1.技术领域

本发明涉及采集胎盘干细胞，例如通过灌注或物理和/或酶破碎胎盘或 其部分来采集胎盘干细胞的改良方法和组合物，以及使用该组合物采集干 细胞的方法。本发明所公开的组合物包含生理学上可接受的水溶液如盐溶 液、一种或多种蛋白酶和一种或多种JNK抑制剂(c-Jun-N-末端激酶)。任选 地，该组合物可进一步包含调节(例如抑制)TNF-α的化合物、免疫调节化合 物、血管舒张剂、坏死抑制剂、携氧全氟化碳或前述物质的任意组合。本 发明提供了使用组合物采集和保存干细胞和干细胞群的方法。

2.背景技术

人干细胞是能够生成各种成熟人细胞系的全能或多能前体细胞。有证 据显示干细胞可用于扩增许多(如非全部)组织并恢复生理和解剖功能。

已经鉴定出了许多不同类型的哺乳动物干细胞。例如，参见Caplan等 人，美国专利5,486,359(人间充质干细胞)；Hu等人，WO00/73421(人羊膜 上皮细胞的分离、低温保存和治疗性使用方法)；Beltrami等人， Cell114(6)：763-766(2003)(心脏干细胞)；Forbes等人， J.Pathol.197(4)：510-518(2002)(肝干细胞)。母系脐带血和来自于脐带血的总 有核细胞已被用于移植中以部分或完全地恢复接受去除治疗的患者的造血 功能。

胎盘是特别引人关注的干细胞来源。例如，参见Hariri，美国专利申请 公开号2002/0123141和2003/0032179。尽管胎盘较容易获得，但仍需要最 大化从每个胎盘获得的干细胞的数量。与其它类型的细胞类似，干细胞也 对采集和贮存过程中带来的环境变化敏感。这些变化可引起干细胞的凋亡 或坏死。因此需要改良的组合物以及从产后哺乳动物胚胎采集胎盘干细胞， 从而由单个胎盘回收更多数量的干细胞。

3.发明概述

本发明提供了用于灌注和保存器官(例如，胎盘)从而促进干细胞回收的 改良方法和组合物，以及使用该组合物采集干细胞的方法。

在一种实施方式中，本发明提供了分离干细胞的方法，其包括将所述 干细胞与包含凋亡抑制剂的溶液相接触，和分离所述干细胞。在另一实施 方式中，本发明提供了分离干细胞的方法，其包括将该干细胞与包含坏死 抑制剂的溶液相接触，和分离所述干细胞。

在上述任一实施方式的特定实施方式中，所述的凋亡抑制剂为半胱氨 酸蛋白酶抑制剂。在另一特定实施方式中，所述的凋亡抑制剂为c-JunN-末 端激酶(JNK)抑制剂。在一个更特定的实施方式中，在所述分离前所述JNK 抑制剂不调节所述干细胞的分化或增殖。在另一特定实施方式中，该方法 还包括将所述干细胞与抑制坏死的化合物相接触。在另一特定实施方式中， 所述的干细胞从哺乳动物胎盘、脐带、胎盘血或脐带血分离得到。在另一 特定实施方式中，该方法还包括将所述干细胞与携氧全氟化碳相接触。在 另一特定实施方式中，该方法还包括将所述干细胞与蛋白酶相接触。在更 特定的实施方式中，所述蛋白酶为基质金属蛋白酶或中性蛋白酶。在更特 定的实施方式中，所述基质金属蛋白酶为胶原酶。在另一特定实施方式中， 所述的中性蛋白酶为嗜热菌蛋白酶或分散酶。在另一特定实施方式中，该 方法还包括将所述干细胞与粘多糖酶相接触。在更特定的实施方式中，所 述粘多糖酶为透明质酸酶。在本方法的另一特定实施方式中，所述溶液为 盐溶液或培养基。在另一特定实施方式中，所述的溶液还包含羟乙基淀粉、 乳糖酸阴离子以及棉子糖。在另一特定实施方式中，所述溶液包含UW溶 液。

在另一特定实施方式中，所述干细胞通过物理破碎，包括酶消化所述 组织而从该组织分离得到。在另一更特定实施方式中，所述的干细胞通过 酶消化至少部分胎盘而从该胎盘分离得到。

在另一特定实施方式中，所述的哺乳动物胎盘在所述物理破碎前被放 血。在另一特定实施方式中，所述的干细胞由所述哺乳动物胎盘分离得到， 且可通过使用灌注溶液灌注所述哺乳动物胎盘进行所述分离。在更特定的 实施方式中，可通过使用灌注溶液灌注所述哺乳动物胎盘进行所述灌注， 且灌注的量和时间足以从所述哺乳动物胎盘采集可检测数量的干细胞。在 更特定的实施方式中，所述的哺乳动物胎盘在所述灌注前被放血。在更特 定的实施方式中，可通过将所述灌注液流过所述胎盘的脐动脉或脐静脉或 同时流过两者进行所述灌注。在另一更特定的实施方式中，所述的灌注溶 液包含0.9％NaCl溶液或磷酸盐缓冲液。在另一更特定的实施方式中，所述 的灌注采用约500mL至约2000mL的所述灌注液，或约750mL的所述灌注 液。在另一更特定的实施方式中，所述的灌注可进行多次。

在另一特定的实施方式中，其中所述干细胞在分娩后暴露于缺氧条件 少于72小时，其中所述的缺氧条件为低于正常血氧浓度的氧浓度。在更特 定的实施方式中，所述的干细胞暴露于所述缺氧条件少于48小时。在另一 更特定的实施方式中，所述的干细胞暴露于所述缺氧条件少于24小时。在 另一更特定的实施方式中，所述的干细胞暴露于所述缺氧条件少于6小时。 在另一更特定的实施方式中，所述的干细胞不暴露至缺氧条件。

在另一特定的实施方式中，所述干细胞在所述分离中未暴露至剪切应 力。

在另一特定的实施方式中，所述的JNK抑制剂为吲唑。在另一特定的 实施方式中，所述JNK抑制剂具有如下结构：

其中：

A为直接的键、-(CH2)a、-(CH2)bCH＝CH(CH2)c-或-(CH2)bC≡C(CH2)c-；

R1为芳基、杂芳基或与苯基结合的杂环，其各自任选地被独立地选自 R3的一至四个取代基取代；

R2为-R3、-R4、-(CH2)bC(＝O)R5、-(CH2)bC(＝O)OR5、-(CH2)bC(＝O)NR5R6、 -(CH2)bC(＝O)NR5(CH2)cC(＝O)R6、-(CH2)bNR5C(＝O)R6、 -(CH2)bNR5C(＝O)NR6R7、-(CH2)bNR5R6、-(CH2)bOR5、-(CH2)bSOdR5或 -(CH2)bSO2NR5R6；

a为1、2、3、4、5或6；

b和c相同或不同，并在各情况下独立地选自0、1、2、3或4；

d在各情况下为0、1或2；

R3在各情况下独立地选自卤素、羟基、羧基、烷基、烷氧基、卤烷基、 酰氧基、硫烷基、亚磺酰烷基、磺酰烷基、羟烷基、芳基、芳烷基、杂环、 杂环烷基、-C(＝O)OR8、-OC(＝O)R8、-C(＝O)NR8R9、-C(＝O)NR8OR9、 -SO2NR8R9、-NR8SO2R9、-CN、-NO2、-NR8R9、-NR8C(＝O)R9、 -NR8C(＝O)(CH2)bOR9、-NR8C(＝O)(CH2)bR9、-O(CH2)bNR8R9、或与苯基结合 的杂环；

R4为烷基、芳基、芳烷基、杂环或杂环烷基，其各自任选地被独立地 选自R3的一至四个取代基取代，或者R4为卤素或羟基；

R5、R6和R7相同或不同，并在各情况下独立地为氢、烷基、芳基、芳 烷基、杂环或杂环烷基，其中R5、R6和R7各自任选地被独立地选自R3的 一至四个取代基取代；且

R8和R9相同或不同，并在各情况下独立地为氢、烷基、芳基、芳烷基、 杂环或杂环烷基，或R8和R9与它们连接的原子一起形成杂环，其中一起形 成杂环的R8、R9以及R8和R9各自任选地被独立地选自R3的一至四个取代 基取代。

在另一特定的实施方式中，所述JNK抑制剂具有如下结构：

其中：

R1为任选地被独立地选自R7的一至四个取代基取代的芳基或杂芳基；

R2为氢；

R3为氢或低级烷基；

R4代表一至四个任选取代基，其中各取代基相同或不同，且独立地选 自卤素、羟基、低级烷基和低级烷氧基；

R5和R6相同或不同，且独立地选自-R8、(CH2)aC(＝O)R9、 -(CH2)aC(＝O)OR9、-(CH2)aC(O)NR9R10、(CH2)aC(＝O)NR9(CH2)bC(＝O)R10、 -(CH2)aNR9C(＝O)R10、(CH2)aNR11C(＝O)NR9R10、-(CH2)aNR9R10、-(CH2)aOR9、 -(CH2)aSOcR9或-(CH2)aSO2NR9R10；

或R5和R6与它们相连的氮原子一起形成杂环或取代杂环；

R7在各情况下独立地为卤素、羟基、氰基、硝基、羧基、烷基、烷氧 基、卤烷基、酰氧基、硫烷基、亚磺酰烷基、磺酰烷基、羟烷基、芳基、 芳烷基、杂环、取代杂环、杂环烷基、-C(＝O)OR8、-OC(＝O)R8、-C(＝O)NR8R9、 -C(＝O)NR8OR9、-SOcR8、-SOcNR8R9、-NR8SOcR9、-NR8R9、-NR8C(＝O)R9、 -NR8C(＝O)(CH2)bOR9、-NR8C(＝O)(CH2)bR9、-O(CH2)bNR8R9、或与苯基结合 的杂环；

R8、R9、R10和R11相同或不同、并在各情况下独立地为氢、烷基、芳 基、芳烷基、杂环、杂环烷基；

或R8和R9与它们相连的原子一起形成杂环；

a和b相同或不同，并在各情况下独立地选自0、1、2、3或4；且

c在各情况下为0、1或2。

在另一特定的实施方式中，所述JNK抑制剂具有如下结构：

其中R0为-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、NH或-CH2-；

结构(III)的化合物可以是：(i)未取代的；(ii)单取代的并具有第一取代基、 或者(iii)双取代的并具有第一取代基和第二取代基；

该第一或第二取代基在存在时位于3、4、5、7、8、9或10号位，其 中该第一和第二取代基在存在时独立地为烷基、羟基、卤素、硝基、三氟 甲基、磺酰、羧基、烷氧羰基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳烷氧基、芳烷 基、环烷基烷氧基、环烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、氨基烷氧基、 单-烷氨基烷氧基、二-烷氨基烷氧基，或由结构(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f) 代表的基团：

其中R3和R4一起为亚烷基或含杂原子的环状亚烷基，或者R3和R4独 立地为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、芳氧基烷基、烷 氧基烷基、氨基烷基、单-烷氨基烷基、或二-烷氨基烷基；和

R5为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、烷氧基、烷氧 基烷基、烷氧基羰基烷基、氨基、单-烷氨基、二-烷氨基、芳氨基、芳烷基 氨基、环烷基氨基、环烷基烷基氨基、氨基烷基、单-烷氨基烷基、或二- 烷氨基烷基。

在更特定的实施方式中，所述方法还包括将所述干细胞与免疫调节化 合物相接触。在更特定的实施方式中，所述免疫调节化合物为3-(4-氨基-1- 氧代-1，3-二氢异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮、3-(4′氨基异吲哚啉-1′-onw)-1-哌 啶-2，6-二酮、4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮、或α-(3- 邻苯二甲酰亚胺)戊二酰亚胺。在另一更特定的实施方式中，所述免疫调节 化合物具有如下结构：

其中X和Y之一为C＝O，X和Y另一个为C＝O或CH2，R2为氢或低 级烷基，或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映体、 非对映体、外消旋体或立体异构体混合物。在另一更特定的实施方式中， 所述免疫调节化合物具有如下结构：

其中X和Y之一为C＝O，另一个为CH2或C＝O；

R1为H、(C1-C8)烷基、(C3-C7)环烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄 基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)杂环烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)杂芳基、C(O)R3、 C(S)R3、C(O)OR4、(C1-C8)烷基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基 -C(O)OR5、C(O)NHR3、C(S)NHR3、C(O)NR3R3’、C(S)NR3R3’或(C1-C8)烷基 -O(CO)R5；

R2为H、F、苄基、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基或(C2-C8)炔基；

R3和R3′独立地为(C1-C8)烷基、(C3-C7)环烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔 基、苄基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)杂环烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)杂芳基、 (C0-C8)烷基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基-C(O)OR5、(C1-C8)烷基 -O(CO)R5或C(O)OR5；

R4为(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、(C1-C4)烷基-OR5、苄基、 芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)杂环烷基或(C0-C4)烷基-(C2-C5)杂芳基；

R5为(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基或(C2-C5)杂 芳基；

各情况下R6独立地为H、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄 基、芳基、(C2-C5)杂芳基或(C0-C8)烷基-C(O)O-R5，或者R6基团可形成杂环 烷基基团；

n为0或1；且

*代表手性-碳中心；

或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映体、非对 映体、外消旋体或立体异构体混合物。在另一更特定的实施方式中，所述 免疫调节化合物具有如下结构：

其中：

X和Y之一为C＝O，另一个为CH2或C＝O；

R为H或CH2OCOR′；

(i)R1、R2、R3或R4各自独立地为卤素、1至4个碳原子的烷基、或1 至4个碳原子的烷氧基，或者(ii)R1、R2、R3或R4之一为硝基或-NHR5且 R1、R2、R3或R4中剩余的为氢；

R5为氢或1至8个碳的烷基

R6为氢、1至8个碳原子的烷基、苯、氯或氟；

R′为R7-CHR10-N(R8R9)；

R7为间亚苯基或对亚苯基或-(CnH2n)-，其中n的值为0至4；

R8和R9各自独立地为氢或1至8个碳原子的烷基，或者R8和R9一起 为四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基、或-CH2CH2X1CH2CH2-，其中X1为-O-、 -S-或-NH-；

R10为氢、1至8个碳原子的烷基、或苯基；且

*代表手性-碳中心；

或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映体、非对 映体、外消旋体或立体异构体混合物。

在本方法的另一特定实施方式中，所述溶液还包含血管舒张剂。在更 特定的实施方式中，所述的血管舒张剂为抗高血压药物。在另一更特定的 实施方式中，所述的血管舒张剂可激活鸟苷酸环化酶、ADP-核糖转移酶或 环氧化酶，或者可以抑制脂氧合酶。在另一更特定的实施方式中，所述的 血管舒张剂为心房钠尿肽(ANP)、促肾上腺皮质激素、促肾上腺皮质激素释 放激素、硝普钠、肼苯哒嗪、三磷酸腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸镁。在 更特定的实施方式中，所述的肼苯哒嗪的存在浓度为约0.1mM至约10mM。 在另一更特定的实施方式中，所述的腺苷的存在浓度为约0.001mM至约 10.0mM。在另一更特定的实施方式中，所述的三磷酸腺苷的存在浓度为约 0.1mM至约1000mM。在另一更特定的实施方式中，所述的吲哚美辛的存 在浓度为约1mg/kg至约20mg/kg，其中“kg”指胎盘的重量。在另一更特定 的实施方式中，所述的硫酸镁的存在浓度为约0.1mM至约20mM。

在本方法另一特定的实施方式中，所述的干细胞为CD34+干细胞。在 另一更特定的实施方式中，所述的CD34+干细胞为CD34+CD38-干细胞。 在更特定的实施方式中，所述的CD34+CD38-干细胞为胎盘灌注液中 CD34+CD38-干细胞群的一部分，其相对于脐带血中的CD34+CD38-细胞具 有更高比例的总有核细胞。在本发明另一特定的实施方式中，所述的干细 胞为CD34-干细胞。在更特定的实施方式中，所述的CD34-干细胞还可以 是CD31+、CD33+、CD44-、CD117+、KDR+、HLA-ABC弱或HLA-DR弱的。 在另一更特定的实施方式中，所述的CD34-干细胞还可以是ABc-p+、 SSEA3+、和SSEA4+的。

本发明还提供了有助于干细胞采集，如通过灌注和/或组织破碎(例如， 酶消化)等方法采集干细胞的组合物(例如，溶液)。在一个实施方式中，本 发明提供了在生理学上可接受的溶液中包含凋亡抑制剂和蛋白酶的组合 物，其中所述的组合物在与干细胞群接触时，与未接触该组合物的干细胞 群相比可减少或防止所述干细胞群的凋亡。在特定的实施方式中，所述的 组合物不是天然存在的组合物。在另一特定实施方式中，所述凋亡抑制剂 是半胱氨酸蛋白酶抑制剂。在另一特定实施方式中，所述凋亡抑制剂是JNK 抑制剂。在更特定的实施方式中，所述JNK抑制剂不调节所述干细胞的分 化或增殖。在另一特定实施方式中，所述蛋白酶存在的数量足以可检测地 解离获取所述干细胞的组织的细胞。在另一实施方式中，该组合物还包含 坏死抑制剂。在更特定的实施方式中，所述坏死抑制剂为2-(1H-吲哚-3- 基)-3-戊氨基-马来酰亚胺。在另一特定实施方式中，该组合物还包含携氧全 氟化碳。在另一特定实施方式中，所述生理学上可接受的溶液为盐溶液或 培养基。在更特定的实施方式中，所述的盐溶液为0.9％Nacl溶液或磷酸盐 缓冲液。在另一更特定的实施方式中，所述蛋白酶为基质金属蛋白酶或中 性蛋白酶。在更特定的实施方式中，所述的基质金属蛋白酶为胶原酶。在 更特定的实施方式中，所述中性蛋白酶为嗜热菌蛋白酶或分散酶。在另一 特定实施方式中，该组合物还包含粘多糖酶。在更特定的实施方式中，所 述粘多糖酶为透明质酸酶。

在另一特定实施方式中，所述组合物进一步包含羟乙基淀粉、乳糖酸 以及棉子糖。在另一特定实施方式中，该组合物进一步包含UW溶液。

在所述组合物的特定实施方式中，所述JNK抑制剂为吲唑。在另一特 定的实施方式中，所述JNK抑制剂具有如下结构：

其中：

A为直接的键、-(CH2)a、-(CH2)bCH＝CH(CH2)c-或-(CH2)bC≡C(CH2)c-；

R1为芳基、杂芳基或与苯基结合的杂环，其各自任选地被独立地选自 R3的一至四个取代基取代；

R2为-R3、-R4、-(CH2)bC(＝O)R5、-(CH2)bC(＝O)OR5、-(CH2)bC(＝O)NR5R6、 -(CH2)bC(＝O)NR5(CH2)cC(＝O)R6、-(CH2)bNR5C(＝O)R6、 -(CH2)bNR5C(＝O)NR6R7、-(CH2)bNR5R6、-(CH2)bOR5、-(CH2)bSOdR5或 -(CH2)bSO2NR5R6；

a为1、2、3、4、5或6；

b和c相同或不同，并在各情况下独立地选自0、1、2、3或4；

d在各情况下为0、1或2；

R3在各情况下独立地选自卤素、羟基、羧基、烷基、烷氧基、卤烷基、 酰氧基、硫烷基、亚磺酰烷基、磺酰烷基、羟烷基、芳基、芳烷基、杂环、 杂环烷基、-C(＝O)OR8、-OC(＝O)R8、-C(＝O)NR8R9、-C(＝O)NR8OR9、 -SO2NR8R9、-NR8SO2R9、-CN、-NO2、-NR8R9、-NR8C(＝O)R9、 -NR8C(＝O)(CH2)bOR9、-NR8C(＝O)(CH2)bR9、-O(CH2)bNR8R9，或与苯基结合 的杂环；

R4为烷基、芳基、芳烷基、杂环或杂环烷基，其各自任选地被独立地 选自R3的一至四个取代基取代，或者R4为卤素或羟基；

R5，R6和R7相同或不同，并在各情况下独立地为氢、烷基、芳基、芳 烷基、杂环或杂环烷基，其中R5，R6和R7各自任选地被独立地选自R3的 一至四个取代基取代；且

R8和R9相同或不同，并在各情况下各自为氢、烷基、芳基、芳烷基、 杂环或杂环烷基，或R8和R9与它们连接的原子一起形成杂环，其中一起形 成杂环的R8、R9以及R8和R9各自被独立地选自R3的一至四个取代基取代；

或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物.对映体、非对 映体、外消旋体或立体异构体混合物。

在该组合物的另一特定实施方式中，所述JNK抑制剂具有如下结构：

其中：

R1为芳基或杂芳基，其任选地被独立地选自R7的一至四个取代基取代；

R2为氢；

R3为氢或低级烷基；

R4代表一至四个任选的取代基，其中各取代基相同或不同，并独立地 选自卤素、羟基、低级烷基和低级烷氧基；

R5和R6相同或不同，并独立地为-R8、-(CH2)aC(＝O)R9、 -(CH2)aC(＝O)OR9、-(CH2)aC(＝O)NR9R10、-(CH2)aC(＝O)NR9(CH2)bC(＝O)R10、 -(CH2)aNR9C(＝O)R10、(CH2)aNR11C(＝O)NR9R10、-(CH2)aNR9R10、-(CH2)aOR9、 -(CH2)aSOcR9或-(CH2)aSO2NR9R10；

或R5和R6与相连的氮原子一起形成杂环或取代杂环；

R7在各情况下分别为卤素、羟基、氰基、硝基、羧基、烷基、烷氧基、 卤烷基、酰氧基、硫烷基、亚磺酰烷基、磺酰烷基、羟烷基、芳基、芳烷 基、杂环、取代杂环、杂环烷基、-C(＝O)OR8、-OC(＝O)R8、-C(＝O)NR8R9、 -C(＝O)NR8OR9、-SOcR8、-SOcNR8R9、-NR8SOcR9、-NR8R9、-NR8C(＝O)R9、 -NR8C(＝O)(CH2)bOR9、-NR8C(＝O)(CH2)bR9、-O(CH2)bNR8R9，或与苯基结合 的杂环；

R8、R9、R10和R11相同或不同，并在各情况下独立地为氢、烷基、芳 基、芳烷基、杂环、杂环烷基；

或R8和R9与相连的原子一起形成杂环；

a和b相同或不同，并在各情况下独立地选自0、1、2、3或4；且

c在各情况下为0、1或2；

或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映体、非对 映体、外消旋体或立体异构体混合物。

在该组合物的另一特定实施方式中，所述JNK抑制剂具有如下结构：

其中R0为-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、NH或-CH2-；

结构(III)的化合物可以是：(i)未取代的；(ii)单取代的并具有第一取代基， 或者(iii)双取代的并具有第一取代基和第二取代基；

该第一或第二取代基在存在时位于3、4、5、7、8、9或10号位，其 中该第一和第二取代基在存在时独立地为烷基、羟基、卤素、硝基、三氟 甲基、磺酰、羧基、烷氧羰基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳烷氧基、芳烷 基、环烷基烷氧基、环烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、氨基烷氧基、 单-烷氨基烷氧基、二-烷氨基烷氧基，或由结构(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f) 代表的基团：

其中R3和R4一起为亚烷基或含杂原子的环状亚烷基，或者R3和R4独 立地为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、芳氧基烷基、烷 氧基烷基、氨基烷基、单-烷氨基烷基、或二-烷氨基烷基；和

R5为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、烷氧基、烷氧 基烷基、烷氧基羰基烷基、氨基、单-烷氨基、二-烷氨基、芳氨基、芳烷基 氨基、环烷基氨基、环烷基烷基氨基、氨基烷基、单-烷氨基烷基、或二- 烷氨基烷基；

或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映体、非对 映体、外消旋体或立体异构体混合物。

在更特定的实施方式中，所述组合物还包含免疫调节化合物。在另一 更特定的实施方式中，所述免疫调节化合物为3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢异 吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮、3-(4′氨基异吲哚异吲哚啉-1′-onw)-1-哌啶-2，6-二 酮、4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮、或α-(3-氨基邻 苯二甲酰亚胺)戊二酰亚胺。在另一更特定的实施方式中，所述免疫调节化 合物具有如下结构：

其中X和Y之一为C＝O，X和Y另一个为C＝O或CH2，R2为氢或低 级烷基，或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映体、 非对映体、外消旋体或立体异构体混合物。在另一更特定的实施方式中， 所述免疫调节化合物具有如下结构：

其中X和Y之一为C＝O，另一个为CH2或C＝O；

R1为H、(C1-C8)烷基、(C3-C7)环烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄 基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)杂环烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)杂芳基、C(O)R3、 C(S)R3、C(O)OR4、(C1-C8)烷基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基 -C(O)OR5、C(O)NHR3、C(S)NHR3、C(O)NR3R3′、C(S)NR3R3′或(C1-C8)烷基 -O(CO)R5；

