利用GST表达体系制备的FertilinBeta胞外段高效价抗体及应用
专利汇可以提供利用GST表达体系制备的FertilinBeta胞外段高效价抗体及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 工程 技术领域，涉及利用GST表达体系制备的Fertilin Beta胞外段高效价 抗体 及应用。利用基因工程技术，将Fertilin Beta基因胞外段克隆到原核表达载体中，经酶切鉴定后，用重组质粒转化大肠杆菌，并IPTG诱导产生GST-Fertilin Beta融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清并用ProteinA/G纯化。抗体的效价及特异性采用ELISA和Western blot检测，并应用免疫 荧光 检测了Fertilin Beta蛋白特异性 定位 于精子头后部。该抗Fertilin Beta多克隆抗体效价与特异性良好，可以应用于细胞中Fertilin Beta蛋白的检测并能有效检出Fertilin Beta蛋白特异性定位于精子头后部，对于系统研究Fertilin Beta蛋白功能意义重大。，下面是利用GST表达体系制备的FertilinBeta胞外段高效价抗体及应用专利的具体信息内容。
1.利用GST表达体系制备的Fertilin Beta蛋白胞外段高效价抗体,其特征在于利用GST表达体系以Fertilin Beta蛋白胞外段341-373位氨基酸对应DNA片段作为特异序列制备的GST-Fertilin Beta融合蛋白作为抗原免疫动物产生抗血清而获得，该抗血清中抗GST-FertilinBeta 抗体的滴度高达1: 1000000,并经过 Western blot 鉴定该 FertilinBeta抗体具有较好的特异性，其中，341-373位氨基酸序列为: Glu Ala He His Phe Ser Gly Val Lys He Phe Ser Asn Cys Ser I 6 11 Phe Glu Asp Phe Ala His Phe He Ser Lys Gln Lys Ser Gln Cys 16 21 26 Leu His Asn 31 其对应核苷酸序列为: gaagcaattc atttcagtgg tgtgaagatc tttagtaact gcagcttcga agactttgca 60 cattttattt caaagcagaa gtcccagtgtcttcacaat 99。
2.如权利要求1所述的原核表达GST-Fertilin Beta融合蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于利用GST表达系统获得GST-Fertilin Beta融合蛋白，再经免疫兔获得抗GST-FertilinBeta抗血清,具体包括四步: 第一步，PCR-PMD18-T/Fertilin Beta重组质粒的构建 Fertilin Beta基因全长从Genebank得到，基因序列号为AAC51110.1，以基因组为模板,上游引物为 5’-GM TTC GAA GCA ATT CAT TTC AGT (含EcoRI 酶切位点);下游:5，_CTCGAG ATT GTG AAG ACA C TG GGA (含XhoI酶切位点），扩增得到的片段与pMD18_T载体连接，将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5 α中，在含Amp+琼脂平板上挑选克隆，以碱裂解法小提重组质粒后，以EcoRI和SalI单酶切鉴定； 第二步，原核表达载体PGEX-4T-1的构建 将含有Fertilin Beta基因胞外段341-373氨基酸片段的pMD18_T质粒经EcoRI和XhoI双酶切后，利用回收试剂盒获得Fertilin Beta基因该区片段，同时用相同的酶处理质粒PGEX-4T-1，然后将回收的Fertilin Beta基因胞外段341-373氨基酸片段和经酶切的载体PGEX-4T-1在T4DNA连接酶作用下于16°C连接过夜，酶切鉴定重组体，并且测序进一步确定； 第三步，GST-Fertilin Beta融合蛋白的诱导表达和纯化 重组质粒PGEX-4T-1/Fertilin Beta转化大肠杆菌BL21，挑取单菌落接入LB/Amp+培养基中，37°C振摇培养过夜。次日，将培养物按1: 50的比例转接于含Amp+的LB培养基中，继续在37°C摇床培养至对数生长中期。在培养液的A600为0.5〜0.6时，加入IPTG至终浓度为0.08mmol/L，不加入IPTG者为阴性对照，置25°C继续培养4〜5h。离心收集菌体，以SDS-PAGE进行鉴定GST-Fertilin Beta融合蛋白的表达，并优化表达条件，进行大量扩增诱导。以5000r/min于4°C离心5min，收集菌体，用60mL冰预冷的NETN悬浮IL菌液的沉淀。用超声裂解细菌，再以9600rpm,于4°C离心15min,取上清，过Glutathione_Sepharose4B柱，先以等体积洗脱缓冲液I (含20mM谷胱甘肽、50mM Tris-Cl,pH = 8.0)洗脱，收集洗脱液，再以等体积洗脱缓冲液2 (含IOOmM谷胱甘肽）洗两遍，收集洗脱液，SDS-PAGE鉴定纯化产物； 第四步，兔抗Fertilin Beta抗血清的制备及纯化 以纯化的Fertilin Beta融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔,初次免疫用500 μ g融合蛋白，与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射，免疫前取耳静脉血分离血清，作为免疫前的血清对照，2wk后进行第I次加强免疫，500 μ g纯化的Ferti I in Beta融合蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀，前后四脚掌肌肉注射，之后每隔2wk加强免疫I次，于末次免疫后Iwk取耳血，用ELISA法测定抗体的效价，当抗体效价达到1: 1000000时，颈动脉放血，收集血清，将ProteinA/G sepharose CL-4B填料缓慢装柱,平衡柱子后加入经过稀释的抗血清，控制流速保证抗血清与填料的结合，即亲和层析使抗体结合在柱子上，经2次洗涤后,加pH2.7洗脱缓冲溶液将抗体洗脱，收集洗脱液并测定各收集管的280nm光密度，将含抗体的收集管混合，纯化后的抗体与纯化前的抗血清用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定； 第五步，Fertilin Beta抗体的免疫学检测 用GST-Fertilin Beta融合蛋白免疫前的新西兰大白兔血清作为对照，将纯化后的GST-Fertilin Beta抗体先稀释10倍再倍比稀释后采用间接ELISA方法测定抗体的效价，并采用Western blot方法分析Fertilin Beta抗体特异性，将纯化的融合蛋白GST-FertilinBeta样品，经SDS-PAGE分离后再电转移至硝酸纤维素膜上，以5%脱脂奶粉封闭Ih，依次滴加兔抗Fertilin Beta抗体，室温2h、PBS洗3次，山羊抗兔IgG2HRP，室温反应Ih、PBS洗涤 3次，最后加底物DAB显色，并拍照。
利用GST表达体系制备的Ferti I in Beta胞外段高效价抗体及应用
技术领域
背景技术
发明内容
<120>利用GST表达体系制备的Fertilin Beta胞外段高效价抗体及应用
<160>2
<210>1<2II>99<212>DNA
<213 >人(Homo sapiens)
<400〉I
gaagcaattc atttcagtgg tgtgaagatc tttagtaact gcagcttcga agactttgca 60cattttattt caaagcagaa gtcccagtgt cttcacaat 99
<210>2
<211>33
<212>PRT
<213〉人(Homo sapiens)
<400>2`Glu Ala He His Phe Ser Gly Val Lys He Phe Ser Asn Cys SerI 6 11
Phe GluAsp PheAla His Phe He Ser Lys Gln Lys Ser Gln Cys16 21 26Leu His Asn31
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