技术领域
[0001] 本
发明属于抗体制备技术领域，尤其涉及一种抗独特型卵黄抗体的制备方法。
背景技术
[0002] 目前，关于抗独特型抗体制备方法较多的是抗独特型单克隆抗体，该方法首先制备
抗原的单克隆抗体，从中筛选出对抗原功能有免疫中和作用的单抗，然后用该单抗再次免疫小鼠，制备抗独特型单克隆抗体，其中经过两次细胞融合，制备两次杂交瘤细胞株，费时费
力。
[0003] 而且，制备一种有用抗独特型单克隆抗体至少需要一年时间，研发流程长，成本高。同时，
现有技术中也有抗独特型多克隆抗体的制备，如抗独特型兔抗体，该方法、取血清时要杀死动物，很难做无菌处理，不适合工业化生产。
发明内容
[0004] 本
申请实施例通过提供一种抗独特型卵黄抗体的制备方法，解决了现有技术中的抗独特型单克隆抗体研发周期长、成本高，抗独特型兔抗体要大量杀生，且难以进行无菌处理，不宜工业化生产的技术问题，达到了缩短研发和生产周期，省时省力，节约成本，使用途径多样，不需要大量杀生，资源丰富，易做无菌处理，可工业化生产的技术效果。
[0005] 本发明实施例提供了一种抗独特型卵黄抗体的制备方法，包括：步骤1：制备免疫原；步骤2：采用步骤1中获得的所述免疫原和不完全弗氏佐剂混合，搅拌均匀后，按照第一预设条件皮下注射免疫小鼠后，获得小鼠抗抗原的抗体；步骤3：采用步骤2中获得的所述小鼠抗抗原的抗体和不完全弗氏佐剂混合后，肌肉注射免疫产蛋鸡，并按照第二预设条件免疫预定次数；步骤4：在第二次免疫后第3～5天，采集所述产蛋鸡当天产的蛋，并利用ELISA法检测抗独特型抗体的效价，判断所述产蛋鸡是否满足第三预设条件；步骤5：当所述产蛋鸡满足所述第三预设条件时，按照第四预设条件进行高免鸡蛋的采集；步骤6：对所述高免鸡蛋进行卵黄分离、保存以及卵黄组织的
破碎；步骤7：对卵黄液进行处理之后，静置以使杂蛋白继续沉淀，经过第一预设时间后，用吸管吸取第一上清，将底部混浊部分离心后再次吸取第二上清，将所述第一上清和所述第二上清混合、并过滤后，收集滤液，获得抗独特型卵黄抗体粗制品；步骤8：根据冷酒精沉淀法，对步骤7中获得的所述抗独特型卵黄抗体粗制品进行纯化；步骤9：分别对所述抗独特型卵黄抗体进行效价检测、特异性检测以及竞争抑制试验。
[0006] 优选的，在所述步骤1中，还包括：当免疫原的分子量满足预设
阈值时，将所述免疫原和蛋白分子偶联，获得免疫原复合物后进行免疫；其中，所述偶联过程具体包括：将10mg载体蛋白溶解至1mL PBS中获得第一溶液、将1mg免疫原蛋白或肽类溶解于1mL蒸馏
水中获得第二溶液，将所述第一溶液和所述第二溶液混合后边搅拌边滴加1mL 0.25％戊二
醛溶液，滴加完后继续搅拌5～10分钟，置于室温静置2～3小时后，获得所述免疫原复合物。
[0007] 优选的，在所述步骤2中，所述第一预设条件为：每只小鼠每次免疫的免疫原含量为5～10μg，免疫次数为3～4次，间隔时间为7～10天。
[0008] 优选的，在所述步骤2中，还包括：在第二次免疫后第3～5天，采集小鼠尾静脉血，并离心获得血清后，对所述血清抗抗原的抗体的效价进行检测，判断检测结果是否满足第五预设条件；当满足所述第五预设条件之后，在第三次免疫后第5～7天分别
放血，离心后获得血清并分装。
[0009] 优选的，在所述步骤3中，所述第二预设条件具体为：每次注射量为0.5mL，含小鼠抗抗原的抗体量为20～40μg，每间隔7～10天免疫一次，所述预定次数为3～4次。
[0010] 优选的，在所述步骤6中，所述对所述高免鸡蛋进行卵黄分离、保存以及卵黄组织的破碎，包括：将所述高免鸡蛋清洗，放入70％酒精浸泡第二预设时间后，送入
净化间晾干，并利用人工或机器分离蛋黄；采用
