检测休眠隐生微生物的存在的方法
专利汇可以提供检测休眠隐生微生物的存在的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及休眠隐生 微 生物 的检测方法，该方法通过当用610nm－680nm区内的电磁 能量 激发时检测发射自710nm－860nm区内的内在 碱 土金属吡啶二 羧酸 盐的电磁射线来进行。使用低能量发射的新内在吡啶二羧酸 钙 盐能够快速检测细菌孢子、 真菌 孢子和 卵囊 而不需要加入任何 试剂 、样品处理或 接触 样品。，下面是检测休眠隐生微生物的存在的方法专利的具体信息内容。
检测休眠隐生微生物的存在的方法
本申请要求2002年1月22日提交的授权的美国专利申请10/054,419的优先权，将该文献的全部内容引入本文作为参考。
发明领域本发明涉及表面上、空气中和液体中孢子的存在的检测方法和设备。
发明背景本领域技术人员已经将通过检测存在的吡啶-2，6-二羧酸(吡啶二羧酸)确定细菌内生孢子存在的方法使用了一定时间。该化合物含有存活孢子的有效部分，否则在自然界非常罕有(R.Lundin和L.Sacks，“细菌孢子的高分辨率固态13C核磁共振：吡啶二羧酸的α-碳信号的鉴定”-Appl.Environ.Microbiol.，vol.54，no.4，pp.923-928，1988)。将各种分析方法用于检测吡啶二羧酸以便显示存在孢子，包括：导数光谱(A.Warth，“用导数光谱法测定细菌孢子中的吡啶二羧酸”-Anal.Biochem.，vol.130，no.，pp.502-505，1983)；内在荧光(A.Alimova，A.Katz，H.E.Savage，M.Shah，G.Minko，D.V.Will，R.B.Rosen，S.A.McCormick和R.R.Alfano，“发生饥饿情况的枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的天然荧光和激发光谱改变”-Appl.Opt.，vol.42，no.19，pp.4080-4087，2003)；添加镧系元素盐后的发光(D.L.Rosen，C.Sharpless和L.B.McGown，“通过使用吡啶二羧酸 光致敏发光进行细菌孢子检测和测定”-Anal.Chem.，vol.69，pp.1082-1085，1997)；质谱法(M.B.Beverly，K.J.Voorhees和T.L.Hadfield，“芽孢杆菌属孢子的直接质谱分析”-Rapid Commun.Mass Spectrom.，vol.13，no.23，pp.2320-2326，1999)；傅里叶变换红外光谱(H.Y.Cheung，J.Cui和S.Sun，“萌发过程中通过减弱的总反射傅里叶红外光谱实时监测枯草芽孢杆菌内生孢子成分”-Microbiology，vol.145，pp.1043-1048，1999)；拉曼光谱(美国专利US 6,040,191)和H.Shibata，S.Yamashita，M.Ohe和I.Tani，“冻干细菌孢子的激光拉曼光谱”-Microbiol.Immunol.，vol.30，no.4，pp.307-313，1986)；和与气相色谱法连接的的等离子体色谱法(美国专利US 6,672,133B1)。
美国专利中已经经由检测吡啶二羧酸钙和/或吡啶二羧酸，通过存在的吡啶二羧酸钙检测内生孢子的方法。美国专利US 6,498,041B1中描述了基于芽孢外被成分的分子识别来俘获孢子、随后通过添加由可见光谱中的光激发的荧光钙结合染料检测Ca2+的方法。美国专利US6,599,715和美国专利申请10,355,462中教导了当用紫外光激发时通过来自吡啶二羧酸 的发光检测吡啶二羧酸的方法。
此外，已经报道了其它隐生微生物存在吡啶二羧酸(或具有极其相关的化学结构的其它吡啶二羧酸类似物)。(隐生描述的是能够实现休眠状态的微生物)。特别将吡啶二羧酸用于检测：梭状芽孢杆菌属孢子(M.W.Tabor，J.MacGee和J.W.Holland，“通过气相色谱法对梭状芽孢杆菌属种类的孢子中的吡啶二羧酸的快速测定”-Appl.Environ.Microbiol.，vol.31，no.1，pp.25-28，1976)；芽孢八叠球菌属(Sporosarchina)孢子(C.A.Loshon和P.Setlow，“芽孢八叠球菌属种类休眠孢子中的小分子水平与芽孢杆菌属和梭状芽孢杆菌属种类的孢子水平比较”-Can.J.Microbiol.，vol.39，no.