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溶瘤麻疹病毒

阅读：696发布：2020-05-12

专利汇可以提供溶瘤麻疹病毒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及用于治疗对无自杀基因活性的溶瘤麻疹病毒具有原发或继发耐性的恶性细胞的包含重组麻疹病毒的药物组合物，所述重组麻疹病毒编码自杀基因。而且，本发明涉及基于麻疹疫苗毒株Schwarz的基因组的编码自杀基因的重组麻疹病毒，用于制备本文所要求的重组麻疹病毒的方法和试剂盒，所述自杀基因包含胞嘧啶脱氨酶特别地酵母胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶核酸核糖基转移酶特别地酵母尿嘧啶核酸核糖基转移酶的融合物。，下面是溶瘤麻疹病毒专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种药物组合物，其包含含有用于治疗对无自杀基因活性的溶瘤麻疹病毒具有原发或继发耐性的恶性细胞的自杀基因的重组麻疹病毒。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述恶性细胞通过进行下列步骤来鉴定：
(a)确定用溶瘤麻疹病毒以感染复数1感染来自所述恶性细胞的细胞群之后72h或优选地96h所述细胞群中活细胞的百分比，其中所述群中40％或更多，优选地50％或更多，更优选地60％或更多的百分比的活细胞指示所述恶性细胞对无自杀基因活性的溶瘤麻疹病毒具有原发或继发耐性。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述重组麻疹病毒基于麻疹疫苗株Schwarz。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中所述无自杀基因活性的溶瘤麻疹病毒来自麻疹疫苗株Schwarz，特别地具有根据SEQ-ID No.1的序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其中所述自杀基因包含胞嘧啶脱氨酶，特别地酵母胞嘧啶脱氨酶。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，其中所述自杀基因还包含尿嘧啶核酸核糖基转移酶，特别地酵母尿嘧啶核酸核糖基转移酶。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述自杀基因包含胞嘧啶脱氨酶特别地酵母胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶核酸核糖基转移酶特别地酵母尿嘧啶核酸核糖基转移酶的融合物，特别地其中所述自杀基因包含根据SEQ-ID NO.2的序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的药物组合物，其中所述重组麻疹病毒包含根据SEQ-ID No.3、SEQ-ID No.4、SEQ-ID No.8或SEQ-ID No.9，特别地SEQ-ID No.4的RNA序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的药物组合物，其中所述恶性细胞另外地对化学治疗和/或放射疗法无响应
10.根据权利要求1至9中任一项所述的药物组合物，其中所述恶性细胞选自下列列表：来自胆管癌、头颈癌和肉瘤的恶性细胞。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，其中所述治疗是重复治疗，特别地每周或每两周或每三周或每四周重复。
12.一种基于麻疹疫苗株Schwarz的重组麻疹疫苗，其编码包含胞嘧啶脱氨酶特别地酵母胞嘧啶脱氨酶的自杀基因，特别地包含胞嘧啶脱氨酶特别地酵母胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶核酸核糖基转移酶特别地酵母尿嘧啶核酸核糖基转移酶的融合物的自杀基因，特别地其中所述自杀基因包含根据SEQ-ID NO.2的序列。
13.根据权利要求12所述的重组麻疹病毒，其中所述重组麻疹病毒包含根据SEQ-ID No.3、SEQ-ID No.4、SEQ-ID No.8或SEQ-ID No.9，特别地SEQ-IDNo.4的RNA序列。
14.一种生产根据权利要求12或13所述的重组麻疹病毒的方法，其包括步骤(a)将(i)麻疹疫苗株Schwarz的基因组和(ii)包含胞嘧啶脱氨酶特别地酵母胞嘧啶脱氨酶的自杀基因，特别地包含胞嘧啶脱氨酶特别地酵母胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶核酸核糖基转移酶特别地酵母尿嘧啶核酸核糖基转移酶的融合物的自杀基因克隆至由RNA聚合酶II启动子控制的质粒中。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述自杀基因包含根据SEQ-ID NO.2的序列。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其进一步包括步骤(b)将麻疹病毒帮助基因N、P和L克隆至至少一个载体中，其每一个由RNA聚合酶II启动子控制。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述病毒帮助基因N、P和L每一种被克隆至单独的载体特别是质粒载体中。
18.根据权利要求17所述的方法，其包括下列步骤：
(ba)将由RNA聚合酶II启动子控制的麻疹帮助基因N克隆至第一载体，特别地质粒载体中；
(bb)将由RNA聚合酶II启动子控制的麻疹帮助基因P克隆至第二载体，特别地质粒载体中；
(bc)将由RNA聚合酶II启动子控制的麻疹帮助基因L克隆至第三载体，特别地质粒载体中。
19.根据权利要求14至18中任一项所述的方法，其中步骤(a)和/或(b)，或(a)、(ba)、(bb)和/或(bc)进一步包括将推定的剪切序列从所述基因组和/或所述帮助基因中的任一个除去的步骤。
20.根据权利要求14至19中任一项所述的方法，其中步骤(a)产生具有根据SEQ-ID No.4、SEQ-ID No.8或SEQ-ID No.9特别地SEQ-ID No.4的质粒。
21.根据权利要求18或19所述的方法，步骤(ba)至(bc)产生具有根据SEQ-ID No.5、SEQ-ID No.6和SEQ-ID No.7的序列的质粒。.
22.根据权利要求14至21任一项所述的方法，其进一步包括步骤(c)用步骤(a)和(b)或(a)和(ba)至(bc)的质粒转染宿主细胞，特别地来自批准用于疫苗生产的已鉴定登记的细胞系特别地来自Vero或MRC-5细胞系的宿主细胞。
23.根据权利要求22所述的方法，其进一步包含步骤(d)从步骤(c)中转染的宿主细胞拯救重组麻疹病毒。
24.一种试剂盒，其包含：
(a)由RNA聚合酶II启动子控制的质粒，其包含(i)麻疹疫苗株Schwarz的基因组和(ii)包含胞嘧啶脱氨酶特别地酵母胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶核酸核糖基转移酶特别地酵母尿嘧啶核酸核糖基转移酶的融合物的自杀基因，特别地其中所述自杀基因包含根据SEQ-ID No.2的序列，特别地其中所述质粒具有根据SEQ-ID No.4、SEQ-ID No.8或SEQ-ID No.9，更特别地SEQ-ID No.4的序列；
(b)包含麻疹病毒帮助基因N、P和L的至少一个质粒，每一个以由RNA聚合酶II启动子控制的单个基因形式。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述病毒帮助基因N、P和L每个克隆至单独的质粒中，特别地其中所述质粒具有根据SEQ-ID No.5、SEQ-IDNo.6和SEQ-ID No.7的序列。

说明书全文

溶瘤麻疹病毒

技术领域

[0001] 本发明涉及用于治疗对无自杀基因活性的溶瘤麻疹病毒具有原发或继发耐性的恶性细胞的包含重组麻疹病毒的药物组合物，所述重组麻疹病毒包含自杀基因。而且，本发明涉及基于麻疹疫苗毒株Schwarz的基因组的包含自杀基因的重组麻疹病毒，用于制备本文所要求的重组麻疹病毒的方法和试剂盒，所述自杀基因包含酵母胞嘧啶脱氨酶和酵母尿嘧啶核酸核糖基转移酶的融合物。

背景技术

[0002] 尽管过去在例如化学治疗、基于抗体的疗法、肿瘤疫苗和放射疗法上已经取得显著进步，但是仍然有对开发用于肿瘤和相关恶性疾病的新的治疗方法和治疗途经的迫切并且未满足的需要。

[0003] 尽管基因疗法途经对于这些治疗来说实际上很有前景并且已经在不同的基因疗法模型中观察到抗肿瘤结果，但是某些限制尤其是在将感兴趣的基因转移至肿瘤细胞上的限制已经阻碍了这些方法的进一步发展。

[0004] 过去，已经偶尔观察到麻疹病毒的天然感染或疫苗接种导致自发性肿瘤缓解，尤其是在恶性血液病例如白血病中，以致对麻疹病毒的溶瘤潜能的确认。

[0005] 麻疹病毒是一种包膜的单链的麻疹病毒属反义副粘病毒，其导致传染性麻疹疾病，一种呼吸系统的传染。麻疹病毒的基因组含有六个基因，其编码八个蛋白：核壳体蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和大蛋白(L)，以及两个辅助蛋白，称为C和V。病毒经由非pH依赖的膜融合进入靶细胞。H和F蛋白分别参与受体结合和膜融合。麻疹病毒进入细胞经由表面H糖蛋白与麻疹病毒的下列两个已知受体的相互作用而发生：CD46，其广泛存在与灵长类细胞上但是在肿瘤中常常过表达，以及信号转导淋巴细胞激活分子(SLAM)，其主要位于B细胞和T细胞上。CD46是膜相关补体调控蛋白，其通过在C3b和C4b补体产物的蛋白水解失活中作为辅因子起作用而防止人类细胞被自身补体溶解，由此为肿瘤细胞提供抗补体介导的溶解的保护。经由H蛋白的受体识别导致F蛋白的构象变化，导致与靶细胞膜的融合以及随后的病毒进入。被感染的细胞，包括肿瘤细胞，在细胞表面上表达病毒F和H蛋白。在邻近的感染或未感染的细胞中病毒受体的识别相似地触发细胞至细胞的融合。因此，麻疹病毒的典型的细胞病变效应是巨大的单核细胞团块的形成(syncytia)。

