[技术领域]

本发明属于检测、测定微生物的方法及试剂，尤其涉及一种利用生物发光对含菌量较 少的样品进行微生物快速检测的方法及用于这种方法的试剂。

[背景技术]

目前，作为微生物最大宗的常规检测项目——细菌、霉菌和酵母菌数量的检测，依然 沿用一百多年前由巴斯德建立的琼脂平板计数法。传统的微生物检测方法依赖于特殊的微 生物培养基来分离培养样品中存活的微生物，这些方法灵敏、直观，能同时提供食品中微 生物数量和种类的信息。然而常规方法从开始培养到肉眼可见的菌落需要1～5天时间， 且操作繁琐，局限于实验室，对操作人员的技术水平要求高，容易出现人为的误差；而迄 今为止作为自然环境中的微生物，能够进行人工培养的一般认为只有5～10％，没有单独 一种培养基或一套物理、化学条件能够满足样品中所有微生物的生理要求；同时，培养基 的制备、平板培养、菌落计数和生化鉴定工作量大、费时、费力，提供的是历史性信息， 不能达到企业生产质量控制、卫生监督检测快速获得微生物信息的要求。近年来，随着科 技的进步和自动化技术的应用，传统方法在样品处理、平板培养、菌落计数和鉴定系统上 所做的许多改进，已使操作更加简易和方便，同时亦降低了花费和减少了工作量。但居于 培养的方法仍需以时间为代价，无法快速得到结果，远远不能满足食品工业生产、环境卫 生监督现场检测的需求。因此，微生物快速检测的技术和仪器便顺势而生，其中ATP生物 发光在线微生物快速检测方法是目前认为最有可能实现微生物数量在线检测的新技术。

ATP生物发光技术于20世纪60年代由NASA(美国航空航天局)的科学家们(Chappelle 和Levin等)提出，其原理是萤火虫荧光素酶(Luciferase)以荧光素(D-Luciferin)、 三磷酸腺苷(ATP)和O2为底物，在Mg2+存在时，能将化学能转化为光能。反应式表示为：

D-Luciferin+ATP+O2 LuciferaseMg²⁺Oxy-Luciferin+AMP+ppi+H2O+hυ

ATP既是荧光素酶催化发光的必需底物，又是所有生物生命活动的能量来源，在荧光 素酶催化的发光反应中，ATP在一定的浓度范围内，其浓度与发光强度呈线形关系。 D’Eustachio和Levin的研究表明，各生长时期的细菌均有较恒定水平的ATP含量，因 此，提取细菌的ATP，利用生物发光法测出ATP的含量后即可推算出样品中的含菌量，整 个过程仅为十几分钟。由于生物发光法无需培养过程，操作简便，灵敏度高，数分钟内可 得到结果，Sharpe等(1970)首先应用该法检测食品中存在的微生物，但高水平的非微 生物细胞ATP降低了灵敏度。尽管如此，许多科研人员依然对该法用来评估食品中的微生 物污染具有浓厚的兴趣，并为此作出了很大的努力。一直到20世纪90年代早期，ATP生 物发光技术才真正应用到食品工业的卫生质量控制(Giffiths，1993，1995；Kyriakides 和Patel，1994)和环境监测。最成功的应用是生产开始前生产线和环境的卫生状况检测， 该法可在2分钟内得到设备表面清洁状况的检测结果，具有其它微生物检测方法无法比拟 的优势。同时，ATP生物发光法还应用到原材料、终产品的微生物检测。Bautista、Joao Niza-Ribeiro等应用ATP生物发光法分别检测禽肉、粗乳中的微生物含量，在数分钟内 得到结果以判断微生物的污染状况，他们认为该法与平板计数法相比快速、可靠、准确。 Russell、Sinell等认为ATP生物发光法是唯一适合HACCP的卫生监测方法，是执行HACCP 的基础，同时也是目前检测微生物最快的方法。国外一些公司根据生物发光的原理研制出 成套的生物发光检测装置和试剂盒用于微生物数量快速测定，该检测系统由生物发光检测 仪和测定试剂盒两大部分组成，其微生物数量的检测限一般为细菌105～6cells/mL，最高 的灵敏度也只达到103cells/mL，微生物含量在103cells/mL以上的样品可在十几分钟内 迅速检测出结果。迄今许多国家已将ATP生物发光法作为食品工业生产和环境卫生监督现 场检测的有效手段，而国内尚处于起步阶段。