R2为H、F、苄基、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基或(C2-C8)炔基；

R3和R3′独立地为(C1-C8)烷基、(C3-C7)环烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔 基、苄基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)杂环烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)杂芳基、 (C0-C8)烷基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基-C(O)OR5、(C1-C8)烷基 -O(CO)R5或C(O)OR5；

R4为(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、(C1-C4)烷基-OR5、苄基、 芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)杂环烷基或(C0-C4)烷基-(C2-C5)杂芳基；

R5为(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基或(C2-C5)杂 芳基；

各情况下R6独立地为H、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄 基、芳基、(C2-C5)杂芳基或(C0-C8)烷基-C(O)O-R5、或者R6基团可形成杂环 烷基基团；

n为0或1；和

*代表手性-碳中心；

或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映体、非对 映体、外消旋体或立体异构体混合物。在另一更特定的实施方式中，所述 免疫调节化合物具有如下结构：

其中：X和Y之一为C＝O，另一个为CH2或C＝O；

R为H或CH2OCOR′；

(i)R1、R2、R3或R4各自独立为卤素、1至4个碳原子的烷基，或1至 4个碳原子的烷氧基，或者(ii)R1、R2、R3或R4之一为硝基或-NHR5且R1、 R2、R3或R4中剩余的为氢；

R5为氢或1至8个碳的烷基

R6为氢、1至8个碳原子的烷基、苯、氯或氟；

R′为R7-CHR10-N(R8R9)；

R7为间亚苯基或对亚苯基或-(CnH2n)-，其中n的值为0至4；

R8和R9各自独立地为氢或1至8个碳原子的烷基，或者R8和R9一起 为四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基、或-CH2CH2X1CH2CH2-，其中X1为-O-， -S-或-NH-；

R10为氢、1至8个碳原子的烷基、或苯基；且

*代表手性-碳中心；

或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映体、非对 映体、外消旋体或立体异构体混合物。

在另一特定实施方式中，所述组合物还包含血管舒张剂。在更特定的 实施方式中，所述血管舒张剂为抗高血压药物。在另一更特定的实施方式 中，所述血管舒张剂可激活鸟苷酸环化酶、ADP-核糖转移酶或环氧化酶， 或抑制脂氧合酶。在另一更特定的实施方式中，所述血管舒张剂为心房钠 尿肽(ANP)、促肾上腺皮质激素、促肾上腺皮质激素释放激素、硝普钠、肼 苯哒嗪、三磷酸腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸镁。在更特定的实施方式中， 所述肼苯哒嗪的存在浓度为约0.1mM至约10mM。在另一更特定的实施方 式中，所述腺苷的存在浓度为约0.001mM至约10.0mM。在另一更特定的 实施方式中，所述三磷酸腺苷的存在浓度为约0.1mM至约1000mM。在另 一更特定的实施方式中，所述吲哚美辛的存在浓度为约1mg/kg至约 20mg/kg，其中“Kg”指胎盘的重量。在另一更特定的实施方式中，所述硫酸 镁的存在浓度为约0.1mM至约20mM。

在另一方面，本发明提供了保存胎盘干细胞群的方法，其包括将干细 胞群与凋亡抑制剂和携氧全氟化碳相接触，其中该凋亡抑制剂以相对于未 接触该凋亡抑制剂的干细胞群足以减少和防止干该细胞群的凋亡的量和时 间存在。在具体实施方式中，所述凋亡抑制剂是半胱氨酸蛋白酶抑制剂。 在另一特定实施方式中，所述凋亡抑制剂是JNK抑制剂。在更特定的实施 方式中，所述JNK抑制剂不调节所述干细胞的分化或增殖。在另一更特定 的实施方式中，在所述接触前将所述JNK抑制剂和所述全氟化碳包含在单 一溶液中。在另一更特定的实施方式中，在所述接触前将所述JNK抑制剂 包含于第一溶液中，而将所述全氟化碳包含在第二溶液中。在另一特定实 施方式中，所述溶液、第一溶液或第二溶液还包含羟乙基淀粉、乳糖酸阴 离子以及棉子糖。如权利要求95所述的方法，其中在所述接触时所述JNK 抑制剂和所述全氟化碳为约0℃到约25℃。在另一更具体的实施例中，所 述JNK抑制剂和所述全氟化碳在所述接触时的温度为约2℃到约10℃、或 为约2℃到约25℃。在另一更具体的实施例中，所述接触在所述干细胞群 的运输过程中进行。在另一更具体的实施例中，所述接触在所述干细胞群 的冷冻和解冻过程中进行。

在另一特定实施方式中，所述方法还包括将所述干细胞与坏死抑制剂 相接触。在更特定的实施方式中，所述坏死抑制剂为2-(1H-吲哚-3-基)-3- 戊氨基-马来酰亚胺。

在本方法的另一特定实施方式中，所述干细胞群在所述保存过程中暴 露于缺氧条件下少于72小时，其中所述的缺氧条件为低于正常血氧浓度的 氧浓度。在一个更具体的实施例中，所述干细胞群在所述保存过程中暴露 于所述缺氧条件下少于48小时。在另一个更具体的实施方案中，所述干细 胞群在所述保存过程中暴露于所述缺氧条件下少于24小时、或少于6小时、 或未暴露于缺氧条件。在另一特定的实施方式中，所述干细胞群在所述保 存过程中未暴露于剪切应力。

在另一特定实施方式中，任意前述溶液包含UW溶液。

在本发明的另一特定实施方式中，所述干细胞群包含在胎盘中或由胎 盘分离得到。

在所述方法的更特定实施方式中，所述的JNK抑制剂具有如下结构：

其中：

A为直接的键、-(CH2)a、-(CH2)bCH＝CH(CH2)c-或-(CH2)bC≡C(CH2)c-；

R1为芳基、杂芳基或与苯基结合的杂环，其各自任选地被独立地选自 R3的一至四个取代基取代；

R2为-R3、-R4、-(CH2)bC(＝O)R5、-(CH2)bC(＝O)OR5、-(CH2)bC(＝O)NR5R6、 -(CH2)bC(＝O)NR5(CH2)cC(＝O)R6、-(CH2)bNR5C(＝O)R6、 -(CH2)bNR5C(＝O)NR6R7、-(CH2)bNR5R6、-(CH2)bOR5、-(CH2)bSOdR5或 -(CH2)bSO2NR5R6；

a为1、2、3、4、5或6；

b和c相同或不同，并在各情况下独立地选自0、1、2、3或4；

d在各情况下为0、1或2；

R3在各情况下独立地选自卤素、羟基、羧基、烷基、烷氧基、卤烷基、 酰氧基、硫烷基、亚磺酰烷基、磺酰烷基、羟烷基、芳基、芳烷基、杂环、 杂环烷基、-C(＝O)OR8、-OC(＝O)R8、-C(＝O)NR8R9、-C(＝O)NR8OR9、 -SO2NR8R9、-NR8SO2R9、-CN、-NO2、-NR8R9、-NR8C(＝O)R9、 -NR8C(＝O)(CH2)bOR9、-NR8C(＝O)(CH2)bR9、-O(CH2)bNR8R9、或与苯基结合 的杂环；

R4为烷基、芳基、芳烷基、杂环或杂环烷基，其各自任选地被独立地 选自R3的一至四个取代基取代，或者R4为卤素或羟基；

R5、R6和R7相同或不同，并在各情况下独立地为氢、烷基、芳基、芳 烷基、杂环或杂环烷基，其中R5、R6和R7各自任选地被独立地选自R3的 一至四个取代基取代；且

R8和R9相同或不同，并在各情况下独立地为氢、烷基、芳基、芳烷基、 杂环或杂环烷基，或R8和R9与它们连接的原子一起形成杂环，其中一起形 成杂环的R8、R9以及R8和R9各自任选地被独立地选自R3的一至四个取代 基取代。

在该方法的更特定实施方式中，所述的JNK抑制剂具有如下结构：

其中：

R1为任选地被独立地选自R7的一至四个取代基取代的芳基或杂芳基；

R2为氢；

R3为氢或低级烷基；

R4代表一至四个任选取代基，其中各取代基相同或不同，且独立地选 自卤素、羟基、低级烷基和低级烷氧基；

R5和R6相同或不同，且独立地选自-R8、(CH2)aC(＝O)R9、 -(CH2)aC(＝O)OR9、-(CH2)aC(O)NR9R10、(CH2)aC(＝O)NR9(CH2)bC(＝O)R10、 -(CH2)aNR9C(＝O)R10、(CH2)aNR11C(＝O)NR9R10、-(CH2)aNR9R10、-(CH2)aOR9、 -(CH2)aSOcR9或-(CH2)aSO2NR9R10；

或R5和R6与它们相连的氮原子一起形成杂环或取代杂环；

R7在各情况下独立地为卤素、羟基、氰基、硝基、羧基、烷基、烷氧 基、卤烷基、酰氧基、硫烷基、亚磺酰烷基、磺酰烷基、羟烷基、芳基、 芳烷基、杂环、取代杂环、杂环烷基、-C(＝O)OR8、-OC(＝O)R8、-C(＝O)NR8R9、 -C(＝O)NR8OR9、-SOcR8、-SOcNR8R9、-NR8SOcR9、-NR8R9、-NR8C(＝O)R9、 -NR8C(＝O)(CH2)bOR9、-NR8C(＝O)(CH2)bR9、-O(CH2)bNR8R9、或与苯基结合 的杂环；

R8、R9、R10和R11相同或不同、并在各情况下独立地为氢、烷基、芳 基、芳烷基、杂环、杂环烷基；

或R8和R9与它们相连的原子一起形成杂环；

a和b相同或不同，并在各情况下独立地选自0、1、2、3或4；且

c在各情况下为0、1或2。

在该方法的另一更特定实施方式中，所述的JNK抑制剂具有如下结构：

其中R0为-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、NH或-CH2-；

结构(III)的化合物可以是：(i)未取代的；(ii)单取代的并具有第一取代基、 或者(iii)双取代的并具有第一取代基和第二取代基；

该第一或第二取代基在存在时位于3、4、5、7、8、9或10号位，其 中该第一和第二取代基在存在时独立地为烷基、羟基、卤素、硝基、三氟 甲基、磺酰、羧基、烷氧羰基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳烷氧基、芳烷 基、环烷基烷氧基、环烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、氨基烷氧基、 单-烷氨基烷氧基、二-烷氨基烷氧基，或由结构(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f) 代表的基团：

其中R3和R4一起为亚烷基或含杂原子的环状亚烷基，或者R3和R4独 立地为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、芳氧基烷基、烷 氧基烷基、氨基烷基、单-烷氨基烷基、或二-烷氨基烷基；和

R5为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、烷氧基、烷氧 基烷基、烷氧基羰基烷基、氨基、单-烷氨基、二-烷氨基、芳氨基、芳烷基 氨基、环烷基氨基、环烷基烷基氨基、氨基烷基、单-烷氨基烷基、或二- 烷氨基烷基。

在更特定的实施方式中，所述方法还包括将所述干细胞与免疫调节化 合物相接触。在更特定的实施方式中，所述免疫调节化合物为3-(4-氨基-1- 氧代-1，3-二氢异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮、3-(4′氨基异吲哚啉-1′-onw)-1-哌 啶-2，6-二酮、4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮、或α-(3- 邻苯二甲酰亚胺)戊二酰亚胺。在另一更特定的实施方式中，所述免疫调节 化合物具有如下结构：

其中X和Y之一为C＝O，X和Y另一个为C＝O或CH2，R2为氢或低 级烷基，或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映体、 非对映体、外消旋体或立体异构体混合物。在另一更特定的实施方式中， 所述免疫调节化合物具有如下结构：

其中X和Y之一为C＝O，另一个为CH2或C＝O；

R1为H、(C1-C8)烷基、(C3-C7)环烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄 基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)杂环烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)杂芳基、C(O)R3、 C(S)R3、C(O)OR4、(C1-C8)烷基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基 -C(O)OR5、C(O)NHR3、C(S)NHR3、C(O)NR3R3’、C(S)NR3R3’或(C1-C8)烷基 -O(CO)R5；

R2为H、F、苄基、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基或(C2-C8)炔基；

R3和R3′独立地为(C1-C8)烷基、(C3-C7)环烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔 基、苄基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)杂环烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)杂芳基、 (C0-C8)烷基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基-C(O)OR5、(C1-C8)烷基 -O(CO)R5或C(O)OR5；

R4为(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、(C1-C4)烷基-OR5、苄基、 芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)杂环烷基或(C0-C4)烷基-(C2-C5)杂芳基；

R5为(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基或(C2-C5)杂 芳基；

各情况下R6独立地为H、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄 基、芳基、(C2-C5)杂芳基或(C0-C8)烷基-C(O)O-R5，或者R6基团可形成杂环 烷基基团；

n为0或1；且

*代表手性-碳中心；

或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映体、非对 映体、外消旋体或立体异构体混合物。在另一更特定的实施方式中，所述 免疫调节化合物具有如下结构：

其中：

X和Y之一为C＝O，另一个为CH2或C＝O；

R为H或CH2OCOR′；

(i)R1、R2、R3或R4各自独立地为卤素、1至4个碳原子的烷基、或1 至4个碳原子的烷氧基，或者(ii)R1、R2、R3或R4之一为硝基或-NHR5且 R1、R2、R3或R4中剩余的为氢；

R5为氢或1至8个碳的烷基

R6为氢、1至8个碳原子的烷基、苯、氯或氟；

R′为R7-CHR10-N(R8R9)；

R7为间亚苯基或对亚苯基或-(CnH2n)-，其中n的值为0至4；

R8和R9各自独立地为氢或1至8个碳原子的烷基，或者R8和R9一起 为四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基、或-CH2CH2X1CH2CH2-，其中X1为-O-、 -S-或-NH-；

R10为氢、1至8个碳原子的烷基、或苯基；且

*代表手性-碳中心；

或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映体、非对 映体、外消旋体或立体异构体混合物。

在上述任意方法或组合物的另一特定实施方式中，所述JNK抑制剂的 存在浓度为约0.5μM至约10μM。在上述方法或组合物的另一特定实施方式 中，所述蛋白酶的存在浓度为约0.1mg/mL至约10mg/mL。在上述方法或组 合物的另一特定实施方式中，所述的粘多糖酶的存在浓度为约0.1mg/mL至 约10mg/mL。在上述方法或组合物的另一特定实施方式中，所述的免疫调 节化合物的存在浓度为约0.5μM至约10μM。在上述方法或组合物的另一特 定实施方式中，所述的血管舒张剂为心房钠尿肽(ANP)、促肾上腺皮质激素、 促肾上腺皮质激素释放激素、硝普钠、肼苯哒嗪、三磷酸腺苷、腺苷、吲 哚美辛或硫酸镁。在更特定的实施方式中，所述肼苯哒嗪的存在浓度为约 0.1mM至约10mM。在另一更特定的实施方式中，所述腺苷的存在浓度为 约0.001mM至约10.0mM。在另一更特定的实施方式中，所述三磷酸腺苷 的存在浓度为约0.1mM至约1000mM。

在另一特定的实施方式中，本发明所述的任意组合物可包含含有氯化 钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸钠、硫酸钾、碳酸钠和葡萄糖的生理 学上可接受的溶液。任意的该组合物均可包含一种或多种必需或非必需氨 基酸或其组合。

3.1定义

本说明书所用的术语“胚胎干细胞”指来自于胚囊(例如，4-至5-日大人 胚胎)的内细胞团并具有多能性的细胞。

本说明书所用的术语“胎盘干细胞”指来自于哺乳动物胎盘的干细胞或 祖细胞，与细胞形态、细胞表面标记或原代培养后的传代次数无关。然而， 该术语不包含仅来源于其它组织(例如，胎盘血或脐带血)的干细胞。

本说明书所用的术语“放血”在与胎盘一起使用时指从胎盘除去和/或排 干基本上所有的脐带血。

本说明书所用的术语“灌注液”指在液体流过器官或组织后采集的该液 体。在优选的实施方式中，该灌注液包含一种或多种抗凝血剂。

本说明书所用的术语“干细胞”包含多能(pluripotent)和专能(multipotent) 细胞和祖细胞，包括定向祖细胞。专能性和多能性干细胞保留了在培养中 增殖和扩增的能力。

“烷基”指具有1至10个碳原子的饱和直链或支链非环状烃。“低级烷基” 如上文定义，指具有1至4个碳原子的烷基。代表性的饱和直链烷基包括 甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬 基和正癸基；而饱和支链烷基包括异丙基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2- 甲基丁基、3-甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2-甲基己 基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2，3-二甲基丁基、2，3-二甲基戊 基、2，4-二甲基戊基、2，3-二甲基己基、2，4-二甲基己基、2，5-二甲基己基、 2，2-二甲基戊基、2，2-二甲基己基、3，3-二甲基戊基、3，3-二甲基己基、4，4- 二甲基己基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基 己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、2-甲基-4-乙基戊基、2-甲基 -2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2-甲基-4-乙基己基、2，2-二乙基戊基、3，3- 二乙基己基、2，2-二乙基己基、3，3-二乙基己基等。

“烯基”或“亚烷基”指具有2至10个碳原子并至少具有一个碳碳双键的 直链或支链非环状烃，代表性的直链和支链(C2-C10)烯基包括乙烯基、丙烯 基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1- 丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2，3-二甲基-2-丁烯基、-1-己烯基、-2-己烯基、 -3-己烯基、-1-庚烯基、-2-庚烯基、-3-庚烯基、-1-辛烯基、-2-辛烯基、-3- 辛烯基、-1-壬烯基、-2-壬烯基、-3-壬烯基、-1-癸烯基、-2-癸烯基、-3-癸 烯基等。烯基可以被取代或未被取代。“环状亚烷基”指具有3至8个碳原子 并包括至少一个碳碳双键的环，其中该环可具有1至3个杂原子。

“炔基”指具有2至10个碳原子并至少具有一个碳碳三键的直链或支链 非环状烃，代表性的直链和支链-(C2-C10)炔基包括乙炔基、丙炔基、-1-丁炔 基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基、-3-甲基-1-丁炔基、-4-戊炔基、-1- 己炔基、-2-己炔基、-5-己炔基、-1-庚炔基、-2-庚炔基、-6-庚炔基、-1-辛 炔基、-2-辛炔基、-7-辛炔基、-1-壬炔基、-2-壬炔基、-8-壬炔基、-1-癸炔 基、-2-癸炔基、-9-癸炔基等。炔基基团可以被取代或未被取代。

术语“卤素”和“卤”指氟、氯、溴或碘。

“卤烷基”指被一个或多个卤素原子取代的烷基基团，其中烷基如上文定 义。

“酮”指羰基(即C＝O)。

“酰基”指-C(O)烷基基团(其中烷基如上文定义)，包括-C(O)CH3、 -C(O)CH2CH3、-C(O)(CH2)2CH3、-C(O)(CH2)3CH3、-C(O)(CH2)4CH3、 -C(O)(CH2)5CH3等。

“酰氧基”指-OC(O)烷基基团(其中烷基如上文定义)，包括-OC(O)CH3、 -OC(O)CH2CH3、-OC(O)(CH2)2CH3、-OC(O)(CH2)3CH3、-OC(O)(CH2)4CH3、 -OC(O)(CH2)5CH3等。

“酯”指-C(O)O烷基基团(其中烷基如上文定义)，包括-C(O)OCH3、 -C(O)OCH2CH3、-C(O)O(CH2)2CH3、-C(O)O(CH2)3CH3、-C(O)O(CH2)4CH3、 -C(O)O(CH2)5CH3等。

“烷氧基”指-O-(烷基)(其中烷基如上文定义)，包括-OCH3、-OCH2CH3、 -O(CH2)2CH3、-O(CH2)3CH3、-O(CH2)4CH3、-O(CH2)5CH3等。“低级烷氧基” 指-O-(低级烷基)，其中低级烷基如上文定义。

“烷氧基烷氧基”指-O-(烷基)-O-(烷基)(其中烷基基团如上文独立定义)， 包括-OCH2OCH3、-OCH2CH2OCH3、-OCH2CH2OCH2CH3等。

“烷氧羰基”指-C(＝O)O-(烷基)(其中烷基如上文定义)，包括 -C(＝O)O-CH3、-C(＝O)O-CH2CH3、-C(＝O)O-(CH2)2CH3、-C(＝O)O-(CH2)3CH3、 -C(＝O)O-(CH2)4CH3、-C(＝O)O-(CH2)5CH3等。

“烷氧羰基烷基”指-(烷基)-C(＝O)O-(烷基)(其中烷基如上文独立定义)， 包括-CH2-CO(＝O)O-CH3、-CH2-C(＝O)O-CH2CH3、-CH2-C(＝O)O-(CH2)2CH3、 -CH2-C(＝O)O-(CH2)3CH3、-CH2-C(＝O)O-(CH2)4CH3、-CH2-C(＝O)O-(CH2)5CH3 等。

“烷氧基烷基”指-(烷基)-O-(烷基)(其中烷基基团如上文独立定义)，包括 -CH2OCH3、-CH2OCH2CH3、-(CH2)2OCH2CH3、-(CH2)2O(CH2)2CH3等。

“芳基”具有5至10个环原子的碳环形芳香基团。代表性范例包括但不 限于：苯基、甲苯基、蒽基、茀基、茚基、奥基、吡啶基和萘基，以及苯 结合的碳环形部分包括5，6，7，8-四氢化萘基。碳环形芳香基团可以被取代或 未被取代。在一个实施方式中，该碳环形芳香基团为苯基。

“芳氧基”指-O-芳基基团，其中芳基如上文定义。芳氧基基团可以被取 代或未被取代。在一个实施方式中，该芳氧基的芳基环为苯基。

“芳烷基”指-(烷基)-(芳基)(其中烷基和芳基如上文定义)，包括-(CH2)苯 基、-(CH2)2苯基、-(CH2)3苯基、-CH(苯基)2、-CH(苯基)3、-(CH2)甲苯基、 -(CH2)蒽基、-(CH2)茀基、-(CH2)茚基、-(CH2)奥基、-(CH2)吡啶基、-(CH2) 萘基等。

“芳烷氧基”指-O-(烷基)-(芳基)(其中烷基和芳基如上文定义)，包括 -O-(CH2)苯基、-O-(CH2)2苯基、-O-(CH2)3苯基、-O-CH(苯基)2、-O-CH(苯 基)3、-O-(CH2)甲苯基、-O-(CH2)蒽基、-O-(CH2)茀基、-O-(CH2)茚基、-O-(CH2) 奥基、-O-(CH2)吡啶基、-O-(CH2)萘基等。

“芳氧基烷基”指-(烷基)-O-(芳基)(其中烷基和芳基如上文定义)，包括 -CH2-O-(苯基)、-(CH2)2-O-苯基、-(CH2)3-O-苯基、-(CH2)-O-甲苯基、-(CH2)-O- 蒽基、-(CH2)-O-茀基、-(CH2)-O-茚基、-(CH2)-O-奥基、-(CH2)-O-吡啶基、 -(CH2)-O-萘基等。

“环烷基”指具有碳和氢原子且没有碳碳多键的单环或多环饱和环。环烷 基基团的范例包括但不限于：(C3-C7)环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、 环己基和环庚基，以及饱和环状和双环状萜烯。环烷基基团可以被取代或 未被取代。在一个实施方式中，该环烷基基团为单环或双环。

“环烷氧基”指-O-(环烷基)(其中环烷基如上文定义)，包括-O-环丙基、-O- 环丁基、-O-环戊基、-O-环己基、-O-环庚基等。

“环烷基烷氧基”指-O-(烷基)-(环烷基)(其中环烷基和烷基如上文定义)， 包括-O-CH2-环丙基、-O-(CH2)2-环丙基、-O-(CH2)3-环丙基、-O-(CH2)4-环丙 基、O-CH2-环丁基、O-CH2-环戊基、O-CH2-环己基、O-CH2-环庚基等。

“氨基烷氧基”指-O-(烷基)-NH2(其中环烷基如上文定义)，例如 -O-CH2-NH2、-O-(CH2)2-NH2、-O-(CH2)3-NH2、-O-(CH2)4-NH2、-O-(CH2)5-NH2 等。

“单-烷氨基”指-NH(烷基)(其中烷基如上文定义)，例如-NHCH3、 -NHCH2CH3、-NH(CH2)2CH3、-NH(CH2)3CH3、-NH(CH2)4CH3、-NH(CH2)5CH3 等。

“二-烷氨基”指-N(烷基)(烷基)(其中各烷基如上文独立定义)，包括 -N(CH3)2、-N(CH2CH3)2、-N((CH2)2CH3)2、-N(CH3)(CH2CH3)等。

