用于免疫疗法的巨噬细胞的遗传工程
阅读：336发布：2020-05-24
专利汇可以提供用于免疫疗法的巨噬细胞的遗传工程专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了制造用于修饰 肿瘤 微环境(TME)的遗传修饰的免疫细胞的方法和对肿瘤微环境(TME)进行修饰的方法。在一些实施方式中，该方法可包括将第一载体递送至免疫细胞，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T 细胞增殖 ；促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活；和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。还提供了在肿瘤微环境中对免疫应答的抑制进行调节的方法；使肿瘤和抑制性细胞的增殖最小化的方法；以及增加抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法的效率的方法。，下面是用于免疫疗法的巨噬细胞的遗传工程专利的具体信息内容。
1.一种制造用于对肿瘤的肿瘤微环境(TME)进行修饰的遗传修饰的免疫细胞的方法，所述方法包括：
向免疫细胞递送第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一载体是病毒载体。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述病毒载体是慢病毒载体。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。
8.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白或其活性片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白或其活性片段的结合不引起激动信号。
10.如权利要求8或9所述的方法，其中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-
1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。
11.如权利要求8-10中任一项所述的方法，其中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第
62-136位氨基酸
12.如权利要求8-10中任一项所述的方法，其中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。
13.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和人单核细胞所组成的组。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，所述免疫细胞是T细胞。
17.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述免疫细胞是NK细胞。
18.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述免疫细胞是遗传修饰的NK细胞。
19.如权利要求16所述的方法，其中，所述T细胞是遗传修饰的T细胞，对所述T细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。
20.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，所述免疫细胞是髓系细胞。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述髓系细胞是巨噬细胞。
22.如权利要求20所述的方法，其中，所述髓系细胞是小胶质细胞。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中，所述肿瘤是胶质瘤。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中，所述肿瘤是胶质母细胞瘤。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：
向所述免疫细胞递送第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸；
以及
向所述免疫细胞递送编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。
26.如权利要求25所述的方法，其中，所述第二载体是mRNA。
27.如权利要求25或26所述的方法，其中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞、例如人细胞中表达。
28.如权利要求25-27所述的方法，其中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括：
向所述免疫细胞递送第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及
向所述免疫细胞递送第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。
30.如权利要求29所述的方法，其中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。
31.如权利要求29或30所述的方法，其中，所述第四载体是mRNA。
32.如权利要求29-31中任一项所述的方法，其中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞、例如人细胞中表达。
33.如权利要求29-32中任一项所述的方法，其中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。
34.如权利要求29-33中任一项所述的方法，其中，所述促炎性基因编码IL-12p40、IL-
15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。
36.如权利要求35所述的方法，其中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。
37.如权利要求1-36中任一项所述的方法，其中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。
38.如权利要求37所述的方法，其中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。
39.如权利要求37或38所述的方法，其中，所述调控元件是可由类固醇、例如雌激素受体的配体诱导的启动子。
40.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。
41.如权利要求1-40中任一项所述的方法，所述方法进一步包括使所述免疫细胞分化。
42.如权利要求41所述的方法，其中，通过将所述细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。
43.如权利要求42所述的方法，其中，通过将所述细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述细胞分化成抗炎性表型。
44.一种遗传修饰的免疫细胞，所述免疫细胞包含第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，诱导T细胞增殖，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。
45.如权利要求44所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。
46.如权利要求44或45所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述免疫细胞是T细胞。
47.如权利要求44-46中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述免疫细胞是修饰的T细胞。
48.如权利要求44-47中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，对所述免疫细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。
49.如权利要求44-48中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述免疫细胞是NK细胞。
50.如权利要求44-48中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述免疫细胞是遗传修饰的NK细胞。
51.如权利要求44-50中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。
52.如权利要求44-51中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述免疫细胞是髓系细胞。
53.如权利要求52的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述髓系细胞是巨噬细胞。
54.如权利要求52所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述髓系细胞是小胶质细胞。
55.如权利要求44-54中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述第一载体是病毒载体。
56.如权利要求55所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述病毒载体是慢病毒载体。
57.如权利要求56所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。
58.如权利要求44-57中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。
59.如权利要求44-58中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述蛋白是TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。
60.如权利要求44-59中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。
61.如权利要求44-60中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。
62.如权利要求44-61中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白或其活性片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白或其活性片段的结合不引起激动信号。
63.如权利要求44-62中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。
64.如权利要求44-63中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸
65.如权利要求44-64中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。
