技术领域
[0001] 本
发明涉及一种合成百草枯抗原的方法，尤其是提供了应用多克隆
抗体术研制的检测百草枯的直接竞争ELISA
试剂盒，同时还公开了其制备方法，属于酶联免疫技术领域。
背景技术
[0002] 百草枯(paraquat，PQ)，化学名为1，1′-二甲基-4，4′-联吡啶阳离子盐，是一种联吡啶类灭生性
除草剂，广泛应用于园林除草、非耕地化学除草，能杀灭大部分禾本科及阔叶
杂草，绿叶
接触药液数小时后便开始枯死。药液接触
土壤后能被土壤胶体迅速、强烈
吸附，并完全
钝化而不影响作物根部。
[0003] 人百草枯急性中毒后
肺毛细血管损伤、肺泡性肺
水肿，最后是肺
纤维化急性爆发性百草枯中毒(＞40ml)患者很快发生多器官衰竭，死亡率高达100％；中重度中毒(20～40ml)可导致急性肾功能衰竭，重度中毒还可并发肺纤维化及中毒性
肝炎，并多于中毒后
2～3周死亡；而轻度中毒者(＜20ml)多表现为
口腔及胃肠道粘膜灼伤，症状有恶心、呕吐、腹泻、肠胃，多数可以痊愈。
[0004] 国外早在上世纪70年代就开始对百草枯的检测方法进行研究，近年来在这方面的研究工作取得了较快的进展。高灵敏度的仪器分析法和快速有效的免疫分析法正逐渐被应用于百草枯的检测。国内起步较晚，而且对于食品中百草枯的快速检测未受到足够的重视。国内起步较晚，而且对于百草枯的快速检测未受到足够的重视。目前已有的测定方法可概括为三类：活
生物体分析法、仪器分析法、免疫化学分析法。生物体分析法是从自然界筛选对生长环境中有毒化合物敏感的物种，作为环境监测的工具。Rioboo等用
淡水微藻C.Moewusii和C.Vulgaris检测水中百草枯和乙丙隆。最低检测浓度定为使生长率降低50％的浓度(EC50)，百草枯对C.Moewusii的EC50为0.28μmol/L，乙丙隆对C.Vulgaris的EC50为0.15μmol/L。用于测试的生物一般生活周期短，容易操作，检测成本低。可考虑作为一种在
基层应用的大面积生态环境监测手段。Khan SU利用气相色谱(GC)检测莴苣、萝卜和洋葱中的百草枯，用5M H2SO4提取样品中的PQ并对提取物催化加氢，然后进行
氧化
铝柱纯化后进行GC检测。加标0.5、0.1和0.05ppm时，回收率在75～86％，绝对误差最高为4％，最低检出限在0.05ppm左右。液相色谱适用于检测热
稳定性差，极性强、分子量大、不易挥发的化合物及离子型化合物。百草枯是一种极性很强的离子型化合物，比较适合用HPLC进行分析。自20世纪80年代以来，液相色谱法占据了主导地位，并与质谱联用，广泛应用于
水体、人
血浆和血清等生物检材中百草枯的检测。有学者直接采用紫外分光光度法进行测定，检出限为0.01 μg/mL，回收率为90.0％～102.4％，操作简便快速，适合于临床上肝中百草枯浓度的测定。Masafumi Tomita利用毛细管
电泳同时检测血清中的对草快(PQ)和
敌草快(DQ)，检测灵敏度为0.05μg/mL。此后十多年，许多国外学者将毛细管电泳用于血清、水等样品中百草枯的检测。由于百草枯的沸点比较高，极性强，需要对样品进行特殊的衍生或裂解处理后才能进行检测，操作比较复杂，用气相色谱分析比较困难。因此，利用GC进行检测的报道较少。薄层层析法可利用特殊的
显色剂观察斑点
颜色和利用Rf值来定性，其测定准确性较差，检测灵敏度不高，因此只能用于半定量分析。
[0005] 免疫分析是以抗原与抗体的特异性结合为
基础，其原理是利用生物分子识别，灵敏度高，特异性强，故在临床医学上有极其重要的地位。酶联免疫法(Enzyme Immunoassay，EIA)是将抗原、抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的一种免疫分析方法。酶免疫法的检测原理与放射免疫法类似，通过测定结合于固相的酶的活