粉碎机或高压均质机进行卵黄组织破碎。
[0011] 优选的，在所述步骤8中，对所述抗独特型卵黄抗体粗制品进行纯化，包括：加入冷酒精至所述抗独特型卵黄抗体粗制品中，以使所述抗独特型卵黄抗体粗制品浓度达到卵黄液体积的50％～60％，搅拌、离心后获得第一沉淀物；向所述第一沉淀物中加入无菌蒸馏水，以使第一
混合液的体积与所述抗独特型卵黄抗体粗制品的体积保持一致，再加入冷酒精达到第一混合液体积的25％～30％，搅拌、离心后获得第二沉淀物；向所述第二沉淀物中加入无菌蒸馏水，以使第二混合液的体积与所述抗独特型卵黄抗体粗制品的体积保持一致，再加入冷酒精达到第二混合液体积的20％～25％，搅拌、离心后获得第三沉淀物；将所述第三沉淀物进行处理后获得所述抗独特型卵黄抗体的精制品。
[0012] 优选的，在所述步骤9中，所述对所述抗独特型卵黄抗体进行效价检测，包括：采用包被缓冲液将兔抗抗原抗体稀释为1:500后，包被至ELISA反应小孔中，其中，每孔加量为100μL，在常温静置1h，弃去孔内液体后，用PBS进行清洗；采用PBS将所述抗独特型卵黄抗体进行10倍系列稀释，并分别加入至包被孔内，在常温静置30min，弃去孔内液体后，用PBS进行清洗；加入酶标山羊抗IgY抗体，每孔加量为100μL，在常温静置30min，弃去孔内液体后，用PBS进行清洗后，加入反应底物，在常温避光显色10～15min，加终止液，用酶标仪检测吸光值。
[0013] 优选的，在所述步骤9中，所述对所述抗独特型卵黄抗体进行特异性检测，包括：分别采用兔抗抗原抗体、兔抗其他肽类抗体包被至ELISA反应小孔，每孔加量为100μL，在常温静置1h，弃去孔内液体后，用PBS进行清洗；加入所述抗独特型卵黄抗体，每孔加量为100μL，在常温静置30min，弃去孔内液体后，用PBS进行清洗；加入酶标山羊抗IgY抗体，每孔加量为100μL，在常温静置30min，弃去孔内液体后，用PBS进行清洗后，加入反应底物，在常温避光显色10～15min，加终止液，用酶标仪检测吸光值。
[0014] 优选的，在所述步骤9中，所述对所述抗独特型卵黄抗体进行竞争抑制试验，包括：采用兔抗抗原抗体包被至反应小孔，每孔加量为100μL，在常温下静置1h，移弃孔内液体后，用PBS进行清洗；加入抗原，每孔加量为100μL，含抗原10μg/孔，用PBS取代抗原作对照，加量为100μL，在常温下静置30min，移弃孔内液体后，用PBS进行清洗；加入所述抗独特型卵黄抗体，每孔加量为100μL，在常温静置30min，弃去孔内液体后，加入酶标山羊抗IgY抗体，每孔加量为100μL，在常温静置30min，弃去孔内液体后，用PBS进行清洗；加反应底物，在常温避光显色10～15min，加终止液，获得检测结果。
[0015] 本发明实施例中的上述一个或多个技术方案，至少具有如下一种或多种技术效果：
[0016] 在本发明实施例提供的一种抗独特型卵黄抗体的制备方法，所述方法包括：步骤1：制备免疫原；步骤2：采用步骤1中获得的所述免疫原和不完全弗氏佐剂混合，搅拌均匀后，按照第一预设条件皮下注射免疫小鼠后，获得小鼠抗抗原的抗体；步骤3：采用步骤2中获得的所述小鼠抗抗原的抗体和不完全弗氏佐剂混合后，肌肉注射免疫产蛋鸡，并按照第二预设条件免疫预定次数；步骤4：在第二次免疫后第3～5天，采集所述产蛋鸡当天产的蛋，并利用ELISA法检测抗独特型抗体的效价，判断所述产蛋鸡是否满足第三预设条件；步骤5：
当所述产蛋鸡满足所述第三预设条件时，按照第四预设条件进行高免鸡蛋的采集；步骤6：
