白细胞介素-31多克隆或单克隆抗体的制备方法及应用
专利汇可以提供白细胞介素-31多克隆或单克隆抗体的制备方法及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种白细胞介素-31多克隆或单克隆 抗体 的制备方法及应用，白细胞介素－31是近年发现的具有4个螺旋结构的多肽链，为Th2型细胞因子，具有调节 细胞增殖 分化、促进造血、参与 炎症 反应等多种 生物 学功能，是一种重要的炎症因子，在炎症反应和过敏性 疾病 中发挥重要的作用。白细胞介素-31多克隆抗体或单克隆抗体的制备方法分为以下几个步骤：大肠杆菌E.coli.BL21的培养及rhIL-31的诱导表达；免疫原制备；免疫原注射试验动物；提取抗体；IL-31多克隆或单克隆抗体特异性鉴定。IL-31多克隆或单克隆抗体的应用包括：ELISA检测方法及 试剂 和抗体外用 治疗 及 皮肤 保健应用。，下面是白细胞介素-31多克隆或单克隆抗体的制备方法及应用专利的具体信息内容。
1.白细胞介素-31多克隆抗体的制备方法，其特征在于：该制备方法的具体步骤如下：
(1)、大肠杆菌E.coli.BL21的培养及rhIL-31的诱导表达
①.挑取含pET-32a/rhIL-31质粒的大肠杆菌E.coli.BL21单菌落各一个，接种于含
100μg/ml 氨苄青霉素的5ml LB 培养基； 37℃ 200r/min培养18～24hrs;
②.次日分别吸取重组菌1ml加入50ml含有相应抗生素的LB液体培养基的锥形瓶中，37℃ 200r/min继续培养至OD600约为0.6左右，分采集1ml菌液于EP管中，剩余菌液加入IPTG至终浓度为1mmol/L，诱导培养18～24h，收集菌液1ml于EP管，12000r/min离心30s后弃上清，沉淀菌体中加入100μl 1×蛋白上样缓冲液，混匀后煮沸5min，4℃保存待用;
③.经Ni-NTA琼脂糖凝胶FF柱对表达蛋白纯化，SDS-PAGE分析蛋白表达情况，采用Bio-Rad图像分析系统测定rhIL-31蛋白;
(2)、rhIL-31免疫原制备
称取羊脂8g，量取石腊油32ml，置高压灭菌器灭菌后用无菌研钵研磨均匀，置4℃冰箱过夜，次日仍均匀粘稠无分层，即成为福氏不完全佐剂;
②.将福氏不完全佐剂放人无菌研钵、按一个方向边研磨边加入卡介苗,以10ml不完全佐剂计，应加卡介苗3～10mg，研磨毕置4℃过夜，如不分层即可使用，此为福氏完全佐剂;
③.将福氏完全佐剂置于研钵内，边研磨边滴加等量rhIL-31,3mg/ml，直至形成白色油包水乳剂，滴加于水中完全不散开即为合格，置于4℃保存备用；
(3)、IL-31多克隆抗体制备
选用2～2.5kg健康家兔，于颈后、两后肢大腿外侧共三个部位皮下各注射IL-31佐剂抗原0.5ml，每只注射IL-31量为1mg；
②.7d后再次同样于颈后、两后肢大腿外侧共三个部位皮下各注射IL-31佐剂抗原
0.5ml，每只注射IL-31量为1mg；21d后、28天后分别于颈后、两后肢大腿外侧共三个部位皮下注射无佐剂IL-31抗原0.5ml；
③.末次注射后第7d试血，双向琼脂扩散试验效价达1∶16～1∶32，ELISA法试验效价达1∶10000～1∶15000放血收集血清，此即兔抗IL-31免疫血清；
④.采用硫酸铵盐析法粗提取兔IL-31抗体IgG：免疫血清10 ml加生理盐水10 ml混合，加入饱和硫酸铵2Xml，缓慢滴加边搅拌边，使硫酸铵饱和度达50％， 4℃，静置3h以上，
