一种微生物诱捕剂及应用
阅读：716发布：2020-05-14
专利汇可以提供一种微生物诱捕剂及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种 微 生物 诱捕剂及应用。该诱捕剂的活性成分为解 淀粉 芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YN2010‑KC CGMCC No.5722 发酵 液，有效活菌数含量≧3×109cfu/ml。该诱捕剂散发出的特殊气味能引诱实蝇、果蝇和美洲斑潜蝇取食，雌雄同捕，作用周期长，成本低，不含有任何化学有毒药剂，不杀死和不杀伤任何其他非靶标生物，属环境友好型生物诱捕剂。对柑橘小实蝇的诱捕：比对照增加18.81～23.71％，比对照诱到的雌虫增加37.78％～30倍。对柑橘大实蝇的诱捕：比对照增加64.43％，诱捕雌虫数增加33.25倍。对美洲斑潜蝇的诱捕：雌虫率占55～60％。，下面是一种微生物诱捕剂及应用专利的具体信息内容。
1.一种微生物诱捕剂在防治实蝇类害虫的应用，所述的微生物诱捕剂的活性成分为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YN2010-KC CGMCC No.5722的发酵液。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的应用是将所述微生物诱捕剂装入塑料瓶内，每瓶的装入量为50～100mL，旋紧瓶盖，在距离瓶内液面1～3cm的瓶壁上均布4个孔，所述各孔的孔径为4～6mm；将塑料瓶悬挂于离地面0.5～1.5米处，每亩悬挂塑料瓶8～
10个，相邻的塑料瓶间隔5～7m；每隔20～30天向塑料瓶内添加一次所述微生物诱捕剂25～
50mL。
3.一种微生物诱捕剂在防治美洲斑潜蝇的应用，所述的微生物诱捕剂的活性成分为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YN2010-KC CGMCC No.5722的发酵液。
一种微生物诱捕剂及应用
技术领域
背景技术
[0002] 双翅目(Diptera)是节肢动物门(Arthropoda)、有颚亚门(Mandibulata)、昆虫纲(Insecta)、有翅亚纲(Pterygota)的1目，是昆虫纲中仅次于鞘翅目、鳞翅目、膜翅目的第四大目。世界已知85000种，全球分布。中国已知4000余种。双翅目昆虫有一对翅膀和一对平衡棒，包括蚊、蝇、虻。常见双翅目一些类群如种蝇、叶潜蝇、果实蝇、麦瘿蚊等的幼虫，都是农业的重要害虫。潜蝇科为害多种豆科植物；实蝇科的许多种类为害柑橘、梨、桃等。
[0003] 实蝇类害虫属于双翅目实蝇科(Tephritidae)，是对果蔬类作物造成严重损失的一类重要害虫。实蝇科迄今为止已知约500属，4500余种，其中，果蔬类有害实蝇的类群达15属、22亚属、150余种，我国以柑橘小实蝇关[Bactrocera dorsalis(Hendel)]，瓜实蝇[Bactrocera cucurbitae(Coqil Lett)]，柑橘大实蝇[Bactrocera minax(Enderlein)]等较为常见，主要分布于湖南、湖北、四川、重庆、贵州、福建、广东、广西、海南、云南、台湾等省。有害实蝇的寄主范围很广，涉及经济水果类植物共计24科、42个属：蔬菜类植物4科、16属(野生寄主植物未包括在内)。实蝇类害虫繁殖力强、危害性大。在实蝇分布或流行区，寄主果实被害率平均为25-45％，严重时高达80％，甚至绝产，给果蔬类作物带来了重大经济损失，严重影响了农民增产创收。
[0004] 目前，防治实蝇类害虫的方法主要有农业防治、化学防治、物理防治和生物防治等。其中农业防治包括定期清除种植园内的带虫果实、果实套袋和冬季翻耕灭蛹等；化学防治措施主要是喷施毒饵杀灭实蝇；物理防治措施采用实蝇诱捕剂和毒饵相结合的技术，目前，用于防治实蝇的诱捕剂主要是化学合成诱捕剂，如引诱酮(cue lure)、甲基丁香酚(methyleugenol)等。由于农业防治措施费时费工，效果不好；化学防治不仅容易使实蝇产生抗药性，而且对人、畜有害，易产生农药残留等环境污染的问题；在实际应用中性诱捕剂又存在挥发快、持效期短、用药频繁等问题，达不到控制蛀果率的防治目的，而且目前应用最广泛诱捕剂甲基丁香酚只引诱雄虫等等，其应用受到限制。