[0006] 用于麻疹疫苗或用于对溶瘤麻疹病毒的研究的大多数麻疹病毒制剂基于来源于所谓Edmonston疫苗毒株的减毒活麻疹病毒，最初于1954年获得的一个分离株，其被用来通过在人类细胞上的连续传代以及随后对鸡胚成纤维(CEF)细胞的驯化产生Edmonston-Enders细胞系以及以此为基础Edmonston A和B种系。因为其高反应原性，必须停止使用最初基于Edmonston B世系开发的减毒活疫苗。已经通过将Edmonston系Edmonston-Enders和Edmonston A和B减毒开发了另外的麻疹衍生物(Edmonston-Enders：AIK-C，Edmonston Zagreb；Edmonston A：Schwarz；Edmonston B：Moraten)

[0007] 尽管由于麻疹病毒溶瘤潜力的发现而取得了进展，其概述于近期的综述文章(Msaouel，P.，Dispenzieri，A.，and Galanis，E.，Clinical testing of engineered oncolytic measles virus strains in the treatment of cancer：An overview，Curr Opin Mol Ther.2009；11：43-53)中，但是还没有基于溶瘤麻疹病毒的治疗产品达到市场阶段，一个可至少部分归因于野生型病毒导致严重副作用的潜能以及制造用于临床使用的高纯度病毒制剂上技术限制的事实。尽管膨胀的麻疹病毒生物学知识以及允许拯救重组麻疹病毒株和病毒工程化的反求遗传系统的发展已经为在癌症治疗中将麻疹病毒开发用作治疗提供了新机会，但是目前使用中的构建体中仍存在若干限制。

[0008] 例如，目前进行中的许多研究和开发计划是以Martin Billeter和其同事的工作为基础的(Radecke，F.，Spielhofer，P.，Schneider，H.，Kaelin，K.，Huber，M.，Dotsch，K，Christiansen，G.，and Billeter，M.，Rescue of measles viruses from cloned DNA.EMBO Journal 14(1995)5773-5784；WO 97/06270)。随后，已经显示来源于Edmonston B序列的克隆的病毒基因组序列与野生型Edmonston毒株更接近并且具有与Edmonston亚类相关的取代(Parks et al.，J.Virol.75(2001)910-920；Parks et al.，J.Virol.75(2001)921-933)。

[0009] 而且，麻疹病毒制剂一般从未被批准为疫苗产品的细胞系像鸡胚成纤维(CEF)细胞或293人类胚肾细胞拯救，这两者均使得大规模生产符合GMP要求的重组麻疹病毒颗粒复杂化并由此增加了成本。

[0010] 此外，已经显示例如来源于某些细胞系(例如RPMI 8226和HT1080)的肿瘤对使用溶瘤麻疹病毒的治疗有耐性，即便重复进行病毒注射(Peng KW，Facteau S，Wegman T，O′Kane D，Russell SJ.Non-invasive in vivo monitoring of trackable viruses expressing soluble marker peptides.Nat Med.(2002)；8：527-31)。

[0011] 因此，还有对用于治疗恶性细胞的包含重组麻疹病毒的改进的药物组合物和用于产生这样的药物组合物和重组麻疹病毒的改进的方法的持续需要。

[0012] 发明目的

[0013] 因此，考虑到本领域中的问题，本发明的第一个目的是提供包含具有抗肿瘤溶瘤活性的重组麻疹病毒的药物组合物，所述肿瘤耐受现有领域的麻疹病毒。

[0014] 本发明的第二个目的是包含具有相应于已确定的减毒麻疹病毒基因组的病毒基因组的重组麻疹病毒的改进的药物组合物。

[0015] 本发明的第三个目的是拯救用于恶性细胞的治疗的重组麻疹病毒的更加安全和廉价的方法。

发明内容

[0016] 通过用于治疗对无自杀基因活性的溶瘤麻疹病毒具有原发或继发耐性的恶性细胞的包含重组麻疹病毒的药物组合物解决了这些和其他目的，所述重组麻疹病毒包含自杀基因。

[0017] 用于治疗对无自杀基因活性的溶瘤麻疹病毒具有原发或继发耐性的恶性细胞的本发明的编码自杀基因的重组麻疹病毒能够有效得多的治疗实体瘤，其随之允许使用减少数目的传染性麻疹病毒颗粒而在抗肿瘤效力上没有任何损失。由此，可显著减少病毒治疗疗法的成本。

[0018] 在另一方面，本发明涉及基于麻疹疫苗株Schwarz的包含自杀基因的重组麻疹疫苗，所述自杀基因包含胞嘧啶脱氨酶特别地酵母胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶核酸核糖基转移酶特别地酵母尿嘧啶核酸核糖基转移酶的融合物，特别地其中所述自杀基因包含根据SEQ-ID NO.2的序列。

[0019] 在另一方面，本发明涉及治疗对无自杀基因活性的溶瘤麻疹病毒具有原发或继发耐性的恶性细胞的方法，其包括向有需要的患者施用根据本发明的包含自杀基因的重组麻疹病毒的步骤。

[0020] 在另一方面，本发明涉及生产根据本发明的重组麻疹病毒的方法，其包括步骤(a)将(i)麻疹疫苗株Schwarz的基因组和(ii)包含胞嘧啶脱氨酶特别地酵母胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶核酸核糖基转移酶特别地酵母尿嘧啶核酸核糖基转移酶的融合物的自杀基因克隆至由RNA聚合酶II启动子控制的质粒中。

[0021] 在再一方面，本发明涉及试剂盒，其包含：

[0022] (a)由RNA聚合酶II启动子控制的质粒，其包含(i)麻疹疫苗株Schwarz的基因组和(ii)包含胞嘧啶脱氨酶特别地酵母胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶核酸核糖基转移酶特别地酵母尿嘧啶核酸核糖基转移酶的融合物的自杀基因，特别地其中所述自杀基因包含根据SEQ-ID No.2的序列，特别地其中所述质粒具有根据SEQ-ID No.4、SEQ-ID No.8或SEQ-ID No.9，更特别地SEQ-ID No.4的序列；

[0023] (b)以单个基因形式包含麻疹病毒帮助基因N、P和L的至少一个质粒，其每一个由RNA聚合酶II启动子控制。附图说明

[0024] 图1显示麻疹疫苗株Schwarz的遗传序列(SEQ-ID NO.1)。

[0025] 图2显示酵母胞嘧啶脱氨酶和酵母尿嘧啶核酸核糖基转移酶的融合物的遗传序列(具有连接体序列)(SEQ-ID NO.2)。

[0026] 图3显示编码从MeV Schwarz株工程化的基本重组麻疹病毒的质粒pc3MerV2 Id-Trka的完整遗传序列，没有任何转基因但是具有另外的转录盒(SEQ-ID NO.3)。

[0027] 图4显示载体pc3MerV2 Id-SCD的遗传序列(编码MeV Id-SCD)(SEQ-ID NO.4)。

[0028] 图5显示表达N基因所需要的帮助质粒的遗传序列(SEQ-ID No.5)，其基于CMV启动子变体构建体pc3，涵盖从-301至-1的CMV启动子核苷酸(+1被定义为转录起始位点)以及在位点-1之后另外插入的三个核苷酸(TGG)：

[0029] -nt 1358-2935：MeV Schwarz的N ORF(1578nt＝525aa+终止密码子)

[0030] 图6显示表达P基因所需要的帮助质粒的遗传序列(SEQ-ID No.6)，其基于CMV启动子变体构建体pc3：

[0031] -nt 1358-2881：MeV Schwarz的P ORF(1524nt＝507aa+终止密码子)

[0032] 图7显示表达L基因所需要的帮助质粒的遗传序列(SEQ-ID No.7)，其基于CMV启动子变体构建体pc3：

[0033] -nt 1358-7909：MeV Schwarz的L ORF(6552nt＝2183aa+终止密码子)

[0034] 图8显示用从质粒pc3MerV2 Id-SCD(Id-SCD)拯救的病毒颗粒处理并且与前药5-FC一起孵育的HuCCT1、RBE和TFK-1细胞(人类胆管癌细胞)的SRB增值测定的结果。

[0035] 图9显示用从质粒pc3MerV2 Id-SCD(Id-SCD)拯救的病毒颗粒处理的HuCCT1、RBE和TFK-1细胞(人类胆管癌细胞)的LDH释放测定的结果。

[0036] 图10显示用从质粒pc3MerV2 Id-SCD(Id-SCD)拯救的病毒颗粒处理的SAS和HTB-43FaDu细胞(人类头颈(H&N)癌细胞)的SRB增殖测定的结果。

[0037] 图11显示用从质粒pc3MerV2 Id-SCD(Id-SCD)拯救的病毒颗粒处理的SAS和HTB-43FaDu细胞(人类头颈(H&N)癌细胞)的LDH释放测定的结果。

[0038] 图12显示用从质粒pc3MerV2 Id-SCD(Id-SCD)拯救的病毒颗粒处理的A673、BRZ和SRH细胞(人类肉瘤细胞)的SRB增殖测定的结果。

[0039] 图13显示用从质粒pc3MerV2 Id-SCD(Id-SCD)拯救的病毒颗粒处理的A673、BRZ和SRH细胞(人类肉瘤细胞)的LDH释放测定的结果。

[0040] 图14显示用从质粒pc3MerV2 Id-SCD(Id-SCD)拯救的病毒颗粒处理的SRH细胞的SRB增殖测定的结果。

[0041] 图15显示用从质粒pc3MerV2 Id-SCD(Id-SCD)拯救的病毒颗粒处理的肉瘤肿瘤细胞(细胞系CCS、LM)的SRB增殖测定的结果。

[0042] 图16显示用从质粒pc3MerV2 Id-SCD(Id-SCD)拯救的病毒颗粒处理的肉瘤肿瘤细胞(细胞系STO、ZAF、KD)的SRB增殖测定的结果。

[0043] 图17显示用从质粒pc3MerV2 Id-SCD(Id-SCD)拯救的病毒颗粒处理的成胶质细胞瘤肿瘤细胞(细胞系LNT 229，LNT 229 CTS-1)的SRB增殖测定的结果。