力来测定被测定物的量。用作标记物的酶有辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)和
碱性
磷酸酶(Alkaline Phosphatase)。酶标试剂制备容易、稳定、价廉。酶免疫分析的灵敏度接近放射免疫技术，而可借助于简单的仪器作定量测定，是目前
农药监测中应用最广泛的免疫分析技术。
[0006] 本发明的百草枯的ELISA检测试剂盒避免了现有检测手段存在的问题，相比较其他的检测手段，建立的百草枯ELISA试剂盒检测方法具有特异性强、敏感度高、检测周期短、操作简单方便，可大量生产等的特点。
发明内容
[0007] 本发明公开一种合成百草枯抗原的方法，可用于制备多克隆抗体。
[0008] 本发明还提供了应用多克隆抗体检测百草枯的直接竞争ELISA检测试剂盒的制备方法，适合工厂化生产。
[0009] 本发明公开的人工合成百草枯抗原是通过以下方法得到的：
[0010] 免疫抗原PQ-h-BSA的制备：43mgBSA溶于3ml水中，用0.1M的NaOH调pH至9.0。9mgN-甲基-N′-戊酸基-二吡啶阳
离子化合物(PQ-h)溶于500μl二噁烷中，进行超声处理。加入无水三正丁胺15μl，将此混合物在12℃
冰浴中冷却，并搅拌15min。加入重蒸的氯
甲酸异丁酯8μl，15℃以下搅拌30min。将搅拌后的PQ-h溶液逐滴加入到溶解的蛋白中，并于4℃轻微搅拌4h，整个过程维持pH在9.0。然后，将混合物于4℃在0.1M的PBS中
透析72h， 每隔6h换
透析液一次。
冷冻干燥后于-20℃保存。
[0011] 包被抗原PQ-h-OVA的制备：28mg OVA溶于3ml水中，用0.1M的NaOH调pH至9.0。9mgN-甲基-N′-戊酸基-二吡啶阳离子化合物(PQ-h)溶于500μl二噁烷中，进行超声处理。 加入无水三正丁胺15μl，将此混合物在12℃冰浴中冷却，并搅拌15min。加入重蒸的氯甲酸异丁酯8μl，15℃以下搅拌30min。将搅拌后的PQ-h溶液逐滴加入到溶解的OVA中，并于4℃轻微搅拌4h，整个过程维持pH在9.0。然后，将混合物于4℃在0.1M的PBS中透析72h， 每隔6h换透析液一次。冷冻干燥后于-20℃保存。
[0012] N-甲基-N′-戊酸基-二吡啶阳离子化合物(PQ-h)的合成方法：
[0013] 4，4-联吡啶和碘甲烷(CH3I)以摩尔比1.05∶1在无水丙
酮中反应，4℃，磁力搅拌，于密闭三颈圆底烧瓶通氮气保护下在暗处反应。反应混合物完全加入后，低温(4℃左右)搅拌过夜。过滤，用无水丙酮洗涤，抽干，得产品N-甲基-二吡啶阳离子化合物(MQ)，
真空干燥，得黄色针状结晶，然后存放于真空干燥器中。将得到的MQ和5-溴戊酸乙酯以摩尔比1∶2混合，120℃油浴，磁力搅拌，在新鲜蒸馏的无水二甲基甲酰胺(DMF)中回流5h，然后室温放置过夜。抽滤，用无水DMF洗涤，真空干燥，得黄色片状结晶N-甲基-N′-戊酸乙酯基-二吡啶阳离子化合物，存放于真空干燥器中。将得到的N-甲基-N′-戊酸乙酯基-二吡啶阳离子化合物与适量浓HCl混合，加热回流3h左右。在旋转
蒸发器上蒸去过量的酸和水，保持水浴
温度不超过60℃，蒸干，得固体残留物。冷却后，加入少量丙酮结晶(析出白色晶体)，过滤，抽干，真空干燥，得粗品，再经95％
乙醇重结晶，真空干燥，得到高纯度N-甲基-N′-戊酸基-二吡啶阳离子化合物。
[0014] 本发明还提供了一种ELISA检测试剂盒，具体而言其组成如下：
[0015] 百草枯酶标物、百草枯标准液、包被百草枯多克隆抗体的酶标板、底物显色液、洗涤液、终止液、酶标物稀释液及样品稀释液等。
[0016] 所述多克隆抗体为以百草枯为半抗原，通过上诉方法合成全抗原，并通过新西兰大白兔免疫制备，具体方法如下：
[0017] 1、抗血清制备
[0018] 免疫前一周从
耳缘静脉
