表达IL12的溶瘤弹状病毒
阅读：252发布：2020-05-13
专利汇可以提供表达IL12的溶瘤弹状病毒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文公开了一种溶瘤重组Maraba病毒，其基因组包含组合地编码白细胞介素-12（IL12）蛋白或其功能部分的一种或多种核酸序列。还公开了一种使用所述溶瘤重组Maraba病毒来 治疗 患者中的癌症的方法。本公开还提供了被溶瘤弹状 病毒感染 的 肿瘤 细胞，所述病毒的基因组包含组合地编码白细胞介素-12（IL12）蛋白或其功能部分一种或多种核酸序列，所述肿瘤细胞用作用于治疗癌症的受感染的细胞 疫苗 （ICV）。还公开了一种使用受感染的细胞疫苗来治疗患者中的癌症的方法。，下面是表达IL12的溶瘤弹状病毒专利的具体信息内容。
1.一种治疗患者中的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用溶瘤性Maraba病毒，所述Maraba病毒的基因组包含组合地编码白细胞介素-12（IL12）蛋白或其功能部分的一种或多种核酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述Maraba病毒在对应于野生型G蛋白的242位的位置包含在G蛋白中的突变，优选地在该位置处例如谷氨酰胺的氨基酸已经变为精氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述Maraba病毒在对应于野生型M蛋白的123位的位置包含在M蛋白中的突变，优选地在该位置处例如亮氨酸的氨基酸已经变为色氨酸。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中：
所述IL12蛋白具有与野生型人IL12序列至少60%相同的氨基酸序列，例如70%、80%、
90%、95%、99%或100%相同；或者
所述IL12蛋白具有与野生型鼠IL12序列至少60%相同的氨基酸序列，例如70%、80%、
90%、95%、99%或100%相同。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述IL12蛋白包含分别对应于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的p40和p35亚基。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述IL12蛋白包含分别对应于SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的p40和p35亚基。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述IL12蛋白包含p40亚基，该p40亚基的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3至少60%相同。
8.根据权利要求1-4和7中任一项所述的方法，其中所述IL12蛋白包含p35亚基，该p35亚基的氨基酸序列与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4至少60%相同。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述IL12蛋白的功能部分是这样的部分，该部分能够：刺激T细胞、NK细胞或两者的生长；增强人NK/淋巴因子激活的杀伤细胞的溶解活性；通过静息人PBMC来刺激IFN-γ的产生；或其任何组合。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述病毒被静脉内施用。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述病毒被腹膜内施用。
12.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述病毒被瘤内施用。
13.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述病毒被鞘内施用。
14.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述病毒被颅内施用。
15.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述病毒被皮下施用。
16.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述病毒被胸内施用。
17.一种溶瘤性Maraba病毒，其基因组包含组合地编码白细胞介素-12（IL12）蛋白或其功能部分的一种或多种核酸序列。
18.根据权利要求17所述的Maraba病毒，其中所述病毒在对应于野生型G蛋白的242位的位置包含在G蛋白中的突变，优选地在该位置处例如谷氨酰胺的氨基酸已经变为精氨酸。
19.根据权利要求17或18所述的Maraba病毒，其中所述病毒在对应于野生型M蛋白的
123位的位置包含在M蛋白的突变，优选地在该位置处例如亮氨酸的氨基酸已经变为色氨酸。
20.根据权利要求16-18中任一项所述的Maraba病毒，其中：
所述IL12蛋白具有与野生型人IL12序列至少60%相同的氨基酸序列，例如70%、80%、
90%、95%、99%或100%相同；或者
所述IL12蛋白具有与野生型鼠IL12序列至少60%相同的氨基酸序列，例如70%、80%、
90%、95%、99%或100%相同。
21.根据权利要求17-20中任一项所述的Maraba病毒，其中所述IL12蛋白包含分别对应于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的p40和p35亚基。
22.根据权利要求17-20中任一项所述的Maraba病毒，其中所述IL12蛋白包含分别对应于SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的p40和p35亚基。
23.根据权利要求17-20中任一项所述的Maraba病毒，其中所述IL12蛋白包含p40亚基，该p40亚基的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3至少60%相同。
24.根据权利要求17-20和23中任一项所述的Maraba病毒，其中所述IL12蛋白包含p35亚基，该p35亚基的氨基酸序列与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4至少60%相同。