对所述高免鸡蛋进行卵黄分离、保存以及卵黄组织的破碎；步骤7：对卵黄液进行处理之后，静置以使杂蛋白继续沉淀，经过第一预设时间后，用吸管吸取第一上清，将底部混浊部分离心后再次吸取第二上清，将所述第一上清和所述第二上清混合、并过滤后，收集滤液，获得抗独特型卵黄抗体粗制品；步骤8：根据冷酒精沉淀法，对步骤7中获得的所述抗独特型卵黄抗体粗制品进行纯化；步骤9：分别对所述抗独特型卵黄抗体进行效价检测、特异性检测以及竞争抑制试验，从而解决了现有技术中的抗独特型单克隆抗体研发周期长、成本高，抗独特型兔抗体要大量杀生，且难以进行无菌处理，不宜工业化生产的技术问题，达到了缩短研发和生产周期，省时省力，节约成本，使用途径多样，不需要大量杀生，只资源丰富，易做无菌处理，可工业化生产的技术效果。
[0017] 上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照
说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。
附图说明
[0018] 图1为本发明实施例的一种抗独特型卵黄抗体的制备方法的流程示意图。
具体实施方式
[0019] 本申请实施例通过提供了一种抗独特型卵黄抗体的制备方法，解决了现有技术中的抗独特型单克隆抗体研发周期长、成本高，抗独特型兔抗体要大量杀生，且难以进行无菌处理，不宜工业化生产的技术问题。
[0020] 本发明实施例中的技术方案，总体思路如下：本发明实施例提供的一种抗独特型卵黄抗体的制备方法，通过步骤1：制备免疫原；步骤2：采用步骤1中获得的所述免疫原和不完全弗氏佐剂混合，搅拌均匀后，按照第一预设条件皮下注射免疫小鼠后，获得小鼠抗抗原的抗体；步骤3：采用步骤2中获得的所述小鼠抗抗原的抗体和不完全弗氏佐剂混合后，肌肉注射免疫产蛋鸡，并按照第二预设条件免疫预定次数；步骤4：在第二次免疫后第3～5天，采集所述产蛋鸡当天产的蛋，并利用ELISA法检测抗独特型抗体的效价，判断所述产蛋鸡是否满足第三预设条件；步骤5：当所述产蛋鸡满足所述第三预设条件时，按照第四预设条件进行高免鸡蛋的采集；步骤6：对所述高免鸡蛋进行卵黄分离、保存以及卵黄组织的破碎；步骤7：对卵黄液进行处理之后，静置以使杂蛋白继续沉淀，经过第一预设时间后，用吸管吸取第一上清，将底部混浊部分离心后再次吸取第二上清，将所述第一上清和所述第二上清混合、并过滤后，收集滤液，获得抗独特型卵黄抗体粗制品；步骤8：根据冷酒精沉淀法，对步骤7中获得的所述抗独特型卵黄抗体粗制品进行纯化；步骤9：分别对所述抗独特型卵黄抗体进行效价检测、特异性检测以及竞争抑制试验，从而达到了缩短研发和生产周期，省时省力，节约成本，使用途径多样，不需要大量杀生，只资源丰富，易做无菌处理，可工业化生产的技术效果。
[0021] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0022] 实施例
[0023] 本实施例提供了一种抗独特型卵黄抗体的制备方法，请参考图1，所述抗独特型卵黄抗体的制备方法包括：
[0024] 步骤1：制备免疫原。
[0025] 进一步的，在所述步骤1中，还包括：当免疫原的分子量满足预设阈值时，将所述免疫原和蛋白分子偶联，获得免疫原复合物后进行免疫；其中，所述偶联过程具体包括：将10mg载体蛋白溶解至1mL PBS中获得第一溶液、将1mg免疫原蛋白或肽类溶解于1mL蒸馏水中获得第二溶液，将所述第一溶液和所述第二溶液混合后边搅拌边滴加1mL 0.25％戊二醛溶液，滴加完后继续搅拌5～10分钟，置于室温静置2～3小时后，获得所述免疫原复合物。
[0026] 具体而言，在进行免疫原制备时，当免疫原为细菌、病毒等