采血作阴性对照。称取1mg PQ-h-BSA，用5mL 0.1mol/L的PBS(经高压灭菌)溶解，然后取0.5mL溶解的抗原与0.5mL完全福氏佐剂充分混合，乳化后供首次免疫用。初次免疫在新西兰大白兔背部进行多点皮下注射，1mL/只。一个月后进行第一次加强免疫，采用四肢内部肌肉注射，剂量与首次免疫相同，与等量不完全福氏佐剂混合充分乳化。共加强免疫4次，每次间隔2周。最后2次加强免疫前从兔耳静脉采血，采用间接ELISA法测定抗血清的效价。效价合格后，兔颈动脉
放血，将采集的血液于室温下静置，待血液凝集后放入37℃保温箱静置1h，4℃静置过夜后，4℃、3000rpm离心20min后，得上清液即为抗血清。每只兔子的血清量大约在35mL。
[0019] 2、抗血清纯化
[0021] 1)取10mL血清于50mL离心管中，加10mL pH 7.0PBS，于冰上轻轻振荡下逐滴加入4℃预冷的饱和硫酸铵20mL，于4℃
冰箱中静置过夜，此时硫酸铵的终浓度为50％。
[0022] 2)于4℃4000r/min离心25min，弃上清，以6mL pH 7.0PBS溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵4mL，4℃静置1h，此时硫酸铵的终
饱和度为40％。
[0023] 3)重复步骤2)离心，用6.7mLpH 7.0PBS溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵3.3mL，4℃静置1h，此时硫酸铵的终饱和度为33％。
[0024] 4)重复步骤2)离心，沉淀用6mL PBS溶解，装入透析袋中。
[0025] 5)于4℃冰箱中，对20倍以上的PBS透析，期间换液数次，直至用
萘氏试剂检测透析液无黄色为止。
[0026] 6)将透析好的溶液冷冻干燥后分装，于-20℃保存备用。
[0027] 3、间接竞争标准曲线的制作
[0028] 1)取酶标板，以最佳包被浓度的PQ-h-OVA稀释液进行包被，100μL/孔，4℃冰箱保存过夜。
[0029] 2)洗液洗涤1次，每次2min，拍干。
[0030] 3)以含3％BSA-PBS溶液封闭，200μL/孔，37℃温育1.5h。
[0031] 4)洗液洗涤3次，每次1min，拍干。
[0032] 5)加入0ng/mL，0.001ng/mL，0.01ng/mL，0.1ng/mL，0.5ng/mL，1ng/mL，2.5ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL的PQ标准品，50μL/孔；再加入最佳稀释度的抗体，50μL/孔，不设置平行，37℃温育1h。
[0033] 6)洗液洗涤3次，每次3min，拍干。
[0034] 7)加入1∶5000稀释的酶标二抗(羊抗兔IgG-HRP)，100μL/孔，37℃温育0.5h。
[0035] 8)洗涤后拍干，加入显色液，100μL/孔，暗处反应15min。
[0036] 9)加终止液(2mol·L-1硫酸)，50μL/孔。
[0037] 10)酶标仪上测定450nm吸光值。
[0038] 以B/B0为纵坐标，以100倍的标准溶液浓度的对数值为横坐标在EXCEL上作图，即得PQ的竞争标准曲线。对标准曲线的范围进行截取，并拟合标准曲线方程。
[0039] 所述百草枯酶标物：辣根过
氧化酶；底物显色液：A液(0.1mol/L
柠檬酸水溶液)：柠檬酸21.01g，双蒸水定容至1000mL；B液(0.2mol/LNa2HPO4)：71.6g Na2HPO4·12H2O， 双蒸水溶解后，定容至1000mL，保存备用。使用时，24.3mLA液与25.7mLB液混合，加入50mL双蒸水及30％H2O218.3μL；洗涤液：含0.05％Tween-20的PBS溶液；终止液：2mol·L-1的H2SO4溶液；抗原稀释液：0.05M、pH9.6的Na2CO3-NaHCO3缓冲液(CBS)：0.315g Na2CO3，