3000rpm离心20min，弃上清，沉淀物用生理盐水稀释至Xml，边搅拌边滴加饱和琉酸铵1/2 X ml，使饱和度为33％，4℃静置3h以上，3000rpm离心20min，弃上清；重复沉淀物用生理盐水稀释至Xml，边搅拌边滴加饱和琉酸铵1/2 X ml，使饱和度为33％，4℃静置3h以上，3
000rpm离心20min，弃上清2遍；
最后一次加少许生理盐水溶解沉淀物装入透析袋，置4℃用PBS透析除盐，更换透析液+ 2-
数次直至：奈氏试剂测定无NH4，，1％BaCl2测定无SO4 ，最后测定蛋白含量，置于4℃保存备用。
2.白细胞介素-31单克隆抗体的制备方法，其特征在于：该制备方法的具体步骤如下：
(1).人IL-31及免疫原制备
分析IL-31氨基酸序列，选择合适的抗原表位序列1和序列2，序列1：aa24-39，SHTLPVRLLRPSDDVQC；序列2：aa155-164，CLTSGAQQATT；合成抗原表位序列，合成的抗原表位序列与牛血清白蛋白偶联成免疫原BSA-IL-31多肽；
单克隆抗体制备
①动物免疫：取浓度为0.5mg/ml的BSA-IL-31多肽与等体积的完全弗氏佐剂混合，免疫BALB/c小鼠，0.5ml/只，两周后采用免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂完全混合，加强免疫，尾静脉采血用间接ELISA法检测抗体效价，选择效价较高的小鼠2周后腹腔冲击免疫；
②细胞融合与杂交瘤细胞的筛选：免疫小鼠脾细胞和SP2/0细胞按PEG方法进行融合，置5%CO2 ，37℃培养；于融合后第8天用间接ELISA法对细胞培养上清进行抗体检测，选择抗体效价高的杂交瘤细胞通过有限稀释法进行亚克隆，直至亚克隆后凡是有细胞生长的孔的抗体检测均为阳性，且OD值（A值）相近，将稳定分泌抗体的杂交瘤细胞转至24孔板内扩大培养；
6
③腹水抗体的生产与纯化：将杂交瘤细胞腹腔注射BALB/c小鼠，2×10个/只，7至
10天后小鼠腹部隆起，活体穿刺抽取腹水，Protein A亲和层析法对单克隆抗体进行初步纯化，ELISA法鉴定抗体的效价；
④单克隆抗体效价测定：取已包被抗原BSA-IL-31-多肽的酶标板，加入倍比稀释的抗体，稀释比例依次为1:200、1:1000、1:5000、1:10000、1:20000；同时设阴性和空白对照孔；
酶标仪测定A450nm；
⑤单克隆抗体IgG亚类鉴定：将杂交瘤细胞上清原液加到已包被抗原BSA-IL-31-多肽的酶标板，50μL/孔，37℃孵育1h；加入稀释的IgG分型二抗，50μL/孔，37℃孵育1h；再加入羊抗鼠HRP为1:5000，50μL/孔，37℃孵育1h，最后加TMB显色，酶标仪测定A450nm，高值孔为抗体亚类；
⑥IL-31单克隆抗体特异性鉴定：取人IL-31蛋白进行SDS-PAGE电泳；电泳完毕后，进行转移电泳，将蛋白条带转印到硝酸纤维素膜上；转印结束后，将NC膜放入杂交瘤细胞上清液中，细胞上清液以1:10、1:100、1:500的比例稀释，37 ℃温浴lh，再浸入HRP标记的羊抗鼠IgG溶液中，37℃温浴1h，ECL超敏发光液作用3min，暗室曝光显影。
3.根据权利要求2所述白细胞介素-31抗体的应用，其特征在于：采用过碘酸钠简易法对纯化的单克隆抗体进行HRP 标记和检测。
4.根据权利要求1所述白细胞介素-31抗体的应用，其特征在于：采用兔抗IL-31抗体加保护剂作为外用品对人类特应性皮炎进行治疗或对特应性皮炎、皮肤过敏、皮肤瘙痒进行预防性保健护理。
白细胞介素-31多克隆或单克隆抗体的制备方法及应用