66.如权利要求44-65中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。
67.如权利要求66所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。
68.如权利要求44-67中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：
第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸；以及
编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。
69.如权利要求68所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述第二载体是mRNA。
70.如权利要求68或69所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞、例如人细胞中表达。
71.如权利要求68-69所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。
72.如权利要求44-71中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，所述免疫细胞进一步包含：
第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及
第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。
73.如权利要求72所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-
15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。
74.如权利要求72或73所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述第四载体是mRNA。
75.如权利要求74所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞、例如人细胞中表达。
76.如权利要求72-75中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。
77.如权利要求72-76中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。
78.如权利要求44-77中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。
79.如权利要求78所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。
80.如权利要求44-79中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，编码所述蛋白质的核酸处于调控元件的控制下。
81.如权利要求80所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。
82.如权利要求80或81所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述调控元件是可由类固醇、例如雌激素受体的配体诱导的启动子。
83.如权利要求80-82中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。
84.如权利要求44-83中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，使所述免疫细胞分化。
85.如权利要求84所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，通过将所述细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。
86.如权利要求84所述的遗传修饰的免疫细胞，其中，通过将所述细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。
87.一种组合物，所述组合物包含：
权利要求44-86中任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种；以及运载体、抗癌治疗剂、抗感染治疗剂、抗菌治疗剂、抗病毒治疗剂或抗肿瘤治疗剂。
88.一种对有需要的受试者的肿瘤微环境中的免疫应答抑制进行调节的方法，所述方法包括：
向有需要的受试者给予权利要求44-86中任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种或权利要求87所述的组合物；并任选地，对所述受试者进行选择或鉴定以接受所述遗传修饰的免疫细胞，和/或在给予所述遗传修饰的免疫细胞后，对所述受试者的肿瘤微环境中的免疫应答抑制的调节进行测量。
89.一种在有需要的受试者中使抑制性细胞和肿瘤的增殖最小化的方法，所述方法包括：
向有需要的受试者给予权利要求44-86中任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种或权利要求87所述的组合物；并任选地，对所述受试者进行选择或鉴定以接受所述遗传修饰的免疫细胞，和/或在给予所述遗传修饰的免疫细胞后，对所述受试者中的抑制性细胞和肿瘤的增殖进行测量。
90.一种在有需要的受试者中增加抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法的效率的方法，所述方法包括：
向有需要的受试者给予权利要求44-86中任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种或权利要求87所述的组合物；并任选地，对所述受试者进行选择或鉴定以接受所述遗传修饰的免疫细胞，和/或在给予所述遗传修饰的免疫细胞后，对所述受试者中的癌症、感染、细菌、病毒或肿瘤的增殖进行测量。
91.如权利要求88-90中任一项所述的方法，其中，给予通过过继性细胞转移来进行。
92.如权利要求88-90中任一项所述的方法，其中，通过注射直接递送至肿瘤床来给予所述遗传修饰的免疫细胞。
93.如权利要求88-92中任一项所述的方法，其中，对患有癌症的有需要的受试者或具有癌症的受试者进行选择，以接受抗癌疗法。
94.如权利要求93所述的方法，其中，所述癌症是实体瘤。
95.如权利要求94所述的方法，其中，所述实体瘤选自于由如下所组成的组：乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。
96.如权利要求88-95中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括：在引入、提供或给予权利要求44-86所述的细胞的任一种或多种或权利要求87所述的组合物之前、之后或同时，向所述有需要的受试者给予细胞疗法。
97.如权利要求96所述的方法，其中，所述细胞疗法是CAR T细胞疗法。
98.如权利要求88-97中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括：在将权利要求
44-86所述的细胞的任一种或多种或权利要求87所述的组合物引入、提供或给予至受试者以进行治疗之前、之后或同时，向所述有需要的受试者递送抗体、小分子、热休克蛋白-肽复合物或溶瘤性脊髓灰质炎病毒。
99.如权利要求98所述的方法，其中，所述抗体对如下具有特异性：甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、HER2和/或p53或ras的异常产物。
100.如权利要求88-99中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括向所述有需要的受试者给予前药。
101.如权利要求100所述的方法，其中，所述前药是爱必妥、赫赛汀、更昔洛韦、FK506或二聚化的化学诱导剂。
102.如权利要求88-101中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括：在引入、提供或给予权利要求44-86所述的细胞的任一种或多种或权利要求87所述的组合物之前、之后或同时，向所述所述受试者给予药物。
103.如权利要求102所述的方法，其中，所述药物是他莫西芬和/或其代谢物。
104.如权利要求88-103中任一项所述的方法，其中，对所述受试者进行鉴定或选择，以接受抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法。
105.如权利要求88-104中任一项或多项所述的方法，所述方法进一步包括：在引入、提供或给予权利要求44-86所述的细胞的任一种或多种或权利要求87所述的组合物之前、之后或同时，向所述受试者引入、提供或给予额外的治疗试剂或辅助疗法，所述额外的治疗试剂例如化疗试剂、抗病毒试剂、或抗菌试剂；所述辅助疗法例如放射疗法和/或手术。
106.如权利要求105所述的方法，其中，所述额外的治疗试剂是包括激素阻断疗法、化疗、小分子、单克隆抗体和/或放射的抗癌疗法。
107.如权利要求106所述的方法，其中，所述单克隆抗体对以下具有特异性：Her2、CD52、CD20、CD25、VEGF或EGRF。
108.如权利要求106所述的方法，其中，所述激素阻断疗法包括他莫西芬、阿那曲唑和/或来曲唑的递送。
109.如权利要求106所述的方法，其中，所述小分子包括酪氨酸激酶抑制剂、小分子药物缀合物、丝氨酸激酶抑制剂和/或苏氨酸激酶抑制剂。
110.用作药物的如权利要求44-86中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞。
用于免疫疗法的巨噬细胞的遗传工程
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2015年9月9日提交的名称为“Genetic Engineering Of Macrophages For Immunotherapy”的美国临时申请序列No.62/216,224以及2016年7月12日提交的名称为“Genetic Engineering Of Macrophages For Immunotherapy”的美国临时申请序列No.62/361,348的优先权，在此以引用的方式将其内容整体明确地并入。
[0006] 将本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以名称为Sequence SCRI.101WO.TXT的文件(2016年9月6日创建，大小46kb)提供。信息为电子格式的序列表，以引用的方式将其整体并入本文。
技术领域
[0007] 本文中公开了在有需要的受试者中对肿瘤微环境(TME)进行修饰的方法，从而在肿瘤微环境中对免疫应答的抑制进行调节，以及使有需要的受试者中的肿瘤和抑制性细胞的增殖最小化。另外，还考虑了用于在有需要的受试者中改善癌症疗法的方法。该方法可包括向受试者给予治疗剂量的遗传修饰的免疫细胞或遗传修饰的免疫细胞的组合物。
背景技术
[0008] 针对血液赘生物和一些实体瘤(包括转移性黑色素瘤和结肠直肠癌)，使用免疫治疗措施调节患者的免疫系统显示出显著成功。与这些成功相反，包括胶质母细胞瘤(GBM)肿瘤在内的实体瘤对免疫治疗措施没有应答。这主要是由于许多实体瘤和它创建生的微环境具有高度免疫抑制性和肿瘤促进，从而支持肿瘤生长并阻止细胞毒性免疫细胞的定位和功能。因此，需要将克服肿瘤微环境(TME)的影响以及对浸润的免疫细胞(负责消除转化细胞)的影响的措施作为开发用于GBM和其它实体瘤的成功免疫疗法中的第一步。