[0005] 国内外针对实蝇有糖醋液、雌性激素、蛋白质三大类诱剂。糖醋液费时、费力，成本较高；雌性激素只能诱雄虫，由于雄虫能行多次交配，防效常不太理想；蛋白质类诱捕剂可以引诱雌雄虫，效果好。但目前国外市场上的蛋白质诱剂为纯净动物蛋白，生产成本高。
[0006] 美洲斑潜蝇(Liriomyza sativae Blanchard)也属于双翅目潜蝇科(Agromyzidae)斑潜蝇属(Liriomyza)，俗称蔬菜斑潜蝇、地图虫、鬼画符等，是潜叶为害的危险性害虫。我国最早于1993年12月在海南省三亚市首次发现，随后美洲斑潜蝇逐渐向北扩散，1994年在云南昆明发生为害，1995年在上海、南京等地出现，1996年在山东、北京暴发成灾，1997年在河南、山西出现，1998年在东北、内蒙古成灾，除西藏外，全国均有分布。它的寄主植物多达200余种，其中蔬菜以茄果类(甜椒、辣椒除外)、豆类、瓜类、伞形花科等受害最重。
[0007] 美洲斑潜蝇成虫为小型蝇类，体黑色，体长1.3～2.3毫米，寿命8.7～12.6天，每雌一生产卵70～125枚，孵化率高达90％以上。幼虫乳白色至淡黄色，长3毫米左右，年繁殖15～20代。冬季进入日光温室内，可四季危害，主要有2次危害高峰，分别出现在5～6月和9～10月，年世代可达20代以上。成虫、幼虫均可危害，雌成虫在寄主叶片上刺孔并在其中取食和产卵，幼虫在叶片表皮下孵化后潜食叶肉或叶柄，产生不规则的蛇形白色虫道，破坏叶片叶绿素，影响光合作用，严重时叶片枯黄脱落甚至整株枯死；苗期造成毁苗。危害严重田块受害株100％，叶片受害70％。盛产期西葫芦，在发现危害后，7天左右吃尽叶肉，15天左右毁灭。幼虫和成虫通过取食还可传播某些病毒病。
[0008] 目前，随着耕作制度的变化，持续暖冬现象和露地及保护地蔬菜面积的不断扩大，潜叶蝇已成为多种蔬菜上危害特大、防治特困难的灾害性害虫之一，全年发生世代多而重叠混乱，传播蔓延快，大田春末夏初秋季保护地全年发生尤其严重。蔬菜的保护地栽培为蔬菜斑潜蝇提供了良好的越冬场所。该虫不但可在大棚内越冬，而且可在棚内发生危害，成为露地蔬菜田的重要虫源。因此,搞好大棚内的防治可有效地防止该虫在揭棚后向露地蔬菜扩散危害。
[0009] 因该虫世代重叠现象严重，抗药性强，生产中较难防治。目前，生产上对美洲斑潜蝇的防治仍主要是以化学防治为主，为了解决多年来化学农药带来的食品安全问题，应利用生物防治措施来控制虫害，但生物防治技术还没有真正在生产上应用和发挥效益，寻找针对性强，防效高，以及对人、畜安全，没有环境污染的一种新诱剂迫在眉睫。
发明内容
[0010] 针对现有技术的需要，本发明的目的是提供一种适用于诱捕实蝇和果蝇类害虫、可雌雄同捕的新型微生物诱捕剂。
[0011] 为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
[0013] 2.根据技术方案1所述的一种微生物诱捕剂，所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YN2010-KC CGMCC No.5722的发酵液通过以下方法制备得到：
[0014] (1)将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YN2010-KC CGMCC No.5722活化后，按5～10％接种量，将活化的所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YN2010-KC CGMCC No.5722接种到种子培养基，在培养温度35℃、转速120rpm/min条件下，摇床培养36～48h，得到一级种子液，所述种子培养基为液体LB培养基，pH 7.0～7.2；
[0015] (2)按10～12％接种量，将一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基，在28～37℃，转速100rpm/min，通气量为1000L/h，罐压保持在0.02～0.03MPa条件下培养36～48h，得到二级种子液；所述二级种子培养基由以下质量分数的以下成分组成：玉米粉0.3～
0.5％，黄豆粉1～1.5％，蔗糖0.2～0.5％，蛋白胨0.1～0.3％，鱼粉0.1～0.3％，MgSO4·
