微生物混合发酵制备木糖醇的方法
专利汇可以提供微生物混合发酵制备木糖醇的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 微 生物 混合 发酵 制备木糖醇，具体的讲，涉及以 葡萄糖 为原料，先分别培养一株酿酒 酵母 FX-6201CGMCC 0283.1，和一株弱 氧 化醋杆菌MF-21CGMCC 0283.2，然后混合发酵，用 乙醇 抽提发酵液，提取固体物质得木糖醇结晶，再通过过滤，干燥，获得木糖醇晶体的一种制备方法。，下面是微生物混合发酵制备木糖醇的方法专利的具体信息内容。
1.一种用微生物混合发酵制备木糖醇的方法，其特征在于，以葡萄 糖为原料，先分别在含葡萄糖的营养培养基中培养酿酒酵母FX-6201 CGMCC 0283.1和在含碳酸钙的培养基中培养弱氧化醋杆菌MF-21CGMCC 0283.2；将上述两菌培养液混合后继续发酵；发酵达到终点，用乙醇抽提发 酵液，提取固体物质得木糖醇结晶，再通过过滤，干燥，获得木糖醇晶体 的方法。
2.如权利要求1所述的制备木糖醇方法，其特征在于，所用的葡萄 糖为淀粉酸水解制备得到的或酶法制备得到的。
3.如权利要求1所述的方法，其所用的培养基中葡萄糖的含量是以 其重量与水体积百分比在10％-70％范围内。
4.如权利要求3所述的方法，其所用的培养基中葡萄糖的含量是以 其重量与水体积百分比在20％-50％的范围内。
5.如权利要求1所述的方法，其所用的含葡萄糖的培养基的pH范围 为4-8。
6.如权利要求5所述的方法，其所用的含葡萄糖的培养基pH为5。
7.如权利要求1所述的方法，其酵母菌FX-6201CGMCC 0283.1在含 葡萄糖培养基中的培养温度范围为24-32℃。
8.如权利要求7所述的方法，其酵母菌FX-6201CGMCC 0283.1在含 葡萄糖培养基中的培养温度为30℃。
9.如权利要求1所述的方法，其酵母菌FX-6201CGMCC 0283.1在含 葡萄糖培养基中的培养时间为3-5天。
10.如权利要求9所述的方法，其酵母菌FX-6201CGMCC 0283.1在含 葡萄糖培养基中的培养时间为4天。
11.如权利要求1所述的方法，其细菌MF-21CGMCC 0283.2所用的含 碳酸钙的培养基，其碳酸钙的重量与水体积百分比为0.1％-5％。
12.如权利要求11所述的方法，其含碳酸钙的重量与水体积百分比 为1％-2.5％。
13.如权利要求1所述的方法，其所用的含碳酸钙的培养基pH为5 -9。
14.如权利要求13所述的方法，其所用的含碳酸钙的培养基pH为7。
15.如权利要求1所述的方法，其细菌MF-21CGMCC 0283.2在含碳酸 钙的培养基中的培养温度为24-37℃。
16.如权利要求15所述的方法，其细菌MF-21CGMCC 0283.2在含碳 酸钙的培养基中的培养温度为30℃。
17.如权利要求1所述的方法，其细菌MF-21CGMCC 0283.2在含碳酸 钙的培养基中培养时间为6-36小时。
18.如权利要求17所述的方法，其细菌MF-21CGMCC 0283.2在含碳 酸钙的培养基中的培养时间为10-24小时。
19.如权利要求1所述的方法，其混合发酵的温度为24-37℃。
20.如权利要求19所述的方法，其混合发酵的温度为30℃。
21.如权利要求1所述的方法，其混合发酵的时间为16-120小时。
22.如权利要求21所述的方法，其混合发酵的时间为40-80小时。
技术领域
本发明属于微生物发酵，具体的讲，涉及一株酿酒酵母FX-6201CGMCC 0283.1，和一株弱氧化醋杆菌MF-21CGMCC 0283.2混合发酵制备木糖醇的 方法。
背景技术
由于木糖醇在植物中天然存在的含量太低，直接提取很不经济。目前 工业上主要用木糖催化加氢的方法制备(Wisnik，J.et al.：Ind.Eng. Chem.Prod.Res.Dev.，3：232-236，1974)，但是这种方法工艺复 杂，成本很高，生物法加氢近年也取得不少进展(Leathers，T.D.：FEMS Yeast Research，3：133-140，2003；江宁等：ZL01110778.2，2004)，但 用木糖为原料毕竟比葡萄糖价格高。利用微生物直接发酵葡萄糖制备木糖 醇是经济上很理想的方法，但是迄今在自然界还没有发现能直接发酵葡萄 糖得到木糖醇的微生物。Hiroshi，O.等人曾用三种微生物分步发酵从葡 萄糖制备了木糖醇(Appl.Microbiol.，18：1031-1035，1969)，证明 了微生物发酵从葡萄糖制木糖醇的可能性，但是三菌分步发酵过程十分复 杂，没有实用价值。近年，Harkki，A.M.等人用重组DNA的方法构建了 工程菌，能直接发酵葡萄糖得到木糖醇，并申请了国际专利(WO 94/ 10325，1994)，但转化率只有3-4％，距离应用仍很遥远。