微生物时，此时则不需进行免疫原制备。如果免疫原的分子量满足了预设阈值要求，则需要将其和分子量大的蛋白分子偶联，制成免疫原复合物，然后免疫。进一步的，本实施例中以该预设阈值要求为一万以下作为优选，即，当免疫原的分子量在一万以下时，需要将其和分子量大的蛋白分子偶联，制成免疫原复合物。具体的偶联方法如下：将10mg载体蛋白(优选
牛血清
白蛋白)溶解到1mL PBS(pH5.0～7.0)，将1mg免疫原蛋白或肽类溶解于1mL蒸馏水中，将两者混合搅均，边搅拌边滴加1mL 0.25％戊二醛溶液，滴加完后继续搅拌5～10分钟，然后在室温静置让其继续反应2～3小时，即可得到抗原的免疫原复合物。分装后置于-20℃保存待用。其中，PBS是
磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)，一般作为
溶剂，起溶解保护
试剂的作用。它是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl。
[0027] 步骤2：采用步骤1中获得的所述免疫原和不完全弗氏佐剂混合，搅拌均匀后，按照第一预设条件皮下注射免疫小鼠后，获得小鼠抗抗原的抗体。
[0028] 进一步的，在所述步骤2中，所述第一预设条件为：每只小鼠每次免疫的免疫原含量为5～10μg，免疫次数为3～4次，间隔时间为7～10天。
[0029] 进一步的，在所述步骤2中，还包括：在第二次免疫后第3～5天，采集小鼠尾静脉血，并离心获得血清后，对所述血清抗抗原的抗体的效价进行检测，判断检测结果是否满足第五预设条件；当满足所述第五预设条件之后，在第三次免疫后第5～7天分别放血，离心后获得血清并分装。
[0030] 具体而言，在制备抗体(Ab1)时，首先需要进行的是免疫过程。具体的方法为：将上述步骤1获得的免疫原或者是或免疫原复合物和不完全弗氏佐剂混合，并且采用的是等体积混合。即，用等体积抗原或免疫原复合物和不完全弗氏佐剂混合，搅匀后分别皮下注射免疫小鼠、大鼠和家兔，小鼠每次每只免疫免疫原5～10μg，大鼠每次每只免疫10～20μg，兔每次每只免疫20～40μg，共免疫3～4次，间隔7～10天。
[0031] 进一步的，当免疫过程结束之后，接着需要进行抗体效价的检测。具体的方法为：第二次免疫后第3～5天，分别采集小鼠尾静脉血、大鼠尾静脉血，家兔
耳静脉血，离心取血清。利用ELISA法分别检测血清中抗抗原抗体的效价，然后判断检测结果是否满足第五预设条件。其中，第五预设条件为效价达1×10-4以上。如果效价达1×10-4以上，第三次免疫后第
5～7天分别放血，离心取血清(小鼠、大鼠麻醉后断头取血，兔麻醉后颈动脉
插管取血)。将血清分装后，置于-20℃保存待用。其中，ELISA是enzyme linked immμnosorbent assay(酶联
免疫吸附测定)的简写，指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。
[0032] 步骤3：采用步骤2中获得的所述小鼠抗抗原的抗体和不完全弗氏佐剂混合后，肌肉注射免疫产蛋鸡，并按照第二预设条件免疫预定次数。
[0033] 进一步的，在所述步骤3中，所述第二预设条件具体为：每次注射量为0.5mL，含小鼠抗抗原的抗体量为20～40μg，每间隔7～10天免疫一次，所述预定次数为3～4次。
[0034] 具体而言，在制备抗独特型卵黄抗体时，首先需要进行的是免疫过程，具体的：用小鼠抗抗原的抗体(Ab1)和不完全弗氏佐剂等体积混合后，肌肉注射免疫产蛋鸡，每次注射量为0.5mL，含Ab1的量为20～40μg。每隔7～10天免疫一次，共免疫3～4次。