7H2O 0.02～0.04％，CaCO3 0.4～0.8％，(NH4)2SO4 0.03～0.06％，余量为水，pH 7.0～7.2；
0.5％，黄豆粉1～1.5％，蔗糖0.2～0.5％，蛋白胨0.1～0.3％，鱼粉0.1～0.3％，MgSO4·
7H2O 0.02～0.04％，CaCO3 0.4～0.8％，(NH4)2SO4 0.03～0.06％，余量为水，pH 7.0～7.2；
[0016] (3)按10～12％接种量，将二级种子液接种到发酵罐内的发酵培养基，在28～37℃，转速100rpm/min，通气量为10000L/h、罐压保持在0.02～0.03MPa条件下培养48～72h，培养后的发酵液中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YN2010-KC CGMCC No.5722的有效活菌数≧3×109cfu/ml时，该发酵液即为所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YN2010-KC CGMCC No.5722的发酵液，所述发酵培养基与步骤(2)所述二级种子培养基相同。
[0017] 3.技术方案1或2所述的微生物诱捕剂在防治实蝇类害虫的应用。
[0018] 4.技术方案1或2所述的微生物诱捕剂在防治美洲斑潜蝇的应用。
[0019] 5.根据技术方案3所述的微生物诱捕剂在防治实蝇类害虫的应用，所述的应用是将所述微生物诱捕剂装入塑料瓶内，每瓶的装入量为50～100mL，旋紧瓶盖，在距离瓶内液面1～3cm的瓶壁上均布4个孔，所述各孔的孔径为4～6mm；将塑料瓶悬挂于离地面0.5～1.5米处，每亩悬挂塑料瓶8～10个，相邻的塑料瓶间隔5～7m；每隔20～30天向塑料瓶内添加一次所述微生物诱捕剂25～50mL。
[0020] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0021] 1、本发明产品散发出的特殊气味能引诱实蝇和果蝇取食，可雌雄同捕，作用周期长，一次性投料可以两周内持效，且成本低，具有较强的竞争力。对柑橘小实蝇诱捕：比果瑞特果蝇引诱剂增加23.71％，比甲基丁香酚增加18.81％。比果瑞特果蝇引诱剂诱到的雌虫增加37.78％，比甲基丁香酚诱到的雌虫增加30倍。对柑橘大实蝇诱捕：比甲基丁香酚增加64.43％，诱捕的柑橘大实蝇雌虫数量比甲基丁香酚增加33.25倍。对美洲斑潜蝇的诱捕：雌虫率占55～60％，产生了预料不到的技术效果。甲基丁香酚诱不到斑潜蝇，只能用糖醋液为对照，而后者也能诱到雌雄虫，只是总虫量比本产品低很多。
[0022] 2、本发明产品中不含有任何化学有毒药剂，不杀死和不杀伤任何其他非靶标生物，属于环境友好型果实蝇诱捕剂。
[0023] 3、本发明产品完全可以取代化学杀虫药剂，大大减少化学农药用量，从而减少化学农药对天敌昆虫的负面影响，无抗药性。
[0024] 4、本发明产品可提高农产品质和产量，对生态安全，生态效益显著，使用简单。
[0025] 本发明所述的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens YN2010-KC于2012年1月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)，保藏号为CGMCC No.5722，并于2012年1月12日检测为存活。该普通微生物中心地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编:100101。
具体实施方式
[0026] 下面结合实施例对本发明提供的一种微生物诱捕剂进行详细说明，但并不对本发明构成限制，本领域技术人员在此基础上改进工艺参数，改变具体的辅料类型等替换和改动，依旧属于本发明的保护范围。各实施例无特殊说明的为常规方法。
[0027] 实施例1 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YN2010-KC的获得、鉴定和保藏
[0028] 1、本发明解淀粉芽孢杆菌YN2010-KC的获得
[0029] 1.1材料
[0031] 1.2培养基制备
[0033] 1.3分离培养
[0034] 采用稀释平皿分离法和平板划线分离，将分离纯化所得的一菌株命名为YN2010-KC。