发明内容
我们通过微生物利用葡萄糖发酵，优化选育了一株酵母菌 (Saccharomyces sp.)FX-6021和一株细菌(Acetobacter suboxydans) MF-21，它们已于1996年12月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心(CGMCC，中国，北京，中关村；邮政编码：100080)进行了 保藏，保藏号分别为CGMCC 0283.1和CGMCC 0283.2。将两个菌株分别培 养后进行混合发酵，可以直接从葡萄糖得到木糖醇。将酵母菌酿酒酵母 (Saccharomyces sp.)FX-6021 CGMCC 0283.1在含高浓度葡萄糖的营 养培养基中，于24-32℃培养3-5天，酵母培养基的成分是：葡萄糖10 -70％，蛋白胨1％，酵母膏1％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.1％，CaCO3 0.05 ％，pH4-8。然后与在含碳酸钙培养基，即碳酸钙0.1-5％，葡萄糖2％，酵 母膏1％，蛋白胨0.5％，NaCl 0.1％，pH 5-9，中与24-37℃培养了6-36小时的 细菌弱氧化醋杆菌(Acetobacter suboxydans)MF-21 CGMCC 0283.2混合，继续 于24-34℃发酵16-120小时，检测培养基中的葡萄糖全部转化为木糖醇后，将发酵 液离心除去菌体，上清液用活性炭脱色，减压蒸干，用热乙醇抽提后冷却结晶，即得 到木糖醇晶体。本发明所述培养基的“成分％”，都是指其成分的重量对水体积的百 分比。
因而，本发明所提供的一种制备木糖醇的方法，其特征在于，以葡萄 糖为原料，先分别培养酿酒酵母FX-6201CGMCC 0283.1，和弱氧化醋杆菌 MF-21CGMCC 0283.2；将上述培养液混合后，继续混合发酵，发酵达到终 点，用乙醇抽提发酵液，提取固体物质得木糖醇结晶，过滤，干燥，获得木 糖醇晶体的方法。
本发明的方法的主要过程为：
(1)将酵母菌FX-6201CGMCC 0283.1在含葡萄糖的营养培养基中培养；
(2)将细菌MF-21CGMCC 0283.2在含碳酸钙的培养基中培养；
(3)将两种培养物混合后进行发酵，得到木糖醇。
在本发明的方法中，所用的葡萄糖为淀粉酸水解制备得到的或酶法制 备得到的。所用的培养基中葡萄糖的含量是在10％-70％范围内，优选 20％-50％。所用的含葡萄糖的培养基pH为4-8，优选pH为5。酵母菌 FX-6201CGMCC 0283.1在含葡萄糖培养基中的培养温度为24-32℃，优选 30℃。酵母菌FX-6201CGMCC 0283.1在含葡萄糖培养基中的培养时间为3 -5天，优选4天。所用的含碳酸钙的培养基含碳酸钙为0.1％-5％，优 选1-2.5％。所用的含碳酸钙的培养基pH为5-9，优选pH为7。细菌 MF-21CGMCC 0283.2在含碳酸钙的培养基中的培养温度为24-37℃，优选 30℃。细菌MF-21CGMCC 0283.2在含碳酸钙的培养基中培养时间为6-36 小时，优选10-24小时。混合发酵的温度为24-37℃，优选30℃。混合 发酵的时间为16-120小时，优选40-80小时。
本发明与现有技术所不同的是：
1.本发明的制备方法以葡萄糖为主要原料，葡萄糖价格低廉，故用 本发明制备木糖醇的成本比以木糖为原料的化学法要低。
2.本发明用二菌混合一步发酵，整个工艺比三菌分步发酵简单，并 可用普通的发酵设备。
3.本发明所选育的菌种，其利用葡萄糖产木糖醇的转化率比已报道 的重组工程菌高得多。
因此，本发明具有原料便宜、成本低廉、工艺简单、设备通用、转化 率高等特点，适合于工业应用。
具体实施方式
实施例1：