[0044] 图18显示用从质粒pc3MerV2 Id-SCD(Id-SCD)拯救的病毒颗粒处理的成胶质细胞瘤肿瘤细胞(细胞系LN 18，LN 18凋亡耐受)的SRB增殖测定的结果。

[0045] 图19显示用从质粒pc3MerV2 Id-SCD(Id-SCD)拯救的病毒颗粒处理的肾细胞癌(ACHN)、肺腺癌(HOP-62)和黑素瘤(M14)肿瘤细胞的SRB增殖测定的结果。

[0046] 图20显示用从质粒pc3MerV2 Id-SCD(Id-SCD)拯救的病毒颗粒处理的结肠腺癌肿瘤细胞(细胞系KM-12、HCT-15)的SRB增殖测定的结果。

[0047] 图21显示三种不同装备的MeV载体对Hep3B人肝细胞癌细胞的影响(载体pc3MerV2 Id-SCD、pc3MerV2 Id-VP22SCD和pMerV2 P-SCD)；所有实验一式四份进行；实验重复三次；值：平均值+SEM。

[0048] 图22显示三种不同装备的MeV载体对HepG2人肝细胞癌细胞的影响(载体pc3MerV2 Id-SCD、pc3MerV2 Id-VP22SCD和pMerV2 P-SCD)；所有实验一式四份进行；实验重复三次；值：平均值+SEM。

[0049] 图23显示三种不同装备的MeV载体对PLC/PRF/5人肝细胞癌细胞的影响(载体pc3MerV2 Id-SCD、pc3MerV2 Id-VP22SCD和pMerV2 P-SCD)；所有实验一式四份进行；实验重复三次；值：平均值+SEM。

[0050] 图24显示确定异种移植动物HCC肿瘤模型中肿瘤体积的结果(Hep3B模型)。

[0051] 图25显示确定异种移植动物HCC肿瘤模型中存活数据的结果(Hep3B模型)。

[0052] 图24显示确定异种移植动物CC肿瘤模型中肿瘤体积的结果(TFK-1模型)。

[0053] 图27显示病毒cDNA和各自病毒载体的图示概述。显示质粒(A)pc3MerV2Id-SCD(20,841bp)、(B)pc3MerV2 Id-VP22SCD(21，759bp)和(C)pMerV2 P-SCD(20,546bp)。
开放阅读框被显示为箭头(病毒基因为白色，转基因为黑色)。未翻译的区和质粒主链被描绘为直线。N：核壳体蛋白，P：磷蛋白，M：基质蛋白，F：融合蛋白；H：血凝素，L：大蛋白，SCD：
超胞嘧啶脱氨酶(Super-cytosine deaminase)，VP22SCD：SCD和单纯疱疹病毒蛋白VP22的融合物。

[0054] 图28显示载体pMerV2P-SCD的遗传序列(编码MeV P-SCD)(SEQ-ID NO.8)。

[0055] 图29显示载体pc3MerV2 Id-VP22SCD的遗传序列(编码MeV Id-VP22SCD)(SEQ-ID NO.9)。

具体实施方式

[0056] 本发明涉及用于治疗对无自杀基因活性的溶瘤麻疹病毒具有原发或继发耐性的恶性细胞的包含重组麻疹病毒的药物组合物，所述重组麻疹病毒包含自杀基因。

[0057] 术语“包含”和“含有”就本发明而言引入特征的非穷举列表。相似地，术语“一”应被理解为“至少一”的含义。

[0058] 在本发明的背景下，术语“自杀基因”是指其在宿主细胞中的表达引起或导致这些宿主细胞的减小的生活力的基因。在特定的环境下，自杀基因将致使细胞通过细胞凋亡杀死自身。在某些这样的环境下，自杀基因的表达将产生酶，其催化从非毒性前药产生细胞毒性药物。

[0059] 在根据本发明的药物组合物的特定的实施方案中，恶性细胞通过进行下列步骤来鉴定：

[0060] (a)确定用溶瘤麻疹病毒以感染复数1感染来自所述恶性细胞的细胞群之后72h或优选地96h所述细胞群中活细胞的百分比，其中所述群中40％或更多，优选地50％或更多，更优选地60％或更多的百分比的活细胞指示所述恶性细胞对无自杀基因活性的溶瘤麻疹病毒具有原发或继发耐性。

[0061] 在特定的实施方案中，重组麻疹病毒基于麻疹疫苗株Schwarz。

[0062] 可在 Tillieux et al.(Tillieux，S.L.，Halseyb，W.S.，Satheb，G.M.，and Vassilev，V.Comparative analysis of the complete nucleotide sequences of TMmeasles，mumps，and rubella strain genomes contained in Priorix-Tetra and TM
ProQuad live attenuated combined vaccines.Vaccine 27(2009)2265-2273)中找到麻疹疫苗株Schwarz的描述，包括其全长遗传序列和与其他疫苗株的比较。

[0063] 在特定的实施方案中，无自杀基因活性的溶瘤麻疹病毒来自麻疹疫苗株Schwarz。更特别地，无自杀基因活性的溶瘤麻疹病毒具有根据SEQ-ID No.1的序列(参见图1)。

[0064] 在本发明的背景下，术语“具有根据SEQ-ID No.1的序列”取决于给定的背景并且是指如SEQ-ID No.1中所描述的DNA序列(来自Schwarz株的麻疹病毒颗粒的cDNA)或相应的RNA序列，如发现在从包含这样的cDNA序列的载体拯救的病毒颗粒中包装的。

[0065] 在根据本发明的药物组合物的特定的实施方案中，自杀基因包含胞嘧啶脱氨酶，特别地酵母胞嘧啶脱氨酶。

[0066] 胞嘧啶脱氨酶，特别地酵母胞嘧啶脱氨酶以及它们作为前药转化酶在癌基因治疗中的用途已经在不同出版物中讨论并检验过(参见：例如Kievit，E.，Nyati，M.K.，Ng，E.，Stegman，L.D.，Parsels，J.，Ross，B.D.，Rehemtulla，A.，Lawrence，T.S.Yeast cytosine deaminase improves radiosensitization and bystander effect by 5-fluoro-cytosine of human colorectal cancer xenografts.Cancer Res.60(2000)6649-55)。

[0067] 在特定的实施方案中，自杀基因还包含尿嘧啶核酸核糖基转移酶，特别地酵母尿嘧啶核酸核糖基转移酶。

[0068] 可以显示的是胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶核酸核糖基转移酶的同时表达改善了5-氟胞嘧啶向细胞毒性代谢物的酶转化(Tiraby M，Cazaux C，Baron M，Drocourt D，Reynes JP，Tiraby G.FEMS Microbiol Lett.167(1998)41-9)。

[0069] 更特别地，自杀基因包含胞嘧啶脱氨酶特别地酵母胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶核酸核糖基转移酶特别地酵母尿嘧啶核酸核糖基转移酶的融合物，称为SCD(超级CD)。

[0070] 已经对腺病毒系统描述包含胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶核酸核糖基转移酶的融合基因的用途(Erbs，P.，Regulier，E.，Kintz，J.，Leroy，P.，Poitevin，Y.，Exinger，F.，Jund，R.，and Mehtali，M.In vivo cancer gene therapy by adenovirus-mediated transfer of a bifunctional yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyltransferase fusion gene.Cancer Res.60(2000)3813-22)。

[0071] 更特别地，自杀基因包含根据SEQ-ID NO.2的序列(参见图2)。

[0072] 在本发明的背景下，术语“包含根据SEQ-ID NO....的序列”取决于给定的背景并且是指如所述SEQ-ID No....中所描述的DNA序列或相应的RNA序列，如发现在从包含这样的cDNA序列的载体拯救的病毒颗粒中包装的。

[0073] 在特定的实施方案中，重组麻疹病毒包含根据SEQ-ID No.3(参见图3)、SEQ-ID No.4(参见图4)、SEQ-ID No.8(参见图28)或SEQ-ID No.9(参见图29)，特别地SEQ-ID No.4的RNA序列。

[0074] 在根据所述本发明的药物组合物的特定的实施方案中，恶性细胞另外地对化学治疗和/或放射疗法无响应。

[0075] 在特定的实施方案中，恶性细胞选自下列列表：来自胆管癌、头颈癌和肉瘤的恶性细胞。

[0076] 在特定的实施方案中，药物组合物用于在治疗中使用，所述治疗是使用这些包含自杀基因的组合麻疹病毒的重复治疗，特别地每周或每两周或每三周或每四周重复，用于治疗对无自杀基因活性的溶瘤麻疹病毒具有原发或继发耐性的恶性细胞。

[0077] 近来，使用重复使用无自杀基因活性的重组麻疹病毒的治疗方案(每4周多达6个循环)已经证实如与基线比较的位于基线和研究完成时的抗麻疹抗体血清水平在血液和腹膜液中均保持稳定，表明缺少对人类免疫响应的显著提高(Galanis E，Hartmann LC，Cliby WA，Long HJ，Peethambaram PP，Barrette BA，Kaur JS，Haluska PJ Jr，Aderca I，Zollman PJ，Sloan JA，Keeney G，Atherton PJ，Podratz KC，Dowdy SC，Stanhope CR，Wilson TO，Federspiel MJ，Peng KW，Russell SJ.Cancer Res.2010；70(3)：875-82)。因此，重复应用重组麻疹病毒被发现在癌症患者的治疗中可行。

[0078] 在另一方面中，本发明涉及基于麻疹疫苗株Schwarz的编码自杀基因的重组麻疹疫苗，所述自杀基因包含胞嘧啶脱氨酶特别地酵母胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶核酸核糖基转移酶特别地酵母尿嘧啶核酸核糖基转移酶的融合物。