“单-烷氨基烷氧基”指-O-(烷基)-NH(烷基)(其中各烷基如上文独立定 义)，包括-O-(CH2)-NHCH3、-O-(CH2)-NHCH2CH3、-O-(CH2)-NH(CH2)2CH3、 -O-(CH2)-NH(CH2)3CH3、-O-(CH2)-NH(CH2)4CH3、-O-(CH2)-NH(CH2)5CH3、 -O-(CH2)2-NHCH3等。

“二-烷氨基烷氧基”指-O-(烷基)-N(烷基)(烷基)(其中各烷基如上文独立 定义)，  包括-O-(CH2)-N(CH3)2、-O-(CH2)-N(CH2CH3)2、 -O-(CH2)-N((CH2)2CH3)2、-O-(CH2)-N(CH3)(CH2CH3)等。

“芳氨基”指-NH(芳基)(其中芳基如上文定义)，包括-NH(苯基)、-NH(甲 苯基)、-NH(蒽基)、-NH(茀基)、-NH(茚基)、-NH(奥基)、-NH(吡啶基)、-NH(萘 基)等。

“芳烷基氨基”指-NH-(烷基)-(芳基)(其中烷基和芳基如上文定义)，包括 -NH-CH2-(苯基)、-NH-CH2-(甲苯基)、-NH-CH2-(蒽基)、-NH-CH2-(茀基)、 -NH-CH2-(茚基)、-NH-CH2-(奥基)、-NH-CH2-(吡啶基)、-NH-CH2-(萘基)、 -NH-(CH2)2-(苯基)等。

“烷氨基”指如-N(烷基)(烷基)等如上定义的单-烷氨基或二-烷氨基(其中 各烷基如上文独立定义)，包括-N(CH3)2，-N(CH2CH3)2，-N((CH2)2CH3)2， -N(CH3)(CH2CH3)和-N(烷基)(烷基)，其中各烷基如上文独立定义，包括 -N(CH3)2、-N(CH2CH3)2、-N((CH2)2CH3)2、-N(CH3)(CH2CH3)等。

“环烷基氨基”指-NH-(环烷基)(其中环烷基如上文定义)，包括-NH-环丙 基、-NH-环丁基、-NH-环戊基、-NH-环己基、-NH-环庚基等。

“羧基”指-COOH。

“环烷基烷基氨基”指-NH-(烷基)-(环烷基)(其中烷基和环烷基如上文定 义)，包括-NH-CH2-环丙基、-NH-CH2-环丁基、-NH-CH2-环戊基、-NH-CH2- 环己基、-NH-CH2-环庚基、-NH-(CH2)2-环丙基等。

“氨基烷基”指-(烷基)-NH2(其中烷基如上文定义)，包括CH2-NH2、 -(CH2)2-NH2、-(CH2)3-NH2、-(CH2)4-NH2、-(CH2)5-NH2等。

“单-烷氨基烷基”指-(烷基)-NH(烷基)(其中各烷基如上文独立定义)，包 括-CH2-NH-CH3、-CH2-NHCH2CH3、-CH2-NH(CH2)2CH3、 -CH2-NH(CH2)3CH3、-CH2-NH(CH2)4CH3、-CH2-NH(CH2)5CH3、 -(CH2)2-NH-CH3等。

“二-烷氨基烷基”指-(烷基)-N(烷基)(烷基)(其中各烷基如上文独立定 义)，  包括-CH2-N(CH3)2、-CH2-N(CH2CH3)2、-CH2-N((CH2)2CH3)2、 -CH2-N(CH3)(CH2CH3)、-(CH2)2-N(CH3)2等。

“杂芳基”指5至10元芳香杂环，其至少具有一个选自氮、氧和硫的杂 原子并含有至少1个碳原子，包括单-和双环系统。代表性的杂芳基为三唑 基、四唑基、噁二唑基、吡啶基、呋喃基、苯并呋喃基、苯硫基、苯并苯 硫基、喹啉基、吡咯基、吲哚基、噁唑基、苯并噁唑基、咪唑基、苯并咪 唑基、噻唑基、苯并噻唑基、异噁唑基、吡唑基、异噻唑、哒嗪基、嘧啶 基、吡嗪基、三嗪基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、嘧啶基、氧环丁基、 氮杂环庚烷基(azepinyl)、哌嗪基、吗啉基、二噁烷基(dioxanyl)、硫杂环丁 基以及噁唑基。

“杂芳基烷基”指-(烷基)-(杂芳基)(其中烷基和杂芳基如上文定义)，包括 -CH2-三唑基、-CH2-四唑基、-CH2-噁二唑基、-CH2-吡啶基、-CH2-呋喃基、 -CH2-苯并呋喃基、-CH2-苯硫基、-CH2-苯并苯硫基、-CH2-喹啉基、-CH2- 吡咯基、-CH2-吲哚基、-CH2-噁唑基、-CH2-苯并噁唑基、-CH2-咪唑基、-CH2- 苯并咪唑基、-CH2-噻唑基、-CH2-苯并噻唑基、-CH2-异噁唑基、-CH2-吡唑 基、-CH2-异噻唑基、-CH2-哒嗪基、-CH2-嘧啶基、-CH2-吡嗪基、-CH2-三嗪 基、-CH2-噌啉基、-CH2-酞嗪基、-CH2-喹唑啉基、-CH2-嘧啶基、-CH2-氧环 丁基、-CH2-氮杂环庚烷基(azepinyl)、-CH2-哌嗪基、-CH2-吗啉基、-CH2- 二噁烷基(dioxanyl)、-CH2-硫杂环丁基、-CH2-噁唑基、-(CH2)2-三唑基。

“杂环”指饱和或不饱和并包含l至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子 的5至7元单环、或7至10元双环杂环，其中该氮和硫杂原子可任选地被 氧化、且该氮杂原子可被选择性季铵化，包括任意上述杂环与苯环结合形 成的双环。该杂环可通过任意杂原子或碳原子连接。杂环包括上述定义的 杂芳基。代表性杂环包括吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、乙内 酰脲基、戊内酰胺基(valerolactamyl)、环氧乙基(oxiranyl)、叔环丁基、四氢 呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢苯硫基、四氢硫吡 喃基、四氢吡啶基、四氢苯硫基、四氢硫吡喃基等。

“与苯基结合的杂环”指在苯环的两个相邻碳原子处与该苯环结合的杂 环，其中杂环如上定义。

“杂环烷基”指-(烷基)-(杂环)(其中烷基和杂环如上文定义)，包括-CH2- 吗啉基、-CH2-吡咯烷酮基、-CH2-吡咯烷基、-CH2-哌啶基、-CH2-乙内酰脲 基、-CH2-戊内酰胺基(valerolactamyl)、-CH2-环氧乙基(oxiranyl)、-CH2-叔环 丁基、-CH2-四氢呋喃基、-CH2-四氢吡喃基、-CH2-四氢吡啶基、-CH2-四氢 嘧啶基、-CH2-四氢苯硫基、-CH2-四氢硫吡喃基、-CH2-四氢吡啶基、-CH2- 四氢苯硫基、-CH2-四氢硫吡喃基等。

本说明书所用的术语“取代”指任意上述基团(即芳基、芳烷基、杂环和 杂环烷基)，其中取代的部分的至少一个氢原子用取代基替换。在一个实施 方式中，所述基团中被取代的各碳原子被不超过两个取代基所取代。在另 一实施方式中，该基团中被取代的各碳原子被不超过一个取代基所取代。 对于酮取代基，两个氢原子被一个氧原子替换，该氧原子通过双键与该碳 原子结合。取代基包括卤素、羟基、烷基、卤烷基、单-或二-取代氨基烷基、 烷氧基烷基、芳基、芳烷基、杂环、杂环烷基、-NRaRb、-NRaC(＝O)Rb、 -NRaC(＝O)NRaRb、-NRaC(＝O)ORb-NRaSO2Rb、-ORa、 -C(＝O)RaC(＝O)ORa-C(＝O)NRaRb、-OC(＝O)Ra、-OC(＝O)ORa、-OC(＝O)NRaRb、 -NRaSO2Rb、或结构式为-Y-Z-R3的基团，其中Y为烷二基或直接的键，Z 为-O-、-S-、-N(Rb)-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-N(Rb)C(＝O)-、 -C(＝O)N(Rb)-或直接的键，Ra和Rb相同或不同，并在各情况下各自为氢、 氨基、烷基、卤烷基、芳基、芳烷基、杂环或杂环烷基，或Ra和Rb与它们 连接的氮原子一起形成杂环。

“卤烷基”指一个或多个氢原子被卤素替换的烷基(其中烷基和卤素如上 文定义)，包括-CF3、-CHF2、-CH2F、-CBr3、-CHBr2、-CH2Br、-CCl3、-CHCl2、 -CH2Cl、-CI3、-CHI2、-CH2I、-CH2-CF3、-CH2-CHF2、-CH2-CH2F、-CH2-CBr3、 -CH2-CHBr2、-CH2-CH2Br、-CH2-CCl3、-CH2-CHCl2、-CH2-CH2Cl、-CH2-CI3、 -CH2-CHI2、-CH2-CH2I等。

“羟烷基”指一个或多个氢原子被羟基替换的烷基(其中烷基如上文定 义)，  包括-CH2OH、-CH2CH2OH、-(CH2)2CH2OH、-(CH2)3CH2OH、 -(CH2)4CH2OH、-(CH2)5CH2OH、-CH(OH)-CH3、-CH2CH(OH)CH3等。

“羟基”指-OH。

“磺酰基”指-SO3H。

“磺酰烷基”指-SO2-(烷基)(其中烷基如上文定义)，包括-SO2-CH3、 -SO2-CH2CH3、-SO2-(CH2)2CH3、-SO2-(CH2)3CH3、-SO2-(CH2)4CH3、 -SO2-(CH2)5CH3等。

“亚磺酰烷基”指-SO-(烷基)(其中烷基如上文定义)，包括-SO-CH3、 -SO-CH2CH3、-SO-(CH2)2CH3、-SO-(CH2)3CH3、-SO-(CH2)4CH3、 -SO-(CH2)5CH3等。

“磺酰氨烷基”-NHSO2-(烷基)(其中烷基如上文定义)，包括-NHSO2-CH3、 -NHSO2-CH2CH3、-NHSO2-(CH2)2CH3、-NHSO2-(CH2)3CH3、 -NHSO2-(CH2)4CH3、-NHSO2-(CH2)5CH3等。

“硫烷基”指-S-(烷基)(其中烷基如上文定义)，包括-S-CH3、-S-CH2CH3、 -S-(CH2)2CH3、-S-(CH2)3CH3、-S-(CH2)4CH3、-S-(CH2)5CH3等。

本说明书所用的术语“JNK抑制剂”包括但不限于本说明书所公开的化 合物。JNK抑制剂可以以其药学上可接受的盐、游离碱、溶剂化物、水化 物、立体异构体、包合物或前药的形式存在。该种抑制活性可通过本领域 公知的测定或动物模型(例如第5节所述)来进行测定。在一个实施方式中， 该JNK抑制剂是结构(I)-(III)的化合物。

如非另行指明，本说明书所用的术语“药学上可接受的盐”包括该术语所 指的化合物的无毒酸和碱加成盐。可接受的无毒酸加成盐包括由本领域已 知的有机和无机酸或碱包括例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、甲烷磺酸、 醋酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、马来酸、山梨酸、乌头 酸、水杨酸、酞酸、栓塞酸、庚酸等所形成的盐。

天然呈酸性的化合物可与各种药学上可接受的碱形成盐。可用于制备 该种酸性化合物的药学可接受碱加成盐的碱为可形成无毒碱加成盐的碱， 该加成盐即为包含药学可接受阳离子的盐，例如但不限于：碱金属或碱土 金属，尤其是钙、镁、钠或钾盐。适用的有机碱包括但不限于：N，N-二苄 乙烯二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡萄糖 胺)、赖氨酸以及普鲁卡因。

除非另行指明，本说明书所使用的术语“前药”指的是化合物的衍生 物，其可以在生物学条件(体外或体内)下水解、氧化或发生其它反应而 提供该化合物。前药的实例包括但不限于含有可生物水解部分如可生物 水解的酰胺、可生物水解的酯、可生物水解的氨基甲酸酯、可生物水解 的碳酸酯、可生物水解的酰脲和可生物水解的磷酸酯类似物的JNK抑制 剂的衍生物。前药的其它实例包括含有-NO、-NO2、-ONO或-ONO2部 分的JNK抑制剂的衍生物。前药一般可以用公知的方法来进行制备，例 如在Burger’s Medicinal Chemistry and Drug Discovery，172-178， 949-982(Manfred E.Wolff编，第5版，1995)和Design of prodrugs (H.Bundgaafd编，Elselvier，NewYork 1985)中描述的方法。

除非另行指明，本说明书所使用的术语“可生物水解的酰胺”、  “可 生物水解的酯”、“可生物水解的氨基甲酸酯”、“可生物水解的碳酸酯”、 “可生物水解的酰脲”、  “可生物水解的磷酸酯”分别表示具有以下性质 的化合物的酰胺、酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、酰脲或磷酸酯:1)不干扰 该化合物的生物活性，但是在体内可赋予该化合物有利属性，例如吸收、 作用持续时间或作用起始；或2)没有生物活性，但是在体内转化成生物 活性化合物。可生物水解的酯的实例包括但不限于低级烷基酯、低级酰 氧基烷基酯(例如乙酰氧基甲基、乙酰氧基乙基、氨基羰氧基甲基、新戊 酰氧基甲基和新戊酰氧基乙基酯)、内酯基酯(例如酞基和硫代酞基酯)、 低级烷氧基酰氧基烷基酯(例如甲氧基羰氧基甲基、乙氧基羰氧基乙基和 异丙氧基羰氧基乙基酯)、烷氧基烷基酯、胆碱酯和酰基氨基烷基酯(例 如乙酰氨基甲基酯)。可生物水解的酰胺的实例包括但不限于低级烷基酰 胺、α-氨基酸酰胺、烷氧基酰基酰胺和烷氨基烷基羰基酰胺。可生物水 解的氨基甲酸酯的实例包括但不限于低级烷基胺、取代的乙二胺、氨基 酸、羟烷基胺、杂环和杂芳族胺以及聚醚胺。

各种JNK抑制剂和免疫调节化合物包含一个或多个手性中心，并可作 为对映体外消旋混合物或非对映体混合物存在。本发明包括使用所述化合 物的立体异构体纯的形式，以及这些形式的混合物。例如，本发明的方法 和组合物可以使用含有等量或不等量JNK抑制剂或免疫调节化合物的对映 体的混合物。此处披露的特定化合物的纯的(R)或(S)对映体可在基本不含其 它对映体的情况下使用。

除非另行指明，本说明书所用的术语”立体异构体纯的”指包含某化合物 的一种立体异构体而基本不含该化合物的另一立体异构体的组合物。例如， 具有一个手性中心的化合物的立体异构体纯的组合物将基本上不含该化合 物的相对的对映体。具有两个手性中心的化合物的立体异构体纯的组合物 将基本上不含该化合物的其它非对映异构体。典型的立体异构体纯的化合 物包含大于约80％重量的该化合物的一种立体异构体和少于约20％重量的 该化合物另一立体异构体，更优选大于约90％重量的该化合物的一种立体 异构体和少于约10％重量的该化合物另一立体异构体，更优选大于约95％ 重量的该化合物的一种立体异构体和少于约5％重量的该化合物另一立体 异构体，最优选大于约97％重量的该化合物的一种立体异构体和少于约3 ％重量的该化合物另一立体异构体。

除非另行指明，本说明书所用的术语“立体异构体富集的”指包含大 于约60％重量，优选大于约70％重量，更优选大于约80％重量的某化合物 的一种立体异构体的组合物。

除非另行指明，本说明书所用的术语“光学异构体纯的”指具有一个 手性中心的化合物的立体异构体纯的组合物。类似地，术语“光学异构体 富集的”指具有一个手性中心的化合物的立体异构体富集的组合物。

4.附图说明

图1为用于灌注胎盘并采集灌注液的胎盘静脉和动脉插管的剖视图。

图2a-e图示了放血和灌注的胎盘的采集、夹钳、灌注、采集和贮存。

图3为用作生物反应器的仪器内灌注胎盘的剖视图。

5.发明详述

5.1干细胞采集组合物

一方面，本发明提供了用于通过物理破碎(例如酶消化)或灌注从器官 (例如哺乳动物胎盘)采集干细胞(包括多能干细胞)和定向祖细胞的组合物。 该组合物优选在采集和后续贮存过程中促进该干细胞的采集，同时抑制该 干细胞的凋亡和/或坏死。下文讨论了采用该干细胞采集组合物采集干细胞 (例如胎盘干细胞)的方法。

在一个实施方式中，本发明提供了从器官采集干细胞(例如胎盘干细胞) 的组合物，其包括生理学上可接受的水溶液，以及凋亡抑制剂，其中所述 组合物在与干细胞群接触时可相对未接触该组合物的干细胞群减少或阻止 所述干细胞群中的凋亡。在一个实施方式中，所述组合物不是天然发生的 组合物。优选地，该生理学上可接受水溶液适于维持干细胞。该生理学上 可接受的水溶液可以是，例如等张水溶液，例如生理学上可接受的水溶液， 例如，缓冲盐溶液如0.9％NaCl溶液、磷酸盐缓冲液、Dulbecco改良Eagle 培养基(DMEM)、高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基(h.DMEM)、Krebs 溶液等。该生理学上可接受水溶液可以是培养基，即任何常用于哺乳动物 细胞培养的培养基，其中该培养基可包含或不包含抗生素或血清等物质。 在特定的实施方式中，该生理学上可接受水溶液包含氯化钠、氯化钾、硫 酸镁、氯化钙、硫酸钠、硫酸钾、碳酸钠以及葡萄糖。该生理学上可接受 水溶液可还可包含或不包含任何必需或非必需氨基酸，或氨基酸的组合。

该干细胞采集组合物优选包含能够破碎组织的酶，例如蛋白酶，如下 文5.1.1节描述的蛋白酶。该干细胞采集组合物包含凋亡抑制剂，它可以是 本领域已知的任何凋亡抑制剂，例如，半胱氨酸蛋白酶抑制剂，如下文5.1.2.1 节描述的半胱氨酸蛋白酶抑制剂。优选地，该凋亡抑制剂为JNK抑制剂， 例如下文5.1.2.2节中描述的JNK抑制剂。在另一实施方式中，该生理学上 可接受的水溶液还可包含免疫调节化合物，例如下文5.1.3节描述的免疫调 节化合物。该生理学上可接受水溶液还可包含血管舒张剂，例如下文5.1.4 节描述的血管舒张剂。该生理学上可接受水溶液还可包含坏死抑制剂，例 如下文5.1.5节描述的坏死抑制剂。该生理学上可接受水溶液还可包含携氧 全氟化碳，例如下文5.1.6节描述的携氧全氟化碳。该生理学上可接受的溶 液还可包含前述化合物的一种或其组合。

本发明的干细胞采集组合物在用作灌注溶液时优选包含抗凝血剂，例 如肝磷脂、柠檬酸盐、柠檬酸磷酸盐、柠檬酸磷酸右旋糖、CPDA(柠檬酸 磷酸右旋糖腺嘌呤)等，且其浓度足以阻止任意残留的脐带血或胎盘血形成 凝血块。在特定的实施方式中，从单个哺乳动物胎盘采集干细胞时每毫升 可采用从约1至约100单位的肝磷脂，优选约1至约10单位的肝磷脂。

5.1.1酶

所述组合物可包含一种或多种破坏组织和/或细胞间、或细胞和基底膜 之间的连接的酶。在一个实施方式中，该酶存在的数量足以从可获得干细 胞的器官或组织(例如胎盘)中解离可检测量的大量干细胞。该种酶可以是， 例如蛋白酶或具有蛋白酶活性的多肽。该蛋白酶可来自于人、哺乳动物、 细菌等，并可以是天然蛋白酶多肽，或具有蛋白酶活性的修饰多肽(例如， 序列变体、截短、融合蛋白、类似物)。在不同的实施方式中，该蛋白酶为 基质金属蛋白酶或中性蛋白酶。在其它实施方式中，该酶为胶原酶(例如， 胶原酶I、胶原酶IV、来自溶组织梭状芽胞杆菌的胶原酶等)、胰蛋白酶(例 如，胰蛋白酶-EDTA)、嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、分散酶、LIBERASETM 或其组合。这些酶可从市场来源获取，例如，SigmaAldrich(St.Louis， Missouri)；RocheDiagnostics(LIBERASETM；Indianapolis，Indiana)； Clinalfa(Bloomington，Indiana)。酶可以以任何有效浓度(例如，约0.1mg/mL 至约10mg/mL)使用。在不同的特定实施方式中，胰蛋白酶-EDTA(GibcoBRL) 可以以约0.25％(w/v)的浓度使用；胶原酶-IA(Sigma)可以以约1mg/mL的浓 度使用；胶原酶-I(Worthington)可以以约0.5mg/mL的浓度使用；弹性蛋白 酶可以以约1mg/mL的浓度使用；胶原酶-IV可以以约0.5mg/mL的浓度使 用，而分散酶(Worthington)可以以约0.1mg/mL的浓度使用。优选的酶组合 包括胶原酶I+胰蛋白酶、胶原酶1A+胰蛋白酶、以及弹性蛋白酶+胶原酶 1+胶原酶IV+分散酶。本领域技术人员可以理解以上提供的示范性工作浓 度可被提高或降低以优化具体的消化或灌注方案。

所述组合物还可包括核酸酶，例如DNA酶或RNA酶。该组合物还可 进一步包含粘多糖酶。在特定的实施方式中，所述粘多糖酶为透明质酸酶。

5.1.2凋亡抑制剂

本发明的干细胞采集组合物包含减少、抑制或消除胎盘细胞(特别是待 采集的干细胞)的凋亡的药剂，例如凋亡抑制剂。优选地，该药剂可在采集 和后续贮存过程中减少、抑制或消除胎盘干细胞的凋亡。该凋亡抑制剂可 以是任何已知的凋亡抑制剂(例如，半胱氨酸蛋白酶抑制剂)，但优选为JNK 抑制剂。

5.1.2.1半胱氨酸蛋白酶抑制剂

本发明的干细胞采集组合物可包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂。该半胱氨 酸蛋白酶抑制剂可以是特定半胱氨酸蛋白酶的抑制剂，例如，半胱氨酸蛋 白酶1、半胱氨酸蛋白酶2、半胱氨酸蛋白酶3、半胱氨酸蛋白酶4、半胱 氨酸蛋白酶5、半胱氨酸蛋白酶6、半胱氨酸蛋白酶7、半胱氨酸蛋白酶8、 半胱氨酸蛋白酶9、半胱氨酸蛋白酶10、半胱氨酸蛋白酶11、半胱氨酸蛋 白酶12、或半胱氨酸蛋白酶13。该半胱氨酸蛋白酶抑制剂可以抑制多种半 胱氨酸蛋白酶，或抑制所有已知的半胱氨酸蛋白酶(例如，pan-半胱氨酸蛋 白酶抑制剂)。该半胱氨酸蛋白酶抑制剂可以是半胱氨酸蛋白酶蛋白的抑制 剂，或半胱氨酸蛋白酶激活的抑制剂，例如编码半胱氨酸蛋白酶的基因的 抑制剂。半胱氨酸蛋白酶抑制剂的范例包括但不限于：2，2′-亚甲基双(1，3-环 己二酮)，具有序列Z-Val-Ala-Asp(OMe)-CH2F的肽，具有序列生物素 -X-Val-Ala-Asp(OMe)-CH2F的肽(其中X为接头)，具有序列 Ac-Val-Ala-Asp-CHO、BoC-ASp(OMe)-CH2F的肽，具有序列 Z-Val-Asp(OMe)-Val-Ala-Asp(OMe)-CH2F的肽，具有序列 Ac-Asp-Glu-Val-Asp-CHO的肽，具有序列Ac-Leu-Glu-Cal-Asp-CHO的肽、 具有序列Z-Trp-Glu(OMe)-His-Asp(OMe)-CH2F的肽等。半胱氨酸蛋白酶抑 制剂可从CalBiochem(SanDiego，CA)、BioVision(MountainView，CA)； Clontech(MountainView，CA)或R&DSystems，Inc.(Minneapolis，MN)等公 司购得。

5.1.2.2 JNK抑制剂

干细胞采集组合物的凋亡抑制剂优选JNK抑制剂，更优选地，该JNK 抑制剂为本说明书所公开的化合物。不希望受限于理论，该凋亡抑制剂(特 别是JNK抑制剂)的添加通过增加可采集的存活干细胞的数量，以及在采集 和分离过程中更接近地维持该干细胞周围的细胞环境，而有利于从哺乳动 物胎盘采集干细胞。