[0009] 例如，虽然儿童白血病对基于T细胞的疗法显示出显著的应答，实体瘤的治疗几乎没有成功的。排除CAR T细胞免疫疗法，随着肿瘤特异性抗原的缺乏，许多实体瘤的免疫抑制性微环境迄今为止一直是不能克服的障碍。占儿童癌症的20％的脑肿瘤被髓系细胞高度浸润，使得肿瘤对细胞毒性功能具有高度抗性。
[0010] 因此，强烈需要将克服肿瘤微环境(TME)的影响以及对浸润的免疫细胞(负责消除转化细胞)的影响的措施作为开发用于GBM和其它实体瘤的成功免疫疗法中的第一步。
[0011] 胶质母细胞瘤(GBM)是一种WHO IV级星形细胞瘤，是在成人和儿童中的最具侵袭性的原发性脑肿瘤，5年存活率分别为<10％和40％(Omuro A，DeAngelis LM.Glioblastoma and other malignant gliomas:a clinical review.JAMA 2013；310:1842-1850；以引用的方式将其整体包括在本文中)。具有GBM的患者的标准疗法包括手术、替莫唑胺化疗和放射，并且仅提供了存活的适度延长。对于许多患者，治疗相关的副作用妨碍了合理的生活质量。过继性细胞免疫疗法对于具有GBM的患者是有吸引力的，因为此些细胞具有有效地到达肿瘤位点并特异性靶向肿瘤细胞而不损伤神经和胶质结构的潜力(Choi BD，Pastan I，Bigner DD等，A novel bispecific antibody recruits T cells to eradicate tumors in the"immunologically privileged"central nervous system.Oncoimmunology 2013；2:e23639；Grupp SA，Kalos M，Barrett D等，Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.N Engl J Med 2013；368:1509-1518；Miao H，Choi BD，Suryadevara CM等，EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor T cells
migrate to and kill tumor deposits infiltrating the brain parenchyma in an invasive xenograft model of glioblastoma.PLoS One 2014；9:e94281；Ransohoff RM，Engelhardt B.The anatomical and cellular basis of immune surveillance in the central nervous system.Nat Rev Immunol 2012；12:623-635；以引用的方式将全部整体并入本文)。与在各种组织中发现的许多类型的实体瘤一样，GBM肿瘤细胞创建了复杂的肿瘤微环境(TME)，该肿瘤环境含有调节性T细胞(Treg)、髓系来源的抑制性细胞(MDSC)和肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)，其阻止通过内源性T细胞和自然杀伤(NK)细胞的免疫监视，减少抗原呈递，并阻碍过继性转移的抗肿瘤T细胞的活性(Razavi SM，Lee KE,Jin BE等，Immune Evasion Strategies of Glioblastoma.Front Surg 2016；3:11；Kostianovsky AM，Maier LM，Anderson RC等，Astrocytic regulation of human monocytic/microglial
activation.J Immunol 2008；181:5425-5432；Beavis PA，Slaney CY，Kershaw MH等，Reprogramming the tumor microenvironment to enhance adoptive cellular
therapy.Semin Immunol 2016；28:64-72；以引用的方式将其全部整体并入本文)。规避这种抑制性环境的新型治疗能够极大地改善怀有GBM或其它类型实体瘤的患者的内源性抗肿瘤应答，并增强免疫疗法(例如抗体介导的检查点阻断疗法、抗体诱导的细胞毒性疗法和工程化T细胞疗法)的功效。
migrate to and kill tumor deposits infiltrating the brain parenchyma in an invasive xenograft model of glioblastoma.PLoS One 2014；9:e94281；Ransohoff RM，Engelhardt B.The anatomical and cellular basis of immune surveillance in the central nervous system.Nat Rev Immunol 2012；12:623-635；以引用的方式将全部整体并入本文)。与在各种组织中发现的许多类型的实体瘤一样，GBM肿瘤细胞创建了复杂的肿瘤微环境(TME)，该肿瘤环境含有调节性T细胞(Treg)、髓系来源的抑制性细胞(MDSC)和肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)，其阻止通过内源性T细胞和自然杀伤(NK)细胞的免疫监视，减少抗原呈递，并阻碍过继性转移的抗肿瘤T细胞的活性(Razavi SM，Lee KE,Jin BE等，Immune Evasion Strategies of Glioblastoma.Front Surg 2016；3:11；Kostianovsky AM，Maier LM，Anderson RC等，Astrocytic regulation of human monocytic/microglial
activation.J Immunol 2008；181:5425-5432；Beavis PA，Slaney CY，Kershaw MH等，Reprogramming the tumor microenvironment to enhance adoptive cellular
therapy.Semin Immunol 2016；28:64-72；以引用的方式将其全部整体并入本文)。规避这种抑制性环境的新型治疗能够极大地改善怀有GBM或其它类型实体瘤的患者的内源性抗肿瘤应答，并增强免疫疗法(例如抗体介导的检查点阻断疗法、抗体诱导的细胞毒性疗法和工程化T细胞疗法)的功效。
[0012] 尽管针对血液恶性肿瘤取得了成功，对胶质母细胞瘤(GBM)的免疫治疗干预迄今为止仍未成功。这在一定程度上是由于促进瘤生长并保护肿瘤免受免疫系统破坏的肿瘤微环境的存在。因此，需要在有需要的受试者中修饰肿瘤微环境(TME)的新措施。
发明内容
[0013] 本文中描述了基于遗传工程化巨噬细胞的免疫疗法，在全切除(gross total resection)后植入脑中时，该疗法通过支持促炎性先天应答和增强经由细胞毒性T细胞和NK细胞的肿瘤导向的免疫活性来中和GBM微环境。对新描述的用于产生转导的单核细胞和单核细胞来源的巨噬细胞的慢病毒表达系统进行了验证，并显示出在体外和GBM的小鼠异种移植模型中转基因表达在数周至数月的过程中是稳定的。此外，遗传工程化的巨噬细胞(GEM)不在动物中引起发病，它们也不有助于加速的肿瘤生长。GEM的多功能性突出显示为：
可对它们进行工程化以分泌减少免疫抑制(例如可溶性TGFβRII)或促进免疫细胞激活(通过表达IL-21)的蛋白。还公开了通过使用CRISPR系统敲除负责细胞毒性细胞机能障碍的基因(包括IL-10和PD-L1)，来防止GEM介导的免疫抑制的潜能。同时，本文所述的结果提供了GEM是用于转化肿瘤微环境和增强抗肿瘤免疫力的理想细胞类型的证据。重要的是，预期这些发现将对于目前排除了成功的免疫治疗措施的具有微环境的其它类型的肿瘤具有广泛的适用性。
可对它们进行工程化以分泌减少免疫抑制(例如可溶性TGFβRII)或促进免疫细胞激活(通过表达IL-21)的蛋白。还公开了通过使用CRISPR系统敲除负责细胞毒性细胞机能障碍的基因(包括IL-10和PD-L1)，来防止GEM介导的免疫抑制的潜能。同时，本文所述的结果提供了GEM是用于转化肿瘤微环境和增强抗肿瘤免疫力的理想细胞类型的证据。重要的是，预期这些发现将对于目前排除了成功的免疫治疗措施的具有微环境的其它类型的肿瘤具有广泛的适用性。
[0014] 因此，本文公开了工程化的原代巨噬细胞的第一医药用途，例如，用于医疗的遗传工程化的原代巨噬细胞。本文所述的本发明的方面还包括用作治疗癌症的药物的遗传工程化的原代巨噬细胞，例如胶质母细胞瘤(GBM)、乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤或卵巢癌。
[0015] 巨噬细胞是重构抑制性TME的理想治疗细胞类型，因为巨噬细胞在适应性免疫系统和固有免疫系统之间的交互作用(crosstalk)中起着核心作用，它们被有效地募集并保留在肿瘤内，并且甚至在它们向促炎性表型极化后仍在TME中存活(Long KB，Beatty GL.Harnessing the antitumor potential of macrophages for cancer
immunotherapy.Oncoimmunology 2013；2:e26860；Peng J，Tsang JY，Li D等，Inhibition of TGF-beta signaling in combination with TLR7ligation re-programs a
tumoricidal phenotype in tumor-associated macrophages.Cancer Lett 2013；331:
239-249；Beatty GL，Chiorean EG，Fishman MP等，CD40agonists alter tumor stroma and show efficacy against pancreatic carcinoma in mice and humans.Science
2011；331:1612-1616；Pyonteck SM，Akkari L，Schuhmacher AJ等，CSF-1R inhibition alters macrophage polarization and blocks glioma progression.Nat Med 2013；19:
1264-1272；以引用的方式将其全部整体包括在本文中)。此外，工程化的巨噬细胞可从制备治疗性T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)T细胞的过程中丢弃的患者单核细胞群生成。
本文中描述了，首次提出的工程化的原代巨噬细胞用于治疗性目的的用途，这部分地归因于用临床批准的载体(例如基于HIV1的慢病毒)对这些细胞进行遗传操作是困难的。对于慢病毒转导，巨噬细胞是难处理的，由于它们表达限制性因子(SAMHD1)，这消耗了可用于逆转录的核苷三磷酸池(Lahouassa H，Daddacha W，Hofmann H等，SAMHD1restricts the replication of human immunodeficiency virus type 1by depleting the
intracellular pool of deoxynucleoside triphosphates.Nat Immunol2012；13:223-
228；以引用的方式将其整体并入本文)。最近开发的慢病毒包装系统生成含有病毒蛋白质X(Vpx)、SIV和HIV2相关蛋白质(诱导SAMHD1的降解)的病毒粒子，使得能够稳定地将基因递送至原代人髓系细胞(Bobadilla S，Sunseri N，Landau NR.Efficient transduction of myeloid cells by an HIV-1-derived lentiviral vector that packages the Vpx