，pp.259-262，1993)；八叠球菌属孢子(R.S.Thompson和E.R.Leadbetter，“对来自尿素八叠球菌的内生孢子的吡啶二羧酸的分离”-Arch.Mikrobi1.，vol.45，pp.27-32，1963)；和Metabacterium孢子(S.Stunkel，J.Alves和I.Kunstyr，“来自啮齿动物肠的两种‘锥柱杆菌属’的特征。多孢锥柱杆菌中吡啶二羧酸的异主寄生培养和验证”-Folia Microbiol.(Praha)，vol.38，no.3，pp.171-175，1993)。在这些和其它隐生(形成孢子)微生物中发现了吡啶二羧酸化合物。
2002年1月22日提交的美国专利申请10/054,419(且引入本文作为参考)中公开了用于检测非生命表面和样品上的微生物的方法和设备，其中使样品接触能够激发来自各种代谢物、辅因子以及细胞和孢子成分的荧光的许多特定能量的电磁射线。因此，其中含有的待取样的微生物细胞和孢子(且更具体的说是激发的代谢物、辅因子和其它细胞、病毒和/或孢子成分)发射可以测定的荧光。用能够(1)除去任何背景和/或反射和散射激发信号和(2)将代谢物、辅因子和孢子成分的相对荧光信号与已知的生理范围值比较的方法分析采集的荧光信号(涉及发射自细胞/病毒/孢子成分的信号)。美国专利申请10/054,419中特别教导了通过分别使用270nm-290nm和310nm-330nm范围紫外电磁射线(光)激发吡啶二羧酸钙(单独或同时)检测孢子并分别检测460nm-480nm和400nm-430nm内的荧光能量的方法。上述申请中还教导了使用610nm-670nm范围的电磁射线(光)激发与检测730nm-800nm区内的光能结合检测孢子的方法。在来自含水的细菌孢子样品的发射光谱中和如上述申请附图3F中说明的非存活的苏云金芽孢杆菌细胞样品中观察到了这种新发射。使用这些新的低能激发和对检测孢子而言的发射范围是有益的，因为：(1)几乎不存在来自其它微生物荧光团的干扰和/或重叠；(2)来自生物衍生的有机表面的背景干扰得到显著减少；和(3)预计可有更大的激发穿透样品深度。本说明书证实有益的低能激发和发射信号来源于吡啶二羧酸钙且教导了使用这些激发光源检测孢子的有益性。
正如本领域技术人员所公知的，荧光是发光的一种形式。[将荧光和磷光定为光致发光光谱测定法的类型(J.D.Ingle，Jr.和S.R.Crouch，Spectrochemical Analysis，pp.438，1988，Prentice-Hall，Inc.)]。荧光与磷光之间的主要差异在于发射存在期(I.Tinoco，Jr.，K.Sauer和J.C.Wang，Physical Chemistry：Principles andApplications in Biological Sciences，pp.577，1995，Prentice-Hall)。(荧光指的是以微秒计和较短范围的发射存在期；磷光指的是一般以微秒计的或较长范围的发射存在期。)因此，由于没有发射存在期数据，所以使用传统发射光谱在实验上无法区别荧光和磷光。在这种情况中，来自内发色团(吸收激发能量并发射低能射线的化学成分)的‘表观荧光’可能来源于磷光或荧光之一。对来自微生物成分的表观荧光的检测提供了检测休眠隐生微生物的能力，但：(1)不与样品进行物理性接触；(2)极快；和(3)不使用任何添加的试剂。
正如易于理解的，能够测定医院、食品区、供水、建筑内和战场上存在的休眠(隐生和/或形成孢子)微生物是极其有用的，因为要根除这些微生物需要花费最大努力。作为本发明的方法和设备应以低廉和快速的方式操作，例如用于食品生产设施。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于检测食品上的隐生微生物污染的方法和设备，其中当由610nm-680nm区内的电磁射线激发时，在730nm-860nm区内检测来源于吡啶二羧酸钙化合物的发射信号，从而使食品上的休眠微生物污染在不接触所述食品的情况下得到定量测定。
本发明的另一个目的是提供可以用于检测非生命表面上、液体和空气中的隐生微生物污染的方法和设备。作为本发明的具体目的，该方法和设备可以用于以低廉而快速的方式发现例如保健设施、研究实验室、水处理和工作站、建筑物以及战场上的隐生微生物和微生物污染。
本发明的另一个目的是提供用于检测非生命表面上和液体和空气样品中的微生物污染的方法和设备，其中由610nm-680nm区内的电磁射线激发吡啶二羧酸钙化合物的发射并在730nm-860nm区内检测，由此在不接触所述样品的情况下测定样品中的微生物污染。