0.588g NaHCO3，加100ml超纯水溶解；抗体稀释液：0.01mol/L、pH7.4
磷酸盐缓冲液(PBS，含1％BSA)：3.0g Na2HPO4.12H2O，0.25g NaH2PO4·2H2O，8.7g NaCl，10g BSA，1L超纯水。
[0040] 另一方面，本发明还提供了检测样品中百草枯含量的方法，步骤如下：
[0041] (1)样品前处理
[0042] (2)用
权利要求2所述的ELISA检测试剂盒检测，向包被百草枯多克隆的酶标板孔加入标准品或样品溶液，加入百草枯酶标物，孵育30分钟，洗涤液洗涤，加入显色液孵育20分钟，终止液终止反应，用酶标仪测定吸光度值。
[0043] (3)分析检测结果
[0044] 本
发明人工合成百草枯完全抗原的原理为：
[0045] 以4，4’-联吡啶和碘甲烷为起始原料，通氮气保护下于暗处经三步反应合成了百草枯半抗原；混合酸酐法偶联大分子蛋白载体
牛血清
白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)制备免疫抗原和包被抗原。
[0046] 本发明试剂盒的检测原理为：
[0047] 将抗百草枯的多克隆抗体包被与固相载体上，加入样本或百草枯标准品溶液并加入百草枯酶标物，待检样品中的百草枯与百草枯酶标物竞争包被于固相载体上的多克隆抗体，通过洗涤除去未结合的百草枯酶标物，加入显色液显色后终止反应，检测样品吸光度值，该值与样品中百草枯的量呈负相关，与标准曲线比较即可测定样品中百草枯的浓度。
[0048] 本发明的积极效果在于：
[0049] 本发明公开一种新的合成百草枯抗原的方法，为制备单克隆抗体或多克隆抗体奠定了基础；并首次应用多克隆抗体建立了一种检测百草枯的直接竞争ELISA试剂盒，可定性或定量分析样品中的百草枯，适合工厂化生产。本发明的试剂盒缩短了检测时间，对样品的前处理要求低，处理过程简单，并配备了相关的样品处理试剂，能够同时迅速检测大批样品。
[0050] 本发明的试剂盒所有试剂均为配置好的工作液，可以直接操作无需处理，减少了操作步骤，可以快速，灵敏检测大豆中的百草枯，避免了复杂的操作，对设备要求低，可以适应多种检测环境，以及多种检测需要；并且本发明的试剂盒样本用量小，试剂保存时间长，自动化程度高，对操作者无毒性，对环境无污染等；因此本发明应用多克隆抗体建立的ELISA检 测试剂盒具有重大的社会意义和广阔的市场前景。
附图说明
[0051] 图1百草枯抑制曲线
[0052] 图2百草枯的分子结构式
具体实施方式
[0054] 1、百草枯半抗原的合成：
[0055] 百草枯的分子结构式如图2，本实验以4,4’-联吡啶和碘甲烷为起始原料，合成了N-甲基-N′-戊酸基-二吡啶二溴化物（简称PQ-h），用于制备百草枯的人工抗原。其合成反应分三步完成。
[0056] 1)N-甲基-二吡啶阳离子化合物——Monoquat(MQ)的合成
[0057] 4，4-联吡啶和碘甲烷(CH3I)以摩尔比1.05∶1在无水丙酮中反应，4℃，磁力搅拌，于密闭三颈圆底烧瓶通氮气保护下在暗处反应。反应混合物完全加入后，低温(4℃左右)搅拌过夜。过滤，用无水丙酮洗涤，抽干，得产品MQ，真空干燥，得黄色针状结晶，然后存放于真空干燥器中。经计算产物得率约为86％。
[0058] 2)N-甲基-N′-戊酸乙酯基-二吡啶阳离子化合物的合成
[0059] 第一步反应得到的MQ和5-溴戊酸乙酯以摩尔比1∶2混合，120℃油浴，磁力搅拌，在新鲜蒸馏的无水二甲基甲酰胺(DMF)中回流5h，然后室温放置过夜。抽滤，用无水DMF洗涤，真空干燥，得黄色片状结晶，存放于真空干燥器中。经计算得率为57％。
[0060] 3)N-甲基-N′-戊酸基-二吡啶阳离子化合物(PQ-h)的合成
[0061] 将第二步得到的N-甲基-N′-戊酸乙酯基-二吡啶阳离子化合物与适量浓HCl混合，加热回流3h左右。在