与食品工业生产和环境卫生监督一样，食品饮料产品的微生物检测同样是生物发光法 的重要应用对象，但ATP生物发光法在这方面存在严重缺陷，因为该法要求样品中细菌浓 度最低不少于103cells/mL，这种灵敏度经常达不到卫生学的要求。当样品带菌量小于 100cells/mL，甚至小于1cell/mL时，直接使用生物发光法微生物快速检测技术则不能有 效地检出其中的含菌量。同时，样品中存在的微生物为休眠状态的芽孢或孢子时，ATP含 量极低，达不到发光检测的灵敏度。另外，在食品工业等生产过程中，广泛的使用着防腐 剂和消毒剂，样品中微生物受到防腐剂和消毒剂的影响，处于抑制或受伤状态，ATP含量 亦极低，同样达不到发光检测的要求。因此，ATP生物发光法虽然灵敏、快速，但由于上 述不足之处使它的应用受到了很大的限制。

[发明内容]

本发明的目的在于克服目前ATP生物发光法存在的灵敏度不足的问题，解决样品中存 在的一些防腐剂或残留消毒剂的干扰问题，提供一种增加灵敏度、抗干扰的微生物快速检 测方法及试剂，提高检测的灵敏度和缩短检测所需的时间。

本发明中所提供的微生物快速检测技术由两部分组成，一是用抗干扰微生物培养基对 有防腐剂或消毒剂等干扰物质的样品进行液体大样法或最近似数(MPN)法增菌，使受损 伤的微生物复苏或休眠状态的芽孢、孢子萌发；二是用细胞ATP释放剂Ec对样品进行处 理，释放出样品中的微生物细胞ATP，然后进行发光检测。

本发明可大大缩短检测时间，细菌6小时内可完成检测，酵母12小时内完成检测， 霉菌24小时内完成检测，同时大幅度提高检测灵敏度，其中生物发光液体大样法可达到 10cells/100mL，生物发光最近似数(MPN)法可达到30cells/100mL，比生物发光法的检 测灵敏度最少提高1000倍。

本发明的微生物数量快速检测方法的具体操作方法：

1)抗干扰细菌和真菌液体大样法及MPN法快速测定

(1)抗干扰细菌和真菌液体大样法快速测定

本方法适于含有防腐剂、消毒剂等干扰物质的样品的无菌度检测，按照样品含干扰物 质的类别和检测项目的不同，分别选择抗防腐剂型、抗消毒剂型及抗臭氧型细菌或真菌液 体培养基：

a.培养基的配制：参照抗干扰细菌和真菌液体培养基说明配制50mL/瓶三料液体培 养基，分装到250mL三角瓶中，并准备其它配套用品，灭菌备用；

b.微生物的培养：在超净工作台中，将已混合并分散好的100mL(g)样品加入到装 有冷却后的50mL/瓶三料培养基的250mL三角瓶中，摇匀混合后细菌在35-37℃下培养 3～6h，真菌在30-32℃下培养10～24h；

c.微生物细胞ATP提取方法：分别取10mL培养液，于10000r/min离心5分钟，去 上清液，沉淀加入1mL微生物细胞ATP释放剂Ec，作用1～5min；

d.ATP生物发光测定方法：吸取0.1mL样品ATP提取液于发光管中，加入适量解抑 剂和25mmol/L Tricine缓冲液，使体积为0.9mL，再加入0.1mL荧光素酶-荧光素试剂， 立刻摇匀，置于25℃生物发光检测仪中进行发光脉冲计数；

e.作标准ATP检测和培养基与样品混合不作培养的对照样液检测；

f.结果判定：当样品发光脉冲计数CPM样＞对照样液CPMCK，即为样品带菌阳性。

(2)抗干扰细菌和真菌MPN法快速测定

要确定含有防腐剂、消毒剂等干扰物质的低菌数样品的微生物数量，可采用最近似数 法(MPN法)对样品进行检测。按照样品含干扰物质的类别和检测项目的不同，分别选择抗 防腐剂型、抗消毒剂型及抗臭氧型细菌或真菌液体培养基：

a.培养基的配制：按国标大肠菌群数量多管发酵法配制抗干扰细菌和真菌液体培养 基(无需在试管中加入小倒管)，并准备其它配套用品，灭菌备用；

b.微生物的培养：在超净工作台中，将已混合并分散好的样品按国标大肠菌群数量 多管发酵法加入到测定系统中，摇匀混合后细菌在35-37℃下培养3～6h，真菌在30-32 ℃下培养10～24h；

c.微生物细胞ATP提取方法：各管培养液，于10000r/min离心5分钟，去上清液， 沉淀加入1mL微生物细胞ATP释放剂Ec，作用1～5min；

d.ATP生物发光测定方法：吸取0.1mL样品ATP提取液于发光管中，加入适量解抑 剂和25mmol/L Tricine缓冲液，使体积为0.9mL，再加入0.1mL荧光素酶-荧光素试剂， 立刻摇匀，置于25℃生物发光检测仪中进行发光脉冲计数；