[0035] 2、解淀粉芽孢杆菌YN2010-KC的鉴定
[0036] 2.1、形态学鉴定
[0037] 取菌株YN2010-KC在LB培养基上培养，37℃培养36小时，进行形态观察鉴定，菌体为杆状、端圆，周生鞭毛、具运动性，产生椭圆形芽孢；在LB和PSA平板上菌落圆形、淡茶褐色、菌落中央颜色略深、隆起、表面干燥有褶皱。与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著，科学出版社，2001年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断菌株YN2010-KC属于芽孢杆菌(Bacillus spp.)。
[0038] 2.2、生理生化鉴定
[0040] 3、解淀粉芽孢杆菌YN2010-KC的保藏
[0041] 经上述鉴定表明所分离获得的菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，其代号为YN2010-KC，所述的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens YN2010-KC于2012年1月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)，保藏号为CGMCC No.5722，并于2012年1月12日检测为存活。
该普通微生物中心地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编:100101。
该普通微生物中心地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编:100101。
[0042] 实施例2 本发明微生物诱捕剂的制备方法，包括以下步骤：
[0043] (1)将-80℃保存的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YN2010-KC CGMCC No.5722接种在液体LB培养基上，35℃培养24h，得活化的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YN2010-KC CGMCC No.5722，按10％接种量，将活化的所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YN2010-KC CGMCC No.5722接种到种子培养基，在培养温度35℃、转速120rpm/min条件下，摇床培养36h，得到一级种子液，所述种子培养基为液体LB培养基，pH 7.0～7.2；
[0044] (2)按10％接种量，将一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基，在35℃，转速100rpm/min，通气量为1000L/h，罐压保持在0.02～0.03MPa条件下培养36～48h，得到二级种子液；得到二级种子液；所述二级种子培养基由以下质量分数的以下成分组成：玉米粉0.5％，黄豆粉1％，蔗糖0.5％，蛋白胨0.3％，鱼粉0.1％，MgSO4·7H2O 0.02％，CaCO3
0.4％，(NH4)2SO4 0.03％，余量为水，pH 7.0～7.2；所述二级种子培养基于121℃灭菌
30min，待降温至30℃，接入一级种子液；
0.4％，(NH4)2SO4 0.03％，余量为水，pH 7.0～7.2；所述二级种子培养基于121℃灭菌
30min，待降温至30℃，接入一级种子液；
[0045] (3)按10％接种量，将二级种子液接种到发酵罐内的发酵培养基，在35℃，转速100rpm/min，通气量为10000L/h、罐压保持在0.02～0.03MPa条件下培养48～72h，培养后的发酵液中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YN2010-KC CGMCC No.5722的有效活菌数≧3×109cfu/ml时，将发酵液用医用塑料瓶包装，即为所述微生物诱捕剂，所述发酵培养基与步骤(2)所述二级种子培养基相同。
[0046] 本发明微生物诱捕剂通过实施例2所述的微生物诱捕剂的制备方法制备得到。