旋转蒸发器上蒸去过量的酸和水，保持水浴温度不超过60℃，蒸干，得固体残留物。冷却后，加入少量丙酮结晶(析出白色晶体)，过滤，抽干，真空干燥，得粗品，再经95％乙醇重结晶，真空干燥。经计算得率为69％。
[0062] 2、半抗原-
蛋白质连接物的制备——混合酸酐法
[0063] 1)9mgPQ-h溶于500μl二噁烷中，进行超声处理。加入无水三正丁胺15μl，将此混合物在12℃冰浴中冷却，并搅拌15min。加入重蒸的氯甲酸异丁酯8μl，15℃以下搅拌30min。
[0064] 2)43mg BSA溶于3ml水中，用0.1M的NaOH调pH至9.0。将上述PQ-h溶液逐滴加入到溶解的蛋白中，并于4℃轻微搅拌4h，整个过程维持pH在9.0。然后，将混合物于4℃在0.1M的PBS中透析72h，每隔6h换透析液一次。冷冻干燥后于-20℃保存。用同样的方法 合成包被抗原PQ-h-OVA。
[0065] 实施例2百草枯特异性多克隆抗体的制备
[0066] 用实施例1方法制备的抗原作为免疫原，取雄性新西兰大白兔2只，健康，体重1.5～2kg。免疫前一周从耳缘静脉采血作阴性对照。称取1mg PQ-h-BSA，用5mL 0.1mol/L的PBS(经高压灭菌)溶解，然后取0.5mL溶解的抗原与0.5mL完全福氏佐剂充分混合，乳化后供首次免疫用。初次免疫在新西兰大白兔背部进行多点皮下注射，1mL/只。一个月后进行第一次加强免疫，采用四肢内部肌肉注射，剂量与首次免疫相同，与等量不完全福氏佐剂混合充分乳化。共加强免疫4次，每次间隔2周。具体免疫程序见表1。最后2次加强免疫前从兔耳静脉采血，采用间接ELISA法测定抗血清的效价。效价合格后，兔颈动脉放血，将采集的血液于室温下静置，待血液凝集后放入37℃保温箱静置1h，4℃静置过夜后，4℃、
3000rpm离心20min后，得上清液即为抗血清。每只兔子的血清量大约在35mL。
[0067] 表1实验动物免疫程序
[0068]
[0069] 采用饱和硫酸铵盐析法纯化抗体，具体步骤如下
[0070] 1)取10mL血清于50mL离心管中，加10mL pH 7.0PBS，于冰上轻轻振荡下逐滴加入4℃预冷的饱和硫酸铵20mL，于4℃冰箱中静置过夜，此时硫酸铵的终浓度为50％。
[0071] 2)于4℃4000r/min离心25min，弃上清，以6mL pH 7.0PBS溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵4mL，4℃静置1h，此时硫酸铵的终饱和度为40％。
[0072] 3)重复步骤2)离心，用6.7mLpH 7.0PBS溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵3.3mL，4℃静置1h，此时硫酸铵的终饱和度为33％。
[0073] 4)重复步骤2)离心，沉淀用6mL PBS溶解，装入透析袋中。
[0074] 5)于4℃冰箱中，对20倍以上的PBS透析，期间换液数次，直至用萘氏试剂检测透析液无黄色为止。
[0075] 6)将透析好的溶液冷冻干燥后分装，于-20℃保存备用。
[0076] 实施例3百草枯酶标物制备
[0077] 酶标抗原中的酶可为辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)，优选为HRP，HRP-百草枯标记物采用过碘酸钠法制备，具体如下：
[0078] 1.称取10mgHRP溶解于1mL蒸馏水中。
[0079] 2.于上液中加入0.2mL新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。
[0080] 3.将上述溶液装入透析袋中，1mM pH4.4的
醋酸钠缓冲液4℃透析过夜。
[0081] 4.加20μL0.2M pH9.5
碳酸盐缓冲液，使以上
醛化HRP的pH升高到9.0-9.5。