accessory protein.Gene Ther 2013；20:514-520；以引用的方式将其整体并入本文)。
immunotherapy.Oncoimmunology 2013；2:e26860；Peng J，Tsang JY，Li D等，Inhibition of TGF-beta signaling in combination with TLR7ligation re-programs a
tumoricidal phenotype in tumor-associated macrophages.Cancer Lett 2013；331:
239-249；Beatty GL，Chiorean EG，Fishman MP等，CD40agonists alter tumor stroma and show efficacy against pancreatic carcinoma in mice and humans.Science
2011；331:1612-1616；Pyonteck SM，Akkari L，Schuhmacher AJ等，CSF-1R inhibition alters macrophage polarization and blocks glioma progression.Nat Med 2013；19:
1264-1272；以引用的方式将其全部整体包括在本文中)。此外，工程化的巨噬细胞可从制备治疗性T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)T细胞的过程中丢弃的患者单核细胞群生成。
本文中描述了，首次提出的工程化的原代巨噬细胞用于治疗性目的的用途，这部分地归因于用临床批准的载体(例如基于HIV1的慢病毒)对这些细胞进行遗传操作是困难的。对于慢病毒转导，巨噬细胞是难处理的，由于它们表达限制性因子(SAMHD1)，这消耗了可用于逆转录的核苷三磷酸池(Lahouassa H，Daddacha W，Hofmann H等，SAMHD1restricts the replication of human immunodeficiency virus type 1by depleting the
intracellular pool of deoxynucleoside triphosphates.Nat Immunol2012；13:223-
228；以引用的方式将其整体并入本文)。最近开发的慢病毒包装系统生成含有病毒蛋白质X(Vpx)、SIV和HIV2相关蛋白质(诱导SAMHD1的降解)的病毒粒子，使得能够稳定地将基因递送至原代人髓系细胞(Bobadilla S，Sunseri N，Landau NR.Efficient transduction of myeloid cells by an HIV-1-derived lentiviral vector that packages the Vpx
accessory protein.Gene Ther 2013；20:514-520；以引用的方式将其整体并入本文)。
[0016] 本文中还描述了利用该方法的平台，来对遗传工程化的巨噬细胞(GEM)作为潜在治疗剂的用途进行评估。因此，可证明GEM：(1)在GBM的异种移植模型中存活而不影响动物存活；(2)可抵抗经由肿瘤分泌信号的重新编程(reprogramming)；以及(3)稳定地表达促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活的因子。在本文的可选方式中描述了来自对GEM作为细胞递送运载体的效用进行研究的结果，其可表达可颠覆(overturn)免疫抑制性TME并支持现存或新的免疫疗法的多种因子。
[0017] 本文公开了开发基于遗传工程化巨噬细胞(GEM)的免疫疗法的方法，例如在全切除后植入脑中时，该方法用于通过表达模拟促炎性免疫应答的因子来中和GBM微环境，以允许功能性肿瘤导向的免疫活性。另外，已验证了用于生产转导的单核细胞来源的巨噬细胞的髓系特异性慢病毒表达系统，并显示出在体外和小鼠颅内异种移植模型中转基因表达在数周至数月的过程中是稳定的。此外，GEM不在动物中引起任何发病，它们也不有助于加速的肿瘤生长。GEM的多功能性突出显示为可对它们进行修饰以分泌因子(例如可溶性TGFβR、IL-7或IL-21)，并且可通过CRISPR系统精确地靶标以敲除负责细胞毒性细胞的机能障碍的基因(例如IL-10和PD-L1)。本文公开的结果提供了GEM转化肿瘤微环境以增强免疫监视和肿瘤破坏的证据。
[0018] 在第一方面，提供了制造遗传修饰的免疫细胞的方法，所述遗传修饰的免疫细胞用于对肿瘤的肿瘤微环境(TME)进行修饰。该方法可包括向免疫细胞递送第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白为PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体(fusion)。在一些可选方式中，第一载体是病毒载体。在一些可选方式中，病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白为TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸
在一些可选方式中，所述蛋白为PD-1检查点结合蛋白与干扰
素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白为T细胞或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(lymphotactin，XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞(allogeneic cell)、髓系细胞、单核细胞和人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，免疫细胞为T细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞为NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞为遗传修饰的NK细胞。
在一些可选方式中，所述T细胞为遗传修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述遗传修饰的T细胞进行遗传修饰，以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞为髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞为巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞为小胶质细胞。在一些可选方式中，所述肿瘤为胶质瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质母细胞瘤。在一些可选方式中，该方法进一步包括向所述免疫细胞递送第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸，并向所述免疫细胞递送编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二个载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，该方法进一步包括，向所述免疫细胞递送第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及向所述免疫细胞递送第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白为IL-
12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因编码IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶(Caspase)自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，该方法进一步包括使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述细胞分化成抗炎性表型。
在一些可选方式中，所述蛋白为PD-1检查点结合蛋白与干扰
素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白为T细胞或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(lymphotactin，XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞(allogeneic cell)、髓系细胞、单核细胞和人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，免疫细胞为T细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞为NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞为遗传修饰的NK细胞。
在一些可选方式中，所述T细胞为遗传修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述遗传修饰的T细胞进行遗传修饰，以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞为髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞为巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞为小胶质细胞。在一些可选方式中，所述肿瘤为胶质瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质母细胞瘤。在一些可选方式中，该方法进一步包括向所述免疫细胞递送第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸，并向所述免疫细胞递送编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二个载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，该方法进一步包括，向所述免疫细胞递送第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及向所述免疫细胞递送第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白为IL-
12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因编码IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶(Caspase)自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，该方法进一步包括使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述细胞分化成抗炎性表型。