[0079] 在根据本发明的重组麻疹病毒的特定的实施方案中，自杀基因包含根据SEQ-ID NO.2的序列(参见图2)。

[0080] 在特定的实施方案中，重组麻疹病毒包含根据SEQ-ID No.3(参见图3)、SEQ-ID No.4(参见图4)、SEQ-ID No.8(参见图28)或SEQ-ID No.9(参见图29)，特别地SEQ-ID No.4的RNA序列。

[0081] 在另一方面，本发明涉及治疗对无自杀基因活性的溶瘤麻疹病毒具有原发或继发耐性的恶性细胞的方法，其包括向有需要的患者施用根据本发明的包含自杀基因的重组麻疹病毒的步骤。

[0082] 在本发明的这一方面的某些实施方案中，治疗是胆管癌、头颈癌或肉瘤的治疗。

[0083] 在某些实施方案中，治疗方法是重复治疗，特别地每周或每两周或每三周或每四周。

[0084] 在另一方面，本发明涉及生产根据本发明的重组麻疹病毒的方法，其包括步骤(a)将(i)麻疹疫苗株Schwarz的基因组和(ii)自杀基因克隆至由RNA聚合酶II启动子控制的质粒中。

[0085] 已经显示用于波尔纳病病毒(BDV)和麻疹病毒的从单分子负链RNA病毒目的cDNA有效表达反基因组RNA(cRNA)的RNA聚合酶II启动子系统的使用(Martin，
A.，Staeheli，P.，and Schneider，U.RNA Polymerase ll-Controlled Expression of Antigenomic RNA Enhances the Rescue Efficacies of Two Different Members of the Mononegavirales Independently of the Site of Viral Genome Replication，J.Virol.80(2006)5708-5715)。

[0086] 在根据本发明的方法的特定的实施方案中，自杀基因包含胞嘧啶脱氨酶，特别地酵母胞嘧啶脱氨酶。

[0087] 在另一特别的实施方案中，自杀基因还包含尿嘧啶核酸核糖基转移酶，特别地酵母尿嘧啶核酸核糖基转移酶。

[0088] 在另一特定的实施方案中，自杀基因包含胞嘧啶脱氨酶特别地酵母胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶核酸核糖基转移酶特别地酵母尿嘧啶核酸核糖基转移酶的融合物。

[0089] 在根据本发明的方法的特定的实施方案中，自杀基因包含根据SEQ-ID NO.2的序列(参见图2)。

[0090] 在特定的实施方案中，所述方法进一步包含步骤(b)将麻疹病毒帮助基因N、P和L克隆至至少一个载体中，其每一个由RNA聚合酶II启动子控制。

[0091] 在特定的实施方案中，病毒帮助基因N、P和L每一种被克隆至由RNA聚合酶II启动子控制的单独的载体特别地质粒载体中，产生(i)编码麻疹病毒帮助基因N的质粒、(ii)编码麻疹病毒帮助基因P的质粒和(iii)编码麻疹病毒帮助基因L的质粒。

[0092] 因此，这些实施方案涉及包含下列步骤的方法：

[0093] (b)将由RNA聚合酶II启动子控制的麻疹帮助基因N克隆至第一载体，特别地质粒载体中；

[0094] (c)将由RNA聚合酶II启动子控制的麻疹帮助基因P克隆至第二载体，特别地质粒载体中；

[0095] (d)将由RNA聚合酶II启动子控制的麻疹帮助基因L克隆至第三载体，特别地质粒载体中。

[0096] 在特定的实施方案中，步骤(a)和/或(b)或(a)和/或(b)至(d)，进一步包括将推定的剪切序列从所述基因组和/或所述帮助基因除去的步骤。

[0097] 在特定的实施方案中，步骤(a)产生具有根据SEQ-ID No.4(参见图4)、SEQ-ID No.8(参见图28)或SEQ-ID No.9(参见图29)特别地SEQ-ID No.4的质粒。

[0098] 20.在特定的实施方案中，步骤(b)至(d)产生具有根据SEQ-ID No.5、SEQ-ID No.6和SEQ-ID No.7(参见图5至7)的序列的质粒。

[0099] 在特定的实施方案中，根据本发明的方法进一步包括步骤(e)用步骤(a)和(b)的质粒转染宿主细胞，特别地来自批准用于疫苗生产的已鉴定登记的细胞系特别地来自Vero或MRC-5细胞系的宿主细胞。

[0100] 生产活的病毒疫苗的最重要因素中的一个是它们遗传稳定性。基因稳定性包括疫苗株可能向更有毒力形式恢复的问题，与其他基因序列重组产生可能致命的病毒以及能够导致免疫原性和效力降低的任何基因漂变。在不同的实例中，已经显示的是Vero和MRC-5细胞系中活的疫苗株的繁殖保持疫苗株的遗传稳定性(参见例如Laassri M，Meseda CA，Williams O，Merchlinsky M，Weir JP,Chumakov K.，Microarray assay for evaluation of the genetic stability of modified vaccinia virus Ankara B5R gene.J.Med.Virol.79(2007)791-802)。

[0101] 在特定的实施方案中，所述方法进一步包含步骤(f)从步骤(e)中转染的宿主细胞拯救重组麻疹病毒。

[0102] 在另一方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含：

[0103] (a)由RNA聚合酶II启动子控制的质粒，其包含(i)麻疹疫苗株Schwarz的基因组和(ii)包含胞嘧啶脱氨酶特别地酵母胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶核酸核糖基转移酶特别地酵母尿嘧啶核酸核糖基转移酶的融合物的自杀基因，特别地其中所述自杀基因包含根据SEQ-ID No.2的序列(参见图2)，特别地其中所述质粒具有根据SEQ-ID No.4(参见图4)、SEQ-ID No.8(参见图28)或SEQ-ID No.9(参见图29)，更特别地SEQ-ID No.4的序列；

[0104] (b)包含麻疹病毒帮助基因N、P和L的至少一个质粒，每一个以由RNA聚合酶II启动子控制的单个基因形式。

[0105] 在根据本发明的试剂盒的特定的实施方案中，病毒帮助基因N、P和L每个克隆至单独的质粒中，每个由RNA聚合酶II启动子的控制，特别地其中所述质粒具有根据SEQ-ID No.5、SEQ-ID No.6和SEQ-ID No.7的序列(SEQ-ID NO.5至7)。

[0106] 现将参照下列实施例描述本发明。这些实施例仅为了说明的目的而提供并且本发明不应当被认为被限制于这些实施例，而是应当被认为涵盖作为本文提供的教导的结果而变得明白的任何和所有变化。提供与随后的实施例有关的下列材料和方法但不限制由本发明所涵盖的材料和方法的多样性。

[0107] 实施例

[0108] 实施例1：MeV cDNA质粒载体pc3MerV2 Id-Trka的制备(SEQ-ID NO.3)

[0109] 基本上如近来所描述的进行麻疹病毒cDNA载体的制备(Inoue K，Shoji Y，Kurane I，lijima T，Sakai T，Morimoto K.J Virol Methods.2003；107：229-36；Martin A，Staeheli P，Schneider U.J Virol.2006；80：5708-15)，但是具有下列重要修改。

[0110] -最初，不清楚的是(i)当用于拯救并扩增重组的麻疹病毒载体时广泛使用的巨细胞病毒(CMV)RNA聚合酶II(PolII)启动器的哪一序列部分/片段必须被认为是最佳的和(ii)在GenBank(M60321，M21295)中描述的不同CMV病毒基因组中哪一个应该被用于生产基于CMV的最小启动子；因此，首先必须进行对不同最小CMV来源的启动子构建体的系统分析；这一研究的结果显示启动子变体构建体pc3，涵盖从-301至-1的CMV启动子核苷酸(+1被定义为转录起始位点)以及在位点-1之后另外插入的三个核苷酸(TGG)，在病毒拯救和病毒扩增两者上都给出最佳产量；

[0111] -这一非常短的版本的巨细胞病毒来源的启动子，仅显示301加3个核苷酸(nt)，提供减短包含重组麻疹病毒载体基因组的质粒全长的另一个优点，其增强了质粒复制的效力；

[0112] -而且，最小pc3CMV启动子(301nt+3nt)中缺少内含子序列妨碍mRNA从细胞核输出之前mRNA对剪切机制的指导；由此减少的剪切效力改善麻疹病毒拯救和扩增；

[0113] -此外，有目的的掺入3’位置的丁型肝炎病毒(HDV)核酶被用于精确加工所有转录物的3’端。

[0114] pc3MerV2 Id-Trka的序列(参见图1)可参照下文核苷酸(nt)的位置来描述；UTR-未翻译区；ORF-开放阅读框：

[0115] -nt 1-55：MeV前导序列

[0116] -nt 56-66：转基因转录的基因起点(从MeV N基因获得的基因起始序列)

[0117] -nt 67-103：5′-UTR(从MeV N基因获得的5-UTR序列)

[0118] -nt 103-108：克隆位点，显示限制性内切酶XhoI的识别位点(C′TCGAG)[0119] -nt 109-114：克隆位点，显示限制性内切酶PauI(G ′ CGCGC) 或AscI(GG′CGCGCC)的识别位点；两个识别位点都代表仅在整个载体序列中出现一次的唯一的位点

[0120] -nt 115-126：来源于MeV基因的3′-UTR

[0121] -nt 127-136：转基因转录的基因终点(从MeV N基因获得)

[0122] -nt 140-150：MeV N的基因起点

[0123] -nt 192-1769：N ORF(1578nt＝525aa+终止密码子)

[0124] -nt 1891-3414：P ORF(1524nt＝507aa+终止密码子)

[0125] -nt 2036-2043：3′-克隆位点，显示限制性内切酶SdaI的识别位点(CCTGCA′GG)，在整个载体序列中仅出现一次的唯一序列

[0126] -nt 1913-2473：C ORF(非结构基因；561nt＝186aa+终止密码子)