在特定的实施方式中，所述JNK抑制剂不调节与包含该JNK抑制剂的 干细胞采集组合物接触的干细胞或干细胞群的分化或增殖，即与未接触该 JNK抑制剂的干细胞相比，该JNK抑制剂不引起干细胞或干细胞群的增殖 或分化的可检测变化。

本发明的组合物和方法中采用的JNK抑制剂包括外消旋的、立体异构 体纯的以及立体异构体富集的JNK抑制剂，具有选择性JNK抑制活性的立 体异构和光学异构体纯的化合物，及其药学上可接受的盐、溶剂化物、水 合物、立体异构体、包合物或前药。该JNK抑制剂可从市场上购买或参照 本说明书所公开的专利或专利公布中描述的方法进行制备。此外，光学纯 的组合物可通过已知的拆分剂或手性柱以及其它标准有机化学合成技术进 行不对称合成或拆分。

在一个实施方式中，JNK抑制剂具有以下结构(I)：

其中：

A为直接的键、-(CH2)a、-(CH2)bCH＝CH(CH2)c-或-(CH2)bC≡C(CH2)c-；

R1为芳基、杂芳基或与苯基结合的杂环，其各自任选地被独立地选自 R3的一至四个取代基取代；

R2为-R3、-R4、-(CH2)bC(＝O)R5、-(CH2)bC(＝O)OR5、-(CH2)bC(＝O)NR5R6、 -(CH2)bC(＝O)NR5(CH2)cC(＝O)R6、-(CH2)bNR5C(＝O)R6、 -(CH2)bNR5C(＝O)NR6R7、-(CH2)bNR5R6、-(CH2)bOR5、-(CH2)bSOdR5或 -(CH2)bSO2NR5R6；

a为1、2、3、4、5或6；

b和c相同或不同，并在各情况下独立地选自0、1、2、3或4；

d在各情况下为0、1或2；

R3在各情况下独立地选自卤素、羟基、羧基、烷基、烷氧基、卤烷基、 酰氧基、硫烷基、亚磺酰烷基、磺酰烷基、羟烷基、芳基、芳烷基、杂环、 杂环烷基、-C(＝O)OR8、-OC(＝O)R8、-C(＝O)NR8R9、-C(＝O)NR8OR9、 -SO2NR8R9、-NR8SO2R9、-CN、-NO2、-NR8R9、-NR8C(＝O)R9、 -NR8C(＝O)(CH2)bOR9、-NR8C(＝O)(CH2)bR9、-O(CH2)bNR8R9、或与苯基结合 的杂环；

R4为烷基、芳基、芳烷基、杂环或杂环烷基，其各自任选地被独立地 选自R3的一至四个取代基取代，或者R4为卤素或羟基；

R5、R6和R7相同或不同，并在各情况下独立地为氢、烷基、芳基、芳 烷基、杂环或杂环烷基，其中R5、R6和R7各自任选地被独立地选自R3的 一至四个取代基取代；且

R8和R9相同或不同，并在各情况下独立地为氢、烷基、芳基、芳烷基、 杂环或杂环烷基，或R8和R9与它们连接的原子一起形成杂环，其中一起形 成杂环的R8、R9以及R8和R9各自任选地被独立地选自R3的一至四个取代 基取代。

在一个实施方式中，-A-R1为苯基，其任选地被独立地选自卤素、烷氧 基、-NR8C(C＝O)R9、-C(＝O)NR8R9以及-O(CH2)bNR8R9的一至四个取代基取 代的，其中b为2或3且其中R8和R9如上所定义。

在另一个实施方式中，R2为-R4、-(CH2)bC(＝O)R5、-(CH2)bC(＝O)OR5、 -(CH2)bC(＝O)NR5R6、-(CH2)bC(＝O)NR5(CH2)cC(＝O)R6、-(CH2)bNR5C(＝O)R6、 -(CH2)bNR5C(＝O)NR6R7、-(CH2)bNR5R6、-(CH2)bOR5、-(CH2)bSOdR5或 -(CH2)bSO2NR5R6，且b为0-4的整数。

在另一个实施方式中，R2为-(CH2)bC(＝O)NR5R6，-(CH2)bNR5C(＝O)R6， 3-三唑基或5-四唑基，其中b为0且其中R8和R9如上所定义。

在另-实施方式中，R2为3-三唑基或5-四唑基。

在另一实施方式中：

(a)-A-R1为苯基，其任选地被独立地选自卤素、烷氧基、-NR8C(＝O)R9、 -C(＝O)NR8R9以及-O(CH2)bNR8R9(其中b为2或3)的一至四个取代基取代； 和

(b)R2为-(CH2)bC(＝O)NR5R6、-(CH2)bNR5C(＝O)R6、3-三唑基或5-四唑 基，其中b为0且其中R8和R9如上所定义。

在另一实施方式中：

(a)-A-R1为苯基，其任选地被独立地选自卤素、烷氧基、-NR8C(＝O)R9、 -C(＝O)NR8R9以及-O(CH2)bNR8R9(其中b为2或3)的一至四个取代基取代； 和

(b)R2为3-三唑基或5-四唑基。

在另一实施方式中，R2为R4，而R4为3-三唑基，其在5号位任选地被 如下基团取代：

(a)C1-C4直链或支链烷基基团，其任选地被羟基、甲基氨、二甲基氨或 1-吡咯烷基取代；或

(b)2-吡咯烷基。

在另一实施方式中，R2为R4，而R4为3-三唑基，其任选地在5号位被 如下基团取代：甲基、正丙基、异丙基、1-羟乙基、3-羟丙基、甲基氨甲基、 二甲基氨甲基、1-(二甲基氨)乙基、1-吡咯烷甲基或2-吡咯烷基。

在另一实施方式中，结构(I)的化合物在A为直接的键时具有结构(IA)， 或在A为-(CH2)a-时具有结构(IB)：

在其它实施方式中，结构(I)的化合物在A为-(CH2)bC＝C(CH2)c-时具有 结构(IC)，或在A为-(CH2)bC≡C(CH2)C-时具有结构(ID)：

在本发明的进一步实施方式中，结构(I)的R1为芳基或取代的芳基，例 如苯基或以下结构(IE)表示的取代的苯基：

在另一实施方式中，结构(I)的R2为-(CH2)bNR4(C＝O)R5。在该实施方式 的一方面，b＝0且该化合物具有如下结构(IF)：

结构(I)化合物的代表性的R2基团包括烷基(例如甲基和乙基)、卤素(例 如氯和氟)、卤烷基(例如三氟甲基)、羟基、烷氧基(例如甲氧基和乙氧基)、 氨基、芳烷氧基(例如苄氧基)、单-或二-烷氨基(例如-NHCH3、-N(CH3)2和 -NHCH2CH3)和-NHC(＝O)R4，其中R6为取代或非取代的苯基或杂芳基(例如 用羟基、羧基、氨基、酯、烷氧基、烷基、芳基、卤烷基、卤素、-CONH2 和-CONH烷基取代的苯基或杂芳基)；-NH(杂芳基烷基)(例如-NHCH2(3-吡 啶)、-NHCH2(4-吡啶))；杂芳基(例如吡唑、三唑和四唑)；-C(＝O)NHR6，其 中R6为氢、烷基或如上所定义(例如-C(＝O)NH2、-C(＝O)NHCH3、 -C(＝O)NH(H-羧苯基))；-C(＝O)N(CH3)2)；芳烯基(例如苯乙烯基、3-氮苯乙 烯基、4-羧苯乙烯基)；杂芳基烯基(例如2-吡啶乙烯基、4-吡啶乙烯基)。

结构(I)化合物的代表性的R3基团包括卤素(例如氯和氟)，烷基(例如甲 基，乙基和异丙基)，卤烷基(例如，三氟甲基)，羟基，烷氧基(例如甲氧基， 乙氧基，正丙氧基和异丁氧基)，氨基，单-或二-烷基氨基(例如二甲基氨基)， 芳基(例如苯基)，羧基，硝基，氰基，亚磺酰烷基(例如甲亚磺酰基)，磺酰 烷基(例如甲磺酰基)，磺酰氨烷基(例如-NHSO2CH3)， -NR8C(＝O)(CH2)bOR9(例如NHC(＝O)CH2OCH3)，NHC(＝O)R9(例如 -NHC(＝O)CH3，-NHC(＝O)CH2C6H5，-NHC(＝O)(2-呋喃))以及 -O(CH2)6NR8R9(例如-O(CH2)2N(CH3)2)。

结构(I)的化合物可通过本领域技术人员已知的有机合成技术，以及于 2002年2月7日公开的国际公开WO02/10137(特别是第35页第1行至第 396页12行的实施例1-430)(其全文在此引用作为参考)中描述的方法进行制 备。此外，该公开中还具有这些化合物的具体举例。

结构(I)的JNK抑制剂的示例为：

3-(4-氟-苯基)-5-(1H-[1，2，4]三唑-3-基)-1H-吲唑；

3-[3-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5-(1H-[1，2，4]三唑-3-基)-1H-吲唑；

3-(4-氟-苯基)-1H-吲唑-5-羧酸(3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺；

3-[3-(3-哌啶-1-基-丙酰氨)-苯基]-1H-吲唑-5-羧酸酰胺；

3-苯[1，3]二氧杂-5-基-5-(2H-四唑-5-基)-1H-吲唑；

3-(4-氟-苯基)-5-(5-甲基-[1，3，4]噁二唑-2-基)-1H-吲唑；

叔-丁基-3-[5-(1H-[1，2，4]三唑-3-基)-1H-吲唑-3-基]-苯酰胺

3-[3-(2-吗啉-4-基-乙氧基)-苯基]-5-(1H-[1，2，4]三唑-3-基)-1H-吲唑

二甲基-(2-{4-[5-(1H-[1，2，4]三唑-3-基)-1H-吲唑-3-基]-苯氧基}-乙基)-胺

5-[5-(1，1-二甲基-丙基)-1H-[1，2，4]三唑-3-基]-3-(4-氟-苯基)-1H-吲唑

3-(4-氟-苯基)-5-(5-吡咯烷-1-基甲基-1H-[1，2，4]三唑-3-基)-1H-吲唑

3-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-(5-吡咯烷-1-基甲基-1H-[I，2，4]三唑-3-基)-1H-吲 唑

3-(4-氟-苯基)-1H-吲唑-5-羧酸酰胺

及其药学上可接受的盐。

在另一实施方式中，该JNK抑制剂具有以下结构(II)：

其中：

R1为任选地被独立地选自R7的一至四个取代基取代的芳基或杂芳基；

R2为氢；

R3为氢或低级烷基；

R4代表一至四个任选取代基，其中各取代基相同或不同，且独立地选 自卤素、羟基、低级烷基和低级烷氧基；

R5和R6相同或不同，且独立地选自-R8、(CH2)aC(＝O)R9、 -(CH2)aC(＝O)OR9、-(CH2)aC(O)NR9R10、(CH2)aC(＝O)NR9(CH2)bC(＝O)R10、 -(CH2)aNR9C(＝O)R10、(CH2)aNR11C(＝O)NR9R10、-(CH2)aNR9R10、-(CH2)aOR9、 -(CH2)aSOcR9或-(CH2)aSO2NR9R10；

或R5和R6与它们相连的氮原子一起形成杂环或取代杂环；

R7在各情况下独立地为卤素、羟基、氰基、硝基、羧基、烷基、烷氧 基、卤烷基、酰氧基、硫烷基、亚磺酰烷基、磺酰烷基、羟烷基、芳基、 芳烷基、杂环、取代杂环、杂环烷基、-C(＝O)OR8、-OC(＝O)R8、-C(＝O)NR8R9、 -C(＝O)NR8OR9、-SOcR8、-SOcNR8R9、-NR8SOcR9、-NR8R9、-NR8C(＝O)R9、 -NR8C(＝O)(CH2)bOR9、-NR8C(＝O)(CH2)bR9、-O(CH2)bNR8R9、或与苯基结合 的杂环；

R8、R9、R10和R11相同或不同、并在各情况下独立地为氢、烷基、芳 基、芳烷基、杂环、杂环烷基；

或R8和R9与它们相连的原子一起形成杂环；

a和b相同或不同，并在各情况下独立地选自0、1、2、3或4；且

c在各情况下为0、1或2。

在一个实施方式中，R1为取代或未取代的芳基或杂芳基。当R1被取代 时，它被以下定义的一种或多种取代基所取代。在一个实施方式中，当被 取代时，R1被卤素、-SO2R8或-SO2R8R9所取代。

在另一实施方式中，R1为取代或未取代的芳基、呋喃基、苯并呋喃基、 硫苯基、苯并硫苯基、喹啉基、吡咯基、吲哚基、噁唑基、苯并噁唑基、 咪唑基、苯并咪唑基、噻唑基、苯并噻唑基、异噁唑基、吡唑基、异噻唑 基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、噌啉基、酞嗪基、或是喹唑啉基。

在另一实施方式中，R1为取代或未取代的芳基或杂芳基。当R1被取代 时，它被以下定义的一种或多种取代基所取代。在一个实施方式中，当被 取代时，R1被卤素、-SO2R8或-SO2R8R9所取代。

在另一实施方式中，R1为取代或未取代的芳基，优选苯基。当R1为取 代的芳基时，该取代基如下定义。在一个实施方式中，当被取代时，R1被 卤素、-SO2R8或-SO2R8R9所取代。

在另一实施方式中，R5和R6与相连的氮原子一起形成取代或未取代的 含氮非芳香杂环，在一个实施方式中，为哌嗪基、哌啶基或吗啉基。

当R5和R6与相连的氮原子一起形成取代的哌嗪基、哌啶基或吗啉基时， 该哌嗪基、哌啶基或吗啉基被如下定义的一种或多种取代基取代。在一个 实施方式中，当被取代时，该取代基为烷基、氨基、烷基氨基、烷氧烷基、 酰基、吡咯烷基或哌啶基。

在一个实施方式中，R3为氢且R4不存在，则JNK抑制剂具有如下结构 (IIA)：

及其药学上可接受的盐。

在更具体的实施方式中，R1为任选地被R7取代的苯基，且具有如下结 构(IIB)：

及其药学上可接受的盐。

在更进一步的实施方式中，R7在苯基基团中相对于嘧啶处于对位，如 以下结构(IIC)所表示：

及其药学上可接受的盐。

结构(II)的JNK抑制剂可通过本领域技术人员已知的有机合成技术，以 及于2002年6月13日公开的国际公开WO02/46170(特别是第23页5行至 第183页25行的实施例1-27)(其全文在此引用作为参考)中描述的方法进行 制备。此外，该公开中还具有这些化合物的具体举例。

结构(II)的JNK抑制剂的示例为：

4-[4-(4-氯-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-苯酰胺

4-[4-(4-氯-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-N，N-二甲基-苯酰胺

4-[4-(4-氯-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-N-(3-哌啶-1-基-丙基)-苯酰胺

{4-[4-(4-氯-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-苯基}-哌嗪-1-基-甲酮

1-(4-{4-[4-(4-氯-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-苯甲酰}-哌嗪-1-基)-乙酮

1-[4-(4-{4-[4-(3-羟基-磺丙基)-苯基]-嘧啶-2-基氨基}-苯甲酰)哌嗪-1- 基]-乙酮

{4-[4-(4-氯-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-苯基}-(4-吡咯烷-1-基-哌啶-1-基)-甲 酮

及其药学上可接受的盐。

在另一实施方式中，该JNK抑制剂具有以下结构(III)：

其中R0为-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、NH或-CH2-；

结构(III)的化合物可以是：(i)未取代的；(ii)单取代的并具有第一取代基、 或者(iii)双取代的并具有第一取代基和第二取代基；

该第一或第二取代基在存在时位于3、4、5、7、8、9或10号位，其 中该第一和第二取代基在存在时独立地为烷基、羟基、卤素、硝基、三氟 甲基、磺酰、羧基、烷氧羰基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳烷氧基、芳烷 基、环烷基烷氧基、环烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、氨基烷氧基、 单-烷氨基烷氧基、二-烷氨基烷氧基，或由结构(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f) 代表的基团：

其中R3和R4一起为亚烷基或含杂原子的环状亚烷基，或者R3和R4独 立地为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、芳氧基烷基、烷 氧基烷基、氨基烷基、单-烷氨基烷基、或二-烷氨基烷基；和

R5为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、烷氧基、烷氧 基烷基、烷氧基羰基烷基、氨基、单-烷氨基、二-烷氨基、芳氨基、芳烷基 氨基、环烷基氨基、环烷基烷基氨基、氨基烷基、单-烷氨基烷基、或二- 烷氨基烷基。

在另一实施方式中，该JNK抑制剂具有以下结构(IIIA)：

2H-二苯并[cd，g]吲哚-6-酮

(IIIA)

该化合物可以是：(i)未取代的；(ii)单取代的并具有第一取代基，或者 (iii)双取代的并具有第一取代基和第二取代基；

该第一或第二取代基当存在时位于3、4、5、7、8、9或10号位置；

其中该第一和第二取代基在存在时独立地为烷基、羟基、卤素、硝基、 三氟甲基、磺酰、羧基、烷氧羰基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳烷氧基、 芳烷基、环烷基烷氧基、环烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、氨基烷 氧基、单-烷氨基烷氧基、二-烷氨基烷氧基，或由结构(a)、(b)、(c)、(d)、 (e)或(f)代表的基团：

其中R3和R4一起为亚烷基或含杂原子的环状亚烷基，或者R3和R4独 立地为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、芳氧基烷基、烷 氧基烷基、氨基烷基、单-烷氨基烷基、或二-烷氨基烷基；和

R5为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、烷氧基、烷氧 基烷基、烷氧基羰基烷基、氨基、单-烷氨基、二-烷氨基、芳氨基、芳烷基 氨基、环烷基氨基、环烷基烷基氨基、氨基烷基、单-烷氨基烷基、或二- 烷氨基烷基。

在结构(IIIA)的化合物的小类中，第一或第二取代基存在于5、7或9 号位置。在一个实施方式中，该第一或第二取代基存在于5或7号位置。

在结构(IIIA)的化合物的另一小类中，第一或第二取代基存在于5、7 或9号位置；

该第一或第二取代基各自为烷氧基、芳氧基、氨基烷基、单-烷氨基烷 基、二-烷氨基烷基或由结构(a)、(c)、(d)、(e)或(f)代表的基团；

R3和R4各自为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基；且

R5为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基或环烷基烷基。

在另一实施方式中，该JNK抑制剂具有以下结构(IIIB)：

2-氧代-2H-2l4-蒽并[9，l-cd]异噻唑-6-酮

(IIIB)

该化合物可以是：(i)未取代的；(ii)单取代的并具有第一取代基，或者 (iii)双取代的并具有第一取代基和第二取代基；

该第一或第二取代基当存在时位于3、4、5、7、8、9或10号位置；

其中该第一和第二取代基在存在时独立地为烷基、羟基、卤素、硝基、 三氟甲基、磺酰、羧基、烷氧羰基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳烷氧基、 芳烷基、环烷基烷氧基、环烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、氨基烷 氧基、单-烷氨基烷氧基、二-烷氨基烷氧基，或由结构(a)、(b)、(c)、(d)、 (e)或(f)代表的基团：

其中R3和R4一起为亚烷基或含杂原子的环状亚烷基，或者R3和R4独 立地为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、芳氧基烷基、烷 氧基烷基、氨基烷基、单-烷氨基烷基、或二-烷氨基烷基；和

R5为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、烷氧基、烷氧 基烷基、烷氧基羰基烷基、氨基、单-烷氨基、二-烷氨基、芳氨基、芳烷基 氨基、环烷基氨基、环烷基烷基氨基、氨基烷基、单-烷氨基烷基、或二- 烷氨基烷基。

在结构(IIIB)的化合物的小类中，第一或第二取代基存在于5、7或9 号位置。在一个实施方式中，该第一或第二取代基存在于5或7号位置。

在结构(IIIB)的化合物的另一小类中，第一或第二取代基各自为烷氧基、 芳氧基或由结构(a)、(c)、(d)、(e)或(f)代表的基团；

R3和R4各自为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基；且

R5为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基或环烷基烷基。

在另一实施方式中，该JNK抑制剂具有以下结构(IIIC)：

2-氧杂-1-氮杂-苯并苊-6-酮

(IIIC)

该化合物可以是：(i)未取代的；(ii)单取代的并具有第一取代基，或者 (iii)双取代的并具有第一取代基和第二取代基；

该第一或第二取代基当存在时位于3、4、5、7、8、9或10号位置；

其中该第一和第二取代基在存在时独立地为烷基、羟基、卤素、硝基、 三氟甲基、磺酰、羧基、烷氧羰基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳烷氧基、 芳烷基、环烷基烷氧基、环烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、氨基烷 氧基、单-烷氨基烷氧基、二-烷氨基烷氧基，或由结构(a)、(b)、(c)、(d)、 (e)或(f)代表的基团：

其中R3和R4一起为亚烷基或含杂原子的环状亚烷基，或者R3和R4独 立地为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、芳氧基烷基、烷 氧基烷基、氨基烷基、单-烷氨基烷基、或二-烷氨基烷基；和

R5为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、烷氧基、烷氧 基烷基、烷氧基羰基烷基、氨基、单-烷氨基、二-烷氨基、芳氨基、芳烷基 氨基、环烷基氨基、环烷基烷基氨基、氨基烷基、单-烷氨基烷基、或二- 烷氨基烷基。

在结构(IIIC)的化合物的小类中，第-或第二取代基存在于5、7或9 号位置。在一个实施方式中，该第一或第二取代基存在于5或7号位置。

在结构(IIIC)的化合物的另一小类中，第一或第二取代基各自为烷氧基、 芳氧基、氨基烷基、单-烷氨基烷基、二-烷氨基烷基或由结构(a)、(c)、(d)、 (e)或(f)代表的基团；

R3和R4各自为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基；且

R5为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基或环烷基烷基。

在另一实施方式中，该JNK抑制剂具有以下结构(IIID)：

2，2-二氧代-2H-2l6-蒽并[9，l-cd]异噻唑-6-酮

(IIID)

该化合物可以是：(i)单取代的并在5、7或9号位置具有第一取代基， (ii)双取代的并在5号位置具有第一取代基，在7号位置具有第二取代基， (iii)双取代的并在5号位置具有第一取代基，在9号位置具有第二取代基， 或(iv)双取代的并在7号位置具有第一取代基，在9号位置具有第二取代基；

其中该第一和第二取代基在存在时独立地为烷基、羟基、卤素、硝基、 三氟甲基、磺酰、羧基、烷氧羰基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳烷氧基、 芳烷基、环烷基烷氧基、环烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、氨基烷 氧基、单-烷氨基烷氧基、二-烷氨基烷氧基，或由结构(a)、(b)、(c)、(d)、 (e)或(f)代表的基团：

其中R3和R4一起为亚烷基或含杂原子的环状亚烷基，或者R3和R4独 立地为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、芳氧基烷基、烷 氧基烷基、氨基烷基、单-烷氨基烷基、或二-烷氨基烷基；和

R5为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、烷氧基、烷氧 基烷基、烷氧基羰基烷基、氨基、单-烷氨基、二-烷氨基、芳氨基、芳烷基 氨基、环烷基氨基、环烷基烷基氨基、氨基烷基、单-烷氨基烷基、或二- 烷氨基烷基。

在结构(IIID)的化合物的小类中，第一或第二取代基存在于5或7号位 置。

在结构(IIID)的化合物的另一小类中，该第一和第二取代基在存在时独 立地为烷基、三氟甲基、磺酰、羧基、烷氧羰基、烷氧基、芳基、芳氧基、 芳烷氧基、芳烷基、环烷基烷氧基、环烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧 基、氨基烷氧基、单-烷氨基烷氧基、二-烷氨基烷氧基、或由结构(a)、(b)、 (c)、(d)、(e)或(f)代表的基团。

在结构(IIID)的化合物的另一小类中，第一和第二取代基各自为烷氧基、 芳氧基或由结构(a)、(c)、(d)、(e)或(f)代表的基团；

R3和R4各自为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基；且

R5为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、烷氧羰基或环烷基烷基。

在另一实施方式中，该JNK抑制剂具有以下结构(IIIE)：

蒽并[9，l-cd]异噻唑-6-酮

(IIIE)

该化合物可以是：(i)单取代的并在5、7或9号位置具有第一取代基， (ii)双取代的并在5号位置具有第一取代基，在9号位置具有第二取代基， (iii)双取代的并在7号位置具有第一取代基，在9号位置具有第二取代基， 或(iv)双取代的并在5号位置具有第一取代基，在7号位置具有第二取代基；