25.根据权利要求17-24中任一项所述的Maraba病毒，其中所述IL12蛋白的功能部分是这样的部分，该部分能够：刺激T细胞、NK细胞或两者的生长；增强人NK/淋巴因子激活的杀伤细胞的溶解活性；通过静息人PBMC来刺激IFN-γ的产生；或其任何组合。
26.一种受溶瘤弹状病毒感染的肿瘤细胞，所述病毒的基因组包含组合地编码白细胞介素-12（IL12）蛋白或其功能部分的一种或多种核酸序列，所述肿瘤细胞用作用于治疗癌症的受感染的细胞疫苗（ICV）。
27.根据权利要求26所述的受感染的肿瘤细胞，其中所述弹状病毒是水泡性口炎病毒（VSV）、Arajas病毒、Cocal病毒、Isfahan病毒、Maraba病毒、Piry病毒、水泡性口炎Alagoas病毒、BeAn 157575病毒、Boteke病毒、Calchaqui病毒、美洲鳗病毒、Grey Lodge病毒、Jurona病毒、Klamath病毒、Kwatta病毒、La Joya病毒、Malpais Spring病毒、Mount Elgon蝙蝠病毒、Perinet病毒、Tupaia病毒、Farmington、Bahia Grande病毒、Muir Springs病毒、Reed Ranch病毒、Hart Park病毒、Flanders病毒、Kamese病毒、Mosqueiro病毒、Mossuril病毒、Barur病毒、Fukuoka病毒、Kern Canyon病毒、Nkolbisson病毒、Le Dantec病毒、Keuraliba病毒、Connecticut病毒、新Minto病毒、Sawgrass病毒、Chaco病毒、Sena Madureira病毒、Timbo病毒、Almpiwar病毒、Aruac病毒、Bangoran病毒、Bimbo病毒、Bivens Arm病毒、Blue crab病毒、Charleville病毒、Coastal Plains病毒、DakArK 7292病毒、Entamoeba病毒、Garba病毒、Gossas病毒、Humpty Doo病毒、Joinjakaka病毒、Kannamangalam病毒、Kolongo病毒、Koolpinyah病毒、Kotonkon病毒、Landjia病毒、Manitoba病毒、Marco病毒、Nasoule病毒、Navarro病毒、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、Obodhiang病毒、Oita病毒、Ouango病毒、Parry Creek病毒、Rio Grande cichlid病毒、Sandjimba病毒、Sigma病毒、Sripur病毒、Sweetwater Branch病毒、Tibrogargan病毒、Xiburema病毒、Yata病毒、Rhode岛Adelaide河病毒、Berrimah病毒、Kimberley病毒、或牛短暂热病毒。
28.根据权利要求27所述的受感染的肿瘤细胞，其中所述弹状病毒是Maraba病毒，例如根据权利要求17-25中任一项所述的Maraba病毒。
29.根据权利要求28所述的受感染的肿瘤细胞，其中所述Maraba病毒是野生型Maraba病毒的变体，其包含野生型G蛋白中的Q242R突变和野生型M蛋白中的L123W突变。
30.根据权利要求26-29中任一项所述的受感染的肿瘤细胞，其中：
所述IL12蛋白具有与野生型人IL12序列至少60%相同的氨基酸序列，例如70%、80%、
90%、95%、99%或100%相同；或者
所述IL12蛋白具有与野生型鼠IL12序列至少60%相同的氨基酸序列，例如70%、80%、
90%、95%、99%或100%相同。
31.根据权利要求26-30中任一项所述的受感染的肿瘤细胞，其中所述IL12蛋白包含分别对应于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的p40和p35亚基。
32.根据权利要求26-30中任一项所述的受感染的肿瘤细胞，其中所述IL12蛋白包含分别对应于SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的p40和p35亚基。
33.根据权利要求26-30中任一项所述的受感染的肿瘤细胞，其中所述IL12蛋白包含p40亚基，该p40亚基的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3至少60%相同。
34.根据权利要求26-30中任一项所述的受感染的肿瘤细胞，其中所述IL12蛋白包含p35亚基，该p35亚基的氨基酸序列与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4至少60%相同。
35.根据权利要求26-34中任一项所述的受感染的肿瘤细胞，其中所述IL12蛋白的功能部分是这样的部分，该部分能够：刺激T细胞、NK细胞或两者的生长；增强人NK/淋巴因子激活的杀伤细胞的溶解活性；通过静息人PBMC来刺激IFN-γ的产生；或其任何组合。
36.一种治疗患者中的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用权利要求26-35中任一项所述的受感染的肿瘤细胞，其中被溶瘤病毒感染的所述肿瘤细胞来自所述患者。
37.根据权利要求36所述的方法，还包括用溶瘤弹状病毒感染来自患者的肿瘤细胞以产生所述受感染的肿瘤细胞，所述溶瘤弹状病毒的基因组包含编码白细胞介素-12（IL12）蛋白或其功能部分的核酸序列。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述受感染的肿瘤细胞被静脉内施用。
39.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述受感染的肿瘤细胞被腹膜内施用。
40.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述受感染的肿瘤细胞被瘤内施用。
41.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述受感染的肿瘤细胞被鞘内施用。
42.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述受感染的肿瘤细胞被颅内施用。
43.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述受感染的肿瘤细胞被皮下施用。
44.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述受感染的肿瘤细胞被胸内施用。
45.根据权利要求17-25中任一项所述的溶瘤性Maraba病毒、或权利要求26-35中任一项所述的受感染的肿瘤细胞用于治疗患者中的癌症的用途。
46.根据权利要求17-25中任一项所述的溶瘤性Maraba病毒、或权利要求26-35中任一项所述的受感染的肿瘤细胞，其用于治疗患者中的癌症。
表达IL12的溶瘤弹状病毒
