区而在神经纤维区的表达则 很低。因此，通过对组织来源相同、几乎同样的组织切片进行不同的分子分析(即原 位杂交和免疫组织化学)，人们可以获得对某种基因表达部位及表达水平的可定量分 析的准确数据。例如，如同本处所示，这些方法可以探测mRNA和蛋白质在组织中的不 同分布。如果目标基因是功能未知的基因，这种分析可以对其产物可能具有的功能提 供有价值的信息。     例2 β-肌动蛋白和细胞角蛋白基因在人乳腺癌组织中表达的分析

β-肌动蛋白和细胞角蛋白在人乳腺癌组织样品中的表达模式是用原位杂交和免疫 组化对人乳腺癌组织样品的连续测试切片进行分析的。所用的β-肌动蛋白探针及抗体 同例1。用于免疫组织化学的抗细胞角蛋白抗体是全抗-Cytokeratin-FITC(购于位于 美国圣路易斯Sigma化学公司，产品目录号是F-0397)。对照样品的处理同处理样 品的处理条件完全一致，只是未加探针和抗体。

上述分子分析所得的结果见图3。特别指出的是：如图3所示在人乳腺组织中β-肌 动蛋白蛋白质表达模式明显不同于细胞角蛋白蛋白质的表达模式。这表明在乳腺癌细 胞的生理环境下，这两种蛋白质无相互作用。因此，通过这种相同的测试切片对两种 不同基因的表达模式进行分子分析，人们可以获得定量性的数据，并可提供有关不同 基因产物是否在功能上相互关联的重要信息。 例3 β-肌动蛋白mRNA和蛋白质在不同组织中表达的定量分析

采用两张含有相同组织样品的测试切片对β-肌动蛋白mRNA和蛋白质在不同小鼠组 织中表达水平进行定量分析。测试切片上的组织包括心、脑、肾、肝、肺、胰腺、脾 和肌肉。具体操作见材料与方法部分。这些测试切片用原位杂交或免疫组职化学方法 进行分析，操作见材料与方法部分。所用材料与抗体见上述例1和例2。由于所有被测 试的不同种类的组织均在同一张测试切片上，在任何特定的测试切片上的每一个组织 所经受原位杂交或免疫组织化学的实验条件是相同的。因而同一切片上的不同组织样 品间的定量分析是可靠的。此外，由于这两张测试切片上的组织样品来源相同，制做 过程一样，故这两张测试结果间也是定量可比的。原位杂交结果见图4。

如图4所示，β-肌动蛋白mRNA在心、胰腺和肌肉组织中的积累显著地高于其它组 织如肺、肾和脾。免疫组织化学结果见图5。如图5所示，细胞角蛋白蛋白质表达模式 类似mRNA的表达，在肌肉类的组织中的表达量要远远高于其它组织，如肺、肾和脾。 而β-肌动蛋白蛋白质在脑中的分布(图5)，某种程度上是不同于β-肌动蛋白mRNA分 布的(图4)。

因此，通过使用含有不同组织的相同测试切片并使用相同的分子分析条件来检查 mRNA或蛋白质的表达，人们可以常规地对基因在这些不同组织中的表达水平进行定量 分析比较，如本处所示，这种分析已经揭示了mRNA在不同组织中的水平是有显著差异 的。如果目标基因是功能未知的基因，这种分析可以对其产物可能具有的功能提供有 价值的信息。 例4  细胞角蛋白蛋白质在不同组织中表达水平的定量分析

采用一张含有各种组织样品的测试切片对细胞角蛋白蛋白质在不同小鼠组织中的 表达水平进行定量分析。所用组织样品有心、脑、肾、肝、肺、胰腺、脾和肌肉，详 见方法与材料部分。测试切片的分析条件如例3所描述。所用测试方法是免疫组织化 学法，详见方法与材料部分。所用抗细胞角蛋白抗体如例2中所描述。免疫组织化学 分析结果见图6。 如图6所示，〔这儿与图5所示的β-肌动蛋白的表达分析结果相比较而言〕细胞角蛋白 与图5所示的β-肌动蛋白蛋白质分布模式有显著不同。而且值得注意的是，细胞角蛋 白蛋白质在脑组织中的分布模式类似于β-肌动蛋白mRNA在脑组织中的分布(见图4)， 但是却与β-肌动蛋白蛋白质在脑中的分布有显著不同(见图5)。 例5  转录因子c-jun在人结肠癌组织中的细胞核定位

为了确定目前所描述的方法是否能够检测致癌基因在癌细胞核中的存在与否，制 做了含有人结肠癌组织样品的测试切片并进行了免疫组织化学分析。详见材料与方法 部分。所用c-jun抗体购于美国麻省剑桥的ONCOGENE Research公司(产品目录号是 PC06)，分析结果见图7。