其中该第一和第二取代基在存在时独立地为烷基、卤素、羟基、硝基、 三氟甲基、磺酰、羧基、烷氧羰基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳烷氧基、 芳烷基、环烷基烷氧基、环烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、氨基烷 氧基、单-烷氨基烷氧基、二-烷氨基烷氧基，或由结构(a)、(b)、(c)、(d)、 (e)或(f)代表的基团：

其中R3和R4一起为亚烷基或含杂原子的环状亚烷基，或者R3和R4独 立地为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、芳氧基烷基、烷 氧基烷基、氨基烷基、单-烷氨基烷基、或二-烷氨基烷基；和

R5为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、烷氧基、烷氧 基烷基、烷氧基羰基烷基、氨基、单-烷氨基、二-烷氨基、芳氨基、芳烷基 氨基、环烷基氨基、环烷基烷基氨基、氨基烷基、单-烷氨基烷基、或二- 烷氨基烷基。

在结构(IIIE)的化合物的小类中，第一或第二取代基存在于5或7号位 置。

在结构(IIIE)的化合物的另一小类中，该结构(IIIE)的化合物被双取代， 且至少一个取代基为结构(d)或(f)代表的基团。

在结构(IIIE)的化合物的另一小类中，该化合物被单取代。在化合物的 另一个小类中，该化合物在5或7号位置被结构(e)或(f)代表的基团单取代。

在另一实施方式中，该JNK抑制剂具有以下结构(IIIF)：

2H-二苯并[cd，g]吲唑-6-酮

(IIIF)

该化合物可以是：(i)未取代的；(ii)单取代的并具有第一取代基，或者 (iii)双取代的并具有第一取代基和第二取代基；

该第一或第二取代基当存在时位于3、4、5、7、8、9或10号位置；

其中该第一和第二取代基在存在时独立地为烷基、羟基、卤素、硝基、 三氟甲基、磺酰、羧基、烷氧羰基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳烷氧基、 芳烷基、环烷基烷氧基、环烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、氨基烷 氧基、单-烷氨基烷氧基、二-烷氨基烷氧基，或由结构(a)、(b)、(c)、(d)、 (e)或(f)代表的基团：

其中R3和R4一起为亚烷基或含杂原子的环状亚烷基，或者R3和R4独 立地为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、芳氧基烷基、烷 氧基烷基、氨基烷基、单-烷氨基烷基、或二-烷氨基烷基；和

R5为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、烷氧基、烷氧 基烷基、烷氧基羰基烷基、氨基、单-烷氨基、二-烷氨基、芳氨基、芳烷基 氨基、环烷基氨基、环烷基烷基氨基、氨基烷基、单-烷氨基烷基、或二- 烷氨基烷基。

在一个实施方式中，该结构(IIIF)的化合物或其药学上可接受的盐在3、 4、5、7、8、9或10号位置未被取代。

结构(III)的JNK抑制剂可通过本领域技术人员已知的有机合成技术， 以及于2001年2月22日公开的国际公开WO01/12609(特别是第24页6行 至第49页16行的实施例1-7)和2002年8月29日公开的国际公开 WO02/066450(特别是第59-108页的化合物AA-HG)(其全文分别在此引用作 为参考)中描述的方法进行制备。此外，该公开中还具有这些化合物的具体 举例。

结构(III)的JNK抑制剂的示例为：

2H-二苯并[cd，g]吲唑-6-酮；

7-氯-2H-二苯并[cd，g]吲唑-6-酮；

5-二甲氨基-2H-二苯并[cd，g]吲唑-6-酮；

7-苄氧基-2H-二苯并[cd，g]吲唑-6-酮；

N-(6-氧代-2，6-二氢-二苯并[cd，g]吲唑-5-基)-乙酰胺

5-(2-哌啶-1-基-乙氨基)-2H-二苯并[cd，g]吲唑-6-酮；

5-氨基-蒽并[9，l-cd]异噻唑-6-酮；

N-(6-氧代-6H-蒽并[9，l-cd]异噻唑-5-基)-苯酰胺；

7-二甲氨基-蒽并[9.1，l-cd]异噻唑-6-酮；

2-氧杂-1-氮杂-苯并苊-6-酮；

及其药学上可接受的盐。

其它可用于本组合物和方法的JNK抑制剂包括但不限于：在如下文献 中披露的JNK抑制剂：国际公开WO00/39101(特别在第2页第10行至第6 页第12行)；国际公开WO01/14375(特别在第2页第4行至第4页第4行)； 国际公开WO00/56738(特别在第3页第25行至第6页第13行)；国际公开 WO01/27089(特别在第3页第7行至第5页第29行)；国际公开 WO00/12468(特别在第2页第10行至第4页第14行)；欧洲专利公开 1110957(特别在第19页第52行至第21页第9行)；国际公开WO00/75118(特 别在第8页第10行至第11页第26行)；国际公开WO01/12621(特别在第8 页第10行至第10页第7行)；国际公开WO00/64872(特别在第9页第1行 至第106页第2行)；国际公开WO01/23378(特别在第90页第1行至第91 页第1行)；国际公开WO02/16359(特别在第163页第1行至第164页第25 行)；美国专利6,288,089(特别在第22栏第25行至第25栏第35行)；美国 专利6,307,056(特别在第63栏第29行至第66栏第12行)；国际公开 WO00/35921(特别在第23页第5行至第26页第14行)；国际公开 WO01/91749(特别在第29页第1-22行)；国际公开WO01/56993(特别在第 43页至第45页)；以及国际公开WO01/58448(特别在第39页)，其全文分 别在此引用作为参考。

本发明的干细胞采集组合物可包含一种或多种溶剂或复合溶剂以促进 JNK抑制剂的溶解。可包含在该干细胞采集组合物的溶剂或复合溶剂的范 例包括但不限于：二甲亚砜、乙醇、二甲基甲酰胺、乙二醇、丙二醇以及 聚乙二醇。一般而言，仅采用获得特定JNK抑制剂的特定浓度所需量的溶 剂或复合溶剂。优选地，仅采用与干细胞采集和培养相容的溶剂或复合溶 剂，或溶剂或复合溶剂的浓度。

应当指出如果在所示结构和对该结构所给的名称之间存在差异，则应 当侧重所示的结构。此外，如果一种结构或结构部分的立体化学未通过如 粗线或虚线等线条指出，则该结构或结构部分应解释为包含了其所有的立 体异构体。

5.1.2.3其它凋亡抑制剂

本发明的干细胞组合物可包括任何其它的凋亡抑制剂。例如，在不同 的实施方式中，该凋亡抑制剂可以是2，2′-亚甲基双(1，3-环己二 酮)(CalBiochem)；凋亡抑制剂3蛋白(即XIAP，含杆状病毒IAP重复序列 的蛋白4，API 3，哺乳动物IAP同源物A，MIHA，凋亡蛋白3抑制剂，凋 亡蛋白的X连锁抑制剂，X连锁IAP，HILP，IAP样蛋白，ILP)；蛋白Mc1-I 等。

5.1.3 TNFα抑制剂/免疫调节化合物

本发明的组合物可包括一种或多种TNF-α抑制剂，例如，免疫调节化 合物。该免疫调节化合物可以是，例如，沙利度胺或沙利度胺衍生物。

免疫调节化合物的具体例子包括但不限于：取代的苯乙烯的氰基和羧 基衍生物，如美国专利5,929,117中公开的那些；1-氧代-2-(2，6-二氧代-3- 氟哌啶-3-基)-异吲哚啉和1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代-3-氟哌啶-3-基)-异吲哚 啉，如美国专利5,874,448和5,955,476中所述的那些；美国专利5,798,368 中所述的四取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉；1-氧代和1，3- 二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-异吲哚啉(例如，沙利度胺的4-甲基衍生 物)，包括但不限于美国专利5,635,517、6,476,052、6,555,554和6,403,613 中公开的那些；美国专利6,380,239中所述在吲哚啉环的4-或5-位被取代的 1-氧代和1，3-二氧代异吲哚啉(例如，4-(4-氨基-1，3-二氧代异吲哚啉-2-基)-4- 氨甲酰基丁酸)；美国专利6,458,810中所述在2-位被2，6-二氧代-3-羟基哌 啶-5-基取代的异吲哚啉-1-酮和异吲哚啉-1，3-二酮(例如，2-(2，6-二氧代-3-羟 基-5-氟哌啶-5-基)-4-氨基异吲哚啉-1-酮)；美国专利5,698,579和5,877,200 中公开的一类非多肽类环酰胺；氨基沙利度胺，以及氨基沙利度胺的类似 物、水解产物、代谢物、衍生物和前体，以及取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3- 基)-邻苯二甲酰亚胺和取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚，如美 国专利6,281,230和6,316,471中所述的那些；以及异吲哚-酰亚胺化合物， 如2001年10月5日提交的美国专利申请09/972,487、2001年12月21日 提交的美国专利申请10/032,286和国际申请号PCT/US01/50401(国际公开 号WO02/059106)中所述的那些。这里提到的各个专利和专利申请被全文纳 入本文作为参考。免疫调节化合物不包括沙利度胺。

其它具体的免疫调节化合物包括但不限于苯并环上被氨基取代的1-氧 代-和1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-异吲哚啉，如美国专利5,635,517 中所述，该专利纳入本文作为参考。这些化合物具有结构I：

其中X和Y中的一个为C＝O，X和Y中的另一个为C＝O或CH2，R2 为氢或低级烷基，尤其是甲基。具体的免疫调节化合物包括但不限于：

1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-氨基异吲哚啉；

1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基异吲哚啉；

1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-6-氨基异吲哚啉；

1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-7-氨基异吲哚啉；

1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-氨基异吲哚啉；和

1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基异吲哚啉。

其它具体的本发明免疫调节化合物属于一类取代的2-(2，6-二氧代哌啶 -3-基)-邻苯二甲酰亚胺和取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚，如 美国专利6,281,230、6,316,471、6,335,349、和6,476,052，以及国际专利申 请PCT/US97/13375(国际公开号WO98/03502)中所述的那些，这些专利文献 在此分别纳入本文作为参考。代表性的化合物具有下式：

其中：

X和Y中的一个为C＝O，X和Y中的另一个为C＝O或CH2；

(i)R1、R2、R3、和R4分别独立地为卤素、含有1至4个碳原子的烷基、 或含有1至4个碳原子的烷氧基，或者(ii)R1、R2、R3、和R4之一为-NHR5， 其余为氢；

R5为氢或含有1至8个碳原子的烷基；

R6为氢、含有1至8个碳原子的烷基、苄基、或卤素；

条件是如果X和Y都为C＝O且(i)R1、R2、R3、和R4都为氟或者(ii)R1、 R2、R3、和R4之一为氨基，则R6不为氢。

代表这类的化合物具有下式：

其中R1为氢或甲基。在单独的实施方案中，本发明包括使用这些化合 物的对映异构体纯的形式(例如旋光纯(R)或(S)对映异构体)。

其它具体的本发明免疫调节化合物属于异吲哚-酰亚胺类化合物，该类 化合物公开于美国专利申请公开2003/0096841和2003/0045552，以及国际 申请号PCT/US01/50401(国际公开号WO02/059106)，它们分别在此纳入本 文作为参考。代表性的化合物具有式II：

及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映异构体、 非对映异构体、外消旋物、及立体异构体的混合物，其中：

X和Y中的一个为C＝O，另一个为CH2或C＝O；

R1为H、(C1-C8)烷基、(C3-C7)环烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄 基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)杂环烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)杂芳基、C(O)R3、 C(S)R3、C(O)OR4、(C1-C8)烷基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基 -C(O)OR5、C(O)NHR3、C(S)NHR3、C(O)NR3R3′、C(S)-NR3R3′或(C1-C8)烷基 -O(CO)R5；

R2为H、F、苄基、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、或(C2-C8)炔基；

R3和R3′独立地为(C1-C8)烷基、(C3-C7)环烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔 基、苄基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)杂环烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)杂芳基、 (C0-C8)烷基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基-C(O)OR5、(C1-C8)烷基 -O(CO)R5、或C(O)OR5；

R4为(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、(C1-C4)烷基-OR5、苄基、 芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)杂环烷基、或(C0-C4)烷基-(C2-C5)杂芳基；

R5为(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基、或(C2-C5) 杂芳基；

每个存在的R6独立地为H、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、 苄基、芳基、(C2-C5)杂芳基、或(C0-C8)烷基-C(O)O-R5，或者多个R6基团连 接起来形成杂环烷基；

n为0或1；和

*表示手性碳中心。

在式II的具体化合物中，当n为0时，则R1为(C3-C7)环烷基、(C2-C8) 烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)杂环烷基、(C0-C4)烷 基-(C2-C5)杂芳基、C(O)R3、C(O)OR4、(C1-C8)烷基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、 (C1-C8)烷基-C(O)OR5、C(S)NHR3、或(C1-C8)烷基-O(CO)R5；

R2为H或(C1-C8)烷基；和

R3为(C1-C8)烷基、(C3-C7)环烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、 芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)杂环烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)杂芳基、(C5-C8)烷 基-N(R6)2；(C0-C8)烷基-NH-C(O)O-R5；(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基 -C(O)OR5、(C1-C8)烷基-O(CO)R5、或C(O)OR5；其它可变量具有相同的定 义。

在式II的其它具体化合物中，R2为H或(C1-C4)烷基。

在式II的其它具体化合物中，R1为(C1-C8)烷基或苄基。

在式II的其它具体化合物中，R1为氢、(C1-C8)烷基、苄基、CH2OCH3、 CH2CH2OCH3，或者

在式II的化合物的另一实施方式中，R1为

或

其中Q为O或S，每个存在的R7独立地为H、(C1-C8)烷基、(C3-C7) 环烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基、卤素、(C0-C4)烷基-(C1-C6) 杂环烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)杂芳基、(C0-C8)烷基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、 (C1-C8)烷基-C(O)OR5、(C1-C8)烷基-O(CO)R5、或C(O)OR5，或者相邻的R7 可一起形成双环烷基或芳环。

在式II的其它具体化合物中，R1为C(O)R3。

在式II的其它具体化合物中，R3为(C0-C4)烷基-(C2-C5)杂芳基、(C1-C8) 烷基、芳基、或(C0-C4)烷基-OR5。

在式II的其它具体化合物中，杂芳基为吡啶基、呋喃基、或噻吩基。

在式II的其它具体化合物中，R1为C(O)OR4。

在式II的其它具体化合物中，C(O)NHC(O)中的H可以被(C1-C4)烷基、 芳基、或苄基取代。

这类化合物的其它例子包括但不限于：[2-(2，6-二氧代-哌啶-3-基)-1，3- 二氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-4-基甲基]-酰胺；(2-(2，6-二氧代-哌啶-3-基)-1，3- 二氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-4-基甲基)-氨基甲酸叔丁酯；4-(氨基甲 基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮；N-(2-(2，6-二氧代-哌啶-3- 基)-1，3-二氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-4-基甲基)-乙酰胺；N-{(2-(2，6-二氧代(3- 哌啶基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)甲基}环丙基-甲酰胺；2-氯-N-{(2-(2，6-二 氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)甲基}乙酰胺；N-(2-(2，6-二氧代 (3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)-3-吡啶基甲酰胺；3-{1-氧代-4-(苄基 氨基)异吲哚啉-2-基}哌啶-2，6-二酮；2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-4-(苄基氨基) 异吲哚啉-1，3-二酮；N-{(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基) 甲基}丙酰胺；N-{(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)甲 基}-3-吡啶基甲酰胺；N-{(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4- 基)甲基}庚酰胺；N-{(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基) 甲基}-2-呋喃基甲酰胺；{N-(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉 -4-基)氨基甲酰基}乙酸甲酯；N-(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚 啉-4-基)戊酰胺；N-(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)-2- 噻吩基甲酰胺；N-{[2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基]甲 基}(丁基氨基)甲酰胺；N-{[2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4- 基]甲基}(辛基氨基)甲酰胺；和N-{[2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异 吲哚啉-4-基]甲基}(苄基氨基)甲酰胺。

其它具体的本发明免疫调节化合物属于异吲哚-酰亚胺类化合物，该类 化合物公开于美国专利申请公开2O02/0045643、国际公开WO98/54170和 美国专利6,395,754，它们在此分别纳入本文作为参考。代表性的化合物具 有式III：

及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映异构体、 非对映异构体、外消旋物、及立体异构体的混合物，其中：

X和Y中的一个为C＝O，另一个为CH2或C＝O；

R为H或CH2OCOR′；

(i)R1、R2、R3、和R4分别独立地为卤素、含有1至4个碳原子的烷基、 或含有1至4个碳原子的烷氧基，或者(ii)R1、R2、R3、和R4之一为硝基或 -NHR5，其余R1、R2、R3、和R4为氢；

R5为氢或含有1至8个碳的烷基；

R6为氢、含有1至8个碳原子的烷基、苯并、氯、或氟；

R′为R7-CHR10-N(R8R9)；

R7为间亚苯基、对亚苯基或-(CnH2n)-，其中n值为0至4；

R8和R9分别独立地为氢或含有1至8个碳原子的烷基，或者R8和R9 一起构成四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基、或-CH2CH2X1CH2CH2-，其中 X1为-O-、-S-或-NH-；

R10为氢、含有1至8个碳原子的烷基、或苯基；和

*表示手性碳中心。

其它代表性化合物具有下式：

其中：

X和Y中的一个为C＝O，X和Y中另一个为C＝O或CH2；

(i)R1、R2、R3、和R4分别独立地为卤素、含有1至4个碳原子的烷基、 或含有1至4个碳原子的烷氧基，或者(ii)R1、R2、R3、和R4之一为-NHR5， 其余R1、R2、R3、和R4为氢；

R5为氢或含有1至8个碳原子的烷基；

R6为氢、含有1至8个碳原子的烷基、苯并、氯、或氟；

R7为间亚苯基、对亚苯基或-(CnH2n)-，其中n值为0至4；

R8和R9分别独立地为氢或含有1至8个碳原子的烷基，或者R8和R9 一起构成四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基、或-CH2CH2X1CH2CH2-，其中 X1为-O-、-S-或-NH-；

R10为氢、含有1至8个碳原子的烷基、或苯基。

其它代表性化合物具有下式：

其中：

X和Y中的一个为C＝O，X和Y中另一个为C＝O或CH2；

(i)R1、R2、R3、和R4分别独立地为卤素、含有1至4个碳原子的烷基、 或含有1至4个碳原子的烷氧基，或者(ii)R1、R2、R3、和R4之一为硝基或 被保护的氨基，其余R1、R2、R3、和R4为氢；和

R6为氢、含有1至8个碳原子的烷基、苯并、氯、或氟。

其它代表性化合物具有下式：

其中；

X和Y中的一个为C＝O，X和Y中另一个为C＝O或CH2；

(i)R1、R2、R3、和R4分别独立地为卤素、含有1至4个碳原子的烷基、 或含有1至4个碳原子的烷氧基，或者(ii)R1、R2、R3、和R4之一为-NHR5， 其余R1、R2、R3、和R4为氢；

R5为氢、含有1至8个碳原子的烷基、或CO-R7-CH(R10)NR8R9，其中 R7、R8、R9、和R10分别如本文所定义；和

R6为含有1至8个碳原子的烷基、苯并、氯、或氟。

所述化合物的具体例子具有下式：

其中：

X和Y中的一个为C＝O，X和Y中另一个为C＝O或CH2；

R6为氢、含有1至8个碳原子的烷基、苄基、氯、或氟；

R7为间亚苯基、对亚苯基或-(CnH2n)-，其中n值为0至4；

R8和R9分别独立地为氢或含有1至8个碳原子的烷基，或者R8和R9 一起构成四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基、或-CH2CH2X1CH2CH2-，其中 X1为-O-、-S-或-NH-；和

R10为氢、含有1至8个碳原子的烷基、或苯基。

本发明的优选免疫调节化合物为4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异 吲哚啉-1，3-二酮和3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮。 可通过标准合成方法获得所述化合物(参见例如美国专利5,635,517，该文献 被纳入本文作为参考)。可从Celgene Corporation，Warren，NJ获得所述化合 物。4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮具有以下化学结 构：

化合物3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮具有以下 化学结构：

在另-个实施方案中，本发明的具体免疫调节化合物包括3-(4-氨基-1- 氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的多晶型形式，如2003年9月4 日提交的美国临时申请60/499,723、和2004年9月3日提交的相应的美国 非临时申请公开的形式A、B、C、D、E、F、G和H，这两个文献均被纳 入本文作为参考。例如，3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6- 二酮的A型是非溶剂化的晶体物质，能够从非水性溶剂体系中获得。A型 的X射线粉末衍射图在大约8、14.5、16、17.5、20.5、24和26度2θ处包 括明显的峰，差示扫描量热法最大熔解温度为约270℃。A型是弱吸湿或不 吸湿的，显示是目前为止发现的3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌 啶-2，6-二酮的热力学最稳定的无水多晶型。

3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的B型是半水合 的晶体物质，能够从各种溶剂体系中获得，包括但不限于己烷、甲苯和水。 B型的X射线粉末衍射图在大约16、18、22和27度2θ处包括明显的峰， DSC曲线在约146℃和268℃有吸热，通过热阶显微镜实验确定为脱水和熔 化。互变研究显示，B型在水性溶剂体系中转化为E型，在丙酮和其它无 水体系中转化为其它型。

3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的C型是半溶剂 化的晶体物质，能够从溶剂例如但不限于丙酮中获得。C型的X射线粉末 衍射图在大约15.5和25度2θ处包括明显的峰，差示扫描量热法最大熔解 温度为约269℃。C型在约85％RH以下不吸湿，但能够在更高的相对湿度 下转化为B型。

3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的D型是从乙腈 和水的混合物中制备的溶剂化多晶型晶体。D型的X射线粉末衍射图在大 约27和28度2θ处包括明显的峰，差示扫描量热法最大熔解温度为约270℃。 D型是弱吸湿或不吸湿的，但当处于更高的相对湿度下时通常将转化为B 型。

3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的E型是二水合 的晶体物质，能够如下获得：将3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌 啶-2，6-二酮在水中制浆，在比率为约9:1的丙酮：水溶剂体系中缓慢蒸发3-(4- 氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮。E型的X射线粉末衍射 图在大约20、24.5和29度2θ处包括明显的峰，差示扫描量热法最大熔解 温度为约269℃。E型在丙酮溶剂体系中可转化为C型，在THF溶剂体系 中可转化为G型。在水性溶剂体系中，E型显示为最稳定的形式。对E型 进行的去溶剂实验显示，当在约125℃加热约五分钟时，E型能够转化为B 型。当在约175℃加热约五分钟时，B型能够转化为F型。

3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的F型是非溶剂 化的晶体物质，能够从对E型的脱水中获得。F型的X射线粉末衍射图案 在大致19、19.5和25度2θ包括明显的峰，差示扫描量热法最大熔解温度 为约269℃。

3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的G型是非溶剂 化的晶体物质，能够从B型和E在溶剂例如但不限于四氢呋喃(THF)中制浆 而获得。G型的X射线粉末衍射图在大约21、23和24.5度2θ处包括明显 的峰，差示扫描量热法最大熔解温度为约267℃。

3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的H型是部分水 合(约0.25摩尔)的晶体物质，能够通过将E型暴露在0％相对湿度而获得。 H型的X射线粉末衍射图在大约15、26和31度2θ处包括明显的峰，差示 扫描量热法最大熔解温度为约269℃。

本发明的其它具体免疫调节化合物包括但不限于1-氧代-2-(2，6-二氧代 -3-氟哌啶-3-基)-异吲哚啉和1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代-3-氟哌啶-3-基)-异吲 哚啉，如美国专利5,874,448和5,955,476中所述的那些，这两个文献被分 别纳入本文作为参考。代表性化合物具有下式：

其中Y为氧或H2，且

R1、R2、R3、和R4分别独立地为氢、卤素、含有1至4个碳原子的烷 基、或含有1至4个碳原子的烷氧基、或氨基。

本发明的其它具体免疫调节化合物包括但不限于美国专利5,798,368中 所述的四取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉，该文献被纳入本 文作为参考。代表性化合物具有下式：

其中R1、R2、R3、和R4分别独立地为卤素、含有1至4个碳原子的烷 基、或含有1至4个碳原子的烷氧基。

本发明的其它具体免疫调节化合物包括但不限于美国专利6,403,613中 公开的1-氧代和1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶3-基)-异吲哚啉，该文献被纳 入本文作为参考。代表性化合物具有下式：

其中：

Y为氧或H2，

R1和R2中的第一个为卤素、烷基、烷氧基、烷氨基、二烷基氨基、氰 基、或氨基甲酰基，R1和R2中的第二个独立于第一个，为氢、卤素、烷基、 烷氧基、烷氨基、二烷基氨基、氰基、或氨基甲酰基，和