e.作标准ATP检测和培养基与样品混合不作培养的对照样液检测；

f.结果表示：当样品发光脉冲计数CPM样＞对照样液CPMCK，即为样品带菌阳性，记录 样品阳性管数，查MPN表，即得结果。

2)普通细菌和真菌液体大样法及MPN法快速测定

(1)普通细菌和真菌液体大样法快速测定

本方法适于不含防腐剂、消毒剂等干扰物质的样品的无菌度检测。

A.培养基的配制：参照普通细菌和真菌液体培养基说明配制50mL/瓶三料液体培养 基，分装到250mL三角瓶中，并准备其它配套用品，然后灭菌；

B.微生物的培养：在100级超净工作台中，将已混合并分散好的100mL(g)样品加入 到装有冷却后的50mL/瓶三料培养基的250mL三角瓶中，摇匀混合后细菌在35-37℃下 培养3～6h，真菌在30-32℃下培养10～24h；

C.微生物细胞ATP提取方法：分别取10mL培养液，于10000r/min离心5分钟，去 上清液，沉淀加入1mL微生物细胞ATP释放剂Ec，作用1～5min；

D.ATP生物发光测定方法：吸取0.1mL样品ATP提取液于发光管中，加入适量解抑 剂和25mmol/L Tricine缓冲液，使体积为0.9mL，再加入0.1mL荧光素酶-荧光素试剂， 立刻摇匀，置于25℃生物发光检测仪中进行发光脉冲计数；

同时作标准ATP检测和培养基与样品混合不作培养的对照样液检测；

E.结果判定：当样品发光脉冲计数CPM样＞对照样液CPMCK，即为样品带菌阳性。

(2)最近似数法(MPN法)快速测定

要确定低菌数样品的微生物数量，可采用最近似数法(MPN法)，对样品进行检测。

A.培养基的配制：按国标大肠菌群数量多管发酵法配制普通细菌和真菌液体培养基 (无需在试管中加入小倒管)，并准备其它配套用品，然后灭菌；

B.微生物的培养：在超净工作台中，将已混合并分散好的样品按国标大肠菌群数量 多管发酵法加入到测定系统中，摇匀混合后细菌在35-37℃下培养3～6h，真菌在30-32 ℃下培养10～24h；

C.微生物细胞ATP提取方法：各管培养液，于10000r/min离心5分钟，去上清液， 沉淀加入1mL微生物细胞ATP释放剂Ec，作用1～5min；

D.ATP生物发光测定方法：吸取0.1mL样品ATP提取液于发光管中，加入适量解抑 剂和25mmol/L Tricine缓冲液，使体积为0.9mL，再加入0.1mL荧光素酶-荧光素试剂， 立刻摇匀，置于25℃生物发光检测仪中进行发光脉冲计数；

同时作标准ATP检测和培养基与样品混合不作培养的对照样液检测；

E.结果表示：当样品发光脉冲计数CPM样＞对照样液CPMCK，即为样品带菌阳性；记录 样品阳性管数，查MPN表，即得结果。

本发明中，对样品通过抗干扰细菌、真菌液体培养基或普通细菌、真菌液体培养基进 行预培养，增加生物发光检测灵敏度。

本发明所提及的用于增菌的液体培养基为具有抵抗防腐剂、消毒剂、臭氧干扰性能的 细菌及真菌液体培养基、普通细菌或真菌培养用的营养肉汤培养基及霉菌培养基等八种培 养基，均由广东省微生物研究所属下广东环凯微生物科技有限公司生产，在该公司均可购 得，其使用浓度见下表1：

表1  各种用于增菌的液体培养基及使用浓度           使用的培养基     浓度     (g/L)     营养肉汤培养基    22-24     抗防腐剂型细菌液体大样检测培养基    22-28     抗消毒剂型细菌液体大样检测培养基    20-24     抗臭氧型细菌液体大样检测培养基    19-23     霉菌液体培养基    14-18     抗防腐剂型真菌液体大样检测培养基    21-25     抗消毒剂型真菌液体大样检测培养基    17-21     抗臭氧型真菌液体大样检测培养基    16-20

抗防腐剂型、抗消毒剂型及抗臭氧型液体大样检测培养基可分别消除防腐剂山梨酸及 山梨酸钾、苯甲酸及苯甲酸钠，消毒剂二氧化氯、过氧乙酸、次氯酸钠及过氧化氢和臭氧 及余氯的干扰(表2)，在检测含有干扰物质的样品时，与普通液体培养基相比，可大大 提高检测的灵敏度。

表2  抗干扰微生物液体培养基可以消除的干扰物质及其浓度     培养基名称   可以消除的干扰物质 可以消除的干扰物质的        浓度 抗防腐剂型液体大样检     测培养基   苯甲酸、苯甲酸钠   山梨酸、山梨酸钾     2.0g/L(kg) 抗消毒剂型液体大样检     测培养基   二氧化氯   过氧乙酸   次氯酸钠   过氧化氢     150mg/L     400mg/L     700mg/L     180mg/L 抗臭氧剂型液体大样检     测培养基   臭氧   余氯     10.0mg/L