技术领域
背景技术
发明内容
①.挑取含pET-32a/rhIL-31质粒的大肠杆菌E.coli.BL21单菌落各一个，接种于含
100μg/ml 氨苄青霉素的5ml LB 培养基； 37℃ 200r/min培养18～24hrs;
②.次日分别吸取重组菌1ml加入50ml含有相应抗生素的LB液体培养基的锥形瓶中，37℃ 200r/min继续培养至OD600约为0.6左右，分采集1ml菌液于EP管中，剩余菌液加入IPTG至终浓度为1mmol/L，诱导培养18～24h，收集菌液1ml于EP管，12000r/min离心30s后弃上清，沉淀菌体中加入100μl 1×蛋白上样缓冲液，混匀后煮沸5min，4℃保存待用;
③.经Ni-NTA琼脂糖凝胶FF柱对表达蛋白纯化，SDS-PAGE分析蛋白表达情况，采用Bio-Rad图像分析系统测定rhIL-31蛋白;
(2)、rhIL-31免疫原制备
①.称取羊脂8g，量取石腊油32ml，置高压灭菌器灭菌后用无菌研钵研磨均匀，置4℃冰箱过夜，次日仍均匀粘稠无分层，即成为福氏不完全佐剂;
②.将福氏不完全佐剂放人无菌研钵、按一个方向边研磨边加入卡介苗,以10ml不完全佐剂计，应加卡介苗3～10mg，研磨毕置4℃过夜，如不分层即可使用，此为福氏完全佐剂;
③.将福氏完全佐剂置于研钵内，边研磨边滴加等量rhIL-31,3mg/ml，直至形成白色油包水乳剂，滴加于水中完全不散开即为合格，置于4℃保存备用；
(3)、IL-31多克隆抗体制备
①.选用2～2.5kg健康家兔，于颈后、两后肢大腿外侧共三个部位皮下各注射IL-31佐剂抗原0.5ml，每只注射IL-31量为1mg；
②.7d后再次同样于颈后、两后肢大腿外侧共三个部位皮下各注射IL-31佐剂抗原
0.5ml，每只注射IL-31量为1mg；21d后、28天后分别于颈后、两后肢大腿外侧共三个部位皮下注射无佐剂IL-31抗原0.5ml；
③.末次注射后第7d试血，双向琼脂扩散试验效价达1∶16～1∶32,ELISA法试验效价达1∶10000～1∶15000放血收集血清，此即兔抗IL-31免疫血清；
④.采用硫酸铵盐析法粗提取兔IL-31抗体IgG：免疫血清10 ml加生理盐水10 ml混合，加入饱和硫酸铵2Xml，缓慢滴加边搅拌边，使硫酸铵饱和度达50％， 4℃，静置3h以上，
3000rpm离心20min，弃上清，沉淀物用生理盐水稀释至Xml，边搅拌边滴加饱和琉酸铵1/2 X ml，使饱和度为33％，4℃静置3h以上，3000rpm离心20min，弃上清；重复沉淀物用生理盐水稀释至Xml，边搅拌边滴加饱和琉酸铵1/2 X ml，使饱和度为33％，4℃静置3h以上，3
000rpm离心20min，弃上清2遍。最后一次加少许生理盐水溶解沉淀物装入透析袋，置4℃+ 2-
用PBS透析除盐，更换透析液数次直至：奈氏试剂测定无NH4，，1％BaCl2测定无SO4 ，最后测定蛋白含量，置于4℃保存备用。
分析IL-31氨基酸序列，选择合适的抗原表位序列1和序列2，序列1：aa24-39，SHTLPVRLLRPSDDVQC；序列2：aa155-164，CLTSGAQQATT；合成抗原表位序列，合成的抗原表位序列与牛血清白蛋白偶联成免疫原BSA-IL-31多肽；
(2). 单克隆抗体制备
①动物免疫：取浓度为0.5mg/ml的BSA-IL-31多肽与等体积的完全弗氏佐剂混合，免疫BALB/c小鼠，0.5ml/只，两周后采用免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂完全混合，加强免疫，尾静脉采血用间接ELISA法检测抗体效价，选择效价较高的小鼠2周后腹腔冲击免疫；