R3为氢、烷基、或苄基。

所述化合物的代表性例子具有下式：

其中R1和R2中第一个为卤素、包含1至4个碳原子的烷基、包含1 至4个碳原子的烷氧基、其中每个烷基包含1至4个碳原子的二烷基氨基、 氰基、或氨基甲酰基，

R1和R2中的第二个独立于第一个，为氢、卤素、包含1至4个碳原子 的烷基、包含1至4个碳原子的烷氧基、其中烷基包含1至4个碳原子的 烷基氨基、其中每个烷基包含1至4个碳原子的二烷基氨基、氰基、或氨 基甲酰基，和

R3为氢、包含1至4个碳原子的烷基、或苄基。

具体例子包括但不限于1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-甲基异吲哚 啉。

其它代表性化合物具有下式：

其中R1和R2中的第一个为卤素、包含1至4个碳原子的烷基、包含1 至4个碳原子的烷氧基、其中每个烷基包含1至4个碳原子的二烷基氨基、 氰基、或氨基甲酰基，

R1和R2中的第二个独立于第一个，为氢、卤素、包含1至4个碳原子 的烷基、包含1至4个碳原子的烷氧基、其中烷基包含1至4个碳原子的 烷基氨基、其中每个烷基包含1至4个碳原子的二烷基氨基、氰基、或氨 基甲酰基，和

R3为氢、包含1至4个碳原子的烷基、或苄基。

具体例子包括但不限于1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-甲基异吲哚 啉。

本发明的其它具体免疫调节化合物包括但不限于美国专利6,380,239和 2004年7月28日提交的共同未决美国申请10/900,270中所述在吲哚啉环的 4-或5-位被取代的1-氧代和1，3-二氧代异吲哚啉，所述文献被纳入本文作为 参考。代表性化合物是具有下式的化合物及其盐：

其中标有C*的碳原子构成手性中心(当n不为零而且R1与R2不相同 时)；X1和X2中一个为氨基、硝基、包含一至六个碳的烷基、或NH-Z，X1 和X2中另一个为氢；R1和R2分别独立地为羟基或NH-Z；R3为氢、包含一 至六个碳的烷基、卤素、或卤代烷基；Z为氢、芳基、包含一至六个碳的烷 基、甲酰基、或包含一至六个碳的酰基；n值为0、1、或2；条件是如果 X1为氨基并且n为1或2，则R1和R2不同时为羟基。

其它代表性化合物为具有下式的化合物：

其中当n不为零而且R1与R2不相同时，标有C*的碳原子构成手性中 心；X1和X2中一个为氨基、硝基、包含一至六个碳的烷基、或NH-Z，X1 和X2中另一个为氢；R1和R2分别独立地为羟基或NH-Z；R3为包含一至六 个碳的烷基、卤素、或氢；Z为氢、芳基、包含一至六个碳的烷基、或包含 一至六个碳的酰基；n值为0、1、或2。

具体的例子包括但不限于具有以下结构的2-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢- 异吲哚-2-基)-4-氨基甲酰基-丁酸和4-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2- 基)-4-氨基甲酰基-丁酸，及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、和立体 异构体：

和

其它代表性化合物为具有下式的化合物及其盐：

其中当n不为零而且R1与R2不相同时，标有C*的碳原子构成手性中 心；X1和X2中一个为氨基、硝基、包含一至六个碳的烷基、或NH-Z，X1 和X2中另一个为氢；R1和R2分别独立地为羟基或NH-Z；R3为包含一至六 个碳的烷基、卤素、或氢；Z为氢、芳基、烷基、或包含一至六个碳的酰基； n值为0、1、或2。

具体例子包括但不限于：分别具有下列结构的4-氨基甲酰基-4-{4-[(呋 喃-2-基-甲基)-氨基]-1，3-二氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基}-丁酸、4-氨基甲酰基 -2-{4-[(呋喃-2-基-甲基)-氨基]-1，3-二氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基}-丁酸、 2-{4-[(呋喃-2-基-甲基)-氨基]-1，3-二氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基}-4-苯基氨基 甲酰基-丁酸、和2-{4-[(呋喃-2-基-甲基)-氨基]-1，3-二氧代-1，3-二氢-异吲哚

-2-基}-戊二酸，及其可药用盐、溶剂化物、前药、和立体异构体：

所述化合物的其它具体例子具有下式：

其中X1和X2中一个为硝基、或NH-Z，X1和X2中另一个为氢；

R1和R2分别独立地为羟基或NH-Z；

R3为包含一至六个碳的烷基、卤素、或氢；

Z为氢、苯基、包含一至六个碳的酰基、或包含一至六个碳的烷基；和

n值为0、1、或2；

条件是如果X1和X2中一个为硝基并且n为1或2，则R1和R2不是羟 基；和

如果-COR2和-(CH2)nCOR1不相同，则标有C*的碳原子构成手性中心。

其它代表性化合物具有下式：

其中X1和X2中一个为包含一至六个碳的烷基；

R1和R2分别独立地为羟基或NH-Z；

R3为包含一至六个碳的烷基、卤素、或氢；

Z为氢、苯基、包含一至六个碳的酰基、或包含一至六个碳的烷基；和

n值为0、1、或2；和

如果-COR2和-(CH2)nCOR1不相同，则标有C*的碳原子构成手性中心。

本发明的它具体免疫调节化合物包括但不限于美国专利6,458,810所述 在2-位用2，6-二氧代-3-羟基哌啶-5-基取代的异吲哚啉-1-酮和异吲哚啉-1，3- 二酮，该文献被纳入本文作为参考。代表性化合物具有下式：

其中：

标有*的碳原子构成手性中心；

X为-C(O)-或-CH2-；

R1为包含1至8个碳原子的烷基或-NHR3；

R2为氢、包含1至8个碳原子的烷基、或卤素；和

R3为氢；

包含1至8个碳原子的烷基，未取代或被包含1至8个碳原子的烷氧 基、卤素、氨基、或包含1至4个碳原子的烷基氨基取代；

包含3至18个碳原子的环烷基；

苯基，未取代或被包含1至8个碳原子的烷基、包含1至8个碳原子 的烷氧基、卤素、氨基、或包含1至4个碳原子的烷基氨基取代；

苄基，未取代或用包含1至8个碳原子的烷基、包含1至8个碳原子 的烷氧基、卤素、氨基、或包含1至4个碳原子的烷基氨基、或-COR4取代， 其中：

R4为氢；

包含1至8个碳原子的烷基，未取代或用包含1至8个碳原子的烷氧 基、卤素、氨基、或包含1至4个碳原子的烷基氨基取代；

包含3至18个碳原子的环烷基；

苯基，未取代或用包含1至8个碳原子的烷基、包含1至8个碳原子 的烷氧基、卤素、氨基、或包含1至4个碳原子的烷基氨基取代；或者

苄基，未取代或用包含1至8个碳原子的烷基、包含1至8个碳原子 的烷氧基、卤素、氨基、或包含1至4个碳原子的烷基氨基取代。

本发明的化合物可通过商业购得，或者按照本文公开的专利或专利申 请中描述的方法制备。此外，光学纯的化合物可以是不对称合成的，或者 是用已知的拆分剂或手性柱以及其它标准有机化学合成技术拆分的。

本发明的组合物还可包括如美国申请公开号2003/0235909(在此全文引 用作为参考)中所述的免疫调节化合物。

5.1.4血管舒张剂

在另一实施方式中，本发明的干细胞组合物包括血管舒张剂。该包含 血管舒张剂的干细胞采集组合物在通过灌注哺乳动物胎盘采集胎盘来源干 细胞中特别有用。该血管舒张剂可以是本领域已知的任意血管舒张剂，包 括天然存在的血管舒张剂以及人工合成的血管舒张剂。在一个实施方式中， 该血管舒张剂为抗高血压药物。该抗高血压药物可以是可激活鸟苷酸环化 酶、ADP-核糖转移酶或环氧化酶、或同时激活三者，和/或者可以抑制脂氧 合酶的药物。该血管舒张剂可以是有机或无机化合物，例如心房钠尿肽 (ANP)、促肾上腺皮质激素、促肾上腺皮质激素释放激素、硝普钠、肼苯哒 嗪、三磷酸腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸镁等。在另一实施方式中，该血 管舒张剂为磷酸二酯酶抑制剂(例如，双丁酰腺苷、甲基异丁基黄嘌呤、吲 哚利旦、咯利普兰、2-o-丙氧基苯基-8-氮杂腺嘌呤-6-酮、曲喹辛、氨吡酮、 米力侬、氨茶碱或双嘧达莫)。

对于通过灌注采集干细胞，肼苯哒嗪的使用浓度可以为约0.1mM至约 10mM。类似地，腺苷的使用浓度可以为约0.001mM至约10.0mM；三磷酸 腺苷的使用浓度可以为约0.1mM至约1000mM；吲哚美辛的使用浓度可以 为约1mg/kg至约20mg/kg(其中“kg”为如胎盘等器官的重量)；或者硫酸镁 的使用浓度可以为约0.1mM至约20mM。

5.1.5坏死抑制剂

本发明进一步提供了包含坏死抑制剂的干细胞采集组合物。该坏死抑 制剂可以是本领域任意生理学上可接受的坏死抑制剂。

因此，在一个实施方式中，本发明提供了包含处于生理学上可接受的 溶液中的坏死抑制剂的干细胞采集组合物。在另一实施方式中，本发明提 供了包含处于生理学上可接受的溶液中的坏死抑制剂和凋亡抑制剂的干细 胞采集组合物。在特定的实施方式中，该坏死抑制剂为2-(1H-吲哚-3-基)-3- 戊氨基-马来酰亚胺、二硫代氨基甲酸吡咯烷或氯硝西泮。在另一特定的实 施方式中，该包含了坏死抑制剂、或坏死抑制剂和凋亡抑制剂的干细胞组 合物可包含一种或多种酶，例如，上文5.1.1节描述的一种或多种酶；上文 5.1.2节描述的凋亡抑制剂；免疫调节化合物，例如上文5.1.3节描述的免疫 调节化合物；血管舒张剂，例如上文5.1.4节描述的血管舒张剂，或携氧全 氟化碳，例如，下文5.1.6节描述的携氧全氟化碳。

在一种实施方式中，本发明提供了分离干细胞的方法，其包括将所述 干细胞与包含坏死抑制剂的溶液相接触，然后分离所述干细胞。在另一实 施方式中，本发明提供了分离干细胞的方法，其包括将所述干细胞与包含 坏死抑制剂和凋亡抑制剂的溶液相接触，然后分离所述干细胞。在特定的 实施方式中，该坏死抑制剂为2-(1H-吲哚-3-基)-3-戊氨基-马来酰亚胺，二 硫代氨基甲酸吡咯烷或氯硝西泮等。

5.1.6携氧全氟化碳

本发明的干细胞采集组合物可进一步包含一种或多种携氧全氟化碳。 一般而言，携氧全氟化碳具有水不溶性，而干细胞采集组合物通常为生理 学上可接受的水溶液。因此，该包含携氧全氟化碳的干细胞采集组合物可 包含单独的水相和全氟化碳相，或作为乳状液同时包含两相。在采集过程 中干细胞可与两相或乳状组合物相接触，或先用水相再接触全氟化碳相进 行采集。例如，器官(例如，胎盘)中的干细胞可在灌注或组织破碎(例如， 酶消化)过程中与包含凋亡抑制剂(例如，JNK抑制剂)的生理学上可接受的 水溶液相接触，然后将所得的细胞悬浮液与全氟化碳相接触。也可在干细 胞采集前将该包含凋亡抑制剂的生理学上可接受的水溶液与全氟化碳混 合，例如乳化。然后该乳状液可用作如灌注溶液或者可悬浮来自破碎组织 或其部分的细胞的溶液。

因此，在一个实施方式中，所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳在与待保 存的干细胞接触前包含在单个溶液中(例如，乳状液)。在另一实施方式中， 在所述接触前所述凋亡抑制剂包含于第一溶液中，而所述的全氟化碳包含 在第二溶液中。

该携氧全氟化碳可包括单种或多种全氟化碳。例如，该携氧全氟化碳 可包括全氟烷基或全氟醚。在特定的实施方式中，该携氧全氟化碳可包含 基本结构为CnF2n+1R或CnF2nR2的脂肪族全氟化碳，其中n为8至12的整 数，R为脂肪族部分；基本结构为CnF2n+1-O-Cn-F2n+1的全氟乙醚；全氟辛乙 烷；全氟辛癸烷；全氟萘烷；全氟甲基二环[3.3.1]-壬烷；全氟二甲基二环 壬烷；全氟-2，2，4，4-四甲基戊烷；全氟三丙基胺；双(F-丁基)乙烯；(F-异丙 基)(F-己基)乙烯；全氟甲基金刚烷；全氟二甲基金刚烷；F-N-甲基十氢异喹 啉；F-4-甲基八氢喹嗪烷；全氟溴辛烷；全氟溴癸烷；α，ω-二氯-F-癸烷；α，ω- 二溴-F-癸烷；C10F21CH＝CH2；C10F21CH2CH3等。

在干细胞采集组合物中存在的所述携氧全氟化碳可在乳状液中以约 5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、 65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、 120％、或约125％重量/乳状液体积的量存在。优选地，该包含携氧全氟化 碳的干细胞采集组合物进一步包含乳化剂(例如，表面活性剂)。该种乳化剂 可以是任意生理学上可接受的乳化剂，优选卵磷脂。该乳化剂可以约0.1％ 至约7％(w/v)的量存在。

在优选的实施方式中，所述干细胞采集组合物包含第一全氟化碳和比 该第一全氟化碳具有更高分子量的第二全氟化碳。全氟化碳总体积中通常 包含约50％至99.9％的第一全氟化碳，以及约0.1％至约50％的第二全氟 化碳。在一个实施方式中，该第一全氟化碳为全氟溴辛烷，而该第二全氟 化碳为全氟溴癸烷。

所述干细胞采集组合物的携氧全氟化碳和水性成分可通过标准乳化技 术进行乳化，例如，美国专利4,987,154中描述的高压匀浆；在烧瓶中晃动， 在Manton-Gaulin混合器或微射流机(Microfluidics Corp.，Newton，Mass.) 中将乳化成分机械或超声乳化等。当干细胞采集组合物包含两种或多种不 同的携氧全氟化碳时，这些种类可按预期比例与乳化剂一起与水相混合。 通常可通过简单混合或掺合各种成分来制备预乳化混合物。然后在预期的 乳化装置中乳化该预乳化液。当干细胞在两相溶液中采集时，优先选择乳 化技术以尽量降低对干细胞的损害。

除了包含在干细胞采集组合物中之外，携氧全氟化碳还可用于从胎盘 采集场所(例如，分娩室)至干细胞采集场所的运输过程中的胎盘保存。在一 个实施方式中，供干细胞采集的胎盘至少在胎盘采集和干细胞采集之间的 部分时间内与包含一种或多种携氧全氟化碳的组合物相接触。优选地，该 胎盘在胎盘采集和干细胞采集之间的大部分时间内均与携氧全氟化碳相接 触。在另一实施方式中，至少在胎盘采集和干细胞采集之间的部分时间内 与包含一种或多种携氧全氟化碳以及一种或多种器官保存介质(例如，UW 溶液；参见下文5.3节)的组合物相接触。

5.1.7其它成分

所述干细胞采集组合物可包含能够减少由于采集或贮存、有机物污染 等原因引起的细胞损伤，或有利于干细胞的采集的其它成分。

所述干细胞采集组合物可包含干细胞造血作用的驱动剂和/或刺激剂， 例如，含量为例如1-10mg/kg胎盘重量的VLA-4(极晚期抗原)拮抗剂(例如， α4整合素拮抗剂如抗体，如那他珠单抗或抗-磷酸-整合素α4(Ser988)，clone 6.33(Upstate Cell Signaling Solutions)或肽(例如，苯乙酰-亮氨酸-天冬氨酸- 苯丙氨酸-D-脯氨酸酰胺(Cytel Corp.，San Diego CA)))，浓度为例如 0.01-10mg/kg(单独或联合G-CSF)的CXCR-4激动剂(例如，MOZOBILTM(还 称为AMD3100；AnorMED，Langley，BC，Canada))；浓度为0.01-10mg/kg 的SDF-1(基质细胞衍生因子)类似物(例如，来自Chemokine Therapeutics Corp.的CTCE-0214)或抗-SDF-1抗体等。

所述干细胞采集组合物可包括杀菌或抑茵有效量的抗生素。在特定的 非限制性实施方式中，该抗生素为大环内酯物(例如托普霉素)、头孢菌素(例 如头孢氨苄、头孢拉定、头孢呋辛、头孢丙烯、头孢克洛、头孢克肟、头 孢羟氨苄)、克拉霉素、红霉素、青霉素(例如青霉素V)或喹诺酮(例如氧氟 沙星、环丙沙星或诺氟沙星)、四环素等。在特定的实施方式中，该抗生素 对革兰氏(+)和/或革兰氏(-)细菌，例如铜绿假单孢菌、金黄色葡萄球菌等具 有活性。

所述干细胞采集组合物还可包括一种或多种下列化合物：腺苷(约1mM 至约50mM)；D-葡萄糖(约20mM至约100mM)；镁离子(约1mM至约 50mM)；分子量大于20,000道尔顿的大分子，在一个实施例中，其存在的 量足以维持内皮完整性和细胞活力(例如，存在量为约25g/l至约100g/l，或 约40g/l至约60g/l的合成或天然存在的胶体，如葡聚糖等多糖或聚乙二醇)； 抗氧化剂(例如，存在量为约25μM至约100μM的丁基羟基茴香醚、二丁基 羟基甲苯、谷胱甘肽、维生素C或维生素E)；还原剂(例如存在量为约0.1mM 至约5mM的N-乙酰半胱氨酸)；防止钙进入细胞的药剂(例如，存在量为约 2μM至约25μM维拉帕米)；硝酸甘油(例如，约0.05g/L至约0.20g/L)；抗 凝血剂，在一个实施例中，其存在的量足以帮助防止残留血凝块(例如，以 约1000单位/1至约100,000单位/l存在的肝磷脂或水蛭素)；或含有阿米洛 利的化合物(例如，存在量为约1.0μM至约5μM的阿米洛利、乙基异丙基 阿米洛利、环己阿米洛利林、二甲基阿米洛利或异丁基阿米洛利)。

5.2使用本发明的组合物采集干细胞的方法

本发明进一步提供了使用上述干细胞采集组合物采集和分离胎盘干细 胞的方法。

在一个实施方式中，本发明提供了分离干细胞的方法，其包括将所述 干细胞与包含坏死抑制剂(例如，上文5.1.5节描述的坏死抑制剂)的溶液相 接触，和分离所述干细胞。在另一实施方式中，本发明提供了分离干细胞 的方法，其包括将所述干细胞与包含凋亡抑制剂(例如，上文5.1.2节描述的 凋亡抑制剂)的溶液相接触，和分离所述干细胞。在另一实施方式中，本发 明提供了分离干细胞的方法，其包括将所述干细胞与包含坏死抑制剂(例如， 上文5.1.5节描述的坏死抑制剂)以及凋亡抑制剂(例如，上文5.1.2节描述的 凋亡抑制剂)的溶液相接触，和分离所述干细胞。在特定的实施方式中，该 坏死抑制剂为2-(1H-吲哚-3-基)-3-戊氨基-马来酰亚胺、二硫代氨基甲酸吡 咯烷或氯硝西泮等。在特定实施方式中，该凋亡抑制剂为半胱氨酸蛋白酶 抑制剂或c-Jun N-末端激酶(JNK)抑制剂。在另一实施方式中，该JHK抑制 剂在所述分离前不调节所述干细胞的分化或增殖，即该JNK抑制剂不会使 干细胞在与该JNK抑制剂接触过程中发生可检测的增殖或分化变化。本方 法中的干细胞可从哺乳动物胎盘、脐带、胎盘血或脐带血分离得到。该方 法还包括将该干细胞与携氧全氟化碳(例如，5.1.6节所描述的携氧全氟化碳) 接触。在另一实施方式中，本方法包括将所述干细胞与酶，如蛋白酶接触。 该蛋白酶可以是例如基质金属蛋白酶或中性蛋白酶，且可以是例如胶原酶、 嗜热菌蛋白酶或分散酶。在另一实施方式中，该干细胞可与透明质酸酶等 粘多糖酶相接触。

本方法采用的干细胞采集组合物可包含溶液，例如盐溶液或培养基。 在部分实施方式中，该溶液包含羟乙基淀粉、乳糖酸阴离子以及棉子糖， 和/或UW溶液。

在优选实施方式中，所述干细胞在分离过程中未暴露于缺氧或剪切应 力，或者该种应力被尽可能地减小。例如，在一个实施方式中，该干细胞 在分离过程中在缺氧条件下暴露少于六小时、少于两小时、少于一小时或 少于30分钟，其中缺氧条件为低于正常血氧浓度的氧浓度。

5.2.1物理破碎

在一个实施方式中，可通过物理破碎，例如酶消化哺乳动物器官，例 如胎盘而从该器官采集干细胞。例如，该器官或其部分可在接触本发明的 干细胞采集组合物的同时进行，例如碾碎、剪切、绞碎、切块、剁碎、浸 渍等，随后以一种或多种酶消化所述组织。该器官或其部分还可物理破碎 并以一种或多种酶消化，然后将所得材料浸入或混合于本发明的干细胞采 集组合物中。本发明的干细胞采集组合物可包含酶。只要通过台盼蓝拒染 法等方法测定的所述器官中大量、优选大部分、优选至少50％、60％、70％、 80％、90％、95％、98％或99％的细胞存活，任何物理破碎的方法均适用。 优选地，通过台盼蓝拒染法等方法测定，该破碎方法可使所述器官中大量、 优选大部分、优选至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％ 的干细胞存活。

可采用任意酶的组合，例如，上文5.1.1节披露的一种或多种蛋白酶和 /或粘多糖酶。例如，胎盘组织可通过单独或联合采用胶原酶(例如，胶原酶 I，II，III或IV)、分散酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶等进行消化。组织消化酶 的常见浓度包括，例如胶原酶I和胶原酶IV为50-200U/mL，分散酶为1-10 U/mL，弹性蛋白酶为10-100U/mL。蛋白酶可组合使用，即在同一消化反 应中采用两种或多种蛋白酶或依次使用以释放胎盘干细胞。例如，在一个 实施例中，先以约2mg/ml的胶原酶I在37℃下消化胎盘或其部分30分钟， 随后使用0.25％的胰蛋白酶消化10分钟。

在另一个实施方式中，在使用所述干细胞采集组合物分离干细胞前， 可通过向包含所述干细胞的该干细胞采集组合物中或向破碎和/或消化所述 组织的溶液中添加螯合剂，如乙二醇双(2-氨基乙醚)-N，N，N′，N′-四乙酸 (EGTA)或乙二胺四乙酸(EDTA)以进一步破碎该组织。

5.2.2灌注

可采用本发明的干细胞采集组合物作为灌注液通过灌注，例如流经胎 盘脉管系统而从器官，例如哺乳动物胎盘中采集细胞，例如干细胞。在一 个实施方式中，可通过将灌注溶液通过脐动脉和脐静脉之一或同时通过两 者以灌注哺乳动物胎盘(图1，图2A-2D)。该灌注溶液可通过利用，例如重 力流等方式流入胎盘。优选地，该灌注溶液通过使用泵，如蠕动泵强制通 过胎盘。脐静脉可以，例如用与无菌连接装置(如无菌管)连接的套管(例如， 或塑料套管)插入。如图3所示，该无菌连接装置与灌注集流腔 连接。

还可通过使用压力腔，例如在灌注过程中腔内胎盘周围的气压大于大 气压的腔室来辅助灌注。在一个实施方式中，该压力腔或箱包括多个允许 多根软管进出的接口。这种软管可与胎盘静脉和动脉连接，从而通过采集 来自胎盘的灌注渗出液或仅在胎盘脉管中循环的灌注液以促进灌注。该箱 还包括与泵连接以控制箱内气压的接口。在具体实施例中，可使用一个泵 将灌注液泵入胎盘(胎)脉管，并用另一个泵控制对胎盘的气压，以例如使用 压力帮助采集灌注液，或模仿胎盘在体内时对胎盘自然压力。