[0127] -nt 2575-2582：A5G3编辑框；nt 2580之后插入单个核苷酸(G)

[0128] -nt 1891-2789：mRNA编辑后的V跨读框ORF(非结构基因；900nt＝299aa+终止密码子)

[0129] -nt 3522-4529：M ORF(1008nt＝335aa+终止密码子)

[0130] -nt 5533-7194：F ORF(1662nt＝553aa+终止密码子)

[0131] -nt 7355-9208：H ORF(1854nt＝617aa+终止密码子)

[0132] -nt 9318-15869：L ORF(6552nt＝2183aa+终止密码子)

[0133] -nt 15942-15978：MeV尾随序列(37nt)

[0134] 实施例2：MeV Id-SCD(Id-SCD)质粒载体pc3MerV2 Id-SCD的制备(SEQ-ID NO.4)[0135] 为了产生重组的MeV Id-SCD(Id-SCD)麻疹病毒载体，将编码SCD自杀融合基因的质粒pUC-SCD用限制性内切酶Mlu1消化并且将包含SCD自杀融合基因的开放读码框的片段连接至已经用限制性内切酶AscI线性化的基本载体pc3MerV2 Id-Trka(含有优化的(短化并且修饰的)CMV RNA聚合酶II(Pol II)启动子的亲代pc3的衍生物)中。通过限制性消化和测序证实正确整合的片段。通过随后的拯救程序成功生产感染性病毒颗粒。

[0136] pc3MerV2 Id-SCD(SEQ-ID NO.4)。pc3MerV2 Id-SCD的序列(参见图2)可参照下文核苷酸(nt)的位置描述：

[0137] -nt 1-55：MeV前导序列

[0138] -nt 56-66：转基因转录的基因起点(从MeV N基因获得的基因起始序列)

[0139] -nt 67-103：5′-UTR(从MeV N基因获得的5′-UTR序列)

[0140] -nt 103-108：克隆位点，显示限制性内切酶XhoI的识别位点(C′TCGAG)[0141] -nt 109-114：克隆位点，显示限制性内切酶PauI(G ′ CGCGC) 或AscI(GG′CGCGCC)的识别位点；两个识别位点代表仅在整个载体序列中出现一次的唯一的位点

[0142] -nt 121-1242：SCD ORF(1122nt＝373aa+终止密码子)

[0143] -nt 1243-1248：克隆位点，显示限制性内切酶MluI(A′CGCGT)+PauI(A′CGCGC)的识别位点

[0144] -nt 1249-1260：3′-UTR

[0145] -nt 1262-1270：转基因转录的基因终点(从MeV N基因获得)

[0146] -nt 1274-1284：MeV N的基因起点

[0147] -nt 1326-2903：N ORF(1578nt＝525aa+终止密码子)

[0148] -nt 3025-4548：P ORF(1524nt＝507aa+终止密码子)

[0149] -nt 3047-3607：C ORF(非结构基因；561nt＝186aa+终止密码子)

[0150] -nt 3709-3716：A5G3编辑框；nt 2580之后插入单个核苷酸(G)

[0151] -nt 3025-3923：mRNA编辑后的V跨读框(非结构基因；900nt＝299aa+终止密码子)

[0152] -nt 4656-5663：M ORF(1008nt＝：335aa+终止密码子)

[0153] -nt 6667-8328：F ORF(1662nt＝553aa+终止密码子)

[0154] -nt 8489-10342：H ORF(1854nt＝617aa+终止密码子)

[0155] -nt 10452-17003：L ORF(6552nt＝2183aa+终止密码子)

[0156] -nt 17076-171 12：MeV尾随序列(37nt)

[0157] 实施例3：帮助质粒的制备(SEQ-ID NO.5至7).

[0158] 基本上如近来所描述的进行分别携带N、P或L基因的帮助质粒的制备(Martin A，Staeheli P，Schneider U.J Virol.2006；80：5708-15)，但采用下列重要修改：

[0159] -作为不同最小CMV来源启动子构建体的系统分析的结果，启动子变体构建体pc3被发现在病毒拯救和病毒扩增上均产生最佳产量，同样被用于帮助质粒生产；

[0160] -在最小pc3 CMV启动子(301nt+3nt)中缺少内含子序列妨碍mRNA从细胞核输出之前mRNA对剪切机制的指导；由此减少的剪切效力改善麻疹病毒拯救和扩增；

[0161] -此外，有目的的掺入3’位置的丁型肝炎病毒(HDV)核酶被用于精确加工所有转录物的3’端。

[0162] -最终，这一启动子变体pc3被发现仅使得可以有效的Pol II-介导的转录麻疹病毒的N、P和L基因，但是麻疹病毒的N、P和L基因的转录物同样从细胞核有效输出而没有大量剪切隐含的剪切位点。

[0163] 实施例4：来自MeV Id-SCD(Id-SCD)载体的麻疹病毒颗粒的拯救

[0164] 在第0天，将Vero细胞(ATCC CCL-81)以4x105个细胞/孔的密度接种于6孔板。在第1天，用下文的转染条件转染Vero细胞

[0165] 将200μl DMEM培养基用移液管移至1.5ml管中。之后加入下列量的质粒DNA：

[0166]

[0167] 混合后，将混合物快速离心并且将18.6μl FuGene HD(Roche)(i.e.3μl FuGene/1pg DNA)直接加至液体中。涡旋后，将混合物快速离心。将反应混合物于室温孵育25min。

[0168] 将细胞用PBS清洗两次。在加入1.8ml DMEM+2％ FCS+PS之后，将转染混合物逐滴加至细胞并且将板旋动。

[0169] 将细胞培养物于37℃和5％CO2下孵育。

[0170] 在第2和3天，更换培养基(1ml DMEM+2％FCS+PS)。

[0171] 当合胞体出现(大约在第4天)时，将Vera细胞放入10cm盘用于覆盖(10ml中一个汇合T75，每盘接种大约0.5ml)。

[0172] 在下一天，通过刮去培养基中拯救的细胞，吸取并且逐滴滴在Vero细胞上来完成覆盖。

[0173] 当合胞体出现(覆盖之后大约第1天)时，将3x105个Vero细胞放入6孔板中作为0代病毒(P.0)

[0174] 在第二天，挑选合胞体(每个构建体2-3个)。将培养基从10cm盘除去并且将5-10μl培养基直接用移液至合胞体上。通过吸液和放液以及通过刮取将合胞体移出并移液至6孔板中新鲜的Vero细胞上。

[0175] 当合胞体出现时，将细胞刮进培养基中并且贮存于-80℃(＝P.0)。

[0176] 作为我们的使用编码下列的这些质粒的结果

[0177] (a)麻疹疫苗株Schwarz的基因组和包含酵母胞嘧啶脱氨酶和酵母尿嘧啶核酸核糖基转移酶的自杀基因，

[0178] (b)麻疹病毒帮助基因N，

[0179] (c)麻疹病毒帮助基因P，

[0180] (d)麻疹病毒帮助基因L，

[0181] 其每个由RNA聚合酶II启动子控制，在1代(P.1)达到16.000个感染点(合胞体)的最大值，其与表达由噬菌体T7 RNA聚合酶控制的相同基因组和转基因在P.1仅产生8.800个传染点(合胞体)的最大值的结果相比高得多。因此，已经证实CMV来源的RNA聚合酶II启动子系统的使用导致感染的重组麻疹病毒颗粒的高度有效的生产。

[0182] 实施例5：HuCCT1、RBE和TFK-1细胞的SRB增殖测定

[0183] 图8显示用从质粒pc3MerV2 Id-SCD(Id-SCD)拯救的MeV Id-SCD病毒颗粒处理并且与前药5-FC一起孵育的HuCCT1、RBE和TFK-1细胞(人类胆管癌细胞)的SRB增值测定的结果。

[0184] 通常对于SRB增值测定，在第0天接种细胞并且在24h之后用0.001、0.01、0.1、1或10MOI的病毒颗粒感染(参见各个实验和/或所附的附图)，并且在前药处理的实例中，感染后3h加入5-FC。SRB测定在感染后96h进行。

[0185] 相反，当RBE或TFK-1细胞以感染复数1(MOI 1)用MeV Id-SCD感染并且之后培养而不加入前药5-FC，计算96h后细胞团块上的损失(如SRB增值测定所测量的)与未感染的对照细胞(设定为100％细胞团块)(图表左手边的矩形环绕的值)相比分别在58％(RBE)或86％(TFK-1)的范围。

[0186] 用MeV Id-SCD(MOI 1)感染并且之后培养而不加入前药5-FC的HuCCT1细胞证实96h之后细胞团块的损失与未感染的对照细胞(设定为100％细胞团块)相比仅在42％的范围内。由此，HuCCT1细胞显示对现有领域的麻疹病毒(未使用另外的自杀基因功能)的原发耐性。然而，当培养MeV Id-SCD(MOI 1)感染的HuCCT1细胞并加入前药5-FC(范围从-4 0
10 至10mM)时96h之后细胞团块上的损失证实与未感染的对照细胞(设定为100％细胞团块)相比在高达99％的范围内。因此，显示HuCCT1细胞对现有领域的麻疹病毒(未使用另外的自杀基因功能)的原发耐性可通过使用催化从无毒性前药(5-FC)产生细胞毒性药物(5-FU和衍生物)的SCD自杀基因功能来克服。

[0187] 实施例6：HuCCT1、RBE和TFK-1细胞的LDH释放测定

[0188] 图9显示用从质粒pc3MerV2 Id-SCD(Id-SCD)拯救的MeV Id-SCD病毒颗粒处理并且与前药5-FC一起孵育的HuCCT1、RBE和TFK-1细胞(人类胆管癌细胞)的LDH释放测定的结果。