按照本发明的这种形式，通常需要使用发射630nm左右的电磁射线的光源。按照本发明的这种形式，由该光源发射的光特别或经过滤通过对特别激发吡啶二羧酸钙的能量的电磁射线。
按照本发明的另一个实施方案，能够且有时需要使580nm左右的电磁射线定向于样品。580nm的光激发微生物中的黄素和血红素化合物，其发射中的某些被样品自我吸收，从而依次激发具有610nm-680nm范围内发射的吡啶二羧酸钙。如上所述采集并分析样品的表观荧光发射。
按照本发明的另一个实施方案，能够且有时需要使能够激发吡啶二羧酸钙的能量和还可以不与孢子发生相互作用的能量的电磁射线定向。因此，按照本发明的该实施方案，可以测定来源于样品的所得荧光信号(来自微生物成分和那些单纯反射和/或散射自样品的成分)且可以通过比较来自微生物的发射信号与那些反射/散射自样品的那些信号的比例确定微生物的存在。
为了实施本发明，将传感器不仅用于检测由内在荧光团产生的荧光、而且用于检测背景、反射和/或散射的电磁射线。该部件用于校准信号并补偿还可能因使用探测器与扫描样品之间的可变距离和不同样品或表面之间的变化产生的信号改变。
还发现通过快速改变以不同于60赫兹的频率定向于样品的电磁射线，基本上可以将环境光(且特别是荧光)的作用减小到最低限度。调节激发能量还使传感器发生运转以使电磁射线定向于样品的不同部分，但基本上不会对微生物含量测定的精确度产生影响。
本文所述的微生物检测方法和设备能够测定隐生微生物的存在和生理状态，同时不需要试剂、不接触样品、以低廉方式进行并提供‘实时’结果。本发明的这些和其它目的、特征和优点在对下面所公开实施方案的详细描述和待批权利要求进行综述时将变得显而易见。
附图简述附图1是可以用于实施本发明最基本特征的仪器的方框图。
附图2表示吡啶二羧酸(吡啶-2，6-二羧酸，A)和白屈氨酸(4-羟基吡啶-2，6-二羧酸，B)的化学结构。
附图3表示当在630nm处激发时20mM吡啶二羧酸钙溶液(—)发射光谱和在670nm处激发时白屈氨酸钙(-----)的发射光谱。
附图4表示当用630nm射线激发时吡啶二羧酸钙固体和溶液的发射光谱。实线表示固体盐的发射光谱，而虚线表示饱和溶液的发射光谱。
附图5表示当在315nm(—)和630nm(—)处激发时吡啶二羧酸钙水溶液的发射光谱。
附图6表示纯吡啶二羧酸钙水溶液(—)、提取自苏云金芽孢杆菌孢子的吡啶二羧酸钙水溶液(—)、提取自啤酒糖酵母孢子的吡啶二羧酸钙水溶液(------)和提取自已经加入Tb3+的Cryptosporidium parvum卵囊的吡啶二羧酸钙水溶液(-●●-●●-)的发射光谱(270nm激发)。
附图7表示纯吡啶二羧酸钙水溶液(—)、提取自苏云金芽孢杆菌孢子的吡啶二羧酸钙水溶液(—)和提取自啤酒糖酵母孢子的吡啶二羧酸钙水溶液(------)的导数光密度光谱。
附图8表示炭疽芽孢杆菌(—)、巨大芽孢杆菌(—)、枯草芽孢杆菌(------)和苏云金芽孢杆菌(-●-●-)的细菌孢子溶液的发射光谱(630nm激发)。
附图9表示细菌(—)和酵母(------)孢子溶液的发射光谱(630nm激发)。
具体实施方式
本发明的各种实施方案、包括不同结构和可应用的不同部件是可行的。用于该微生物检测方法的基本部件允许：(1)在610nm-680nm区内激发吡啶二羧酸钙盐；(2)采集和检测710nm-860nm区内发射的电磁射线、背景(环境)光、反射激发光和散射的光能；和(3)用能够校正背景干扰的方法分析检测的信号。在使用该方法的任何设备中所用的结构和部件应与应用的要求和预计的干扰相匹配。
能够且有时需要应用可提供宽带照明的光源。所用光源的种类受其产生激发有意义内在微生物成分所需波长的电磁射线的能力的影响。另外，有时需要应用脉冲光源以便测定关闭回路过程中的环境背景。可以使用的光源包括带有各种电灯泡的灯(例如汞、钨、氘、氙灯)、光发射二极管(LEDs)和对所需激发能量而言特定的二极管激光器。所用的光源类型取决于所需激发射线的强度和所需的检测极限。
在本发明各种实施方案中所用的激发和发射滤波器包括干扰滤波器、浸渍玻璃、截止滤波器系列、凝胶滤波器、单色仪、光栅、折射(rugate)滤波器等。所用的发射滤波器的光截止特性取决于分析方法可接受多少散射和反射的激发射线信号或所需的检测极限。如果使用仅具有有意义能量的光源，则可以不必使用激发滤波器；如果校准光源(诸如激光)，则可以不必使用聚焦光学部件。(聚焦光学部件的目的是使激发射线定向于取样的面积或体积)。重要的是应注意如果使用多光子激发，则能够使用具有能量低于有意义发色团激发能量的光源。