在制备灌注时，胎盘优选定向(例如悬浮)成使得脐动脉和脐静脉定位于 胎盘的最高点。可通过将灌注液(例如，本发明的干细胞采集组合物)流过胎 盘脉管系统或通过胎盘脉管系统和周边组织对胎盘进行灌注。灌注液可以 以任意组合流经任意脐带脉管。灌注液可从任意方向流过胎盘脉管(即灌注 液可灌入胎盘动脉或胎盘静脉，或从胎盘动脉或胎盘静脉采集，或从胎盘 组织的渗出液中采集)。在一个实施方式中，该脐动脉和脐静脉被同时连接 至吸管(如图1所示)上，该吸管经柔性连接器与灌注溶液储器相连。该灌注 溶液被传递通过脐静脉和动脉。该灌注溶液从血管壁流出和/或通过血管壁， 而进入胎盘的周边组织，并在适当的开口容器中从怀孕过程中附在母体子 宫上的胎盘表面采集。还可将该灌注溶液引导通过脐带开口并从与母体子 宫壁结合的胎盘壁的开口流出或滤出。在另一个实施方式中，该灌注溶液 通过脐静脉并从脐动脉采集，或通过脐动脉并从脐静脉采集。

在一个实施方式中，可在灌注过程中夹住近段脐带，更优选在脐带插 入胎盘4-5cm(厘米)处夹住。

在放血过程中从哺乳动物胎盘首次采集的灌注液(例如，本发明的干细 胞采集组合物)通常由于脐带血和/或胎盘血中的残留红细胞而带有颜色。该 灌注液将随灌注的进行以及残留脐带血被洗出胎盘而变浅。通常30至100 ml(毫升)的灌注液足以使胎盘放干血，但可根据观察结果采用更多或更少的 灌注液。

用于采集胎盘干细胞的灌注液的体积可随着待采集的干细胞的数量、 胎盘的大小、从单个胎盘获取的采集物的数量等因素而变化。在不同的实 施方式中，灌注液的体积可以是从50mL至5000mL、50mL至4000mL、 50mL至3000mL、100mL至2000mL、250mL至2000mL、500mL至 2000mL、或750mL至2000mL。通常，在放血后以700-800mL的灌注液 对胎盘进行灌注。由于本发明预期灌注任意哺乳动物胎盘、因此该胎盘可 至少(或不多于)使用1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL、 7.0mL、8.0mL、9.0mL、10mL、15mL、20mL、25mL、30mL、35mL、 40mL、45mL、50mL、55mL、60mL、65mL、70mL、75mL、80mL、 85mL90mL、95mL、100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、600mL、 700mL、800mL、900mL、1000mL、1500mL、2000mL、2500mL、3000 mL、3500mL、4000mL、4500mL、5000mL、5500mL、6000mL、6500mL、 7000mL、7500mL、8000mL、8500mL、9000mL、9500mL或10,000mL 的灌注液进行灌注以采集胎盘来源干细胞。

可在数小时或数天的过程中多次灌注器官，例如胎盘。当需要多次灌 注器官时，可将器官在罐中或其它适当容器中于无菌条件下保存或培养， 并以本发明的干细胞采集组合物或含有或不含有抗凝血剂(例如，肝磷脂、 华法林钠、香豆素、双羟香豆素、柠檬酸、柠檬酸磷酸葡萄糖腺嘌呤(CPDA-1)) 以及/或含有或不含有抗菌剂(例如，链霉素等抗生素(例如40-100μg/ml)； 青霉素(例如40U/ml)；两性霉素B(例如0.5μg/ml))的标准灌注溶液(例如， 常规盐溶液，如磷酸缓冲盐(″PBS″))进行灌注。在一个实施方式中，分离的 器官，例如胎盘在不采集灌注液的情况下保存或培养一段时间，从而使该 器官在灌注和采集灌注液前保存或培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或2 或3或更多天。该灌注的器官可另外保存一定时间，例如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24或更多小时，并再次以如700-800mL的灌注液进行灌注。该器官， 例如胎盘可在如每1、2、3、4、5或6小时内灌注1、2、3、4、5次或更 多次。在优选实施方式中，可重复胎盘的灌注和灌注溶液(例如，干细胞采 集组合物)的采集直至回收的有核细胞的数量降至100细胞/ml以下。在不 同时间点的灌注液可进一步单独处理以回收时间依赖性细胞群，例如干细 胞。还可将不同时间点的灌注液集中。

然后可任选地将所述胎盘培养于本发明所述的一种或多种干细胞采集 组合物中，其中该干细胞采集组合物在采集胎盘来源的干细胞前在胎盘脉 管中保留一段时间，而并不立即采集。例如，在一个实施方式中，可使用 足量的干细胞采集组合物灌注胎盘以填充胎盘脉管，其中该干细胞采集组 合物包含有利于干细胞后续采集的血管舒张剂等。在另一实施方式中，以 包含例如一种或多种蛋白酶的干细胞采集组合物灌注胎盘。将胎盘与干细 胞采集组合物培养足够的时间(例如，1-5小时)以使一种或多种蛋白酶开始 消化胎盘组织，随后通过进一步灌注采集干细胞。

还可采用不同的干细胞采集组合物来灌注胎盘。例如，可首先采用包 含血管舒张剂的干细胞采集组合物灌注胎盘足够的时间以使血管舒张剂舒 张胎盘脉管。优选地，仅使用填充胎盘脉管所需的干细胞采集组合物。如 上所述，该胎盘可在干细胞采集之前任选地在干细胞采集组合物中培养一 段时间。然后使用包含一种或多种蛋白酶的第二干细胞采集组合物灌注该 胎盘。任选地将该胎盘在该干细胞采集组合物中培养充足时间以使该蛋白 酶开始消化胎盘组织。然后可以用另一干细胞采集组合物灌注或第三干细 胞采集组合物(例如，包含一种或多种凋亡和/或坏死抑制剂的干细胞采集组 合物)灌注该胎盘。本领域的技术人员将能轻易理解不同干细胞采集组合物 的系列组合。

在一个实施方式中，对于自然阴道分娩(SVD)，可以用本发明的采集组 合物填充所述胎盘的脉管，并将该胎盘浸泡(例如浸)在所述溶液中，采集干 细胞，例如在分娩后20至24小时通过灌注采集。在另一实施方式中，至 少在分娩和干细胞采集之间的部分时间内将胎盘浸在该采集组合物中。在 另一实施方式中，至少在分娩和干细胞采集之间的部分时间内以采集组合 物填充胎盘脉管。在另一实施方式中，该胎盘在分娩后立即冷藏(例如，在 约0℃至约5℃下)，直至通过灌注、酶消化胎盘组织培养等方法采集干细胞。 在特定的实施方式中，在分娩后20至24小时从冷藏胎盘采集干细胞。

不期望受限于理论，对胎盘放血并灌注充足时间后，将胎盘干细胞转 移进入胎盘的放血和灌注微循环中，其中如本发明所述，它们优选通过灌 注洗入采集容器进行采集。灌注分离胎盘不仅有助去除残留脐带血还能向 胎盘提供适当的营养，包括氧。该胎盘可采用用于去除残留脐带血细胞的 类似溶液(优选不添加抗凝血剂)进行培养和灌注。

根据本发明的方法进行灌注所得的采集物中的胎盘干细胞明显多于未 经所述溶液灌注且未经其它获取干细胞的处理(例如，通过组织破碎，例如， 酶消化)而从哺乳动物胎盘获得的胎盘干细胞数量。上下文中的“明显更多” 指至少多10％。根据本发明所进行的灌注可获得比从培养胎盘或其部分的 培养基中获得的胎盘干细胞数量显著更多的胎盘干细胞。

可以分离干细胞，如通过用包含一种或多种蛋白酶或其它组织破碎酶 的溶液进行灌注从胎盘分离。在一个特定实施方式中，可使胎盘或其部分(例 如羊膜、羊膜和绒毛膜、胎盘小叶或子叶、脐带或前述的任意组合)维持在 25-37℃，然后与一种或多种组织破碎酶在200mL的培养基中培养30分钟。 从灌注液采集细胞，将温度调节为4℃，并用包含5m MEDTA、2mM二硫 苏糖醇和2mM β-巯基乙醇的冷抑制剂混合物进行洗涤。数分钟后用本发明 的冷(例如，4℃)干细胞采集组合物洗涤该干细胞。

5.2.3干细胞的分离、分类和表征

不管通过灌注还是酶消化从器官(例如，哺乳动物胎盘)获得的细胞最初 均可通过Ficoll梯度离心从其它细胞中纯化(即分离)。该离心可参照任意离 心速度标准方案。在一个实施方式中，可通过在室温下以约400至约1000×g 离心10-30分钟从灌注液中回收来自器官(例如，胎盘)的细胞。在另一实施 方式中，灌注液被浓缩至约200ml，在例如Ficoll、Percoll或羟乙基淀粉梯 度上轻柔分层，并在例如22℃下400-3000×g离心20分钟，采集低密度中 间细胞层作进一步处理。在另一实施方式中，将羟乙基淀粉与胎盘细胞混 合，并重力沉淀；去除上清液，采集羟乙基淀粉和细胞作进一步处理。

将细胞团重悬浮于新鲜干细胞采集组合物或适于干细胞保存的培养基 中，例如含2U/ml肝磷脂和2mM EDTA(GibcoBRL，NY)、DMEM等的 IMDM无血清培养基。在一个实施方式中，可在包含例如DMEM-LG、 MCDB-201、ITS(胰岛素、转铁蛋白、硒)、LA-BSA(亚油酸-牛血清白蛋白)、 地塞米松、EGF(表皮生长因子)、PDGF(血小板衍生生长因子)以及抗生素(例 如青霉素和/或链霉素)的培养基中选择通过灌注或破碎(例如，酶消化)获得 的胎盘细胞。总单核细胞组分可例如采用Lymphoprep(Nycomed Pharma， Oslo，Norway)按照生产商推荐的操作进行分离，并将单核细胞组分重新悬 浮。重新悬浮干细胞的该干细胞组合物或培养基优选包含干细胞相容蛋白， 例如人血白蛋白等白蛋白。

本说明书所用的“分离的干细胞”指去除至少50％的在完整器官(例如， 胎盘)中通常与该干细胞相伴随的细胞。当干细胞所在的细胞群包含少于50 ％的在完整器官中通常与该干细胞伴随的细胞时，来自该器官的干细胞是 与来自该器官的其它干细胞“分离的”。

通过灌注或消化获得的胎盘细胞可进一步或首先采用例如含有0.2％ EDTA的0.05％胰蛋白酶溶液(Sigma，St.Louis MO)通过差异胰蛋白酶化 (differential trypsinization)进行分离。由于来自如胎盘的成纤维细胞通常在大 约5分钟内从塑料表面脱离，而其它粘附群通常需要孵育超过20-30分钟， 因而使得差异胰蛋白酶化是可能的。该脱离的成纤维细胞可在胰蛋白酶化 和采用如胰蛋白酶中和溶液(TNS，Cambrex)进行胰蛋白酶中和后进行收集。 在粘附细胞分离的一个实施方式中，在多个T-75瓶(优选涂覆纤维连接蛋白 的T75瓶)中的每一个分别放入等量，例如约5-10×106个细胞。该细胞可用 商用的间充质干细胞生长培养基(MSCGM)(Cambrex)在组织培养箱中 (37℃，5％CO2)培养。10至15天后，以PBS从瓶中洗去未粘附细胞。然后 以MSCGM替换PBS。优选每天检查瓶中存在的各种粘附细胞类型，特别 是鉴定和扩增成纤维细胞簇。

从器官(例如，胎盘)采集的细胞的数量和类型可通过如下方式简单监 测：使用标准细胞检测技术如流式细胞术、细胞分选、免疫组织化学(例如， 通过组织特异性或细胞标记特异性抗体)、荧光激活细胞分选法(FACS)、磁 激活细胞分选(MACS)检测形态和细胞表面标记的变化，用光镜或共焦显微 镜检测细胞形态，或通过本领域公知的技术如PCR和基因表达图谱检测基 因表达的变化。胎盘细胞，特别是通过Ficoll分离、差异粘附或两者的组合 分离的细胞，可采用荧光激活细胞分选(FACS)进行分选。荧光激活细胞分 选法(FACS)是一种基于颗粒的荧光属性分离颗粒(包括细胞)的公知方法 (Kamarch，1987，Methods Enzymol,151：150-165)。通过对单独颗粒中的荧 光部分进行激光激发可产生能从混合物中电磁分离正和负颗粒的微量电 荷。在一个实施方式中，可通过独特的荧光标记对细胞表面标记特异性抗 体或配体进行标记。通过所述细胞分选处理细胞，这可基于细胞结合所用 的抗体的能力来进行细胞分离。可将FACS分选出的颗粒直接放入96孔或 384孔板的单独微孔中以便于分离和克隆。

在一个分选方案中，胎盘来源干细胞可根据标记AC133、CD34、CD38、 CD90、CD117、HLA-DR、CD10、CD4、CD71、CD38、CD45和CD61的 表达进行分选(如图4所示)。在另一实施方式中，胎盘来源干细胞可根据标 记CD200和/或HLA-G的表达进行分选；在一个实施方式中，可将展示这 些标记中任意一种的细胞分离以供进一步使用。在一个特定实施方式中， 表达如CD200和/或HLA-G的细胞可根据CD73或CD105的表达，或抗体 SH2、SH3或SH4识别的表位，或CD34、CD38或CD45表达的缺失进行 进一步分选。例如，在一个实施方式中，可根据CD200、HLA-G、CD73、 CD105、CD34、CD38和CD45的表达或其缺失对胎盘细胞进行分选，并从 其它胎盘细胞分离出CD200+、HLA-G+、CD73+、CD105+、CD34-、CD38- 和CD45-的胎盘细胞以供进一步使用。

在另一实施方式中，可采用磁珠分离细胞。可采用磁激活细胞分选 (MACS)技术，一种基于颗粒结合磁珠(直径0.5-100μm)的能力分离颗粒的 方法对细胞进行分选。磁性微球可进行各种有用的改良，包括共价添加特 异性识别特定细胞表面分子或半抗原的抗体。然后将珠子与细胞混合以进 行结合。然后将细胞通过磁场以分离具有特定细胞表面标记的细胞。在一 个实施方式中，然后将这些细胞分离并与结合了其它细胞表面标记的抗体 的磁珠进行再混合。将该细胞再次通过磁场，分离同时结合两种抗体的细 胞。然后将该种细胞稀释进分离的皿，例如微量滴定皿以进行克隆分离。

胎盘细胞(例如，胎盘干细胞)还可根据细胞形态和生长特征进行表征和 /或分选。例如，可通过具有如培养中的鹅卵石或成纤维状外观和/或在此基 础上的选择表征胎盘细胞。还可通过具有能形成拟胚体的能力或缺失该能 力和/或在此基础上的选择表征胎盘干细胞。例如，在一个实施方式中，可 从其它胎盘细胞中分离呈成纤维状，表达CD73和CD105，和在培养中生 成一种或多种拟胚体的胎盘细胞。在另一个实施方式中，可从其它胎盘细 胞中分离在培养中生成一种或多种拟胚体的OCT-4+胎盘细胞。

在另一实施方式中，可通过集落形成单位鉴定和表征胎盘干细胞。集 落形成单位测定已为本领域公知，例如MesenCultTM培养基(Stem Cell Technologies，Inc.，Vancouver British Columbia)。

干细胞(例如，胎盘干细胞)的活力、增殖潜力以及寿命可通过本领域已 知的标准技术进行评定，例如台盼蓝拒染测定、荧光双乙酸吸收测定、碘 化丙啶吸收测定(用于评定活力)；以及胸苷吸收测定、MTT细胞扩增测定(用 于评定增殖)。寿命可通过本领域公知的方法进行测定，例如测定扩大培养 中的最大倍增数。

5.2.4干细胞贮存

在其它实施方式中，对从胎盘采集的细胞进行低温保存以供日后使用。 细胞(例如干细胞)冷藏保存的方法已为本领域公知，例如，Hu等人 (WO00/73421，2000年12月7日公开)。

5.2.5干细胞群的效力评估

本发明所述的胎盘来源干细胞群或包含胎盘来源干细胞群的分离细胞 群可通过使用集落形成单位测定进行效力(即活细胞数量)评估。在优选的实 施方式中，该集落形成单位测定用于评估包含在胚胎初始灌注液和胎盘组 织的初始酶消化物中的胎盘干细胞群的效力。集落形成单位测定还可用于 在培养中至少传代1次、至少5次、10次、15次、20次或更多次的胎盘来 源干细胞群或包含胎盘来源干细胞的分离胎盘细胞群。任意集落形成单位 测定均可采用，例如，由Stem Cell Technologies，Inc.提供的集落形成测定。 该测定可采用如MESENCULTTM培养基(Stem Cell Technologies，Inc.， Vancouver British Columbia)。

所述集落形成单位测定可以针对单个胎盘来源干细胞群(例如，单个灌 注液或消化物单位)或包含胎盘来源干细胞的分离胎盘细胞群进行以评估所 述群的效力。例如，可单独采用集落形成单位测定或联合其它测试(例如生 存力测试)测定胎盘衍生细胞群中的有用细胞数量。通常可采用集落形成单 位测定对来自群的小细胞样本进行测定，然后将所得结果外推至剩余的群。

上述集落形成单位测定可用于评估各种干细胞采集组合物配方的功 效，即可用于鉴定能够在各种条件下进行干细胞采集的改良的或优化的干 细胞采集配方。该条件可包括，例如，在干细胞采集前获取、运输、培养 或处理胎盘的方法；采集干细胞的方法，由胎盘采集到干细胞采集之间的 时间，干细胞采集时或采集前胎盘培养步骤是否采用等。例如，在一个实 施方式中，本发明提供了胎盘来源干细胞群或包含胎盘来源干细胞的分离 胎盘细胞群的效力评估方法，其包括将所述群与干细胞采集组合物相接触； 在集落形成单位测定中检测由所述群生成的集落形成单位数量；其中所述 的集落形成单位数量为该群的效力或与之相关。在特定实施方式中，该集 落形成单位数量可与对照进行比较。例如，该对照可以是对特定数量的胎 盘来源干细胞所预期的集落形成单位的绝对数量(例如效力标准)。在另一实 施例中，该对照可以是与第二干细胞采集配方接触的等量胎盘来源干细胞 所生成的集落形成单位的数量；在该实施例中，该方法允许对两个配方进 行比较以评估何者更利于保存或生成更高数量的存活胎盘来源干细胞。在 另一特定实施方式中，该对照为通过特定方法将胎盘从分娩场所运输至干 细胞采集场所可获得的集落形成单位数量或平均数。在另一特定实施方式 中，所述对照为在干细胞采集场经特定胎盘处理方法可获得的集落形成单 位数量。

在另一实施方式中，本发明提供了选择干细胞采集组合物以保存胎盘 来源干细胞群或包含胎盘来源干细胞的分离胎盘细胞群的方法，其包括将 包含一定量胎盘来源干细胞的第一群与第一干细胞采集组合物相接触，其 中该第一群在集落形成单位测定中生成第一数量的集落形成单位；和包含 所述胎盘来源干细胞的第二群与第二干细胞采集组合物相接触，其中所述 的第二群在集落形成单位测定中生成第二数量的集落形成单位；和比较集 落形成单位的第一数量和集落形成单位的所述第二数量，并选择所述第一 数量或所述第二数量中的更高者。

5.3干细胞保存

另一方面，本发明提供了保存干细胞群的组合物和方法。本发明包括 在分离和采集过程之前或该过程中对干细胞群的保存，无论该群为分离干 细胞群或在器官或组织原位的干细胞群。例如，本发明的方法和组合物可 用于保存分离的胎盘干细胞群，或胎盘中的胎盘干细胞群，例如在胎盘处 于运输中或等待干细胞分离和采集处理的过程中。

本发明进一步提供了采用包含凋亡抑制剂和携氧全氟化碳(例如，上文 5.1.5节描述的全氟化碳)的干细胞采集组合物保存干细胞群的方法。在一个 实施方式中，本发明提供了保存胎盘干细胞群的方法，其包括将所述干细 胞群与凋亡抑制剂和携氧全氟化碳相接触，其中与未接触凋亡抑制剂的干 细胞群相比，所述凋亡抑制剂的数量和存在时间足以减少和防止干细胞群 的凋亡。在具体实施方式中，所述凋亡抑制剂是半胱氨酸蛋白酶抑制剂。 在另一优选实施方式中，所述凋亡抑制剂为JNK抑制剂，例如上文5.1.2.2 节中描述的JNK抑制剂。在更特定的实施方式中，所述JHK抑制剂不调节 所述干细胞的分化或增殖。在另一实施方式中，所述干细胞采集组合物在 分开的相中包含了所述凋亡抑制剂和所述携氧全氟化碳。在另一实施方式 中，所述干细胞采集组合物在乳液中包含所述凋亡抑制剂和所述携氧全氟 化碳。在另一实施方式中，该干细胞采集组合物还包括乳化剂，例如卵磷 脂。在另一实施方式中，所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳在与干细胞接触 时其温度介于约0℃和约25℃。在另一更具体的实施方式中，所述凋亡抑 制剂和所述全氟化碳在与干细胞接触时其温度介于约2℃和约10℃，或介 于约2℃和约5℃。在另一更具体的实施方式中，所述接触在所述干细胞群 的运输过程中进行。在另一更具体的实施方式中，所述接触在所述干细胞 群的冷冻和解冻过程中进行。

在另一实施方式中，本发明提供了保存干细胞群的方法，其包括将所 述干细胞群或包含该干细胞的器官(例如，胎盘)与凋亡抑制剂和器官保存化 合物相接触，其中与未接触凋亡抑制剂的干细胞群相比，所述凋亡抑制剂 的数量和存在时间足以减少和防止干细胞群的凋亡。在具体实施方式中， 该器官保存化合物为UW溶液(参见美国专利号4,798,824；也称为ViaSpan， 还可参见Southard等人，Transplantation 49(2)：251-257(1990))或如Stern等人 的美国专利号5,552,267所述的溶液。在另一个实施方式中，所述器官保存 化合物为羟乙基淀粉、乳糖酸、棉子糖或其组合。在另一实施方式中，该 干细胞采集组合物还在两相中或以乳状液形式包含携氧全氟化碳。

在本方法的另一实施方式中，所述干细胞在灌注过程中与包含凋亡抑 制剂和携氧全氟化碳、器官保存化合物或其组合的干细胞采集组合物相接 触。在另一实施方式中，所述干细胞在组织分解过程中相接触。在另一实 施方式中，所述干细胞在通过灌注采集后、或通过组织破碎(例如，酶消化) 采集后与所述干细胞采集化合物接触。

在胎盘细胞采集、富集和分离过程中，通常优选尽量减少或消除由于 缺氧和机械应力等而产生的细胞应激。因此，在本方法的另一实施方式中， 干细胞或干细胞群在所述保存过程中在采集、富集或分离时暴露于缺氧条 件少于72小时，其中缺氧条件是低于正常血氧浓度的氧浓度。在一个更具 体的实施方式中，所述干细胞群在所述保存过程中暴露于所述缺氧条件少 于48小时。在另一个更具体的实施方式中，所述干细胞群在采集、富集或 分离过程中暴露于所述缺氧条件少于24小时、或少于12小时、6小时或2 小时，或未暴露于缺氧条件。在另一具体实施方式中，所述干细胞群在采 集、富集或分离过程中未暴露于剪切应力。

5.4胎盘处理

一般而言，人胎盘在分娩后立即回收。在优选实施方式中，该胎盘在 患者知情同意并在获得该患者与胎盘相关的完整病史后从该患者回收。优 选地，该病史在分娩后仍然继续。该病史可用于协调从其采集的胎盘或干 细胞的后续使用。例如，根据该病史，人胎盘干细胞可用于向与该胎盘相 关的婴儿、或婴儿的父母、兄弟姐妹或其它亲属的个体化用药。

在胎盘干细胞回收之前先去除脐带血和胎盘血。在某些实施方式中， 分娩后将胎盘中的脐带血回收。可对该胎盘进行常规的脐带血回收处理。 通常采用针或套管在重力的帮助下从胎盘抽血(例如，参见，Anderson，美 国专利号5,372,581；Hessel等人，美国专利号5,415,665)。该针或套管通常 插入脐带静脉且可以轻柔按摩胎盘以帮助胎盘排出脐带血。该脐带血回收 还可通过商业手段实现，例如LifeBank Inc.，Cedar Knolls，N.J.，ViaCord， Cord Blood Registry and Cryocell。优选地，该胎盘通过重力排放且不采取其 它操作，从而使在脐带血回收过程中的组织破坏最小化。在某些实施方式 中，脐带血回收前夹住近端脐带，优选夹住插入胎盘中的4-5cm(厘米)以内 处。在另一实施例中，该近端脐带在脐带血回收后但在进一步处理胎盘前 被夹住。

胎盘通常从产房传送至另一地点，例如实验室，以通过例如灌注或组 织分离回收脐带血并采集干细胞。在一个实施方式中，优选在无菌，绝热 的输送装置(将胎盘温度维持在20-28℃)中运送胎盘，例如，近端脐带被夹 住的胎盘放置在无菌塑料袋中，然后将该袋子放入绝缘容器。在另一实施 方式中，在如2005年9月19日提交的未决美国专利申请号11/230,760(其 全文在此引用作为参考)中所描述的脐带血采集试剂盒中运输胎盘。优选地， 该胎盘在分娩后4至24小时内送至实验室。