技术领域
[0002] 本公开涉及表达白细胞介素-12的重组溶瘤弹状病毒。
背景技术
[0003] 以下段落不是承认其中讨论的任何内容是现有技术或本领域技术人员的知识的一部分。
[0004] 溶瘤病毒（Oncolytic Virus，OV）是有前途的抗癌治疗剂，其被设计或选择来在肿瘤细胞中感染和繁殖，同时在正常组织中具有减弱的复制能力。对一些OV的效力重要的一个特征是刺激抗肿瘤免疫应答的能力。
[0005] 在过去曾尝试患者自身癌细胞的疫苗接种（自体细胞疫苗），并取得了不同程度的成功（1、2）。大多数采用将全细胞疫苗与非特异性佐剂混合，例如Bacillus Colmette-Guérin（BCG），但是在克服肿瘤微环境内免疫抑制方面的困难收效甚微（3）。尽管如此，临床试验一致表明，能够对全细胞疫苗产生免疫应答的患者的存活率明显更好，这表明当产生免疫应答时，预后得到改善（4）。
[0006] 细胞因子，例如IL-12，也已被用于引导抗肿瘤免疫应答，但这些细胞因子当作为蛋白质给药时的短半衰期，以及全身给药后遇到的剂量限制性毒性，已经减少了它们潜在的有效性（5）。也就是说，基于细胞因子的疫苗的强免疫原理继续推动世界各地众多实验室开发新的实验方法。发明内容
[0007] 以下介绍旨在向读者介绍本说明书，而不是定义任何发明。一个或多个发明可以存在于下面或本文的其他部分中描述的元素或方法步骤的组合或子组合中。发明人不会仅仅因为没有在权利要求书中描述其他发明，而放弃或否认对本说明书中公开的任何发明的权利。
[0008] 使用溶瘤病毒治疗癌症的常见问题是使用该病毒作为单一药剂的抗肿瘤免疫激活不足。
[0009] 本领域需要用能够抗肿瘤免疫激活的OV治疗癌症的方法。此类OV可用于在肿瘤微环境中具有改善的免疫应答的自体细胞疫苗中。
[0010] 在一方面，本公开试图通过提供Maraba病毒来解决或改善与溶瘤病毒治疗癌症有关的一个或多个缺点，所述Maraba病毒的基因组包括编码白细胞介素-12（IL12）或其功能部分的核酸序列。IL12蛋白或其功能部分的表达可以增强被Maraba病毒感染的肿瘤细胞的免疫原性。
[0011] 白细胞介素12也称为自然杀伤细胞刺激因子（NKSF）或细胞毒性淋巴细胞成熟因子（CLMF）。IL-12是含有两个二硫键连接的亚基p35和p40的异二聚体细胞因子。人p35和p40蛋白的序列分别显示在SEQ ID NO：1和2中。鼠p35和p40蛋白的序列分别显示在SEQ ID NO：3和4中。人和鼠IL-12在他们的p35和p40亚基中分别具有60%和70%的氨基酸序列同一性。二硫键连接的鼠p40同型二聚体可以结合至IL-12受体，并且可以在体外充当IL-12活性的拮抗剂。尽管与同型二聚体的活性相比活性降低，但鼠p40单体仍然可以充当IL-12拮抗剂。在本公开的上下文中，p40的这些单体和同型二聚体将被认为是IL12的功能部分。
[0012] 由Maraba病毒编码的IL12或其功能部分可以具有基本上对应于人p35和p40序列的序列。由Maraba病毒编码的IL12或其功能部分可以具有基本上对应于鼠p35和p40序列的序列。由Maraba病毒编码的IL12或其功能部分可以具有至少60%与野生型人IL12相同的序列，只要IL12或其功能部分能够：刺激T细胞、NK细胞或两者的生长；增强人NK/淋巴因子激活的杀伤细胞的溶解活性；通过静息（resting）人外周血单核细胞（PBMC）来刺激IFN-γ的产生；或其任何组合。
[0013] IL12可以具有来自不同来源的IL12的序列的嵌合体的序列。例如，由Maraba病毒编码的IL12可以具有基本上对应于人p35单体的序列的序列，以及基本上对应于鼠p40单体的序列的序列。得到的异二聚体是人和小鼠IL12亚基的嵌合体。如实施例中所示，尽管鼠IL12和人IL12在其p40和p35亚基中仅分别具有70%和60%的氨基酸序列同一性，但由Maraba病毒表达的鼠IL12保留其对人NK细胞的刺激特性。
[0014] 在本公开的上下文中，诸如“IL12序列”的表达应当被理解为是指构成二聚体蛋白的亚基的序列的全体，而不管该亚基以何种顺序列出。因此，应该理解的是，上述关于由Maraba病毒编码的IL12具有至少60%与野生型人IL12相同的序列的讨论，比较了由Maraba病毒编码的p35和p40的序列的组合和野生型人IL12的p35和p40的序列的组合。
[0015] 弹状病毒可以是野生型Maraba病毒的变体。野生型Maraba病毒基因组具有从3'末端到5'末端编码N、P、M、G和L蛋白的核苷酸序列。Maraba病毒（美国专利号8,481,023的SEQ ID No：1-6，通过引用并入本文；HQ660076.1）根据本公开的野生型Maraba病毒的变体可以具有含有以不同于3'-N、P、M、G、L-5'的顺序编码N、P、M、G和L蛋白的核苷酸序列的基因组。Maraba病毒的变体可以包括：G蛋白在对应于野生型序列的位置242的位置的突变（例如Q242R）；和/或基质（M）蛋白在对应于野生型序列的位置123的位置的突变（例如L123W）。包括野生型G蛋白中的Q242R突变、以及野生型M蛋白中的L123W突变的野生型Maraba病毒的变体，在本文中可称为“MG1”。在G蛋白的氨基酸242处和/或在M蛋白的氨基酸123处含有取代的Maraba病毒如在美国专利号9,045,729的第2栏第24-42行中描述，其整体内容通过引用并入本文。溶瘤性Maraba MG1病毒经过遗传修饰，在G和M蛋白中均具有突变，使其在癌细胞中具有高毒力，并在正常细胞中衰减（6）。野生型Maraba病毒的变体可包括具有重排的N、P、M、G和L蛋白的核苷酸序列的基因组，以及上述G和M蛋白的突变中的一个或两个。
[0016] IL12可由一个或多个核苷酸序列编码，所述核苷酸序列位于：编码N、P、M、G和L蛋白的核苷酸序列之前；编码N、P、M、G和L蛋白的核苷酸序列之后；或编码N、P、M、G和L蛋白的任何核苷酸序列之间。例如，编码p35和p40蛋白的核苷酸序列可位于编码突变的G蛋白和L蛋白的核苷酸序列之间。在另一个实施例中，编码p35的核苷酸序列可位于编码M蛋白和突变的G蛋白的核苷酸序列之间，而编码p40蛋白的核苷酸序列可位于编码突变的G蛋白和L蛋白的核苷酸序列之间。
[0017] 为清楚起见，应该理解本公开考虑了以下任何组合：（i）改变由Maraba病毒编码的蛋白质的顺序；（ii）包括G和/或M蛋白的突变，如上所述；以及（iii）改变编码IL12或其功能部分的核苷酸序列的位置。
[0018] 在另一方面，本公开提供了受感染的细胞疫苗（Infected Cell Vaccine，ICV），其中来自患者的肿瘤细胞被表达IL12或其功能部分的溶瘤弹状病毒感染。在受感染的细胞疫苗中，将肿瘤细胞从患者移除，并在体外用溶瘤弹状病毒进行感染。然后可以将被病毒感染的细胞作为受感染的细胞疫苗（ICV）施用给患者。溶瘤弹状病毒可以是Maraba病毒，其基因组包括编码白细胞介素-12（IL12）或其功能部分的核酸序列，如本文所讨论的。所述ICV可以腹膜内给药；静脉内给药；鼻内、颅内、皮下、鞘内、皮内、胸内或肌肉内给药。