[0035] 步骤4：在第二次免疫后第3～5天，采集所述产蛋鸡当天产的蛋，并利用ELISA法检测抗独特型抗体的效价，判断所述产蛋鸡是否满足第三预设条件。
[0036] 具体而言，在进行高免鸡的筛选时，具体的步骤为：第二次免疫后第3～5天，采集产蛋鸡当天产的蛋，用ELISA法检测抗独特型抗体的效价，然后判断产蛋鸡是否满足第三预设条件。其中，第三预设条件为抗独特型抗体的效价达到1×10-4以上。若设定抗独特型抗体的效价达到1×10-4以上，该产蛋鸡则被选为高免鸡，列为采蛋对象。检测不到抗独特型抗体或效价达不到1×10-4时，其鸡蛋可按常规出售。进一步的，判断抗独特型抗体的标准是：能与不同种族动物产生的抗原的抗体发生免疫反应；这种免疫反应能被抗原竞争抑制；能诱导异种动物产生抗原特异性抗体。
[0037] 步骤5：当所述产蛋鸡满足所述第三预设条件时，按照第四预设条件进行高免鸡蛋的采集。
[0038] 具体而言，当筛选出高免鸡之后，则继续进行高免鸡蛋的采集，具体的方法为：第四预设条件具体为：在第三次免疫后第三天开始采集高免鸡的鸡蛋，连续采集20天，20天后如需要，再追加免疫一次，然后继续采集20天，直到产蛋鸡被淘汰。
[0039] 步骤6：对所述高免鸡蛋进行卵黄分离、保存以及卵黄组织的破碎。
[0040] 进一步的，在所述步骤6中，所述对所述高免鸡蛋进行卵黄分离、保存以及卵黄组织的破碎，包括：将所述高免鸡蛋清洗，放入70％酒精浸泡第二预设时间后，送入净化间晾干，并利用人工或机器分离蛋黄；采用粉碎机或高压均质机进行卵黄组织破碎。
[0041] 具体而言，对卵黄的分离及保存，具体为：将采集到的鸡蛋用
自来水清洗干净，放入70％酒精浸泡第二预设时间，其中，第二预设时间为10分钟，进行杀菌消毒，捞出之后接着传入净化间晾干，然后采用人工或机器分离蛋黄，分离出来的蛋黄如不
马上制备卵黄抗体，可置于-20℃保存1～6个月。进一步的，对于卵黄组织的破碎，主要是采用粉碎机或高压均质机(60Pa)进行卵黄组织破碎。
[0042] 步骤7：对卵黄液进行处理之后，静置以使杂蛋白继续沉淀，经过第一预设时间后，用吸管吸取第一上清，将底部混浊部分离心后再次吸取第二上清，将所述第一上清和所述第二上清混合、并过滤后，收集滤液，获得抗独特型卵黄抗体粗制品。
[0043] 具体而言，卵黄组织破碎完成之后，接着进行杂蛋白去除，具体方法为：用水稀释和
酸化法去除杂蛋白，加10～40倍无菌蒸馏水搅拌均匀，然后用
盐酸和氢
氧化钠溶液将卵黄液pH值调至5.2～6.0，使卵黄液产生混浊沉淀，置于4℃～8℃
冰箱过夜，使杂蛋白继续沉淀。经过第一预设时间后，其中，第一预设时间为24h，因此，第二天用吸管吸取上清，底部混浊部分离心20～40分钟，转速3500～4000rpm，取上清。将两部分上清混合后经微孔过滤(孔径0.22μm)进一步去除脂蛋白和脂肪，收集滤液，该滤液为抗独特型卵黄抗体粗制品。
[0044] 步骤8：根据冷酒精沉淀法，对步骤7中获得的所述抗独特型卵黄抗体粗制品进行纯化。
[0045] 进一步的，在所述步骤8中，对所述抗独特型卵黄抗体粗制品进行纯化，包括：加入冷酒精至所述抗独特型卵黄抗体粗制品中，以使所述抗独特型卵黄抗体粗制品浓度达到卵黄液体积的50％～60％，搅拌、离心后获得第一沉淀物；向所述第一沉淀物中加入无菌蒸馏水，以使第一混合液的体积与所述抗独特型卵黄抗体粗制品的体积保持一致，再加入冷酒精达到第一混合液体积的25％～30％，搅拌、离心后获得第二沉淀物；向所述第二沉淀物中加入无菌蒸馏水，以使第二混合液的体积与所述抗独特型卵黄抗体粗制品的体积保持一致，再加入冷酒精达到第二混合液体积的20％～25％，搅拌、离心后获得第三沉淀物；将所述第三沉淀物进行处理后获得所述抗独特型卵黄抗体的精制品。