在干细胞采集前，该胎盘可在无菌条件下且在室温或在5℃至25℃(摄 氏度)下保存。在灌注胎盘以去除残留脐带血之前可将胎盘保存超过48小 时，或保存例如4至24小时。胎盘优选在抗凝血剂溶液中于5℃至25℃(摄 氏度)下保存。适用的抗凝血剂溶液已为本领域熟知。例如，可采用肝磷脂 或华法林钠溶液。在优选实施方式中，该抗凝血剂溶液包含肝磷脂溶液(在 1:1000溶液中含1％w/w)。该无血胎盘在胎盘干细胞采集前优选保存不超过 36小时。

当胎盘等待进行干细胞采集时，该胎盘可至少在由分娩室至干细胞采 集场所的胎盘采集和干细胞采集之间的部分时间内与包含一种或多种携氧 全氟化碳的溶液相接触。优选地，该胎盘在胎盘采集和干细胞采集之间的 大部分时间内均与携氧全氟化碳相接触。该胎盘可至少在胎盘采集和干细 胞采集之间的部分时间内与包含一种或多种携氧全氟化碳以及一种或多种 器官保存介质(例如，UW溶液；参见上文5.3节)的组合物相接触。

5.5胎盘干细胞

根据本发明的方法获取的胎盘干细胞包括多能性和专能性细胞、具有 一种或多种胚胎干细胞特征的干细胞以及定向祖细胞。

脐带血和胎盘血主要包含CD34+CD38+造血祖细胞。在放血并基本去除 所有的胎盘和脐带血后首个24小时内，可从该胎盘分离出与脐带血和骨髓 中所发现的数量相当的CD34+CD38-造血祖细胞，同时还有CD34-CD38+造 血祖细胞。还可通过对组织培养底物的差异粘附等方法从胎盘分离 CD34-CD38-细胞。例如，参见美国专利号7,045,148。

在优选实施方式中，通过本发明的方法获取的胎盘干细胞为存活的、 休眠的、多能性或专能性的干细胞。

至少一类人胎盘干细胞自然发育的(developmenltally naive)。例如，这种 干细胞为SSEA3-(阶段特异性胚胎抗原3)、SSEA4-、OCT-4+(干细胞转录因 子)以及ABC-p+(ATP结合盒(ABC)转运蛋白)、指示自然发育的标记。在特 定的实施方式中，这种干细胞为非胚胎的和SSEA3-SSEA4-OCT-4+ABC-p+ 的。在另一实施方式中，该人胎盘干细胞不表达MHC2类抗原。在另一实 施方式中，这种干细胞能够分化成为内胚层、外胚层、或中胚层细胞。

在一个实施方式中，由本发明的方法获得的胎盘干细胞可通过OCT-4 和ABC-p标记的存在进行鉴定。此外，本发明包括对展示标记CD10、CD29、 CD44、CD54、CD90、CD105(SH2)、CD73(SH3、SH4)、OCT-4以及ABC-p、 或者缺失或不展示标记CD34、CD38、CD45、SSEA3或SSEA4的胎盘干 细胞的采集。在特定实施方式中，该胎盘干细胞为CD10+、CD29+、CD34-、 CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD73+、CD90+、CD105+、SSEA3-、SSEA4-、 OCT-4+和ABC-p+干细胞。在另一个特定实施方式中，该胎盘干细胞为 CD200+和HLA-G+干细胞。在另一个特定实施方式中，该胎盘干细胞为 CD73+、CD105+和CD200+干细胞。在另一特定实施方式中，该胎盘干细胞 为CD200+和OCT-4+干细胞。在另一特定实施方式中，该胎盘干细胞为 CD73+和CD105+干细胞，且包含该胎盘干细胞的分离胎盘细胞群在允许拟 胚体形成的条件下形成拟胚体。在另一个特定实施方式中，该胎盘干细胞 为CD73+、CD105+和HLA-G+干细胞。在另一特定实施方式中，该胎盘干 细胞为OCT-4+干细胞，并在允许拟胚体形成的条件下形成拟胚体。

该细胞表面标记可参照本领域公知的方法常规地进行检测，例如先用 流式细胞术，随后进行洗涤并以抗细胞表面标记抗体染色。例如，欲测定 CD34或CD38的存在，可以PBS洗涤细胞，然后以抗CD34藻红蛋白和抗 CD38异硫氰酸萤光素(BectonDickinson，MountainView，CA)进行双染色。

通过本发明的方法和组合物采集的胎盘干细胞可用于多种治疗方案， 其中通过植入、移植或输注目标细胞群(例如干细胞或祖细胞群)来扩增、修 复或替换身体组织或器官。本发明的胎盘干细胞可用于替换或扩增现有组 织，导入新的或改造后的组织或与生物组织或结构相结合。本发明胎盘干 细胞还可在通常采用胚胎干细胞的治疗方案中取代胚胎干细胞。

6.实施例

6.1实施例1：干细胞采集组合物

以下实施例描述了干细胞采集组合物的配制。其它的实施方式对本领 域技术人员而言将是显而易见的。

6.1.1包含凋亡抑制剂和蛋白酶的组合物

制备灌注溶液，其包含0.9％NaCl，终浓度为50-100μM的半胱氨酸蛋 白酶抑制剂Ac-Val-Ala-Asp-CHO，和终浓度约为0.25％的胰蛋白酶-EDTA。

制备灌注溶液，其包含实施例1所示的改良的Krebs溶液，终浓度为 50-100-的半胱氨酸蛋白酶抑制剂Ac-Val-Ala-Asp-CHO，以及终浓度约 为0.25％的胰蛋白酶-EDTA。

制备灌注溶液，其包含实施例1所示的基于DMEM的溶液，终浓度为 50-100μM的半胱氨酸蛋白酶抑制剂Ac-Val-Ala-Asp-CHO，以及终浓度约 为0.25％的胰蛋白酶-EDTA。

6.1.2包含凋亡抑制剂组合和蛋白酶的组合物

制备灌注溶液，其包含0.9％NaCl，终浓度为50-100μM的半胱氨酸蛋 白酶抑制剂Ac-Val-Ala-Asp-CHO，终浓度约为0.25％的胰蛋白酶-EDTA， 以及具有如下结构之一的JNK抑制剂：

5-氯蒽[1，9cd]吡唑-6(2H)-酮，

{4-[4-(4-氯-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-苯基}-(4-吡咯烷-1-基-哌啶-1-基)-甲酮

其中该JNK抑制剂的浓度为约0.5μM至约10μM。

制备灌注溶液，其包含实施例1所示的基于DMEM的溶液，终浓度为 50-100-的半胱氨酸蛋白酶抑制剂Ac-Val-Ala-Asp-CHO，本实施例前文 所示的JNK抑制剂，以及终浓度约为0.25％的胰蛋白酶-EDTA。

制备灌注溶液，其包含实施例1所示的改良的Krebs溶液，终浓度为 50-100μM的半胱氨酸蛋白酶抑制剂Ac-Val-Ala-Asp-CHO，本实施例前文 所示的JNK抑制剂，以及终浓度约为0.25％的胰蛋白酶-EDTA。

6.1.3包含JNK抑制剂和蛋白酶组合的组合物

制备灌注溶液，其包含0.9％NaCl；包含终浓度约为1.0mg/mL的弹性 蛋白酶，终浓度约为1.0mg/mL的胶原酶I，终浓度约为0.5mg/mL的胶原 酶IV以及终浓度约为0.1mg/mL的分散酶的蛋白酶混合物；以及具有如下 结构之一的JNK抑制剂：

5-蒽氯[1，9cd]吡唑-6(2H)-酮，

{4-[4-(4-氯-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-苯基}-(4-吡咯烷-1-基-哌啶-1-基)-甲酮

其中该JNK抑制剂的浓度为约0.5μM至约10μM。

制备灌注溶液，其包含实施例1所示的基于DMEM的溶液；包含终浓 度约为1.0mg/mL的弹性蛋白酶，终浓度约为1.0mg/mL的胶原酶I，终浓 度约为0.5mg/mL的胶原酶IV以及终浓度约为0.1mg/mL的分散酶的蛋白 酶混合物；以及本实施例前文所示的JNK抑制剂。

制备灌注溶液，其包含实施例1所示的改良的Krebs溶液；包含终浓度 约为1.0mg/mL的弹性蛋白酶，终浓度约为1.0mg/mL的胶原酶I，终浓度 约为0.5mg/mL的胶原酶IV以及终浓度约为0.1mg/mL的分散酶的蛋白酶 混合物；以及本实施例前文所示的JNK抑制剂。

6.1.4包含JNK抑制剂组合和酶组合的组合物

制备灌注溶液，其包含0.9％NaCl；包含终浓度约为1.0mg/mL的弹性 蛋白酶，终浓度约为1.0mg/mL的胶原酶I，终浓度约为0.5mg/mL的胶原 酶IV，终浓度约为0.1mg/mL的分散酶以及浓度为约0.1至约10.0mg/mL 的透明质酸酶的蛋白酶混合物；以及两种或多种具有如下一种或多种结构 的JNK抑制剂：

5-蒽氯[1，9cd]吡唑-6(2H)-酮，

{4-[4-(4-氯-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-苯基}-(4-吡咯烷-1-基-哌啶-1-基)-甲酮

其中该JNK抑制剂的浓度为约0.5μM至约10μM。

制备灌注溶液，其包含实施例1所示的基于DMEM的溶液；包含终浓 度约为1.0mg/mL的弹性蛋白酶，终浓度约为1.0mg/mL的胶原酶I，终浓 度约为0.5mg/mL的胶原酶IV，终浓度约为0.1mg/mL的分散酶以及浓度 为约0.1至约10.0mg/mL的透明质酸酶的蛋白酶混合物；以及两种或多种 如本实施例前文所示的JNK抑制剂。

制备灌注溶液，其包含实施例1所示的改良的Krebs溶液；包含终浓度 约为1.0mg/mL的弹性蛋白酶，终浓度约为1.0mg/mL的胶原酶I，终浓度 约为0.5mg/mL的胶原酶IV，终浓度约为0.1mg/mL的分散酶以及浓度为 约0.1至约10.0mg/mL的透明质酸酶的蛋白酶混合物；以及两种或多种如 本实施例前文所示的JNK抑制剂。

6.1.5包含JNK抑制剂、蛋白酶和血管舒张剂的组合物

制备灌注溶液，其包含0.9％NaCl，终浓度约为0.25％的胰蛋白酶 -EDTA，终浓度为约0.15mM至约6mM的作为血管舒张剂的硫酸镁；以 及具有如下结构之一的JNK抑制剂：

5-蒽氯[1，9cd]吡唑-6(2H)-酮，

{4-[4-(4-氯-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-苯基}-(4-吡咯烷-1-基-哌啶-1-基)-甲酮

其中该JNK抑制剂的浓度为约0.5μM至10μM。

制备灌注溶液，其包含实施例1所示的基于DMEM的溶液；终浓度约 为0.25％的胰蛋白酶-EDTA；终浓度为约0.15mM至约6mM的作为血管 舒张剂的硫酸镁；以及本实施例前文所示的JNK抑制剂。

制备灌注溶液，其包含实施例1所示的改良的Krebs溶液；终浓度约为 0.25％的胰蛋白酶-EDTA；终浓度为约0.15mM至约6mM的作为血管舒张 剂的硫酸镁；以及本实施例前文所示的JNK抑制剂。

6.1.6包含JNK抑制剂、蛋白酶和抗坏死药剂的组合物

制备灌注溶液，其包含0.9％NaCl；终浓度约为0.25％的胰蛋白酶 -EDTA；浓度为约0.5μM至约100.0μM的2-(1H-吲哚-3-基)-3-戊氨基-马来 酰亚胺；以及具有如下结构之一的JNK抑制剂：

5-蒽氯[1，9cd]吡唑-6(2H)-酮，

{4-[4-(4-氯-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-苯基}-(4-吡咯烷-1-基-哌啶-1-基)-甲酮

其中该JNK抑制剂的浓度为约0.5μM至约10.0μM。

制备灌注溶液，其包含实施例1所示的基于DMEM的溶液；终浓度约 为0.25％的胰蛋白酶-EDTA；浓度为约0.5μM至约100.0μM的2-(1H-吲哚 -3-基)-3-戊氨基-马来酰亚胺；以及本实施例前文所示的JNK抑制剂。

制备灌注溶液，其包含实施例1所示的改良的Krebs溶液；终浓度约为 0.25％的胰蛋白酶-EDTA；浓度为约0.5μM至约100.0μM的2-(1H-吲哚-3- 基)-3-戊氨基-马来酰亚胺；以及本实施例前文所示的JNK抑制剂。

6.1.7包含JNK抑制剂、蛋白酶和携氧全氟化碳的组合物

制备灌注溶液，其包含0.9％NaCl；终浓度约为0.25％的胰蛋白酶 -EDTA；以及具有如下结构之一的JNK抑制剂：

5-蒽氯[1，9cd]吡唑-6(2H)-酮，

{4-[4-(4-氯-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-苯基}-(4-吡咯烷-1-基-哌啶-1-基)-甲酮

其中该JNK抑制剂的浓度为约0.5μM至约10.0μM。该溶液还包含重 量体积比为50％-100％的全氟溴辛烷，为全氟溴辛烷体积约10％的全氟溴癸 烷以及重量体积比约为4％的作为乳化剂的卵磷脂。该溶液在使用前乳化。

按如上制备灌注溶液，但以实施例1所示的基于DMEM的溶液取代 0.9％NaCl。按如上制备灌注溶液，但以实施例1所示的改良的Krebs溶液 取代0.9％NaCl。

6.2实施例2：胎盘干细胞培养

胎盘干细胞通过灌注或物理破碎(例如，酶消化)从产后哺乳动物胎盘获 取。该细胞培养于含60％DMEM-LG(Gibco)、40％MCDB-201(Sigma)、2％ 胎牛血清(FCS)(Hyclone Laboratories)、1×胰岛素-铁传递蛋白-硒(ITS)、1× 亚油酸-牛血清白蛋白(LA-BSA)、10-9M地塞米松(Sigma)、10-4M抗坏血酸 -2-磷酸(Sigma)、表皮生长因子(EGF)10ng/ml(R&D Systems)、血小板衍化 生长因子(PDGF-BB)10ng/ml(R&D Systems)以及100 U青霉素/1000 U链霉 素的培养基中。

培养细胞的培养瓶可按如下方式制备。通过向瓶中添加含5ng/ml人纤 维连接蛋白(FN)(Sigma F0895)的5ml PBS从而以FN涂覆T75瓶。将含有 FN溶液的瓶子在37℃下放置30分钟。然后在细胞培养前去除FN溶液。 无需在处理后干燥瓶子。或者可在使用前使瓶子与FN溶液在4℃下接触过 夜或更长时间，然后对瓶子加温去除FN溶液。

通过灌注分离的胎盘干细胞

来自胎盘灌注的胎盘干细胞培养物可按如下方式制备。将来自Ficoll 梯度法的细胞在15ml培养基中以50-100×106细胞/瓶的浓度接种至如上所 述的FN涂覆T75瓶中。通常可接种5至10瓶。将瓶子在37℃下孵育12-18 小时以使粘附细胞吸附。向各瓶添加10ml的温PBS以去除悬浮的细胞， 并轻柔混合。然后取出15ml培养基并以15ml新鲜培养基置换。自培养开 始后3-4天更换所有培养基。当取出50％或7.5ml培养基时进行后续的培 养基置换。

自约12日起，以显微镜检查培养物中粘附细胞集落的生长。通常在培 养开始后13日至18日之间，当细胞培养物达到约80％汇合时，通过胰蛋 白酶消化收集粘附细胞。从该原代培养采集的细胞被称为0(零)代。

通过酶消化分离的胎盘干细胞

来自消化的胎盘组织的胎盘干细胞培养物可按如下方式制备。将灌注 胎盘母体一侧朝上放置在无菌纸上。用刀片在胎盘母体一侧刮取约0.5cm 的表面层，该刀片可用于去除胎盘组织块，尺寸为约1×2×1cm。然后将该 胎盘组织切成约1mm3的片段。将这些片段放入50ml Falcon管并在37℃ 的水浴中先以胶原酶IA(2mg/ml，Sigma)消化30分钟，再以胰蛋白酶 -EDTA(0.25％，GIBCO BRL)消化10分钟。将所得溶液在室温下以400g 离心10分钟，并去除消化液。以大约10倍体积的PBS重悬浮该球团(例如， 将5ml的球团以45ml PBS重悬浮)，然后在室温下以400g离心10分钟。 将组织/细胞球团重悬浮于约130mL的培养基中，然后在每个涂覆纤维连 接蛋白的T75瓶接种13ml细胞。在37℃下于含有5％CO2的潮湿空气中孵 育细胞。在该阶段可选择性低温保存胎盘干细胞。

胎盘干细胞的传代培养和扩增

在37℃的水浴中迅速解冻低温保存细胞。用10ml温培养基从冷冻小 瓶中迅速取出胎盘干细胞并转移至15ml无菌管。将细胞在室温下以400×g 离心5分钟。用吸管将细胞轻柔重悬浮于10ml温培养基中，并用台盼蓝拒 染法计算活细胞数。以大约6000-7000细胞/cm2的浓度将细胞接种于如上制 备的涂覆RN的瓶中(大约每个T-75瓶中有5×105细胞)。将细胞在37℃、 5％CO2和90％湿度下孵育。当细胞达到75-85％汇合，从瓶中无菌取出耗竭 培养基并废弃。添加3ml的0.25％胰蛋白酶/EDTA溶液以覆盖细胞层，然 后在在37℃、5％CO2和90％湿度下孵育细胞5分钟。轻拍瓶子一次或两次 以加速细胞分离。当＞95％的细胞呈圆形并分离后，向每个T-75瓶添加7ml 的温培养基，通过在细胞层表面多次吹吸分散该溶液。

按如上所述对细胞计数并检测活性后，在室温下以1000RPM离心细胞 5分钟。通过在含培养基的T-75瓶中轻柔重悬浮该细胞团并均匀涂布于两 个涂覆FN的T-75瓶中进行细胞传代。

通过上述方法鉴定表达标记CD105、CD117、CD33、CD73、D29、CD44、 CD10、CD90和CD133的粘附胎盘干细胞群。该细胞群不表达CD34或 CD45。然而这些胎盘干细胞的一些但不是所有培养物表达HLA-ABC和/ 或HLA-DR。

6.3实施例3：胎盘干细胞的分化

6.3.1诱导分化为神经元

进行胎盘干细胞的神经元性分化，例如按如下步骤进行：

1.将胎盘干细胞在由DMEM/20％FBS和1mM的β-巯基乙醇组成 的预诱导培养基中生长24小时。

2.去除预诱导培养基，以PBS洗涤细胞。

3.向细胞添加由DMEM和1-10mM的β-巯基乙醇组成的神经元诱 导培养基。或者可采用由DMEM/2％DMSO/200μM丁基羟基茴香醚组成的 诱导培养基。

4.在某些实施方式中，早在暴露于无血清培养基和β-巯基乙醇后60 分钟便会出现形态和分子的变化。可采用RT/PCR对如神经生长因子受体 和神经丝重链基因的表达进行评估。

6.3.2诱导分化为脂肪细胞

进行胎盘干细胞的脂肪细胞生成性分化，例如按如下步骤进行：

1.将胎盘干细胞生长于MSCGM(Cambrex)或添加了15％脐带血清 的DMEM中。

2.进行三个循环的诱导/维持。各循环由以下步骤组成：以脂肪生成 诱导培养基(Cambrex)饲养胎盘干细胞，并将细胞培养3天(37℃，5％CO2)， 然后在脂肪生成维持培养基(Cambrex)中培养1-3天。可采用的替代性诱导 培养基包含1μm的地塞米松、0.2mM吲哚美辛、0.01mg/ml胰岛素、0.5mM IBMX、DMEM-高糖、FBS以及抗生素。

3.3个完整的诱导/维持循环后，将细胞在脂肪生成维持培养基中继 续培养7天，每2-3天更换培养基。

4.脂肪生成的标志为多重胞浆内脂质泡的形成，其可通过使用油红 O亲脂性染色后轻易地观察到。脂肪酶和/或脂肪酸结合蛋白基因的表达可 通过对开始分化成为脂肪细胞的胎盘干细胞进行RT/PCR进行确认。

6.3.3诱导分化为软骨细胞

进行胎盘干细胞的软骨细胞生成性分化，例如按如下步骤进行：

1.将胎盘干细胞维持于MSCGM(Cambrex)或添加了15％脐带血清 的DMEM中。

2.将胎盘干细胞等分放入无菌聚丙烯管中。将细胞离心(150×g，5 分钟)，并以不完全软骨形成培养基(Cambrex)洗涤两次。

3.最后一次洗涤后，将细胞以5×105细胞/ml的浓度重新悬浮于含 0.01μg/ml TGF-β-3的完整软骨形成培养基中

4.将0.5ml的细胞等分放入15ml聚丙烯培养管中。在150×g下5 分钟使细胞成团。将球团完整保留在培养基中。

5.在37℃，5％CO2下将松散加盖的管子培养24小时。

6.每2-3天以新鲜制备的完全软骨形成培养基饲养细胞球团。

7.以低速涡旋每天搅拌，使球团保持悬浮在培养基中。

8.培养14-28天后收集软骨形成性的细胞球团。

9.鉴定软骨形成，例如如下鉴定：观察嗜酸细胞基质的生成、评估 细胞形态、和/或通过RT/PCR确定胶原蛋白2和胶原蛋白9基因的表达。

6.3.4诱导分化为骨细胞

进行成骨性分化，例如按如下步骤进行：

1.将胎盘干细胞的贴壁培养物培养于MSCGM(Cambrex)或添加了 15％脐带血清的DMEM中。

2.在组织培养瓶中将培养物培养24小时。

3.通过含有0.1μm地塞米松、0.05mM抗坏血酸-2-磷酸、10mM β 甘油磷酸的成骨性诱导培养基(Cambrex)替换MSCGM来诱导成骨性分化。

4.在2-3周内每3-4天以成骨性诱导培养基饲养细胞。

5.通过对碱性磷酸酶和骨桥蛋白基因表达的钙特异性染色和 RT/PCR测定分化。

6.3.5诱导分化为胰细胞

进行胰腺分化，例如按如下步骤进行：

1.  将胎盘干细胞培养于添加了碱性成纤维细胞生长因子(10ng/ml)、 烟酰胺(10mM)、B27(1×)、N2(1×)、转化生长因子β1(2ng/ml)的 DMEM/20％CBS中。可使用KnockOut血清替代品类取代CBS。

2.以50/50的浓度添加由巢蛋白阳性神经元细胞培养物获得的条件 培养基。

3.将细胞培养14-28天，每3-4天重新投料。

4.通过RT/PCR对胰岛素蛋白或胰岛素基因表达的测定来表征分 化。

6.3.6诱导分化为心肌细胞

进行肌原性(心原性)分化，例如按如下步骤进行：

1.将胎盘干细胞培养于添加了维甲酸(1μM)、碱性成纤维细胞生长 因子(10ng/ml)以及转化生长因子β-1(2ng/ml)和表皮生长因子(100ng/ml)的 DMEM/20％CBS中。可使用KnockOut血清替代品(Invitrogen，Carlsbad， California)类取代CBS。

2.可替代地，可将胎盘干细胞在添加了50ng/ml心调理素-1的 DMEM/20％CBS中培养24小时。

3.可替代地，可将胎盘干细胞在无蛋白培养基中维持5-7天，然后 以人心肌萃取物进行刺激(递增剂量分析)。心肌萃取物可通过在添加了1％ 脐带血清的1％ HEPES缓冲液中对1mg人心肌匀浆化制备得到。将悬浮液 孵育60分钟，然后离心采集上清液。

4.将细胞培养10-14天，每3-4天重新投料。

5.通过RT/PCR验证心肌肌动蛋白基因的表达以确认分化。

本发明不受本文所述的具体实施方式的范围限制。事实上，除了本文 所描述之外的对本发明所进行的各种修饰对本领域的技术人员而言是显而 易见的。该些修饰均在落入所附权利要求书的范围之内。

本文所引用的所有参考文献在此均全文引为参考，对于所目的，其引 用的程度如同各个单独公开、专利或专利申请在此为所有目而特定和单独 地引为参考一样。

任意公开的所述引用是针对申请日前公开的内容，这些引用并不应解 释为承认本发明由于存在先发明而晚于这些公开。

本申请主张于2005年12月29日提交的美国临时申请号60/754,969的 权益，其全文在此引用作为参考。