[0019] 为清楚起见，应该理解的是本公开考虑由溶瘤弹状病毒表达的IL12或其功能部分可以与上述由Maraba病毒表达的IL12或其功能部分相同。
[0020] 为清楚起见，还应理解本公开考虑了以下任意组合：（i）改变由野生型弹状病毒编码的蛋白质的顺序；（ii）将编码IL12或其功能部分的核苷酸序列置于编码弹状病毒蛋白的任何基因之间。
[0021] 在其他方面，本公开提供了一种治疗癌症的方法，其通过施用所公开的Maraba病毒或所公开的受感染的细胞疫苗。本公开还提供了所公开的Maraba病毒或所公开的受感染的细胞疫苗用于治疗癌症的相应用途。附图说明
[0022] 现在将参考附图仅通过实施例的方式描述本公开的实施方案。
[0023] 图1是显示在MG1的G和L基因之间插入IL12基因以形成重组MG1-IL12溶瘤弹状病毒的图。
[0025] 图3是证明表达IL12的重组MG1在指定的MOI下对CT26lacZ肿瘤细胞与单独的MG1一样具有细胞毒性的实施例。
[0027] 图5显示通过ELISA测量，包含用重组MG1-IL12感染的经辐射的CT26lacZ肿瘤细胞的示例性ICV产生IL12细胞因子。
[0028] 图6证明通过ELISA测量，被施用了包含用重组MG1-IL12感染的经辐射的B16F10肿瘤细胞的示例性ICV的肿瘤幼稚小鼠（tumour naïve mice）的肺匀浆具有增加的IL12细胞因子水平。
[0029] 图7证明通过ELISA测量，被施用了包含用重组MG1-IL12感染的经辐射的B16F10肿瘤细胞的示例性ICV的肿瘤幼稚小鼠的肺匀浆具有增加的IFNγ细胞因子水平。
[0030] 图8显示通过流式细胞术测量，在经包含用重组MG1-IL12感染的经辐射的B16F10肿瘤细胞的示例性ICV治疗的肿瘤幼稚小鼠的肺中CD3+ T细胞的总数没有变化。
[0031] 图9显示通过流式细胞术测量，在经包含用重组MG1-IL12感染的经辐射的B16F10肿瘤细胞的示例性ICV治疗的肿瘤幼稚小鼠的肺中NK1.1+细胞的总数增加。
[0032] 图10显示通过流式细胞术测量，在经包含用重组MG1-IL12感染的经辐射的B16F10肿瘤细胞的示例性ICV治疗的肿瘤幼稚小鼠的肺中NK1.1+ IFNγ+细胞的总数增加。
[0033] 图11显示通过流式细胞术测量，在经包含用重组MG1-IL12感染的经辐射的B16F10肿瘤细胞的示例性ICV治疗的肿瘤幼稚小鼠的肺中NK1.1+颗粒酶B+细胞的总数增加。
[0034] 图12显示用MG1-IL12 ICV处理后从肿瘤幼稚小鼠分离的脾细胞的离体铬释放细胞毒性测定的结果，表明增加的靶YAC1细胞的杀伤。
[0035] 图13显示与施用不含IL12的MG1 ICV和未感染的B16F10细胞相比，向小鼠静脉内施用MG1-IL12 ICV后B16F10肺转移中的减少。
[0036] 图14显示在免疫接种MG1-IL12 ICV的小鼠的腹膜腔中NK（NK1.1- CD3-）细胞的募集的增加。
[0037] 图15显示通过CD69染色测量，在免疫接种MG1-IL12 ICV的小鼠的腹膜腔中积聚的NK（NK1.1- CD3-）细胞被激活。
[0038] 图16显示免疫接种MG1-IL12 ICV的小鼠在用RMA-S肿瘤细胞攻击时表现出排斥反应的百分比的增加。
[0039] 图17显示免疫接种MG1-IL12 ICV的患有腹膜B16F10肿瘤的小鼠的存活率增加。
[0040] 图18证明免疫接种MG1-IL12 ICV后携带肿瘤的小鼠的增加的存活是NK细胞依赖性的，因为使用抗-NK1.1抗体通过NK细胞消耗消除了这种效应。
[0041] 图19显示从幼稚小鼠分离并用已经用MG1-IL12 ICV刺激的分离的树突细胞（DC）共培养的脾细胞的IFNγ分泌增加。
[0042] 图20显示从幼稚小鼠分离并用已经用MG1-IL12 ICV刺激的分离的DC共培养的脾细胞的IFNγ分泌的增加主要是由于NK细胞群。
[0043] 图21显示趋化性测定的结果，证明分离的幼稚NK细胞迁移至用已经用MG1-IL12 ICV刺激的分离的DC调节的无细胞培养基中的增加。
[0044] 图22证明在用MG1-IL12 ICV刺激的DC的共培养后，IP-10趋化因子被释放到培养基中。
[0045] 图23证明用IP-10中和抗体中和IP-10消除了在具有通过MG1-IL12 ICV刺激的DC的条件培养基中诱导的NK细胞趋化性。
[0046] 图24说明在初始肿瘤接种和随后的免疫接种MG1-IL12 ICV与MG1 ICV或用单独的病毒MG1或重组病毒MG1-IL12处理后对小鼠的存活的有益作用。
[0047] 图25证明免疫接种MG1-IL12后增加的存活率伴随着腹膜器官（包括相关的肿瘤负荷）的总重量中相应的减少。
[0048] 图26说明对每两周免疫接种一次MG1-IL12 ICV、为期三周的具有大型晚期肿瘤的小鼠的存活的有益效果。
[0049] 图27显示免疫接种MG1-IL12 ICV的一只代表性小鼠的MRI扫描，其表明肿瘤负荷随时间减少。
[0050] 图28显示用感染了MG1-IL12 ICV的SW620细胞培养的PBMC中人NK细胞的活化增加。
[0051] 图29证明从用感染了MG1-IL12 ICV的SW620细胞培养的PBMC制备的无细胞条件培养基的刺激效应引起人NK细胞的迁移增加。
[0052] 图30显示在人PBMC与感染了MG1-IL12 ICV的SW620细胞共培养后增加的IP-10趋化因子产生。
[0053] 图31显示来自人癌症患者的与感染了MV1-IL12 ICV的SW620细胞在50:1的效应物：靶标比例下一起培养的分离的NK细胞的增强的离体细胞毒性。
[0054] 图32显示来自人癌症患者的与感染了MG1-IL12 ICV的SW620细胞在30:1的效应物：靶标比例下一起培养的分离的NK细胞的增强的离体细胞毒性。
[0055] 图33显示用MG1-IL12 ICV全身静脉内治疗后，肿瘤幼稚小鼠的脾脏中NK1.1+ IFNγ+细胞的总数的增加。
[0056] 图34显示用MG1-IL12 ICV全身静脉内治疗后，肿瘤幼稚小鼠的脾脏中NK1.1+颗粒酶（Gramzyme）B+细胞的总数的增加。
[0057] 图35显示使用感染了MG1-IL12的K562细胞培养的个体健康患者PBMC的离体铬释放细胞毒性测定的结果。
[0058] 图36显示使用感染了MG1-IL12的K562细胞培养的个体健康患者PBMC的离体铬释放细胞毒性测定的结果。
[0059] 图37显示使用感染了MG1-IL12的K562细胞培养的个体癌症患者PBMC的离体铬释放细胞毒性测定的结果。