[0189] 当用MeV Id-SCD以MOI 1感染RBE或TFK-1细胞并且之后培养而不加入前药5-FC，96h后计算酶LDH的释放(本文被用作细胞完整性损失的代表参数)与通过用去污剂Triton X-100处理完全溶解的未感染的对照细胞(设定为100％的LDH释放)(图表左手边的矩形环绕的值)相比分别在70％(RBE)或85％(TFK-1)的范围内。

[0190] 相反，用MeV Id-SCD(MOI 1)感染并且之后培养而不加入前药5-FC的HuCCT1细胞证实96h后酶LDH的释放与未感染的对照细胞相比分别仅在31％的范围中。由此，再次证实HuCCT1细胞显示对现有领域的麻疹病毒(未使用另外的自杀基因功能)的原发耐性。然-4 0而，当培养MeV Id-SCD(MOI 1)感染的HuCCT1细胞并加入前药5-FC(范围从10 至10mM)时，96h之后酶LDH的释放上非常显著的增加被证实与未感染的对照细胞(设定为100％的LDH释放)相比分别在高达82％的范围内。

[0191] 因此，再次显示HuCCT1细胞对现有领域的麻疹病毒(未使用另外的自杀基因功能)的原发耐性将通过使用SCD自杀基因功能来克服。

[0192] 实施例7：SAS和HTB-43 FaDu细胞的SRB增殖测定

[0193] 图10显示用从质粒pc3MerV2 Id-SCD(Id-SCD)拯救的MeV Id-SCD病毒颗粒处理并且与前药5-FC一起孵育的SAS和HTB-43FaDu细胞(人类头颈(H&N)癌细胞)的SRB增值测定的结果。

[0194] 当用MeV Id-SCD以MOI 1感染HTB-43 FaDu细胞并且之后培养而不加入前药5-FC时，96h之后计算细胞团块上的损失与未感染的对照细胞(图表左手边的矩形环绕的值)相比在66％的范围内。

[0195] 相反，用MeV Id-SCD(MOI 1)感染并且之后培养而不加入前药5-FC的SAS细胞证实96h后与未感染的对照细胞相比根本没有细胞团块上的损失(0％)。由此，SAS细胞显示对现有领域的麻疹病毒(未使用另外的自杀基因功能)的原发耐性。然而，当培养MeV -4 0Id-SCD(MOI 1)感染的SAS细胞并加入前药5-FC(范围从10 至10mM)时，96h之后细胞团块上的损失被证实与未感染的对照细胞相比分别在高达83％的范围内。

[0196] 因此，所显示的是SAS细胞对现有领域的麻疹病毒(未使用另外的自杀基因功能)的原发耐性将通过使用SCD自杀基因功能来克服。

[0197] 实施例8：SAS和HTB-43 FaDu细胞的LDH释放测定

[0198] 图11显示用从质粒pc3MerV2 Id-SCD(Id-SCD)拯救的MeV Id-SCD病毒颗粒处理并且与前药5-FC一起孵育的SAS和HTB-43FaDu细胞(人类H&N癌细胞)的LDH释放测定的结果。

[0199] 当用MeV Id-SCD以MOI 1感染HTB-43 FaDu细胞并且之后培养而不加入前药5-FC时，96h后计算酶LDH的释放与通过用去污剂Triton X-100处理完全溶解的未感染的对照细胞(图表左手边的矩形环绕的值)相比分别在16％的范围内。

[0200] 用MeV Id-SCD(MOI 1)感染并且之后培养而不加入前药5-FC的SAS细胞证实96h后酶LDH的释放与未感染的对照细胞相比分别仅在18％的范围中。然而，当培养MeV -4 0
Id-SCD(MOI 1)感染的SAS细胞并加入前药5-FC(范围从10 至10mM)时，96h之后酶LDH的释放上的显著增加被证实与未感染的对照细胞(设定为100％的细胞团块)相比在高达
38％的范围内。

[0201] 因此，再次显示SAS细胞对现有领域的麻疹病毒(未使用另外的自杀基因功能)的原发耐性将通过使用SCD自杀基因功能来克服。

[0202] 实施例9：A673、BRZ和SRH细胞的SRB增殖测定

[0203] 图12显示用从质粒pc3MerV2 Id-SCD(Id-SCD)拯救的MeV Id-SCD病毒颗粒处理并且与前药5-FC一起孵育的A 673、BRZ和SRH细胞(人类肉瘤细胞)的SRB增值测定的结果。

[0204] 当用MeV Id-SCD以MOI 1感染A 673或BRZ细胞并且之后培养而不加入前药5-FC时，96h之后计算细胞团块上的损失与未感染的对照细胞(图表左手边的矩形环绕的值)相比分别在96％或75％的范围内。

[0205] 相反，用MeV Id-SCD(MOI 1)感染并且之后培养而不加入前药5-FC的SRH细胞证实96h后细胞团块上的损失与未感染的对照细胞相比仅在10％的范围中。由此，SRH细胞显示对现有领域的麻疹病毒(未使用另外的自杀基因功能)的原发耐性。然而，当培养MeV -4 0Id-SCD(MOI 1)感染的SRH细胞并加入前药5-FC(范围从10 至10mM)时，96h之后细胞团块上的损失被证实与未感染的对照细胞相比在高达55％的范围内。

[0206] 因此，显示SAS细胞对现有领域的麻疹病毒(未使用另外的自杀基因功能)的原发耐性可以被显著改善，但是在所选择的条件下(MOI 1)还没有通过使用SCD自杀基因功能来克服。

[0207] 实施例10：A 673和SRH细胞的LDH释放测定

[0208] 图13显示用从质粒pc3MerV2 Id-SCD(Id-SCD)拯救的MeV Id-SCD病毒颗粒处理并且与前药5-FC一起孵育的A 673和SRH细胞(人类肉瘤细胞)的LDH释放测定的结果。

[0209] 当用MeV Id-SCD以MOI 1感染A 673细胞并且之后培养而不加入前药5-FC时，96h后计算酶LDH的释放与通过用去污剂Triton X-100处理完全溶解的未感染的对照细胞(图表左手边的矩形环绕的值)相比在54％的范围内。

[0210] 用MeV Id-SCD(MOI 1)感染并且之后培养而不加入前药5-FC的SRH细胞证实96h后酶LDH的释放与未感染的对照细胞相比仅在23％的范围中。注意，当培养MeV -4 0
Id-SCD(MOI 1)感染的SRH细胞并加入前药5-FC(范围从10 至10mM)时，证实与未感染的对照细胞(设定为100％的细胞团块)相比96h之后31％的酶LDH的释放上的增加。

[0211] 因此，显示SRH细胞对现有领域的麻疹病毒(未使用另外的自杀基因功能)的原发耐性可以被显著改善，但是在所选择的条件下(MOI 1)还没有通过使用SCD自杀基因功能有效克服。

[0212] 实施例11：SRH细胞的SRB增殖测定

[0213] 图14显示用从质粒pc3MerV2 Id-SCD(Id-SCD)拯救的MeV Id-SCD病毒颗粒以升高的MOI 10(通常，使用MOI 1；本处“病毒负载”上的增加被用于克服在前药5-FC存在时于MOI 1观察到的耐性现象)处理的SRH细胞的SRB增值测定的结果。

[0214] 用MeV Id-SCD以MOI 10感染并且之后培养而不加入前药5-FC的SRH细胞证实96h后与未感染的对照细胞相比现在在68％的范围中的细胞团块上的损失，其与于MOI 1获得的与未感染的对照细胞相比获得仅28％的细胞团块上的损失的结果相比被显著改善-4
了。而且，当培养MeV Id-SCD(MOI 10)感染的SRH细胞并加入前药5-FC(范围从10 至
0
10mM)时，96h之后细胞团块上的损失被证实与未感染的对照细胞相比在高达89％的范围内。

[0215] 因此，显示SRH细胞对现有领域的麻疹病毒(未使用另外的自杀基因功能)的原发耐性可以在所选择的条件下(MOI 10)通过另外使用SCD自杀基因功能来克服。

[0216] 实施例12：肉瘤肿瘤细胞(细胞系CCS、LM)的SRB增殖测定

[0217] 图15显示用从质粒pc3MerV2 Id-SCD(Id-SCD)拯救的病毒颗粒处理并且与前药5-FC一起孵育的肉瘤肿瘤细胞(细胞系CCS、LM)的SRB增值测定的结果。

[0218] 用载体MeV Id-SCD于MOI 1感染并且之后培养而不加入前药5-FC的CCS或LM细胞证实96h后细胞团块上的损失与未感染的对照细胞(图表左手边的矩形环绕的值)相比分别在5％或25％的范围中。由此，CCS和LM细胞都显示对现有领域的麻疹病毒(未使用另外的自杀基因功能)的原发耐性。然而，当培养MeV Id-SCD感染的CCS或LM细胞(MOI -4 01)并加入前药5-FC(范围从10 至10mM)时，96h之后细胞团块上的损失被证实与未感染的对照细胞相比分别在高达79％或94％的范围内。

[0219] 因此，显示CCS和LM细胞对现有领域的麻疹病毒(未使用另外的自杀基因功能)的原发耐性可以被显著改善，并且在LM细胞的实例中，在所选择条件下(MOI 1)通过使用SCD自杀基因功能几乎完全克服了。

[0220] 实施例13：肉瘤肿瘤细胞(细胞系STO、ZAF、KD)的SRB增殖测定

[0221] 图16显示用从质粒pc3MerV2 Id-SCD(Id-SCD)拯救的MeV Id-SCD病毒颗粒处理并且与前药5-FC一起孵育的肉瘤肿瘤细胞(细胞系STO、ZAF、KD)的SRB增值测定的结果。