[0047] 实施例3 本发明微生物诱捕剂与其它诱剂对柑橘小实蝇诱捕的对比试验[0048] 在云南省元江县柑橘园内进行诱捕效果试验，同时与“果瑞特”果蝇引诱剂，(属蛋白饵剂，市售)、甲基丁香酚(属性诱剂，市售)和水(空白对照)进行对比。本发明微生物诱捕剂用量50ml/瓶，果瑞特果蝇引诱剂用量50ml/瓶，甲基丁香酚用量3ml/瓶。
[0049] 每个塑料瓶装上述一种引诱剂，旋紧瓶盖，在距离瓶内液面2cm的瓶壁上均布4个孔，所述各孔的孔径为5mm。于2015年5月16日中午进行田间释放，将塑料瓶悬挂于离柑橘地0.5-1.5米处。两天后诱到柑橘小实蝇数量(头)见表1。可见，本发明微生物诱捕剂诱虫数量均高于果瑞特果蝇引诱剂和甲基丁香酚，且雌虫率高达51.67％。本发明微生物诱捕剂诱虫数量比果瑞特果蝇引诱剂增加23.71％，比甲基丁香酚增加18.81％。本发明微生物诱捕剂比果瑞特果蝇引诱剂诱到的雌虫增加37.78％，比甲基丁香酚诱到的雌虫增加30倍。
[0050] 表1 本发明微生物诱捕剂对柑橘小实蝇引诱试验
[0051]
[0052] 实施例4 本发明微生物诱捕剂对柑橘果实蝇诱捕试验
[0053] 在云南省河口县南溪农场进行果实蝇诱捕试验，试验试剂：本发明微生物诱捕剂。装试剂的塑料瓶及操作与实施例3相同，本发明微生物诱捕剂用量50ml/瓶，于2014年7月5日中午装有试剂的塑料瓶悬挂于离柑橘地0.5-1.5米处，自投料后1天、2天和3天调查各瓶中虫量见表2，可见，本发明诱捕剂发酵产生挥发性蛋白质类等化合物引诱果实蝇食用，效果显著，且雌雄同诱。
[0054] 表2 本发明微生物诱捕剂诱捕果实蝇(柑橘大实蝇、小实蝇、番石榴实蝇、瓜实蝇等)的效果
[0055]
[0056] 实施例5 本发明微生物诱捕剂对柑橘大实蝇防治效果的对比试验
[0057] 在云南省蒙自县柑橘园内进行诱捕柑橘大实蝇试验，同时与甲基丁香酚进行对比。本发明微生物诱捕剂用量50ml/瓶，甲基丁香酚用量50ml/瓶。
[0058] 装各试剂的塑料瓶及操作与实施例3相同，于2014年12月4日中午将装有试剂的塑料瓶悬挂于离柑橘地0.5-1.5米处，自投料后1天、2天和3天调查各瓶中虫量见表3，可见，用本发明微生物诱捕剂发酵产生挥发性蛋白质类等化合物引诱柑橘大实蝇食用，除第一天诱虫量低于性诱剂甲基丁香酚外，其它时间内诱捕大实蝇的效果均优于性诱剂甲基丁香酚，且雌雄同诱。三天内，本发明微生物诱捕剂诱捕柑橘大实蝇数量比甲基丁香酚增加64.43％，诱捕的柑橘大实蝇雌虫数量比甲基丁香酚增加33.25倍。
[0059] 表3 本发明微生物诱捕剂诱捕柑橘大实蝇的效果
[0060]
[0061] 实施例6 本发明微生物诱捕剂与黄板田间诱虫对比试验
[0062] 在云南省蒙自县番茄蔬菜基地上进行诱捕效果试验，同田与30×30cm黄板进行了对比。每个黄色塑料瓶装50ml本发明微生物诱捕剂，旋紧瓶盖，在距离瓶内液面2cm处的瓶壁上均布4个孔，所述各孔的孔径为5mm。于2015年6月16日中午进行田间释放，将塑料瓶悬挂于距地面0.5～0.8米高，每亩悬挂塑料瓶8个，相邻的塑料瓶间隔5～10m；在同田，将黄板悬挂于距地面0.5-0.8米高，每亩悬挂黄板8个，相邻的黄板间隔5～10m。每两天后诱到美洲斑潜蝇数量(头)见表4。可见，本发明微生物诱捕剂平均每天诱虫数量均高于黄板，8天内，本发明微生物诱捕剂诱虫1988头，黄板诱虫379头，是黄板诱虫量的5.2倍。
[0063] 表4 本发明微生物诱捕剂和黄板对美洲斑潜蝇引诱的对比试验
[0064]
[0065] 实施7 本发明微生物诱捕剂对美洲斑潜蝇雌雄数量诱捕试验
[0066] 在云南省江川县牛魔村蔬菜基地进行豇豆美洲斑潜蝇诱捕试验，将50ml本发明微生物诱捕剂直接加入外壁贴有黄色胶带塑料瓶中，旋紧瓶盖，在距离瓶内液面2cm处的瓶壁上均布4个孔，所述各孔的孔径为5mm。于2015年2月3日中午悬挂于距离地面0.5～0.8米高，自投料后1天、2天和3天调查各瓶中虫量见表5，可见，用本发明微生物诱捕剂发酵产生的挥发性蛋白质类等化合物引诱美洲斑潜蝇食用，效果显著，且雌雄同诱，雌虫率达55～60％。
[0067] 表5 本发明微生物诱捕剂捕雌雄美洲斑潜蝇统计
[0068]
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