[0060] 图38显示使用感染了MG1-IL12的K562细胞培养的个体癌症患者PBMC的离体铬释放细胞毒性测定的结果。
[0061] 图39显示在肿瘤接种后在BALB/c小鼠中使用不同途径的MG1-IL12 ICV施用的差异效力。
[0062] 图40说明免疫接种MG1-IL12 ICV后NK细胞募集和激活的机制的建议模型。
[0063] 详细说明大体地，本公开提供了：一种Maraba病毒，其基因组包括编码细胞因子IL12的转基因序列；一种受感染的细胞疫苗（ICV），其中来自患者的自体肿瘤细胞被用表达IL12的溶瘤重组弹状病毒离体感染；一种通过施用Maraba病毒或受感染的细胞疫苗来治疗癌症的方法；以及Maraba病毒或受感染的细胞疫苗用于治疗癌症的用途。不希望受理论束缚，本公开的作者认为，IL12的表达可以增强所施用的溶瘤病毒的抗肿瘤免疫应答。
[0064] 腹膜癌（PC）是腹部恶性肿瘤（包括胃肠癌和卵巢癌）转移的最常见和有问题的部位之一（7）。这是一种常见的癌症转移，其与显著降低的生活质量、中数生存率和不良预后相关，需要新的治疗选择。PC对不能用于发生并发症（例如肠梗阻）的患者的传统化疗的使用提出了挑战（8）。治疗PC的另一个挑战是难以递送治疗药剂。有效治疗的另一个障碍是全身使用或直接递送至靶位点的免疫调节剂的毒性和短半衰期。
[0065] 本公开的一个方面可以通过增强溶瘤病毒的抗肿瘤免疫应答来克服这些挑战中的一个或多个。举例来说，在一个特定的实施方案中，用表达细胞因子IL12的溶瘤弹状病毒离体感染患者的肿瘤细胞。然后将这些受感染的细胞作为受感染的细胞疫苗（ICV）再次施用给患者。不希望受理论束缚，本公开的作者认为，受感染的肿瘤细胞提供由IL12的产生补充的免疫刺激环境。IL12原位的表达降低了与IL12的高剂量给药相关的半衰期和/或毒性缺陷。本公开的作者认为，IL12的表达可以补充和刺激NK细胞至肿瘤部位，并减小肿瘤的大小。NK细胞的激活（免疫应答的适应性臂）可以赋予长期记忆，从而降低肿瘤复发的可能性。
[0066] 材料和方法。
[0067] 细胞系和小鼠：鼠CT26结肠癌、鼠B16F10 F10黑素瘤、人SW620结直肠腺癌、人HCT15结直肠腺癌、人A549肺癌、鼠YAC-1淋巴瘤、人K562白血病细胞系（均来自American Type Tissue Collection）在用于粘附细胞系的Dulbecco的改良的Eagle培养基（Hyclone）、或补充有10%胎牛血清的用于非粘附细胞系的Roswell Park Memorial Institutes培养基（Hyclone）（Cansera, Etobicoke, Ontario, Canada）中繁殖。Rauscher鼠白血病病毒诱导的T细胞淋巴瘤（RMA）和RMA-S（RMA的MHC缺陷变体）获自Dr. A. Veillette (Institut de Recherches Clinique, Montreal, Quebec, Canada)。6至8周龄的雌性Balb/C和C57BL/6小鼠购自Charles River Laboratories (Wilmington, MA)。将动物饲养在无病原体的条件下，并且所有实验均在University of Ottawa Animal Care和Veterinary Service的批准下进行。
[0068] 构建：从pORF-mIL-12 (IL-12elasti (p35::p40)) (InvivoGen, San Diego, CA, USA) PCR扩增鼠IL12以添加MluI（5'）和（3'）克隆位点来促进克隆成 Maraba MG1（9）。如前所述拯救重组MG1-IL12病毒（10）。简而言之，将A549使用表达T7聚合酶的痘苗病毒进行感染，随后使用脂质体2000（Invitrogen, Burlington, ON, Canada）通过2 mg的MG1-IL-12 DNA质粒和编码Maraba N、P和L的pCI-Neo质粒（分别为1、1.25、0.25 mg）来转染。将获救的病毒在SNB19细胞上传代，然后空斑纯化、扩增并滴在Vero细胞上。
[0069] 生存力测定：将B16lacZ、CT26lacZ、SW620和HCT15细胞系接种到96孔板（2×104细胞/孔）中。24小时后，细胞以0.001–10 pfu/细胞的感染复数（MOI）感染MG1或MG1-IL12病毒。孵育48小时后加入阿尔玛蓝（Sigma-Aldrich, St Louis, MO）至终浓度为20 μg/ml。孵育6小时后，在570 nm的波长下读取吸光度。
[0070] 抗体和FACS 分析：对于脾和肺淋巴细胞群分析，从小鼠收获器官，并使用氯化铵–钾裂解（ACK）缓冲液裂解红细胞。使用以下单克隆抗体：来自eBiosciences的抗TCR-b（H57-597）、抗NK1.1（PK136）。在使用抗CD3（17A2）、抗NK1.1（PK136）、抗IFN-γ（XMG1.2）和抗颗粒酶B（16G6）（均来自BD Biosciences）进行1小时GolgiPlug（BD Biosciences）孵育后，分析脾和肺NK细胞IFN-γ和颗粒酶B分泌。用于人NK细胞迁移和活化的单克隆抗体是：来自Biolegend的抗CD56（HCD56）、来自eBiosciences的抗CD3（UCHT1）和抗CD69（FN50）。使用Summit软件（Beckman Coulter, Mississauga, Canada）在CyAn-ADP上进行荧光激活细胞分选（FACS）采集，并用Kaluza软件（Beckman Coulter）分析数据。
[0071] 离体脾细胞细胞毒性测定如前所述进行51Cr释放测定（11）。简而言之，在处理后两天从处理和对照小鼠收获脾细胞。将经ACK缓冲液处理的脾细胞重悬并与铬标记的YAC-1细胞以特定的效应物与靶标（E:T）比例混合。
[0072] 体内肿瘤排斥试验如前所述进行体内排斥试验（11）。简而言之，分别用5和0.5 mmol/L CFSE标记RMA和RMA-S。在ICV处理后24小时，将含有每种细胞类型的1:1混合物的1×106个细胞腹膜内注射到C57BL/6小鼠中。第二天（24小时）通过用5 mL含有2 mmol/L EDTA的PBS洗涤腹膜来收集腹膜细胞。通过流式细胞术分析收集的细胞中CFSE标记的存在。
[0073] 病毒感染B16F10细胞并与骨髓来源的DC共培养用于趋化性和趋化因子分析在感染后18小时收获感染了MG1或MG1-IL12（MOI = 0.1 pfu/细胞）的B16F10细胞，并在96孔板中在DC培养基（1% FBS）（补充有1X的2-巯基乙醇（2-Mercapoethanol）(cat #21985-023, Gibco, life technologies)的完全PRMI）中以3:1的比例与其他地方描述的骨髓来源的树突细胞（DC）一起培养（12）。24小时后收集培养基并储存在-80℃下直至进一步分析。