如图7所示，c-jun转录因子的蛋白质在人结肠癌组织中的表达极高，且清楚地显 示出其表达仅限于细胞核内。就此而言，本发明不仅能检测目标基因是否在特定细胞 类型中表达，而且还能够对目标基因在细胞内部表达的分布进行定位。 例6  MAP蛋白激酶在正常人乳腺组织中的细胞质定位

为了确定目前所描述的方法是否能够检测蛋白质的表达在细胞质中的空间分布， 制做了含有正常人乳腺组织样品的测试切片并进行了免疫组织化学分析。详见材料与 方法部分。所用MAP抗体购于位于美国印第安那州Indianapolis的Boehringer Mannhein公司〔产品目录号是147694〕。分析结果见图8。

如图8所示，MAP蛋白质在人乳腺组织中的表达极高，且清楚显示出其表达仅限于 细胞的细胞质中。就此而言，本发明不仅能检测目标基因是否在特定细胞类型中表达， 而且还能够对目标基因在细胞内部的表达分布进行定位。 例7  erbB-2受体在人乳腺癌组织中的细胞膜定位

为了确定目前所描述的方法是否能够检测蛋白质在细胞膜表面的存在情况，制做 了含有人乳腺癌组织的测试切片，并进行了免疫组织化学分析。详见材料与方法部分。 所用erbB-2抗体购于位于美国缅因州Westbook的Immunotech公司(产品目录号是 1591)。分析结果见图9。    

如图9所示，erbB-2受体在人乳腺癌组织中的表达极高，且清楚地显示出其表达 仅限于细胞膜表面，就此而言，本发明不仅能检测目标基因是否在特定细胞类型中表 达，而且还能对目标基因在细胞内部表达的分布进行定位。 例8 β-肌动蛋白和细胞角蛋白在各种不同组织中表达的定量分析与比较

为了定量分析β-肌动蛋白mRNA或蛋白质以及细胞角蛋白mRNA与蛋白质在不同小鼠 组织中的表达水平，制做了许多测试切片，它们含有不同组织包括心、脑、肾、肺、 肝、胰腺、脾及肌肉等在内的相同组织样品。详见材料与方法部分。使用这些切片进 行了原位杂交或免疫组织化学分析。方法描述见材料与方法部分。所用β-肌动蛋白探 针或抗体同例1及例2。由于所有的组织加载于同一张检测切片上，任何一张特定切片 上的每一个组织都经过一致的原位杂交或免疫组织化学的试验处理条件，所以，同张 测试切片上的不同组织间的结果是可定量比较的。此外，由于许多测试切片上的组织 样品来源相同，并且测试切片制做条件一样，因此不同切片间结果也是可以进行定量 比较的。对照样品处理条件同处理样品的处理条件一样，只是未加探针或抗体。分析 结果见图10。

如图10所示，该分析可使人对任何目标基因在任何组织中的mRNA或蛋白质表达进 行比较和对比分析。由于多种组织可以按预先确定顺序的模式固定在同一张测试切 片上，而且由于多种相同的测试切片可以被平行地用于不同的分析来检测mRNA或蛋白 质的表达，所以所获得的任何目标基因在任何组织中表达结果是可与任何其它目标基 因或组织所获得的结果进行定量比较和对比的。因此便可获得有关任何未知基因的 有关生理功能的重要信息。换言之，本发明提供一种新型的、高输出的分析方法。它 可使人们快速地定量性地比较与对比两个不同基因在同样组织(不论正常还是疾病组 织)中的表达情况，或相同基因在不同组织(不论正常还是疾病组织)中的表达。并且 还可确定mRNA和蛋白质在细胞内的分布区域。这种高输出分析法在筛选和确定那些功 能未知基因的组织表达特异性以及在其表达组织中的分布区域时是相当有用的，因此 这种分析可对功能未知的基因提供有关可能具有的生理功能方面的重要信息。 例9 β-肌动蛋白mRNA在不同成人组织及胎儿组织中表达的定量分析与比较

β-肌动蛋白原位杂交分析如同上述，只是使用了切片含有48种不同成人组织及胎 儿组织的多种组织矩阵。如图11所示，所测定的组织样品几乎代表了所有的人体主要 器官和重要区域。结果显示了β-肌动蛋白的基因的表达遍布于人体的多个器官，在 一些组织中的表达量高于另外一些组织。因此使用由多种不同组织组成的多种组织 矩阵可以对基因的表达进行高输出的筛选鉴定。如图11所示，基因表达的图象信息可 被数据化处理，从而以电子化的形式加以建档和贮存。