[0222] 当用MeV Id-SCD以MOI 1感染STO、ZAF或KD细胞并且之后培养而不加入前药5-FC时，96h之后计算细胞团块上的损失与未感染的对照细胞(图表左手边的矩形环绕的值)相比分别76％、87％或94％的范围内。

[0223] 因此，STO、ZAF或KD细胞没有显示对现有领域的麻疹病毒(未使用另外的自杀基因功能)的原发耐性。当培养MeV Id-SCD感染的STO、ZAF或KD细胞(MOI 1)并加入前药-4 05-FC(范围从10 至10mM)时，96h之后细胞团块上的损失被证实与未感染的对照细胞相比分别在高达94％、99％或98％的范围内。

[0224] 实施例14：肉瘤肿瘤细胞(细胞系CCS、LM)的SRB增殖测定

[0225] 图17显示用从质粒pc3MerV2 Id-SCD(Id-SCD)拯救的MeV Id-SCD病毒颗粒处理并且与前药5-FC一起孵育的胶质细胞瘤肿瘤细胞(细胞系LNT 229、LNT 229CTS-1)的SRB增值测定的结果。

[0226] 用MeV Id-SCD于MOI 1感染并且之后培养而不加入前药5-FC的LNT 229或LNT229 CTS-1细胞证实96h后细胞团块上的损失与未感染的对照细胞(图表左手边的矩形环绕的值)相比分别在56％或2％的范围中。由此，LNT 229或LNT 229 CTS-1细胞都显示对现有领域的麻疹病毒(未使用另外的自杀基因功能)的原发耐性。然而，当培养MeV Id-SCD-4 0
感染LNT 229或LNT 229 CTS-1细胞(MOI 1)并加入前药5-FC(范围从10 至10mM)时，
96h之后细胞团块上的损失被证实与未感染的对照细胞分别相比在高达97％或96％的范围内。

[0227] 因此，显示LNT 229或LNT 229 CTS-1细胞对现有领域的麻疹病毒(未使用另外的自杀基因功能)的原发耐性可以在所选择条件下(MOI 1)通过使用SCD自杀基因功能几乎完全克服。

[0228] 实施例15：胶质细胞瘤肿瘤细胞(细胞系LN 18，LN 18凋亡耐性)的SRB增殖测定

[0229] 图18显示用从质粒pc3MerV2 Id-SCD(Id-SCD)拯救的MeV Id-SCD病毒颗粒处理并且与前药5-FC一起孵育的胶质细胞瘤肿瘤细胞(细胞系LN 18，LN 18凋亡耐性)的SRB增值测定的结果。

[0230] 用MeV Id-SCD于MOI 1感染并且之后培养而不加入前药5-FC的LN 18或LN 18凋亡耐性细胞证实96h后细胞团块上的损失与未感染的对照细胞(图表左手边的矩形环绕的值)相比分别在33％或22％的范围中。由此，LN 18或LN 18凋亡耐性细胞都显示对现有领域的麻疹病毒(未使用另外的自杀基因功能)的原发耐性。然而，当培养MeV Id-SCD-4 0感染LN 18或LN 18凋亡耐性细胞(MOI 1)并加入前药5-FC(范围从10 至10mM)时，
96h之后细胞团块上的损失被证实与未感染的对照细胞分别相比在高达97％或83％的范围内。

[0231] 因此，显示LNT 229或LNT 229 CTS-1细胞对现有领域的麻疹病毒(未使用另外的自杀基因功能)的原发耐性可以被显著改善，并且在LN 18细胞的实例中，在所选择条件下(MOI 1)通过使用SCD自杀基因功能几乎完全克服。

[0232] 实施例16：肾细胞癌(ACHN)、肺腺癌(HOP-62)和黑素瘤(M14)肿瘤细胞的SRB增殖测定

[0233] 图19显示用从质粒pc3MerV2 Id-SCD(Id-SCD)拯救的MeV Id-SCD病毒颗粒处理并且与前药5-FC一起孵育的肾细胞癌(ACHN)、肺腺癌(HOP-62)和黑素瘤(M14)肿瘤细胞的SRB增殖测定的结果。

[0234] 用MeV Id-SCD于MOI 1感染并且之后培养而不加入前药5-FC的ACHN、HOP-62或M14细胞时，96h后细胞团块上的损失与未感染的对照细胞相比分别在20％、16％或16％的范围中。因此，ACHN、HOP-62和M14细胞都显示对现有领域的麻疹病毒(未使用另外的自杀基因功能)的原发耐性。然而，当培养MeV Id-SCD(MOI 1)感染的ACHN、HOP-62或M14细胞并加入前药5-FC时，96h之后细胞团块上的损失证实与未感染的对照细胞相比分别在85％、86％或76％的范围内。

[0235] 因此，显示ACHN、HOP-62和M14细胞对现有领域的麻疹病毒(未使用另外的自杀基因功能)的原发耐性可以在所选择条件下(MOI 1)通过使用SCD自杀基因功能被显著改善。

[0236] 实施例17：结肠腺癌肿瘤细胞(细胞系KM-12、HCT-15)的SRB增殖测定

[0237] 图20显示用从质粒pc3MerV2 Id-SCD(Id-SCD)拯救的病毒颗粒处理并且与前药5-FC一起孵育的结肠腺癌肿瘤细胞(细胞系KM-12、HCT-15)的SRB增殖测定的结果。

[0238] 用载体MeV Id-SCD于MOI 1感染并且之后培养而不加入前药5-FC的KM-12或HCT-15细胞时，96h后细胞团块上的损失与未感染的对照细胞(图表左手边的矩形环绕的值)相比分别在13％或2％的范围中。因此，KM-12和HCT-15细胞都显示对现有领域的麻疹病毒(未使用另外的自杀基因功能)的原发耐性。然而，当培养MeV Id-SCD感染的KM-12或HCT-15细胞(MOI 1)并加入前药5-FC时，96h之后细胞团块上的损失证实与未感染的对照细胞相比分别在高达94％或65％的范围内。

[0239] 因此，显示KM-12或HCT-15细胞对现有领域的麻疹病毒(未使用另外的自杀基因功能)的原发耐性可以被显著改善，并且在KM-12细胞的实例中，在所选择条件下(MOI 1)通过使用SCD自杀基因功能几乎完全克服。

[0240] 实施例18：可选择的病毒载体的构建

[0241] 构建自杀基因阵列不同的三个载体，其涉及(i)麻疹病毒基因组中的定位以及(ii)它们的SCD基因表达的背景(本文在融合基因的背景下；即与介导融合蛋白的蛋白伸展功能的1型单纯疱疹病毒(HSV-1)被膜蛋白VP22一起)(参见图27)。

[0242] 由于转基因被插入麻疹病毒基因组中的基因组位点影响病毒复制和转基因表达两者，因此我们比较了超级半胱氨酸脱氨酶(SCD)转基因的两种版本的定位，SCD的基因组定位一在载体pc3MerV2 Id-SCD中，SCD的基因组定位三在载体pMerV2 P-SCD中。

[0243] 此外，构建第三个载体，载体pc3MerV2 Id-VP22SCD并且将其与另外两个载体比较。在基因定位一，这一载体pc3MerV2 Id-VP22SCD表达这一SCD转基因与介导融合蛋白从表达细胞向尚未被从载体pc3MerV2 Id-VP22SCD拯救的这一MeV Id-VP22SCD感染的邻近细胞的蛋白伸展功能(本文：VP22SCD)的1型简单疱疹病毒(HSV-1)被膜蛋白VP22基因的融合物，因此使得其成为补偿不充分的初始载体转化效率的有前景的工具。

[0244] pc3MerV2 Id-VP22SCD的构建细节：为了重新产生第三个装配的麻疹疫苗病毒(MeV Id-VP22SCD)，质粒pc3MerV2 Id-Trka被用作起始基础。这一质粒编码与病毒株Schwarz具有100％同一性的病毒cDNA并且含有前导序列和N-基因之间的空的另外的转录单元(ATU或Trka转录盒)。这一另外的转录单元包含从病毒基因组表达转基因所需要的所有调控序列。基因起始和基因末端序列以及未翻译的区与来自N基因的那些相同。转基因可经由限制性内切酶位点XhoI或PauI插入。

[0245] VP22SCD的开放读码框(ORF)来源于质粒pUC29-VP22SCD。因为这一ORF含有两个SalI限制性位点并且因为在MeV全长克隆位点中另外的克隆步骤很可能经由SalI来进行，因此这些限制性位点必须首先通过定点突变来移除。因为ORF已经有产生与由Pau1产生的那些相同的末端的MluI位点在两侧，并且因为来源于这一质粒的MluI-MluI片段已经含有根据六规则产生Mev基因组的正确数量的核苷酸，因此在移除SalI位点后将这一片段插入MeV cDNA而没有任何其他修饰是可能的。因此，克隆策略由三个步骤组成：

[0246] ·通过定点突变移除SalI位点

[0247] ·将VP22SCD插入pc3MerV2 Id-Trka

[0248] ·拯救病毒

[0249] SalI位点的移除：应用两轮单个位点突变。如限制性分析所显示的，在第一轮中，位置802的SalI位点被成功移除。之后将所产生的质粒用DpnI消化并且在XL-1blue超级感受态细菌中扩增并用作第二轮突变的模板，其中如限制性分析所显示的，位置1127的位点被移除。两个位点的移除以及ORF的正确序列通过测序证实。所获得的质粒命名为pUC29-VP22SCD_w/oSalI。

[0250] 将VP22SCD插入pc3MerV2 Id-Trka中：将接受质粒pc3MerV2 Id-Trka用PauI消化。为了避免～20kb质粒的机械剪切，没有将线性化的质粒凝胶纯化。将限制性内切酶热失活并且将DNA片段去磷酸化并且直接进行连接。将pUC29-VP22SCD_w/oSalI用MluI消化，凝胶纯化并且经历连接。HindIII消化和测序显示成功插入转基因。所获得的质粒命名为pc3MerV2 Id-VP22SCD。