[0019] 第二方面，提供了遗传修饰的免疫细胞。该遗传修饰的免疫细胞可包含第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，诱导T细胞增殖，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白为PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述免疫细胞为T细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞为修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述免疫细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞为NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞为遗传修饰的NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞为髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞为巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞为小胶质细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述第一载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白为TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂为PD-L1蛋白或其活性片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白或其活性片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白为PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白为T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述免疫细胞进一步包含：第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因为PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白为IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体为mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因为内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。
[0020] 第三方面，提供了组合物。该组合物可包含：本文所述的可选方式中的任一项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种；以及运载体、抗癌治疗剂、抗感染治疗剂、抗菌治疗剂、抗病毒治疗剂或抗肿瘤治疗剂。所述遗传修饰的免疫细胞可包含第一载体，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和/或激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白为PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述免疫细胞为T细胞。在一些可选方式中，免疫细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述免疫细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是遗传修饰的NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述第一载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体为慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白为TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白或其活性片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白或其活性片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白为PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白为T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸以及编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。
在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸以及编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。
在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。
[0021] 在第四方面，提供了在受试者(例如人)的肿瘤微环境中对免疫应答的抑制进行调节的方法，其中，所述方法可包括给予本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种或本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的任意组合物，以及运载体、抗癌治疗剂、抗感染治疗剂、抗菌治疗剂、抗病毒治疗剂、或抗肿瘤治疗剂。所述遗传修饰的免疫细胞可包含第一载体，所述第一载体包含编码如下蛋白的核酸，所述蛋白促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，诱导T细胞增殖，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白为PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述免疫细胞是T细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述免疫细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是遗传修饰的NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，第一载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白为TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。
在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白或其活性片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白或其活性片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:
7)。在一些可选方式中，所述蛋白为PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白为T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸以及编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，给予通过过继性细胞转移来进行。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞通过注射直接递送至肿瘤床来给予。在一些可选方式中，选择有需要的受试者(例如，遭受癌症的人或患有癌症的受试者)，来接受抗癌疗法。在一些可选方式中，所述癌症是实体瘤。在一些可选方式中，所述实体瘤选自于由如下所组成的组：乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。
所述组合物可包含本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种，以及运载体、抗癌治疗剂、抗感染治疗剂、抗菌治疗剂、抗病毒治疗剂、或抗肿瘤治疗剂。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向有需要的受试者给予细胞疗法。在一些可选方式中，所述细胞疗法是CAR T细胞疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在将本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物引入、提供或给予至受试者以进行治疗之前、之后或同时，向有需要的受试者递送抗体、小分子、热休克蛋白-肽复合物或溶瘤性脊髓灰质炎病毒。在一些可选方式中，所述抗体对如下是特异性的：甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、HER2和/或p53或ras的异常产物。在一些可选方式中，该方法进一步包括向有需要的受试者给予前药。在一些可选方式中，所述前药是爱必妥(Erbitux)、赫赛汀
(Herceptin)、更昔洛韦、FK506或二聚化的化学诱导剂。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向所述受试者给予药物。
在一些可选方式中，对所述受试者进行鉴定或选择，以接受抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向所述受试者引入、提供或给予额外的治疗试剂(例如化疗试剂、抗病毒试剂、或抗菌试剂)或辅助疗法(例如放射疗法和/或手术)。在一些可选方式中，额外的治疗试剂是抗癌疗法，所述抗癌疗法包括激素阻断疗法、化疗、小分子、单克隆抗体或其结合片段、和/或放射。在一些可选方式中，所述单克隆抗体对以下具有特异性的：Her2、CD52、CD20、CD25、VEGF或EGRF。在一些可选方式中，所述激素阻断疗法包括他莫西芬、阿那曲唑和/或来曲唑的递送。在一些可选方式中，所述小分子包括酪氨酸激酶抑制剂、小分子药物缀合物、丝氨酸激酶抑制剂和/或苏氨酸激酶抑制剂。
在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白或其活性片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白或其活性片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:
7)。在一些可选方式中，所述蛋白为PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白为T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸以及编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，给予通过过继性细胞转移来进行。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞通过注射直接递送至肿瘤床来给予。在一些可选方式中，选择有需要的受试者(例如，遭受癌症的人或患有癌症的受试者)，来接受抗癌疗法。在一些可选方式中，所述癌症是实体瘤。在一些可选方式中，所述实体瘤选自于由如下所组成的组：乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。