[0046] 具体而言，在得到抗独特型卵黄抗体粗制品之后，则继续进行抗独特型卵黄抗体的纯化，具体操作如下：采用盐沉淀或冷酒精沉淀法对抗独特型卵黄抗体粗制品进行纯化，本实施例中以冷酒精沉淀法作为优选。首先，第一次加入-20℃冷酒精到抗独特型卵黄抗体粗制品液中，使其浓度(体积比)达到卵黄液体积的50％～60％。充分搅拌，使其发生混浊沉淀。在4000rpm离心20～30分钟，取沉淀物。接着，加无菌蒸馏水使其恢复到抗独特型卵黄抗体粗制品体积，再加冷酒精达到抗独特型卵黄抗体液体积的25％～30％，充分搅拌，使其发生混浊沉淀。在4000rpm离心25～30分钟，取沉淀物。然后，继续加无菌蒸馏水使其恢复到抗独特型卵黄抗体粗制品体积。再加冷酒精达到抗独特型卵黄抗体液体积的20％～25％，充分搅拌，使其发生混浊沉淀。在4000rpm离心20～30分钟，取沉淀物。最后，将沉淀物在37℃恒温箱烤干或加适量无菌蒸馏水溶解，即可得到固体或液体抗独特型卵黄抗体的精制品。
[0047] 步骤9：分别对所述抗独特型卵黄抗体进行效价检测、特异性检测以及竞争抑制试验。
[0048] 具体而言，对于抗独特型卵黄抗体的检测，主要包括效价检测、特异性检测以及竞争抑制试验。
[0049] 采用间接ELISA法检测卵黄抗体的效价。具体程序为：用包被缓冲液将兔抗抗原抗体稀释为1:500，然后包被到ELISA反应小孔内，每孔100μL，在常温静置1h，弃去孔内液体，用PBS洗三次，每次清洗的时间为3min，用PBS将抗独特型卵黄抗体进行10倍系列稀释，共稀释10级，分别加到包被孔内，每级加两个重复孔，对照孔加PBS，每孔100μL，在常温静置30min，弃去孔内液体，用PBS洗三次，每次清洗的时间为3min。加酶标山羊抗IgY抗体(1:
1000)，每孔100μL，在常温静置30min，弃去孔内液体，用PBS洗三次，每次清洗的时间为
3min。加反应底物，在常温避光显色10～15min，加终止液，用酶标仪在492nm下测吸光值(A)。待测样品的A值大于或等于对照孔的2.1倍，即为阳性反应。如表1所示，为效价检测的检测结果。从表1中可以看到，该抗独特型卵黄抗体的效价为1×10-5。
[0050] 表1.卵黄Ab2效价检测结果表
[0051]
[0052] 用间接ELISA法检测卵黄Ab2的特异性，具体程序为：分别用兔抗抗原抗体、兔抗其他肽类抗体(1:500)包被ELISA反应小孔，每孔100μL，在常温静置1h，弃去孔内液体，用PBS洗三次，每次清洗的时间为3min，加卵黄抗独特型抗体(1:1000)，每孔100μL，在常温静置30min，弃去孔内液体，用PBS洗三次，每次清洗的时间为3min，加酶标山羊抗IgY抗体(1:
1000)，每孔100μL，在常温静置30min，弃去孔内液体，用PBS洗三次，每次清洗的时间为
3min。加反应底物，在常温避光显色10～15min，加终止液，用酶标仪在492nm下测吸光值(A)。待测样品的A值大于或等于对照孔的2.1倍，即为阳性反应。如表2所示，为特异性检测的检测结果。从表2中可以看到，该抗独特型卵黄抗体只和兔抗抗原抗体发生免疫反应，不和兔抗其他抗原抗体发生免疫反应。
[0053] 表2.卵黄Ab2特异性检测结果表
[0054]