[0074] 细胞因子和趋化因子分析根据制造商的说明，通过FlowCytomix（eBioscience）试剂盒检测来自DC共培养上清液的鼠IFNγ。对于肺IL12和IFNγ表达，以5×105个细胞/100ul/小鼠静脉内注射irrB16、MG1 ICV或MG1-IL12 ICV处理的来自C57Bl/6小鼠的肺被切除并在处理后24小时在1ml PBS中匀浆。根据制造商的说明，使用ELISArray试剂盒（SABiosciences）在ICV处理后18小时，从C57Bl/6小鼠的腹膜液（体内）或从组织培养上清液中测定鼠MCP-1、SDF-1和IP-10趋化因子。
[0075] 鼠transwell趋化性试验在DC培养基中产生用于趋化因子或趋化性试验的评估的组织培养上清液。如前所述使用Transwell系统评估NK细胞的趋化性（13）。简而言之，将500 ul来自DC培养物的条件培养基加入具有5-um孔的Transwell板（Costar，Corning）的下室。将3×105个DX5+分选的NK细胞加入上室中，并将板在37℃下孵育3小时。 收获下室中的细胞，用台盼蓝染色并计数。迁移百分比计算为（底室中NK细胞总数/NK细胞输入总数）×100。计算NK细胞指数：（NK细胞迁移百分比/来自单独培养基组的NK细胞迁移百分比）。
[0076] 人transwell趋化性试验通过直接ICV-PBMC以3:1的比例共培养18小时，在DC培养基中产生条件培养基。将1×
106个PBMC加入上室中，并将板在37℃下温育3小时。收获下室中的细胞，用抗CD56（HCD56）和抗CD3（UCHT1）染色并通过FACS定量。迁移百分比计算为（底室中NK细胞总数/NK细胞输入总数）×100。计算NK细胞指数：（NK细胞迁移百分比/来自单独培养基组的NK细胞迁移百分比）。
106个PBMC加入上室中，并将板在37℃下温育3小时。收获下室中的细胞，用抗CD56（HCD56）和抗CD3（UCHT1）染色并通过FACS定量。迁移百分比计算为（底室中NK细胞总数/NK细胞输入总数）×100。计算NK细胞指数：（NK细胞迁移百分比/来自单独培养基组的NK细胞迁移百分比）。
[0077] 脾细胞共培养物通过MACS CD11c+选择（Miltenyi Biotec）分离DC-MG1-IL-12-ICV，并在DC培养基中以
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1:5的比例、以96孔板形式以2×10个脾细胞/孔与幼稚脾细胞共培养。二十四小时后，将无细胞上清液储存在-80℃下用于IFNγ的测量。还如上所述通过细胞内FACS对脾细胞进行细胞内IFNγ染色。
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1:5的比例、以96孔板形式以2×10个脾细胞/孔与幼稚脾细胞共培养。二十四小时后，将无细胞上清液储存在-80℃下用于IFNγ的测量。还如上所述通过细胞内FACS对脾细胞进行细胞内IFNγ染色。
[0078] 小鼠模型。
[0079] 治疗性处理模型。将分别在BALB/c和C57Bl/6小鼠中的CT26和B16F10腹膜癌，在腹膜内接种5×105个肿瘤细胞后，在第3天用1×104 ICV处理。对于CT26庞大的肿瘤模型，将5×105个肿瘤细胞接种在腹膜内，并且在磁共振（MR）扫描确认大小为>3 mm的肿瘤后开始六个剂量的ICV的治疗方案。动物用异氟烷气体进行镇静，并用7 Tesla GE/Agilent MR 901（GE Healthcare, Chicago, USA）进行MR扫描。对于每只小鼠，使用三个MR脉冲序列：在冠状面和轴向面中的一个定位器和两个快速自旋回波（FSE）序列。FSE序列的参数是：回波链长度8，带宽=16 kHz，回波时间=42ms，重复时间=1500ms，视场=35mm，矩阵256×256，切片厚度=1mm。每只小鼠的总MR扫描时间约为15分钟。使用相同的MR扫描参数，在治疗开始后一周、六周和十三周进行后续MR扫描。
[0080] 预防性治疗模型。C57Bl/6小鼠腹膜内注射接种单剂量的1×103 irrB16、MG1 ICV或MG1-IL-12-ICV。第二天，用3×105 个B16F10-LacZ细胞IV攻击小鼠，在肿瘤细胞注射后4天处死小鼠，然后如前所述用X-gal（Bioshop，Burlington，Canada）染色和定量肺转移瘤（14）。使用立体显微镜（Leica Microsystems，Concord，Canada）在所有肺叶上测定肺表面转移瘤的总数。
[0081] 统计分析所有统计学分析均使用GraphPad Prism 6.0软件来确定。统计学显著性通过Student t检验确定，截止值P = 0.05。数据表示为±SD。
[0082] 编码鼠IL12的MG1溶瘤病毒（MG1-IL12）的表征将由p35和p40亚基组成的鼠IL12转基因（p70）掺入溶瘤Maraba病毒变体MG1的骨架中以产生MG1-IL12（图1）。这种复制能力强的溶瘤病毒被发现感染鼠和人肿瘤细胞系，其效率与亲本MG1相当，并且IL12的表达不会对病毒复制或扩散产生负面影响（图2和3）。此外，在感染了MG1-IL12的B16F10（22 pg/细胞）和CT26（180 pg/细胞）细胞的培养基中检测到IL12（图4和5）。这些结果一起证明，MG1-IL-12可成功感染鼠肿瘤细胞，导致病毒复制和IL-12分泌，从而产生受MG1-IL12感染的细胞疫苗（ICV）。
[0083] 实施例MG1-IL12 ICV增强NK细胞介导的肿瘤排斥。
本公开的作者先前已证明，用溶瘤病毒离体感染自体肿瘤细胞可以在体内引发针对已建立的、非允许性肿瘤的强烈免疫应答（15）。为了确定当用作ICV时MG1和MG1-IL12是否可以类似地诱导免疫应答，作者静脉内（i.v.）注射5x105 Ɣ-辐射的B16F10细胞，该细胞被模拟感染或受MG1或MG1-IL12感染。作者先前已证明，ICV的静脉内注射给药与在无肿瘤动物中在肺中持续长达1天的注射细胞的快速和剂量依赖性积累相关（16）。在ICV递送后，与接受单独细胞或MG1 ICV的动物相比，在接受MGI-IL12 ICV的小鼠的肺匀浆中检测到显著更高水平的IL12（图6，t = 24小时）。为了确定增加的IL12浓度是否具有任何功能效应，测量了IL12响应性细胞因子IFNγ的水平。与IL12的增加一致，与接受MG1 ICV或经辐射的细胞的小鼠相比，在用MG1-IL12 ICV治疗的小鼠的肺中IFNγ的水平也升高（图7）。由于IL12靶向NK细胞和T细胞以促进IFNγ分泌（17），因此作者接下来试图确定哪种细胞类型对我们的MG1-IL12 ICV处理有响应。有趣的是，没有发现用MG1-IL12 ICV接种疫苗影响肺部中T细胞的总数，但是，观察到肺部中存在的NK细胞的总数增加了3倍，表明MG1-IL12 ICV增强 NK细胞募集（图8和9）。此外，注射MG1-IL12 ICV后，IFNγ和颗粒酶B阳性NK细胞的总数分别增加约7倍和4倍，表明NK细胞活化增加（图10和11）。为了进一步研究这种效应，离体测量了NK细胞针对YAC-1靶细胞的细胞毒活性，并观察到从MG1-IL-12 ICV处理的小鼠中分离的脾细胞表现出显著更高水平的YAC-1杀伤（图12）。这些数据支持MG1-IL12 ICV在促进NK细胞募集到递送的位点和脾NK细胞的伴随的全身活化中的作用（图33和34）。为了确定这种效应是否转化为改善的肿瘤清除率，通过静脉内递送单独用经辐射的细胞、MG1-IL12 ICV或MG1 ICV治疗B16F10肺转移（图13）。与用MG1 ICV或经辐射的细胞处理相比，MG1-IL12 ICV的全身递送足以显著地减弱可检测的肺转移的数量。这些结果表明，MG1-IL12 ICV可以刺激NK细胞募集和效应功能以显著地提高受感染的细胞疫苗的抗肿瘤效力。