所述组合物可包含本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种，以及运载体、抗癌治疗剂、抗感染治疗剂、抗菌治疗剂、抗病毒治疗剂、或抗肿瘤治疗剂。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向有需要的受试者给予细胞疗法。在一些可选方式中，所述细胞疗法是CAR T细胞疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在将本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物引入、提供或给予至受试者以进行治疗之前、之后或同时，向有需要的受试者递送抗体、小分子、热休克蛋白-肽复合物或溶瘤性脊髓灰质炎病毒。在一些可选方式中，所述抗体对如下是特异性的：甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、HER2和/或p53或ras的异常产物。在一些可选方式中，该方法进一步包括向有需要的受试者给予前药。在一些可选方式中，所述前药是爱必妥(Erbitux)、赫赛汀
(Herceptin)、更昔洛韦、FK506或二聚化的化学诱导剂。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向所述受试者给予药物。
在一些可选方式中，对所述受试者进行鉴定或选择，以接受抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向所述受试者引入、提供或给予额外的治疗试剂(例如化疗试剂、抗病毒试剂、或抗菌试剂)或辅助疗法(例如放射疗法和/或手术)。在一些可选方式中，额外的治疗试剂是抗癌疗法，所述抗癌疗法包括激素阻断疗法、化疗、小分子、单克隆抗体或其结合片段、和/或放射。在一些可选方式中，所述单克隆抗体对以下具有特异性的：Her2、CD52、CD20、CD25、VEGF或EGRF。在一些可选方式中，所述激素阻断疗法包括他莫西芬、阿那曲唑和/或来曲唑的递送。在一些可选方式中，所述小分子包括酪氨酸激酶抑制剂、小分子药物缀合物、丝氨酸激酶抑制剂和/或苏氨酸激酶抑制剂。
[0022] 第五方面，提供了在有需要的受试者中使抑制性细胞和肿瘤的增殖最小化的方法。该方法可包括：向有需要的受试者给予本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种、或组合物的任一种；并任选地，选择或鉴定所述受试者来接受所述遗传修饰的免疫细胞，和/或在给予所述遗传修饰的免疫细胞后，对所述受试者中的肿瘤和抑制性细胞的增殖进行测量。所述组合物可包含本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种，以及运载体、抗癌治疗剂、抗感染治疗剂、抗菌治疗剂、抗病毒治疗剂或抗肿瘤治疗剂。所述遗传修饰的免疫细胞可包含第一载体，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，诱导T细胞增殖，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白为PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述免疫细胞是T细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述免疫细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是遗传修饰的NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述第一载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白或其活性片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白或其活性片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。
在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，给予通过过继性细胞转移来进行。在一些可选方式中，通过注射直接递送至肿瘤床，来给予所述遗传修饰的免疫细胞。在一些可选方式中，对有需要的受试者(例如遭受癌症的人或患有癌症的受试者)进行选择，以接受抗癌疗法。在一些可选方式中，所述癌症是实体瘤。在一些可选方式中，所述实体瘤选自于由如下所组成的组：乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向有需要的受试者给予细胞疗法。
在一些可选方式中，所述细胞疗法是CAR T细胞疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在将本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物引入、提供或给予至受试者以进行治疗之前、之后或同时，向有需要的受试者递送抗体或其结合片段、小分子、热休克蛋白-肽复合物或溶瘤性脊髓灰质炎病毒。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段对以下具有特异性：甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、HER2和/或p53或ras的异常产物。在一些可选方式中，该方法进一步包括向有需要的受试者给予前药。在一些可选方式中，所述前药是爱必妥、赫赛汀、更昔洛韦、FK506或二聚化的化学诱导剂。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向所述受试者给予药物。在一些可选方式中，对所述受试者进行鉴定或选择，以接受抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向所述受试者引入、提供或给予额外的治疗试剂(例如化疗试剂、抗病毒试剂、或抗菌试剂)或辅助疗法(例如放射疗法和/或手术)。在一些可选方式中，所述额外的治疗试剂是抗癌疗法，所述抗癌疗法包括激素阻断疗法、化疗、小分子、单克隆抗体或其结合片段、和/或放射。在一些可选方式中，所述单克隆抗体对以下具有特异性的：Her2、CD52、CD20、CD25、VEGF或EGRF。在一些可选方式中，所述激素阻断疗法包括他莫西芬、阿那曲唑和/或来曲唑的递送。在一些可选方式中，所述小分子包括酪氨酸激酶抑制剂、小分子药物缀合物、丝氨酸激酶抑制剂和/或苏氨酸激酶抑制剂。
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。
在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，给予通过过继性细胞转移来进行。在一些可选方式中，通过注射直接递送至肿瘤床，来给予所述遗传修饰的免疫细胞。在一些可选方式中，对有需要的受试者(例如遭受癌症的人或患有癌症的受试者)进行选择，以接受抗癌疗法。在一些可选方式中，所述癌症是实体瘤。在一些可选方式中，所述实体瘤选自于由如下所组成的组：乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向有需要的受试者给予细胞疗法。
在一些可选方式中，所述细胞疗法是CAR T细胞疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在将本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物引入、提供或给予至受试者以进行治疗之前、之后或同时，向有需要的受试者递送抗体或其结合片段、小分子、热休克蛋白-肽复合物或溶瘤性脊髓灰质炎病毒。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段对以下具有特异性：甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、HER2和/或p53或ras的异常产物。在一些可选方式中，该方法进一步包括向有需要的受试者给予前药。在一些可选方式中，所述前药是爱必妥、赫赛汀、更昔洛韦、FK506或二聚化的化学诱导剂。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向所述受试者给予药物。在一些可选方式中，对所述受试者进行鉴定或选择，以接受抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向所述受试者引入、提供或给予额外的治疗试剂(例如化疗试剂、抗病毒试剂、或抗菌试剂)或辅助疗法(例如放射疗法和/或手术)。在一些可选方式中，所述额外的治疗试剂是抗癌疗法，所述抗癌疗法包括激素阻断疗法、化疗、小分子、单克隆抗体或其结合片段、和/或放射。在一些可选方式中，所述单克隆抗体对以下具有特异性的：Her2、CD52、CD20、CD25、VEGF或EGRF。在一些可选方式中，所述激素阻断疗法包括他莫西芬、阿那曲唑和/或来曲唑的递送。在一些可选方式中，所述小分子包括酪氨酸激酶抑制剂、小分子药物缀合物、丝氨酸激酶抑制剂和/或苏氨酸激酶抑制剂。
[0023] 在第六方面，提供了在有需要的受试者中增加抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法的效率的方法。该方法可包括：向有需要的受试者给予本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种、或组合物的任一种；并任选地，选择或鉴定所述受试者以接受所述遗传修饰的免疫细胞，和/或在给予所述遗传修饰的免疫细胞后，对所述受试者中的癌症、感染、细菌、病毒或肿瘤的增殖进行测量。该组合物可包含本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种，以及运载体、抗癌治疗剂、抗感染治疗剂、抗菌治疗剂、抗病毒治疗剂或抗肿瘤治疗剂。所述遗传修饰的免疫细胞可包含第一载体，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，诱导T细胞增殖，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白为PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述免疫细胞是T细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述免疫细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是遗传修饰的NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述第一载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白或其活性片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白或其活性片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，给予通过过继性细胞转移来进行。在一些可选方式中，通过注射直接递送至肿瘤床，来给予所述遗传修饰的免疫细胞。在一些可选方式中，对有需要的受试者(例如遭受癌症的人或患有癌症的受试者)进行选择，以接受抗癌疗法。在一些可选方式中，所述癌症是实体瘤。