[0082] 5.0.5mg半抗原溶于1mL0.01M碳酸盐缓冲液中，分为两份，加入到醛化的HRP中，室温下避光轻轻搅拌2小时。
[0083] 6.加0.1mL新配的4mg/mLNaBH4液，混匀，再置4℃2小时。
[0084] 7.将上述液转入透析袋中，对0.15MpH7.4PBS透析，4℃过夜。
[0085] 8.在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。
[0086] 9.3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗两次，最后沉淀物溶于少量0.15M pH7.4的PBS中。
[0087] 10.将上诉溶液装入透析袋中，对0.15M pH7.4的PBS缓冲液透析，去除铵离子后，10000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，加入等量50％甘油，小量分装，4℃或-20℃保存。
[0088] 实施例4直接竞争ELISA方法的建立
[0089] 1.多抗最佳包被浓度和抗体最佳稀释浓度的确定
[0090] 1.棋盘试验粗筛：
[0091] PQ标准品浓度分别为：0ng/mL、50ng/mL、500ng/mL；
[0092] 包被抗原浓度分别为0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL；
[0093] 抗体稀释度分别为1∶2×103、1∶2×104、1∶2×105。
[0094] 棋盘试验数据如表2，由表2可以计算出不同抗原/抗体浓度组合所对应的抑制率，见表3。
[0095] 表2棋盘试验结果
[0096]
[0097] 表3各种组合得出的抑制率
[0098]
[0099] 由表4可以看出，抑制率相对较高的抗原/抗体浓度组合为0.1μg/mL+1∶1∶2×103、0.1μg/mL+1∶2×105、和1μg/mL+1∶2×104，但是结合表4-1，0.1μg/mL+1∶2×105这个组合虽然抑制率高，但是OD数值太低，可信度不高；所以决定选取抗原浓度在0.1～1μg/mL之间，抗体稀释度在1∶2×103～1∶2×104之间，继续做棋盘实验，将各个浓度细化。
[0100] 2、棋盘实验第二步筛选：
[0101] PQ标准品浓度分别为0ng/mL、50ng/mL、500ng/mL；
[0102] 抗原浓度分别为0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL；
[0103] 抗体稀释度分别为1∶5000、1∶10000、1∶20000、1∶40000。
[0104] 棋盘试验数据如表4，由表4可以计算出不同抗原/抗体浓度组合所对应的抑制率，见表5。
[0105] 表4棋盘试验结果
[0106]
[0107]
[0108] 表5各种组合得出的抑制率
[0109]
[0110] 由表4和表5可以初步判断，抗原浓度在0.2μg/mL～0.5μg/mL之间，抗体稀释度在1∶5000～1∶10000之间比较好，因为这之间数值适宜，抑制率处于正常范围内，而且抗原浓度尽量越低越好。
[0111] 3、棋盘实验第三步筛选：
[0112] 标准品浓度分别为0ng/mL、0.001ng/mL、0.01ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL；
[0113] 抗原浓度分别为0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL；
[0114] 抗体稀释度分别为1∶5000、1∶10000。
[0115] 棋盘试验数据如表6，由表6可以计算出不同抗原/抗体浓度组合所对应的抑制率，见表7。
[0116] 表6棋盘试验结果
[0117]
[0118]