本公开的作者先前已证明，用溶瘤病毒离体感染自体肿瘤细胞可以在体内引发针对已建立的、非允许性肿瘤的强烈免疫应答（15）。为了确定当用作ICV时MG1和MG1-IL12是否可以类似地诱导免疫应答，作者静脉内（i.v.）注射5x105 Ɣ-辐射的B16F10细胞，该细胞被模拟感染或受MG1或MG1-IL12感染。作者先前已证明，ICV的静脉内注射给药与在无肿瘤动物中在肺中持续长达1天的注射细胞的快速和剂量依赖性积累相关（16）。在ICV递送后，与接受单独细胞或MG1 ICV的动物相比，在接受MGI-IL12 ICV的小鼠的肺匀浆中检测到显著更高水平的IL12（图6，t = 24小时）。为了确定增加的IL12浓度是否具有任何功能效应，测量了IL12响应性细胞因子IFNγ的水平。与IL12的增加一致，与接受MG1 ICV或经辐射的细胞的小鼠相比，在用MG1-IL12 ICV治疗的小鼠的肺中IFNγ的水平也升高（图7）。由于IL12靶向NK细胞和T细胞以促进IFNγ分泌（17），因此作者接下来试图确定哪种细胞类型对我们的MG1-IL12 ICV处理有响应。有趣的是，没有发现用MG1-IL12 ICV接种疫苗影响肺部中T细胞的总数，但是，观察到肺部中存在的NK细胞的总数增加了3倍，表明MG1-IL12 ICV增强 NK细胞募集（图8和9）。此外，注射MG1-IL12 ICV后，IFNγ和颗粒酶B阳性NK细胞的总数分别增加约7倍和4倍，表明NK细胞活化增加（图10和11）。为了进一步研究这种效应，离体测量了NK细胞针对YAC-1靶细胞的细胞毒活性，并观察到从MG1-IL-12 ICV处理的小鼠中分离的脾细胞表现出显著更高水平的YAC-1杀伤（图12）。这些数据支持MG1-IL12 ICV在促进NK细胞募集到递送的位点和脾NK细胞的伴随的全身活化中的作用（图33和34）。为了确定这种效应是否转化为改善的肿瘤清除率，通过静脉内递送单独用经辐射的细胞、MG1-IL12 ICV或MG1 ICV治疗B16F10肺转移（图13）。与用MG1 ICV或经辐射的细胞处理相比，MG1-IL12 ICV的全身递送足以显著地减弱可检测的肺转移的数量。这些结果表明，MG1-IL12 ICV可以刺激NK细胞募集和效应功能以显著地提高受感染的细胞疫苗的抗肿瘤效力。
[0084] 增强NK细胞活化并改善腹膜癌的模型中的存活率。初步发现表明，与MG1 ICV相比，由MG1-IL12 ICV引起的改善的抗肿瘤应答部分是由于IL12的强效趋化性质，这有助于增强细胞毒性NK细胞向递送部位的募集（图9、10和11）。因此，作者接下来试图评估用MG1-IL12 ICV腹腔内接种疫苗小鼠是否可以改善腹膜腔内肿瘤的清除率并促进身生存率的提高。与之前对静脉内接种疫苗的观察相似，作者观察到与MG1 ICV相比，腹膜内接种疫苗24小时后腹膜中NK细胞的比例增加（19% vs 49%，p = 0.0073）（图14）。浸润的NK细胞还显示出活化标记物CD69的显著上调，表明在MG1-IL12 ICV接种的小鼠的腹膜中积累的NK细胞被更高度地活化（图15）（18、19）。为了补充这些发现，通过用NK敏感性RMA-S和亲本RMA肿瘤细胞系挑战接种疫苗的小鼠来进行体内NK细胞细胞毒性测定，以研究迁移至腹膜腔中的活化的NK细胞是否是肿瘤杀伤的。接种MG1-IL12 ICV后，肿瘤细胞清除率显著提高，表明ICV介导的NK细胞的募集和活化可有效地促进肿瘤细胞从腹膜中清除（图16）。支持这一结论，NK细胞耗尽后，用MG1-IL12 ICV对携带B16F10腹膜肿瘤的小鼠进行免疫接种的保护作用被完全消除，这进一步表明该处理策略的疗效取决于NK细胞的募集和活化（图17和18）。
[0085] 响应于MG1-IL12 ICV的NK细胞活化和迁移部分取决于从树突细胞分泌的IP10。该数据清楚地确定了MG1-IL12 ICV促进NK细胞活化、迁移和功能的能力，但是，尚不清楚树突细胞（DC）（体内NK细胞功能的关键介质）是否参与该过程。为了理解在MG1-IL 12的存在下NK细胞和DC之间的相互作用，作者量化了在骨髓来源的DC的存在下培养的脾细胞的IFNγ产生，这些DC未经处理或用模拟、MG1或MG1-IL12感染的B16F10细胞培养。值得注意的是，作者发现，用先前暴露于MG1-IL12 ICV的DC培养的脾细胞导致NK细胞特异性IFNγ分泌的显著增加，表明DC促进NK细胞细胞因子分泌（图19和20）。随后的步骤是使用体外transwell趋化性测定来研究DC促进NK细胞迁移的能力。发现NK细胞穿过5 um膜的迁移通过MG1ICV或MG1-IL-12 ICV而显著增加，然而MG1-IL12 ICV导致更高百分比的迁移NK细胞（图21）。NK细胞迁移通过在DC的存在下调节的培养基进一步增加，表明DC提供增加的NK细胞活化和迁移的刺激。接下来，作者试图确定DC通常分泌的何种趋化因子介导观察到的效应。尽管无法检测到对MCP-1（单核细胞趋化蛋白-1）和SDF-1（基质细胞衍生因子-1）分泌的任何作用，但发现MG1-IL12 ICV诱导IP-10（IFN-诱导蛋白-10）显著增加（图22）。在源自用MG1-IL12 ICV培养的DC的条件培养基中IP-10的中和，显著抑制体外NK细胞的迁移能力，证实其核心作用（图23）。
[0086] 可有效治疗小鼠中已形成的腹膜疾病。这些发现一起表明，MG1-IL12 ICV可以通过刺激活化的NK细胞的募集来显著减缓腹膜腔内B16F10肿瘤的生长。由于腹膜癌是晚期胃肠道和妇科恶性肿瘤的常见表现，本公开的作者试图确定MG1-IL12 ICV是否能够在有腹膜疾病的临床相关的结肠癌模型（CT26）中在治疗时提供治疗效益。为了实现这一目的，用CT26肿瘤细胞接种BALB/c小鼠（图24）。三天后，用单独的单剂量的辐射的细胞、单独的病毒或受感染的细胞疫苗处理小鼠。与接受MG1-IL12 ICV的小鼠相比，用经辐射的CT26细胞、MG1、MG1-IL12和MG1 ICV治疗的小鼠均具有显著更低的中位存活时间和增加的腹膜肿瘤负荷（>90% 26只治愈/28只存活的小鼠存活>