在一些可选方式中，所述实体瘤选自于由以下所组成的组：乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向有需要的受试者给予细胞疗法。在一些可选方式中，所述细胞疗法是CAR T细胞疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在将本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物引入、提供或给予至受试者以进行治疗之前、之后或同时，向有需要的受试者递送抗体或其结合片段、小分子、热休克蛋白-肽复合物或溶瘤性脊髓灰质炎病毒。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段对以下具有特异性：甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、HER2和/或p53或ras的异常产物。在一些可选方式中，该方法进一步包括向有需要的受试者给予前药。在一些可选方式中，前药是爱必妥、赫赛汀、更昔洛韦、FK506或二聚化的化学诱导剂。在一些可选方式中，对所述受试者进行鉴定或选择，以接受抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向所述受试者引入、提供或给予额外的治疗试剂(例如化疗试剂、抗病毒试剂、或抗菌试剂)或辅助疗法(例如放射疗法和/或手术)。在一些可选方式中，所述额外的治疗试剂是抗癌疗法，所述抗癌疗法包括激素阻断疗法、化疗、小分子、单克隆抗体或其结合片段、和/或放射。在一些可选方式中，所述单克隆抗体对以下具有特异性：Her2、CD52、CD20、CD25、VEGF或EGRF。在一些可选方式中，激素阻断疗法包括他莫西芬、阿那曲唑和/或来曲唑的递送。在一些可选方式中，所述小分子包括酪氨酸激酶抑制剂、小分子药物缀合物、丝氨酸激酶抑制剂和/或苏氨酸激酶抑制剂。更多的可选方式涉及上述遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种单独或组合用作药物。
[0024] 在第七方面，本文所述的可选方式中的任一项所述的遗传修饰的免疫细胞作为药物的用途。所述遗传修饰的免疫细胞可包含第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，诱导T细胞增殖，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述免疫细胞是T细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述免疫细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是遗传修饰的NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述第一载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白为TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白或其活性片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白或其活性片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-
15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶
(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。
附图说明
15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶
(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。
附图说明
[0025] 图1示出了具有显著的巨噬细胞浸润的高级别胶质瘤。图1A示出了用CD163(巨噬细胞细胞标志物)染色(右)以及使用用于细胞数/视野的Nuance定量软件分析(左)(图1B)的代表性组织切片。图1C示出了由CD11b和HLA-DR表达所界定的，在肿瘤切除后立即分析的浸润GBM患者肿瘤的巨噬细胞的代表性流式细胞术(左)。所分析的全部患者的总结(MNGn＝13，GBMn＝17)(图1D)。
[0026] 图2示出了募集至移植U87肿瘤的小鼠巨噬细胞。
[0027] 图3示出了用含有VPX的慢病毒成功转导的HLA-DR+巨噬细胞。
[0028] 图4示出了用编码GFP和萤火虫萤光素酶的慢病毒转导的MDM存留于GBM的小鼠模型中。图4A：转导有编码GFP和萤光素酶的慢病毒且对GFP表达进行了评价的MDM。图4B：颅内5
注射有2×10个野生型U87细胞的NSG小鼠的结果。图4C：纵向GEM发光信号。
注射有2×10个野生型U87细胞的NSG小鼠的结果。图4C：纵向GEM发光信号。
[0029] 图5示出了代表性慢病毒构建体的示意图。基因调控元件由箭头指示，并包含EF1α启动子和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element，WPRE)增强子。每个开放阅读框分别包含：在启动子符号后面示出的感兴趣的转基因、T2A共翻译切割位点、以及Her2t或EGFRt细胞表面表位标签(用于通过结合赫赛汀或爱必妥对感染的细胞进行检测)。
[0030] 图6示出了MDM中的TGFβRII表达和信号转导抑制。如图6A(顶部框图)所示的是使用GM-CSF来源于原代单核细胞的巨噬细胞，所述巨噬细胞用针对HLA-DR-PE-Cy7和TGFβRII-488的抗体染色并通过FCM进行分析。(底部框图，图6C)。HLA-DR+细胞的MFI(群体的-98％)。如图6B所示，将表达SBE(SMAD结合元件)萤光素酶报告子和/或dnTGFβRII的293T用
1ng/mL TGFβ1处理3小时。
1ng/mL TGFβ1处理3小时。
[0031] 图7示出了转导的H9细胞分泌PD-1/IFNα融合蛋白(PIFP)。如图7A所示，将来自亲本或PD1:IFNα转导的H9细胞的上清液进行浓缩，电泳并使用针对2A标签(由IFNα蛋白保留)(左，1:5000)或PD1(右，1:250)的单克隆抗体进行蛋白质印迹(Western blotted)。图7B：将亲本或PD1:IFNα转导的H9细胞与Brefeldin A一起进行培养、并进行固定和渗透，用荧光团缀合的抗体进行细胞内染色。通过FCM对细胞就抗-IFNα(左)和抗-PD1(右)进行分析。
[0033] 图9示出了遗传工程化巨噬细胞(GEM)的功能。认为来源于修饰的MMC的GEM具有多种功能(取决于修饰方法)，包括1)增强抗肿瘤免疫细胞的募集和功能，2)抵抗由抑制免疫应答的肿瘤微环境的组分介导的功能修饰，或3)直接抑制肿瘤生长。
[0034] 图10A-图10B示出了感染策略。
[0035] 图11A和图11B示出了GM-CSF分化图表。将慢病毒与Vpx一起包装是成功感染GM-CSF来源的巨噬细胞所必需的。
[0036] 图12A和图12B示出了M-CSF分化图表。将慢病毒与Vpx一起包装是成功感染M-CSF来源的巨噬细胞所必需的。
[0037] 图13示出了可用Vpx+慢病毒以剂量依赖性方式，对巨噬细胞和单核细胞进行感染。在分化的第7天，以20个、50个、100个、250个、500个、750个或1000个编码GFP的慢病毒颗粒(lentiviral particle，LP)/细胞(包含有Vpx)，或者1000个LP/细胞(不含Vpx)，对GM-CSF(图13A)或M-CSF(图13B)单核细胞来源的巨噬细胞进行感染。感染后7天(分离后14天)，通过流式细胞术对对于HLA-DR和GFP均呈阳性的群体(右上象限)的频率进行量化。数据代表了3个独立重复。(图13C)与图13A类似，但感染与分化同时进行，分离/感染后14天进行分析。(图13D)在存在或不存250个LP/细胞的病毒的情况下，分化的GM-CSF和M-CSF巨噬细胞的产率。百分比相对于输入CD14+细胞的数量，误差棒代表3个独立重复的标准偏差(t-检验，*，p<0.05.209×218mm(300×300DPI))。
[0038] 图14示出了同时进行用M-CSF分化和慢病毒感染导致剂量依赖性的GFP表达，但产率低。将单核细胞在M-CSF中分化，并同时用20个、50个、100个、250个、500个、750个或1000个编码GFP的LP/细胞(包含有Vpx)，或1000个LP/细胞(不含Vpx)感染。分离/感染后14天，通过流式细胞术对细胞进行分析。右上象限中示出了对于HLA-DR和GFP呈阳性的百分比。
[0039] 图15示出了GEM表达标准髓系细胞表面标志物，并对LPS/IFNγ刺激产生应答。在分化第0天，用250个LP/细胞的编码mCherry的慢病毒对GM-CSF或M-CSF单核细胞来源的巨噬细胞进行感染。在第6天，用新鲜培养基或LPS/IFNγ处理细胞18小时，然后通过流式细胞术进行分析。无论何种处理，发现对于mCherry表达巨噬细胞均呈100％阳性(图15A)。病毒感染后和/或LPS/IFNγ刺激后，(图15B)细胞阳性百分比，或(图15C-图15G)平均荧光强度(MFI)和巨噬细胞表面蛋白表达的覆盖直方图(overlaid histograms)。误差棒代表使用来自3个健康供体的单核细胞的独立实验的标准偏差。单因素ANOVA与Dunnet多重比较检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
[0040] 图16示出了GEM存留于胶质瘤异种移植模型中。(图16A)实验方案：用未标记的U87对动物进行注射，六天后，在相同位点用表达GFP-ffluc的GEM对动物进行注射。(图16B)皮下注射萤光素后15分钟的生物发光图像。(图16C)萤光素处理的动物中生物发光的纵向分析，所述萤光素处理的动物注射有U87肿瘤细胞与以下物质：仅PBS(圆形)、GM-CSF分化的GEM(正方形)、或GM-CSF分化的LPS/IFNγ刺激的GEM(三角形)。(图16D)注射有U87肿瘤细胞与以下物质的动物的存活曲线：仅PBS、GM-CSF分化的GEM、或GM-CSF分化的LPS/IFNγ刺激的GEM(每组n＝4，Mantel-Cox：p＝0.2542)。
[0041] 图17示出了GEM不影响胶质瘤异种移植模型中的肿瘤生长。(图17A)实验方案：用表达GFP-ffluc的U87对动物进行注射。七天后，在相同位点用表达mCherry(非生物发光的)的GEM注射动物。(图17B)皮下注射萤光素后15分钟的生物发光图像。(图17C)萤光素处理的动物中的生物发光的纵向分析，所述萤光素处理的动物注射有U87肿瘤细胞与以下物质：仅PBS(圆形)、GM-CSF分化的GEM(正方形)、或GM-CSF分化的LPS/IFNγ刺激的GEM(三角形)。(图17D)注射有U87肿瘤细胞与以下物质的动物的存活曲线：仅PBS、GM-CSF分化的GEM、或GM-CSF分化的LPS/IFNγ刺激的GEM，每组n＝5，(Mantel-Cox：p＝0.4491)。(图17E-图17G)为了鉴定肿瘤组织中的GEM，将福尔马林固定、石蜡包埋的整个脑切片用抗人CD45抗体进行免疫染色。肿瘤区域用*表示，并以虚线为界。
[0042] 图18A至图18CC示出了LPS/IFNγ刺激后细胞因子释放持续仅24小时-48小时。在500μL培养基中，用LPS(100ng/mL)、IFNγ(20ng/mL)或LPS+IFNγ，对野生型、GM-CSF分化的巨噬细胞(以每孔200,000个细胞播种于24孔板中)进行刺激18小时。在18小时(第1天)时收集条件培养基，并替换为不含细胞因子的新鲜培养基。每24小时对培养基进行收获，共10天。使用Luminex human 30-plex细胞因子试剂盒(Life Tech)对细胞因子释放进行检测。