(1)将酿酒酵母菌FX 6021 CGMCC 0283.1接入装有10ml酵母培养 基A的250ml三角瓶中，于30℃、220rpm旋转摇床培养96hr。酵母培养 基A的成分是：葡萄糖(淀粉酸水解制备)30％，蛋白胨1％，酵母膏1 ％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.1％，CaCl2 0.05％，pH 5.0。
(2)将弱氧化醋杆菌MF-21 CGMCC 0283.2接入装有10ml细菌培养 基的250ml三角瓶中，于30℃、250rpm旋转摇床培养24hr。细菌培养基 的成分是：葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨0.5％，NaCl 0.1％，CaCO3 2 ％，pH 6.8。
(3)将(1)、(2)中的发酵液于无菌条件下混合后，继续在摇床上 以30℃、220rpm培养50hr。发酵结束时发酵液中木糖醇浓度为25g/L。
(4)将发酵液离心(Beckman GS-15R，8000rpm，10min，20℃)得 上清液19ml，加入0.38g活性炭，调pH＝5.0，煮沸，冷却到室温后抽滤 得无色清液。将清液于50℃减压蒸干，用无水热乙醇抽提固体物质，冷 却后得木糖醇结晶，过滤，将晶体干燥，得木糖醇晶体0.41g。
实施例2：
(1)将酵母菌FX 6021接入装有10ml酵母培养基(如实施例1(1)) 的250ml三角瓶中，于30℃、220rpm旋转摇床培养96hr。
(2)将细菌MF-21接入装有10ml细菌培养基(如实施例1(2)) 的250ml三角瓶中，于30℃、250rpm旋转摇床培养24hr。
(3)取(2)中发酵液3ml于无菌条件下转入装有20ml细菌培养基
(如实施例1(2))的250ml三角瓶中，于30℃、250rpm旋转摇床培养 8hr。
(4)取(3)中发酵液10ml与发酵液(1)于无菌条件下混合后， 继续在摇床上以30℃、220rpm培养60hr。发酵结束时发酵液中木糖醇浓 度为31g/L。
(5)将发酵液离心得上清液19ml，加入0.38g活性炭，调pH＝5.0， 煮沸，冷却到室温后抽滤得无色清液。将清液于50℃减压蒸干，用无水 热乙醇抽提固体物质，冷却后得木糖醇结晶，过滤，将晶体干燥，得木糖 醇晶体0.47g。
实施例3
(1)将酵母菌FX 6021 CGMCC 0283.1接入装有20ml酵母培养基B 的250ml三角瓶中，于30℃、220rpm旋转摇床培养100hr。酵母培养基B 的成分是：葡萄糖(淀粉酶水解制备)30％，蛋白胨1％，酵母膏1％， 牛肉膏0.5％，NaCl 0.1％，CaCl2 0.05％，pH 5.0。
(2)将细菌MF-21 CGMCC 0283.2接入装有20ml细菌培养基(如实 施例1(2))的250ml三角瓶中，于30℃、250rpm旋转摇床培养20hr。
(3)将(1)、(2)中的发酵液于无菌条件下混合后，继续在摇床上 以30℃、220rpm培养55hr。发酵结束时发酵液中木糖醇浓度为26g/L。
(4)将发酵液离心得上清液38.5ml，加入0.77g活性炭，调pH＝5.0， 煮沸，冷却到室温后抽滤得无色清液。将清液于50℃减压蒸干，用无水 热乙醇抽提固体物质，冷却后得木糖醇结晶，过滤，将晶体干燥，得木糖 醇晶体0.86g。
实施例4：
(1)将酵母菌FX 6021 CGMCC 0283.1接入装有10ml酵母培养基B(如 实施例3(1))的250ml三角瓶中，于30℃、220rpm旋转摇床培养96hr。
(2)将细菌MF-21 CGMCC 0283.2接入装有10ml细菌培养基(如实 施例1(2))的250ml三角瓶中，于30℃、250rpm旋转摇床培养24hr。
(3)取(2)中发酵液2ml于无菌条件下转入装有20ml培养基(如 实施例1(2))的250ml三角瓶中，于30℃、250rpm旋转摇床培养10hr。
(4)取(3)中发酵液10ml与发酵液(1)于无菌条件下混合后， 继续在摇床上以30℃、220rpm培养46hr。发酵结束时发酵液中木糖醇浓 度为25g/L。
(5)将发酵液离心得上清液19ml，加入0.38g活性炭，调pH＝5.0， 煮沸，冷却到室温后抽滤得无色清液。将清液于50℃减压蒸干，用无水 热乙醇抽提固体物质，冷却后得木糖醇结晶，过滤，将晶体干燥，得木糖 醇晶体0.40gg。
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