[0119] 表7各种组合得出的抑制率
[0120]
[0121] 经过多次的棋盘试验，最终确立最适包被抗原浓度为0.3μg/mL，抗体最佳稀释度为1∶5000。
[0122] 2.半数抑制浓度IC50及灵敏度的确定
[0123] 以R值接近50％时的混合溶液中的PQ标准浓度作为IC50，本实验中，当PQ浓度为5ng/mL时，R值为49.2％，相对其它R值，49.2％最接近50％。初步确定本实验方法的抑制浓度IC50为5ng/mL；经回归方程Y＝-0.1853X+0.9998(R2＝0.9992)计算，得IC50为4.74ng/mL。
[0124] 按icELISA方法测定了10份2号兔抗血清的平行阴性孔的吸光度A阴，数据如表8。分别计算A阴平均值和相对标准偏差SD，通过计算A阴-2SD＝1.549-2×0.167＝1.215，根据线性回归方程：Y＝-0.1853X+0.9998(R2＝0.9992)计算，可以得到2号兔抗血清ELISA检测方法的灵敏度为0.63ng/mL。
[0125] 表8灵敏度测定的数据
[0126]
[0127] 实施例5检测百草枯直接竞争ELISA试剂盒的组建
[0128] ELISA检测试剂盒包括以下组建：
[0129] 百草枯酶标物：辣根过氧化酶；
[0130] 底物显色液：A液(0.1mol/L柠檬酸水溶液)：柠檬酸21.01g，双蒸水定容至1000mL；B液(0.2mol/L Na2HPO4)：71.6g Na2HPO4·12H2O，双蒸水溶解后，定容至1000mL，保存备用。使用时，24.3mLA液与25.7mLB液混合，加入50mL双蒸水及30％H2O218.3μL；
[0131] 洗涤液：含0.05％Tween-20的PBST溶液；
[0132] 终止液：2mol·L-1的H2SO4溶液；
[0133] 抗原稀释液：0.05M、pH9.6的Na2CO3-NaHCO3；
[0134] 缓冲液(CBS)：0.315gNa2CO3，0.588gNaHCO3，加100ml超纯水溶解；
[0135] 包 被缓 冲 液(0.05mol·L-1，pH 9.6 的碳 酸 盐 缓 冲 液)：0.315gNa2CO3，0.588gNaHCO3，加超纯水至100mL；
[0136] PBS(0.01mol·L-1，pH 7.4的磷酸盐缓冲液)：8.7g NaCl，0.25g Na H2PO4，3.0gNa2HPO4·12H2O，溶于800mL超纯水中，加热搅拌，待全部溶解后，加超纯水至1000mL。
[0137] 实施例6样品中百草枯的残留检测
[0138] 1.样品前处理
[0139] 将大豆样品用
粉碎机粉碎，分别称取4.0g粉碎试样，置于15ml离心管中，分别加入50ng/mL、500ng/mL、2000ng/mL百草枯标准品及标准品稀释液各4.0ml，每个浓度平行做3次。使样品中百草枯浓度分别为0.05mg/kg、0.5mg/kg、2mg/kg和0mg/kg。混合均匀，
超声波提取20min，然后于离心15min，取上清液，用于ELISA试剂盒检测。
[0140] 2.试剂盒检测
[0141] (1)将向包被百草枯多克隆抗体的酶标板中加入50μL样品或百草枯标准溶液，并加入50μL百草枯酶标物；
[0142] (2)轻轻震荡30秒，室温反应30分钟；
[0143] (3)洗涤：倾去孔内的液体，用洗涤液注满各孔(约300μL)，然后倒掉洗涤液，反复3次，最后一次在吸水纸上拍干。
[0144] (4)加入50μL百草枯酶标物，37℃反应20分钟；
[0145] (5)加50μL终止液终止反应；
[0146] (6)用酶标仪读出OD450nm值。
[0147] 3.结果分析：
[0148] 绘制标准曲线，相对应每个样品中百草枯的含量可以从标准曲线上读出，也可以用回归方程计算出样品中百草枯的含量。测得的吸光度与样品中的百草枯含量成反比，可通过标准曲线计算百草枯的含量。