[0251] 实施例19：可选择的病毒载体的比较

[0252] 以确定最有效的一个为目的比较如实施例18中所描述的合成的三个不同病毒载体(参见图21至23)。

[0253] 图21显示病毒颗粒pc3MerV2 Id-SCD、pc3MerV2 Id-VP22SCD和pMerV2 P-SCD对Hep3B人肝细胞癌细胞的影响。

[0254] 将Hep3B细胞以0.001或0.01的MOI用从pc3MerV2 Id-SCD、pMerV2 P-SCD和pc3MerV2 Id-VP22SCD拯救的病毒颗粒感染并且在1mM 5-FC存在的情况下或5-FC不存在的情况下随时间确定肿瘤细胞团块。

[0255] 如可见的，从pc3MerV2 Id-SCD拯救的病毒颗粒显示显著较高的溶瘤潜力，甚至是在MOI 0.01的实例中在5-FC不存在的情况下，并且导致6天后肿瘤细胞团块的几乎完全失去，甚至是在MOI 0.001的实例中在5-FC存在的情况下。

[0256] 图22显示从载体pc3MerV2 Id-SCD、pc3MerV2 Id-VP22SCD和pMerV2 P-SCD拯救的病毒颗粒对HepG2人肝细胞癌细胞的影响。

[0257] 将HepG2细胞以0.001或0.01的MOI用从pc3MerV2 Id-SCD、pMerV2 P-SCD和pc3MerV2 Id-VP22SCD拯救的病毒颗粒感染并且在1mM 5-FC存在的情况下或不存在5-FC的情况下随时间确定肿瘤细胞团块。

[0258] 如可见的，MeV Id-SCD病毒颗粒显示大大升高的溶瘤潜力，甚至是在MOI0.01的实例中在5-FC不存在的情况下，并且导致6天后肿瘤细胞团块的损失的大大增加，甚至是在MOI 0.001的实例中在5-FC存在的情况下。

[0259] 图23显示从载体pc3MerV2 Id-SCD、pc3MerV2 Id-VP22SCD和pMerV2 P-SCD拯救的病毒颗粒对PLC/PRF/5人肝细胞癌细胞的影响。

[0260] 将PLC/PRF/5细胞以0.001或0.01的MOI用从pc3MerV2 Id-SCD、pMerV2 P-SCD和pc3MerV2 Id-VP22SCD拯救的病毒颗粒感染并且在1mM 5-FC存在的情况下或不存在5-FC的情况下随时间确定肿瘤细胞团块。

[0261] 如可见的，从载体pc3MerV2 Id-SCD拯救的病毒颗粒显示大大升高的溶瘤潜力，甚至是在MOI 0.01的实例中在5-FC不存在的情况下，并且导致6天后肿瘤细胞团块的损失的大大增加，甚至是在5-FC存在的情况下在MOI 0.001的实例中。

[0262] 因此，令人惊讶地发现麻疹病毒基因组中SCD自杀基因的定位以及SCD基因表达的内容对病毒颗粒的溶瘤活性具有显著影响，来自载体pc3MerV2 Id-SCD的颗粒大大好于从载体pMerV2 P-SCD和pc3MerV2 Id-VP22SCD拯救的颗粒。

[0263] 实施例20：装备的载体在异种移植动物肿瘤模型中的体内表征

[0264] 为了体内测试所装备的载体pc3MerV2 Id-SCD、pMerV2 P-SCD和pc3MerV2 Id-VP22SCD，使用人类HCC的小鼠异种移植模型。因为麻疹病毒不感染小鼠细胞，因此不可能使用具有同基因型肿瘤的小鼠模型测试载体而没有表面糖蛋白的特殊修饰。

[0265] 为了比较所装备的载体，选择皮下生长的Hep3B肿瘤的小鼠模型。这一决定基于以下事实(i)Hep3B可被MeV有效感染并且支持高水平的MeV复制，(ii)在Hep3B中，5-FC向5-FU的转化迅速并且有效，并且(iii)经过向感染细胞加入前药后1-4天的孵育，在仅用病毒的处理和组合处理之间增加的差异可观察到。此外，之前已经描述过Hep3B的小鼠模型(Blechacz B，Splinter PL，Greiner S，Myers R，Peng KW，Federspiel MJ，Russell SJ，LaRusso NF.Hepatology.2006Dec；44(6)：1465-77)，具有高的移植率(80％，与Boris Blechacz，Mayo Clinic的私下交流，Rochester，MN，USA)。相反，这一比率在PLC/PRF/5(60％)和HepG中低得多，两者都在我们的实验室中确定。

[0266] 为了这一体内实验，六周大裸鼠接受含有溶于PBS的106个Hep3B细胞的100μl细胞悬浮液的皮下注射。如所期望的，尽管发现肿瘤细胞移植和肿瘤出现之间的持续时间是非常不均匀的，但是在80％的小鼠中植入了细胞。肿瘤血管化非常好并且透过小鼠裸露的皮肤呈现蓝色。当肿瘤生长至约5mm的直径之后，小鼠接受各个病毒(MeV Id-SCD、MeV6
Id-VP22SCD或MeV P-SCD)的五次肿瘤内注射，以2*10pfu每次注射并且每天注射一次
7
(总剂量：10pfu)。对照组仅用培养基处理。在接下来的七天，小鼠腹膜内接受溶于PBS的
500mg/kg体重5-FC。每周三次测定动物的肿瘤体积和重量。

[0267] 为了确保上文描述的处理时间表没有导致毒性，每天监测小鼠并且每周三次测定体重。组合处理(MeV-SCD+5-FC)没有导致动物行为上任何可见的改变也没有显示类似对抚摸增强的敏感性的反应。小鼠皮肤看起来健康，在其运动或喂食行为上没有观察到任何改变并且它们的体重保持稳定。

[0268] 用自杀基因疗法处理肿瘤负载小鼠显著减少了肿瘤体积并且延长了存活。

[0269] 作为体内监测的结果，病毒中任一个的强溶瘤效应都有证明文件。如所期望的，仅施用前药没有影响：在病毒处理的小鼠中注射5-FC与仅用病毒处理相比没有产生变化的结果，但重要的是，其也没有通过早期阻止病毒复制抑制病毒介导的作用。此外，在三个载体之间没有观察到显著的溶瘤差异。在这一实验设置中，溶瘤麻疹疫苗病毒的直接影响似乎是高度有效的，以致另外使用5-FC没有导致增强的溶瘤作用或任何存活益处。与对照相比，小鼠的存活被所有处理显著改善。对照处理的小鼠的中值存活是35天而仅用5-FC处理的小鼠的是32天(参见图24)。来自三组的所有小鼠已经在第50天前被安乐死。相反，在处理组中中值存活在49天(仅MeV P-SCD)和82.5天(仅MeV Id-SCD)的范围内(参见图24)。来自用MeV P-SCD处理的两组小鼠都在第100天前被安乐死，然而来自其他处理组的六只小鼠无肿瘤存活超过150天(仅MeV Id-SCD和MeV Id-VP22SCD+5-FC各1只小鼠；MeV Id-SCD+5-FC和仅MeV Id-VP22SCD各2只小鼠)。来自不同处理组的一些小鼠在腹膜腔中发育出可见并且可感知的继发肿瘤。由于这被认为是处理失败，因此这些小鼠没有从在统计分析中排除。

[0270] 在所有处理组中，观察到具有不同生长表现的肿瘤。一些肿瘤生长非常迅速并且3
在处理开始后第30天左右达到＞2000mm 的所定义的终点，其近似于对照处理的小鼠。几只其他小鼠具有受阻的肿瘤生长，具有处理开始后第一周低的肿瘤体积，但是最终，它们的肿瘤重新开始生长并且达到终点体积。一些其他肿瘤完全消失，并且小鼠无肿瘤超过195天。这一差异表现示例性显示于所有MeV Id-SCD处理组。同样，一些肿瘤具有反复的生长行为，其可能是归因于病毒复制减少肿瘤体积，之后所剩余的肿瘤细胞的生长，为病毒提供了新的复制基础，再次导致溶瘤和肿瘤消失。肿瘤的这一收缩和生长通过如透过小鼠皮肤的蓝色发光所检测的肿瘤血管化的失去和重新获得来完成。在本文所示的是实例中，肿瘤最终在第91天消失。这一反复生长被认为是肿瘤中长期的病毒复制的首要征兆。

[0271] 用另外的异种移植动物模型(HepG2人肝细胞癌细胞和PLC/PRF/5人肝细胞癌细胞)获得相似的结果，分别参见图25和26。

[0272] 序列表：

[0273] SEQ-ID NO.1：麻疹疫苗株Schwarz的遗传序列(参见图1)

[0274] SEQ-ID NO.2：酵母胞嘧啶脱氨酶和酵母尿嘧啶核酸核糖基转移酶的融合物的遗传序列(具有连接体序列)(参见图2)

[0275] SEQ-ID NO.3：无任何转基因但有插入盒的基础重组麻疹病毒的遗传序列(参见图3)

[0276] SEQ-ID NO.4：载体pc3MerV2 Id-SCD的遗传序列(参见图4)

[0277] SEQ-ID No.5：表达N基因所需要的帮助质粒的遗传序列(参见图5)

[0278] SEQ-ID No.6：表达P基因所需要的帮助质粒的遗传序列(参见图6)

[0279] SEQ-ID No.7：表达L基因所需要的帮助质粒的遗传序列(参见图7)

[0280] SEQ-ID No.8：载体pMerV2 P-SCD的遗传序列(参见图28)

[0281] SEQ-ID No.9：载体pc3MerV2 ld-VP22SCD的遗传序列(参见图29)。

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