[0055] 竞争抑制试验的具体操作方法为：采用兔抗抗原抗体Ab1(1:1000)包被反应小孔，每孔100μL，在常温下静置1h，移弃孔内液体，用PBS洗三次，每次清洗的时间为3min，加抗原，每孔100μL，含抗原10μg/孔，在常温下静置30min，移弃孔内液体，用PBS洗三次，加抗独特型卵黄抗体(1:1000)，每孔100μL，常温下静置30min，移弃孔内液体，加酶标山羊抗IgY抗体(1:1000)，每孔100μL，在常温静置30min，弃去孔内液体，用PBS洗三次，每次清洗的时间为3min。加反应底物，在常温避光显色10～15min，加终止液，用PBS取代抗原作对照，检测两组ELISA反应A值，计算出均值，标准差和差别显著性意义，结果两组差别应该有显著性意义。说明该卵黄Ab2能和异种动物抗原特异性抗体发生免疫反应，该免疫反应它能被抗原竞争抑制。如果以上条件都达到了，说明该卵黄Ab2是一种高效价、高特异性，具有抗原内影像的卵黄Ab2，可作抗原使用，也可作抗原的
疫苗使用。
[0056] 因此，本实施例中的抗独特型卵黄抗体的制备方法和抗独特型单克隆抗体制备方法相比，研发和生产周期更短，省时省力，节约成本，使用途径更多样。和抗独特型兔抗体比，不需要大量杀生，只采集高免鸡的蛋，资源丰富，较易做无菌处理，可工业化生产，使用途径多样，成本也更低。进一步的，本实施例中的抗独特型抗体能模拟抗原的功能，可当抗原使用，也可当抗原的疫苗使用，可用它来治病和
预防疾病。
[0057] 进一步的，本发明的目的是能快捷简便地制备出抗独特型抗体。该抗独特型抗体资源丰富，制备工艺简便、产量高成本低，应用途径更多样，使用更方便，可大规模工业化生产。同时，抗独特型卵黄抗体性能稳定、资源丰富、成本低，抗独特型卵黄抗体无种族界限，推广应用更方便，抗独特型卵黄抗体使用途径更多样，注射、口服、浸泡(对鱼)均有效，使用更简便可行。
[0058] 本发明实施例中的上述一个或多个技术方案，至少具有如下一种或多种技术效果：
[0059] 在本发明实施例提供的一种抗独特型卵黄抗体的制备方法，所述方法包括：步骤1：制备免疫原；步骤2：采用步骤1中获得的所述免疫原和不完全弗氏佐剂混合，搅拌均匀后，按照第一预设条件皮下注射免疫小鼠后，获得小鼠抗抗原的抗体；步骤3：采用步骤2中获得的所述小鼠抗抗原的抗体和不完全弗氏佐剂混合后，肌肉注射免疫产蛋鸡，并按照第二预设条件免疫预定次数；步骤4：在第二次免疫后第3～5天，采集所述产蛋鸡当天产的蛋，并利用ELISA法检测抗独特型抗体的效价，判断所述产蛋鸡是否满足第三预设条件；步骤5：
当所述产蛋鸡满足所述第三预设条件时，按照第四预设条件进行高免鸡蛋的采集；步骤6：
对所述高免鸡蛋进行卵黄分离、保存以及卵黄组织的破碎；步骤7：对卵黄液进行处理之后，静置以使杂蛋白继续沉淀，经过第一预设时间后，用吸管吸取第一上清，将底部混浊部分离心后再次吸取第二上清，将所述第一上清和所述第二上清混合、并过滤后，收集滤液，获得抗独特型卵黄抗体粗制品；步骤8：根据冷酒精沉淀法，对步骤7中获得的所述抗独特型卵黄抗体粗制品进行纯化；步骤9：分别对所述抗独特型卵黄抗体进行效价检测、特异性检测以及竞争抑制试验，从而解决了现有技术中的抗独特型单克隆抗体研发周期长、成本高，抗独特型兔抗体要大量杀生，且难以进行无菌处理，不宜工业化生产的技术问题，达到了缩短研发和生产周期，省时省力，节约成本，使用途径多样，不需要大量杀生，只资源丰富，易做无菌处理，可工业化生产的技术效果。
[0060] 尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和
修改。所以，所附
权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0061] 显然，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样，倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