②细胞融合与杂交瘤细胞的筛选：免疫小鼠脾细胞和SP2/0细胞按PEG方法进行融合，置5%CO2 ，37℃培养；于融合后第8天用间接ELISA法对细胞培养上清进行抗体检测，选择抗体效价高的杂交瘤细胞通过有限稀释法进行亚克隆，直至亚克隆后凡是有细胞生长的孔的抗体检测均为阳性，且OD值（A值）相近，将稳定分泌抗体的杂交瘤细胞转至24孔板内扩大培养；
6
③腹水抗体的生产与纯化：将杂交瘤细胞腹腔注射BALB/c小鼠，2×10个/只，7至
10天后小鼠腹部隆起，活体穿刺抽取腹水，Protein A亲和层析法对单克隆抗体进行初步纯化，ELISA法鉴定抗体的效价；
④单克隆抗体效价测定：取已包被抗原BSA-IL-31-多肽的酶标板，加入倍比稀释的抗体，稀释比例依次为1:200、1:1000、1:5000、1:10000、1:20000；同时设阴性和空白对照孔；
酶标仪测定A450nm。Ｐ/Ｎ［（一定稀释度的纯化抗体A450nm－空白对照A450nm）/（阴性对照A450nm－空白对照A450nm）］≥2.1为阳性，最大稀释度为其效价；
⑤单克隆抗体IgG亚类鉴定：将杂交瘤细胞上清原液加到已包被抗原BSA-IL-31-多肽的酶标板，50μL/孔，37℃孵育1h；加入稀释的IgG分型二抗，50μL/孔，37℃孵育1h；再加入羊抗鼠HRP为1:5000，50μL/孔，37℃孵育1h，最后加TMB显色，酶标仪测定A450nm，高值孔为抗体亚类；
⑥IL-31单克隆抗体特异性鉴定：取人IL-31蛋白进行SDS-PAGE电泳；电泳完毕后，进行转移电泳，将蛋白条带转印到硝酸纤维素（NC）膜上；转印结束后，将NC膜放入杂交瘤细胞上清液中，细胞上清液以1:10、1:100、1:500的比例稀释，37 ℃温浴lh，再浸入HRP标记的羊抗鼠IgG溶液中，37℃温浴1h，ECL超敏发光液作用3min，暗室曝光显影。
具体实施方式
①.挑取含pET-32a/rhIL-31质粒的大肠杆菌E.coli.BL21(DE3)单菌落各一个，接种于含100μg/ml 氨苄青霉素的5ml LB 培养基； 37℃ 200r/min培养18～24hrs。
透析袋，置4℃用PBS透析除盐，更换透析液数次直至：奈氏试剂测定无NH4，（有NH4会出现
2- 2-
砖红色或黄色），1％BaCl2测定无SO4 （有SO4 会出现白色沉淀），最后测定蛋白含量（mg/ml），置4℃保存备用。
IgG抗体效价测定双向琼脂扩散试验效价≥1:16,ELISA试验≥1:10000
下面详细介绍白细胞介素-31单克隆抗体的制备方法，其具体步骤为：
(1).人IL-31及免疫原制备
分析IL-31氨基酸序列，选择合适的抗原表位序列1和序列2，序列1：aa24-39，SHTLPVRLLRPSDDVQC；序列2：aa155-164，CLTSGAQQATT。合成抗原表位序列，合成的抗原表位序列与牛血清白蛋白（BSA）偶联成免疫原BSA-IL-31多肽。
取浓度为0.5mg/ml的BSA-IL-31多肽与等体积的完全弗氏佐剂混合，免疫BALB/c小鼠，0.5ml/只，两周后采用免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂完全混合，加强免疫，尾静脉
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