采集光学部件的目的在于将发射自激发微生物发色团的光以及散射和反射自样品的光输送至检测器。如果将干扰滤波器用于区分这些发射能量，那么需要校准采集的光以便使这些滤波器以最佳状态工作。纤维光缆也可以用于将激发射线输送至样品并采集发射的射线且使其定向于检测器。当许多光学成分在紫外线和可见光范围内显示出荧光时，能够且有时需要应用抛光的反光金属、蓝宝石、熔凝硅石、石英、MgF2和/或CaF2光学成分。
检测器用于将发射的电磁射线转化成可以测定的电信号。大量具有不同灵敏度的检测器可以用于本发明的实施方案：光电倍增管(PMTs)、雪崩光二极管(APDs)、针型二极管、CCDs等。所选择的检测器取决于所检测的射线的能量、发射信号的强度和设备所需的检测极限。用能够除去产生的任何背景发射、反射激发光和/或散射激发信号的方法分析采集的已经转化成放大的电信号的发射能量。
附图2表示吡啶二羧酸(吡啶-2，6-二羧酸，A)和白屈氨酸(4-羟基吡啶-2，6-二羧酸，B)的化学结构。附图3表示吡啶二羧酸钙溶液的发射光谱(630nm处激发)和白屈氨酸钙的发射光谱(670nm处激发)。当使用610nm-680nm区内的电磁能量激发时，710nm-860nm区内的能量发射是碱土金属吡啶二羧酸盐的特性，从而证明可以应用来自吡啶二羧酸钙(或因可选生物合成途径或随后的吡啶二羧酸盐的天赋反应产生的具有极其相近化学结构的其它内在吡啶二羧酸类似物)检测休眠隐生微生物。
附图4表示当使用630nm射线激发时吡啶二羧酸钙固体样品和溶液的发射光谱。实线表示固体盐的发射光谱，而虚线表示饱和溶液的发射光谱。吡啶二羧酸钙固体和水溶液的光谱表示在780nm左右的发射，不过，与溶液相比固体样品的光谱下降。(固体吡啶二羧酸钙光谱的发射可以因浓度而终止)。附图5表示当在315nm(—)和630nm(—)处激发时吡啶二羧酸钙水溶液的发射光谱，说明与已知吡啶二羧酸钙荧光发射相比新的低能发射信号的相对信号强度(R.Nudelman，N.Feay，M.Hirsch，S.Efrima和B.Bronk，“作为观察到的细菌孢子UV发射光谱的可能成分的吡啶二羧酸荧光”-SPIE vol.3533，pp.190-195，1998)。
附图6表示纯吡啶二羧酸钙溶液(—)、提取自苏云金芽孢杆菌孢子的水溶液(—)、提取自啤酒糖酵母孢子的水溶液(------)和提取自已经加入Tb3+的Cryptosporidium parvum卵囊的水溶液的发射光谱(270nm激发)(按照Anal.Chem.，vol 69，pp.1082-1085，1997中所述的方法)。附图7表示纯吡啶二羧酸钙溶液(—)的导数光密度光谱；该附图还表示提取自苏云金芽孢杆菌孢子(—)和已经加入Ca2+的啤酒糖酵母孢子的水溶液(------)(按照Anal.Chem.，vol 130，no.2，pp.502-505，1983中所述的方法)。这些附图清楚地表明在各种休眠隐生微生物中存在周期表II族(碱土金属，包括Mg2+、Ca2+等)吡啶二羧酸化合物：酵母孢子、细菌孢子和草履虫卵囊。附图8表示炭疽芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的细菌孢子溶液的发射光谱(630nm激发)。710nm-860nm之间存在吡啶二羧酸钙发射表明在许多细菌孢子中普遍存在吡啶二羧酸钙。附图9表示细菌(芽孢杆菌属的种类)和酵母(糖酵母属的种类)孢子溶液的发射光谱(630nm激发)，说明可以使用710nm-860nm的发射检测真菌和细菌孢子。
使用新的内在碱土金属吡啶二羧酸盐低能发射能够快速检测休眠隐生微生物，但不需要加入任何的试剂、取样处理或接触样品。上述本发明的实施方案仅作为典型使用，本领域技术人员可以使用上述基本构思进行其它组合、变化和修改而不会脱离本发明的实质。检测休眠隐生微生物的该方法范围包括当使用610nm-680nm区内的电磁能量激发时，使用来自内在710-860nm区内的碱土金属吡啶二羧酸盐的发射光。重要的实施方案包括激发这种内在发色团且随后使用同时计算背景信号、散射激发信号和反射激发信号的方法分析检测的发射。所有变化、修改和组合均属于如待批权利要求所定义的本发明范围。
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