本发明所提及的微生物细胞ATP释放剂Ec含有：

1～30g/L TritonX-100

0.1～5.0g/L十六烷三甲基溴化铵(CTAB)

0.1～3.0g/L二甲亚砜(DMSO)

0.01～0.1g/L乙二胺四乙酸(EDTA)

0.01～0.1g/L硫酸镁(MgSO4)

制作过程为：每升无菌超纯水中加入1～30g TritonX-100、0.1～5.0g CTAB、0.1～ 3.0g DMSO、0.01～0.1g EDTA、0.01～0.1g MgSO4，加热使其溶解，振匀即成，所有试剂 采用分析纯，可在室温条件下1～5min内完成微生物细胞ATP的提取，简便、快速。

本发明所提及的样品处理解抑剂为内含葡萄糖单元分别为6、7、8的环糊精等环状化 合物，具体制作过程为：取0.1～15.0g分析纯环糊精溶解于pH 7.8 Tricine缓冲液(内 含50mmol/L Tricine、10mmol/L MgSO4、1mmol/L EDTA、1mmol/L DTT)中，使终体积为 1000mL，0.22μm滤膜过滤除菌后分装至5个灭菌的小瓶，于4℃冰箱储存备用。该解抑 剂可以排除阳离子、阴离子和两性离子表面活性剂等物质对分析的干扰。

[具体实施方式]

实施例1：瓶装饮用天然矿泉水中细菌液体大样快速测定

因瓶装饮用天然矿泉水通常用臭氧进行消毒处理，因此选用抗臭氧型细菌液体大样检 测培养基：

a.培养基的配制：参照抗臭氧型细菌液体大样检测培养基说明配制50mL/瓶三料液体 培养基，分装到250mL三角瓶中，并准备其它配套用品，然后灭菌；

b.微生物的培养：在100级超净工作台中，将100mL待检样品加入到装有冷却后的 50mL/瓶三料培养基的250mL三角瓶中，摇匀混合后在35-37℃下培养6h；

c.微生物细胞ATP提取方法：取10mL培养液，于10000r/min离心5分钟，去上清 液，沉淀加入1mL微生物细胞ATP释放剂Ec，作用1～5min；

d.ATP生物发光测定方法：吸取0.1mL样品ATP提取液于发光管中，加入适量解抑 剂和25mmol/L Tricine缓冲液，使体积为0.9mL，再加入0.1mL荧光素酶-荧光素试剂， 立刻摇匀，置于25℃生物发光检测仪中进行发光脉冲计数；

e.作标准ATP检测和培养基与样品混合不作培养的对照样液检测；

f.发光脉冲计数结果：样品发光脉冲计数CPM样＝13450

对照样液CPMCK＝1103

结果判定：样品发光脉冲计数CPM样＞对照样液CPMCK，即为样品带菌阳性。

实例2：果汁饮料的酵母菌和霉菌的MPN法快速测定

果汁饮料通常添加有防腐剂以延长保质期，但刚生产出来的产品其含菌量是很低的， 因此要确定含有防腐剂的低菌数样品的微生物数量，可采用最近似数法(MPN法)，对样品 进行检测：

a.培养基的配制：按国标大肠菌群数量多管发酵法(9管法)配制抗防腐剂型真菌液 体大样检测培养基(无需在试管中加入小倒管)，每管10mL，并准备其它配套用品，然后 灭菌；

b.微生物的培养：在100级超净工作台中，将已混合并分散好的样品按国标大肠菌 群数量多管发酵法加入到测定系统中，摇匀混合后在30-32℃下培养12h；

c.微生物细胞ATP提取方法：各管培养液，于10000r/min离心5分钟，去上清液， 沉淀加入1mL微生物细胞ATP释放剂Ec，作用1～5min；

d.ATP生物发光测定方法：吸取0.1mL样品ATP提取液于发光管中，加入适量解抑 剂和25mmol/L Tricine缓冲液，使体积为0.9mL，再加入0.1mL荧光素酶-荧光素试剂， 立刻摇匀，置于25℃生物发光检测仪中进行发光脉冲计数；

e.作标准ATP检测和培养基与样品混合不作培养的对照样液检测；

f.结果表示：样品发光脉冲计数CPM样＞对照样液CPMCK，即为样品带菌阳性；记录样 品阳性管数，查MPN表，即得结果，样品含菌量为460MPN/100mL。

表3发光检测结果   样品量  发光脉冲计数(CPM)   阳性管数  MPN/100mL     10mL     33180     10mL     43129     3     10mL     29037     1mL     8159     1mL     9804     3     460     1mL     9311     0.1mL     7576     0.1mL     1004     1     0.1mL     998     对照样液     1011