200天，图24和25）。有趣的是，被治愈的小鼠产生了持久的免疫力，使得当存活的小鼠在侧翼上用5X105 个CT26细胞再次攻击时，处理后148天，它们排斥肿瘤（5/5小鼠）。但是，这种抗肿瘤记忆免疫应答对CT26肿瘤是特异性的，并且当在相对侧翼上用同源4T1肿瘤细胞攻击时，所有小鼠都产生肿瘤（5/5小鼠）。令人惊讶的是，疫苗接种的途径在MG1-IL12 ICV赋予的效力中起重要作用，因为与静脉内或皮下注射相比，腹膜内给予的治疗具有更好的效力（图39）。
200天，图24和25）。有趣的是，被治愈的小鼠产生了持久的免疫力，使得当存活的小鼠在侧翼上用5X105 个CT26细胞再次攻击时，处理后148天，它们排斥肿瘤（5/5小鼠）。但是，这种抗肿瘤记忆免疫应答对CT26肿瘤是特异性的，并且当在相对侧翼上用同源4T1肿瘤细胞攻击时，所有小鼠都产生肿瘤（5/5小鼠）。令人惊讶的是，疫苗接种的途径在MG1-IL12 ICV赋予的效力中起重要作用，因为与静脉内或皮下注射相比，腹膜内给予的治疗具有更好的效力（图39）。
[0087] 接下来，作者试图测量在已形成的庞大肿瘤中治疗的效果。在植入后第10天和第17天之间，通过MRI观察肿瘤，将携带有显著肿瘤块（1级> 8 mm和2级> 3 mm）的小鼠随机分配到治疗组中，然后用6剂量的经辐射的细胞、MG1 ICV或MG1-IL12 ICV在两周内施用来治疗（图26）。尽管肿瘤负荷是致死的，这由到第15天用辐射细胞处理的所有动物的损失可以明显看出，但是MG1-IL12 ICV提供了完全保护（21/21存活> 80天，研究正在进行）。引人注目的是，在治疗的早期阶段确认了存在大肿瘤块的随访MRI扫描，在稍后的时间点显著减少（图27）。共同地，这些结果表明，MG1-IL12 ICV是促进腹膜癌的小鼠模型中腹膜内大的、已形成的肿瘤清除的有效方法。
[0088] 增强人NK细胞的细胞毒性和迁移能力。鉴于IL-12的鼠p40和p35亚基分别与其人对应物具有70%和60%的同源性，它们能够在功能上激活人NK细胞和T细胞（20）。作者接下来试图证实该疫苗可以离体引发对人NK细胞的类似作用。为实现此目的，用MG1或MG1-IL12感染经辐射的SW620结肠癌细胞，并与从健康供体分离的外周血单核细胞（PBMC）一起培养，作为（Ottawa Health Science Network Research Ethics Board批准的围手术期血液采集方案#2011884）的一部分。与先前的发现一致，MG1-IL12 ICV在PBMC的NK细胞（CD56+ CD3-）子集中导致CD69（确切的NK细胞活化标记物）的表达显著增加（图28）。此外，在与MG1-IL12 ICV共培养的PBMC的上清液中，IP-10趋化蛋白分泌也显著增加。该上清液增强了离体transwell系统中NK细胞的迁移，表明MG1-IL12 ICV疫苗引发了来自人和鼠来源的NK细胞的类似响应（图29和30）。最后，用MG1-IL12 ICV刺激PBMC导致对K562靶肿瘤细胞的细胞毒活性增加，表明在MG1-IL12 ICV的存在下培养的人NK细胞的活化和增强的迁移能力与根除肿瘤细胞的能力增加有关（图31、32、35、36、37和
38）。这些结果共同为假设提供了支持，即自体感染的肿瘤细胞疫苗可以在PC患者的治疗中提供急需的疗效。
38）。这些结果共同为假设提供了支持，即自体感染的肿瘤细胞疫苗可以在PC患者的治疗中提供急需的疗效。
[0089] 虽然上述实施例证明了特定Maraba病毒在小鼠中的效力，但作者相信，根据本公开的Maraba病毒和ICV也将解决或改善与溶瘤病毒治疗人类癌症有关的一个或多个缺点。
[0090] 腹膜癌用作可以使用根据本公开的Maraba病毒治疗的癌症表现的实施例。作者相信，其他肿瘤类型和其他位置的肿瘤也适合用根据本公开的Maraba病毒和ICV治疗。
[0091] 在前面的描述中，出于解释的目的，阐述了许多细节以便提供对实施例的透彻理解。但是，对于本领域技术人员显而易见的是，这些具体细节不是必需的。因此，已经描述的内容仅仅是对所描述的实施例的应用的说明，并且鉴于上述教导，许多修改和变化是可能的。
[0092] 由于以上说明书提供了实施例，应当理解，本领域技术人员可以对特定实施例进行修改和改变。因此，权利要求的范围不应受本文所述的特定实施例的限制，而应以与说明书整体一致的方式解释。
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[0094] 附录 A – 序列:SEQ ID NO:1 – 人IL12 p35亚基
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mdpkrqifld qnmlavidel mqalnfnset vpqkssleep dfyktkiklc illhafrira 241
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SEQ ID NO:2 – 人IL12 p40亚基
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tldqssevlg sgktltiqvk efgdagqytc hkggevlshs llllhkkedg iwstdilkdq 121
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lqlkplknsr qvevsweypd twstphsyfs ltfcvqvqgk skrekkdrvf tdktsatvic 301
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SEQ ID NO:3 – 小鼠IL12 p35亚基
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llkttddmvk tareklkhys ctaedidhed itrdqtstlk tclplelhkn esclatrets 121
sttrgsclpp qktslmmtlc lgsiyedlkm yqtefqaina alqnhnhqqi ildkgmlvai 181
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SEQ ID NO:3 – 小鼠IL12 p35亚基
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SEQ ID NO:4 – 小鼠IL12 p40亚基
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