大多数细胞因子仅在前2次收集中检测到，18小时后急剧降低。注意到在LPS+IFNγ条件下，IL-10、IL-12、IL-17、IL-7、IP-10和MIG在过去2天内保持升高。单独的IFNγ几乎没有影响，但通常会加强对LPS的应答。
大多数细胞因子仅在前2次收集中检测到，18小时后急剧降低。注意到在LPS+IFNγ条件下，IL-10、IL-12、IL-17、IL-7、IP-10和MIG在过去2天内保持升高。单独的IFNγ几乎没有影响，但通常会加强对LPS的应答。
[0043] 图19示出了可对GEM进行工程化，以抵抗免疫抑制性肿瘤微环境，并支持抗肿瘤应答。图19A)通过Surveyor核酸内切酶对扩增和退火的基因组DNA进行切割，所述基因组DNA分离自感染有表达Cas9/IL-10gRNA的病毒(而不是仅Cas9的对照)的GEM。图19B、图19C)在对LPS+IFNγ刺激的应答中，表达Cas9和IL-10gRNA的GEM产生较少的IL-10。图19D)通过Surveyor核酸内切酶对扩增和退火的基因组DNA进行切割，所述基因组DNA分离自感染有表达Cas9/PD-L1gRNA的病毒(而不是仅Cas9的对照)的GEM。图19E)示出了相对于仅Cas9的对照，表达Cas9/PD-L1gRNA的GEM上降低的LPS+IFNγ诱导的PD-L1表达的代表性流动图(flow plot)。图19F)Cas9介导的PD-L1基因中断后的PD-L1表达的MFI差异。图19G)以500,000个细胞/孔将GM-CSF分化的巨噬细胞播种在12孔板中，用250个或500个LP/细胞的编码sTGFβRII的慢病毒转导。在调理24小时后的3天、5天、12天和15天收集培养基，并通过ELISA对蛋白分泌进行检测。GEM以依赖于病毒剂量的方式表达sTGFβRII。表达在转导后第5天左右达到最高，但持续至少2周。误差棒代表使用来自3个健康供体的单核细胞的独立实验的标准偏差。图19H)以200,000个细胞/孔将GM-CSF分化的巨噬细胞播种在24孔板中，用1000个LP/细胞的编码IL-21的慢病毒转导。在调理24小时后6天收集培养基，并通过Bioplex对蛋白分泌进行检测。误差棒代表使用来自2个健康供体的单核细胞的独立实验的标准偏差。图19I)以
500,000个细胞/孔将GM-CSF分化的巨噬细胞播种在12孔板中，用250个或500个LP/细胞的编码sTGFβRII的慢病毒转导。在调节24小时后的3天、5天、12天和15天收集培养基，并通过ELISA对蛋白分泌进行检测。GEM以依赖于病毒剂量的方式表达sTGFβRII。表达在转导后第5天左右达到最高，但持续至少2周。误差棒代表使用来自3个健康供体的单核细胞的独立实验的标准偏差。
500,000个细胞/孔将GM-CSF分化的巨噬细胞播种在12孔板中，用250个或500个LP/细胞的编码sTGFβRII的慢病毒转导。在调节24小时后的3天、5天、12天和15天收集培养基，并通过ELISA对蛋白分泌进行检测。GEM以依赖于病毒剂量的方式表达sTGFβRII。表达在转导后第5天左右达到最高，但持续至少2周。误差棒代表使用来自3个健康供体的单核细胞的独立实验的标准偏差。
[0044] 图20示出了能够在肿瘤解离后从脑中对GEM进行回收。在动物安乐死后从脑肿瘤异种移植物中对人细胞进行分离，并染色以用于流式细胞术。在单线态(singlet)和活细胞上设门(gating)后，GEM被鉴定为对于mCherry和CD45表达呈双阳性。
[0045] 图21示出了人GEM从注射位点分散开并浸润肿瘤组织。在GEM注射后25天(U87注射后30天)，对脑进行收获、切片，并就DAPI(蓝色)和人CD45进行染色。CD45表达限于工程化的巨噬细胞，并不与小鼠髓系细胞交叉反应。图21A：来自注射有U87并在5天后仅模拟注射有PBS的小鼠的代表性切片，图21B：来自注射有U87细胞并在5天后注射有表达CD45的GEM的小鼠的代表性切片。
[0046] 图22示出了GEM表达标准髓系细胞表面标志物，并对LPS/IFNγ刺激产生应答。在分化第0天，用250个含有vpx的LP/细胞的慢病毒细胞(编码mCherry)对GM-CSF(图22A)或M-CSF(图22B)单核细胞来源的巨噬细胞进行感染。无论何种处理，发现在第7天对于表达进行分析的细胞均呈100％阳性。还对这些细胞就常见髓系标志物CD11b、CD16、C80、HLADR、PD-L1和CD163的表面表达进行了分析(图22C-图22H)。
[0047] 图23A-图23F示出了在第0天(在CD14分离时)对GM-CSF和M-CSF巨噬细胞进行转导，在第7天染色并对髓系表面标志物进行分析。
[0048] 图24示出了在GEM的功能分析过程中使用的构建体。用Surveyor分析，就它们诱导Cas9介导的基因组DNA中断的能力，对编码PD-L1(图24A)和IL-10(图24B)的gRNA序列进行筛选。示出了成功的序列和产生的切割。所使用的(图24C)epHIV7.2和(图24D)LentiCRISPRv2慢病毒载体的整合区域的构造。(图24E)在用(图24C)中编码的慢病毒感染后，通过流式细胞术分析的CD19t表位标签的表面表达。(图24F)在用(图24D)中编码的慢病毒感染后，通过流式细胞术的EGFR表位标签的表面表达。
[0049] 图25示出了可用Vpx+慢病毒以剂量依赖性方式，对GM-CSF分化的巨噬细胞和单核细胞进行感染。(图25A)在GM-CSF分化7天后，用20个、50个、100个、250个、500个、750个或1000个编码GFP-ffluc的慢病毒颗粒(LP)/细胞(含有Vpx)，或1000个LP/细胞(不含Vpx)，对巨噬细胞进行感染。感染后7天(分离后14天)，通过流式细胞术对对于HLA-DR和GFP(右上象限)均呈阳性的群体的频率进行量化。数据代表了3个独立重复。(图25B)与图25A类似，但感染与分化同时进行，14天后进行分析。相对于回收的未感染细胞的数量，作为巨噬细胞(图
25C)或单核细胞(图25D)的感染的细胞的产率。(图25E)用GM-CSF或M-CSF分化后所回收的巨噬细胞的产率，作为原始分离的CD14+单核细胞的数量的百分比。误差棒代表使用从3个健康供体分离的CD14+单核细胞的独立实验的标准偏差。非配对t-检验(Unpaired t-
test)，ns：p>0.05。ns：不显著。
25C)或单核细胞(图25D)的感染的细胞的产率。(图25E)用GM-CSF或M-CSF分化后所回收的巨噬细胞的产率，作为原始分离的CD14+单核细胞的数量的百分比。误差棒代表使用从3个健康供体分离的CD14+单核细胞的独立实验的标准偏差。非配对t-检验(Unpaired t-
test)，ns：p>0.05。ns：不显著。
[0050] 图26示出了可对GEM进行工程化，以抵抗免疫抑制性肿瘤微环境，并支持抗肿瘤应答。(图26A)使用Bioplex，就在对LPS+IFNγ刺激的应答中的IL-10分泌，对用Cas9和IL-10gRNA转导的GEM进行评价。每个患者的IL-10表达以EGFRt载体对照的百分比表示。误差棒代表使用从3个健康供体分离的CD14+单核细胞的独立实验的标准偏差。非配对t-检验，***p<0.001。(图26B)示出了相对于仅Cas9的对照(EGFRt载体)，表达Cas9/PD-L1gRNA的GEM上LPS+IFNγ诱导的PD-L1表达的代表性流式细胞术点图。(图26C)在Cas9介导的PD-L1基因中断后，PD-L1表面表达的平均荧光强度。误差棒代表使用从3个健康供体分离的CD14+单核细胞的独立实验的标准偏差。每个患者的PD-L1表达以EGFRt载体对照的百分比表示。非配对t-检验，****p<0.0001。(图26D)在第7天，用250个LP/细胞的编码CD19t-T2A-sTβRII或CD19t载体对照的慢病毒，对GM-CSF分化的巨噬细胞进行转导。在各时间点，在调理24小时后5天、6天和7天收集培养基，并使用ELISA对分泌的sTβRII进行检测。误差棒代表使用来自
3个健康供体的单核细胞的独立实验的标准偏差。单因素ANOVA与Dunnet多重比较检验。p>
0.05。ns：不显著。n/d：未检测到。(图26E)用250个LP/细胞的编码IL-21-T2A-CD19t或CD19t载体对照的慢病毒，对GM-CSF分化的巨噬细胞进行转导。在第6天替换培养基，24小时后收集，使用Bioplex就IL-21对分泌的蛋白进行量化。误差棒代表使用来自3个健康供体的单核细胞的独立实验的标准偏差。n/d：未检测到。
3个健康供体的单核细胞的独立实验的标准偏差。单因素ANOVA与Dunnet多重比较检验。p>
0.05。ns：不显著。n/d：未检测到。(图26E)用250个LP/细胞的编码IL-21-T2A-CD19t或CD19t载体对照的慢病毒，对GM-CSF分化的巨噬细胞进行转导。在第6天替换培养基，24小时后收集，使用Bioplex就IL-21对分泌的蛋白进行量化。误差棒代表使用来自3个健康供体的单核细胞的独立实验的标准偏差。n/d：未检测到。
[0051] 图27示出了可对GEM进行工程化，以具有多种功能。(图27A)可对用编码sTβRII和PD-L1gRNA的病毒感染的GEM进行选择，以用于CD19t和EGFRt表位标签的共表达(Q2、EGFRt和CD19t阳性)。(图27B)示出了相对于仅Cas9的对照，表达Cas9/PD-L1gRNA的GEM上降低的LPS+IFNγ诱导的PD-L1表达的代表性流式细胞术点图，在EGFRt和CD19t表达上设门以选择双重感染的细胞。(图27C)在Cas9介导的PD-L1基因中断并就EGFRt和CD19t的共表达进行选择后，PD-L1表达的MFI差异。误差棒代表使用从3个健康供体分离的CD14+单核细胞的独立实验的标准偏差。非配对t-检验，***p<0.001。(图27D)感染有两种病毒的GEM产生sTβRII。，从如上所述的双重转导的细胞收集条件培养基，并通过ELISA就sTβRII表达进行分析。误差棒代表使用从3个健康供体分离的CD14+单核细胞的独立实验的标准偏差。n/d：未检测到。(图27E)使用对非信号转导表位标签(non-signaling epitope tags)CD19t和EGFRt具有特异性的抗体鉴定的感染有编码IL-21和Cas9/IL-10gRNA的病毒的GEM(Q2、EGFRt和CD19t阳性)。从如上所述的双重转导的细胞收集条件培养基，并使用Bioplex对IL-21和IL-10表达进行分析。(图27F)在对LPS+IFNγ应答中，感染有IL-21和IL-10gRNA病毒的GEM分泌减少的dIL-10。误差棒代表使用从3个健康供体分离的CD14+单核细胞的独立实验的标准偏差。单因素ANOVA与Dunnet多重比较检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。(图
27G)感染有IL-21和IL-10gRNA病毒的GEM仍然分泌高水平的IL-21。误差棒代表使用从3个健康供体分离的CD14+单核细胞的独立实验的标准偏差。非配对t检验，p>0.05。ns：不显著。
n/d：未检测到。
27G)感染有IL-21和IL-10gRNA病毒的GEM仍然分泌高水平的IL-21。误差棒代表使用从3个健康供体分离的CD14+单核细胞的独立实验的标准偏差。非配对t检验，p>0.05。ns：不显著。
n/d：未检测到。
[0052] 图28示出了包装有Vpx的慢病毒在转导树突状细胞和巨噬细胞方面更有效。在分化的第3天，用MOI为0、1或15的含有GFP-ffluc的慢病毒(未包装Vpx)、或用MOI为1的编码GFP-ffluc的慢病毒(包装有Vpx)，对单核细胞来源的树突状细胞(图28A)和巨噬细胞(图28B)进行感染。生活力细胞染色包括在内(左栏)，就GFP表达对落在“活(live)”门中的这些细胞进行分析(右)。
[0053] 图29示出了可用Vpx+慢病毒以剂量依赖性方式，对M-CSF分化的巨噬细胞和单核细胞进行感染。(图29A)在M-CSF分化7天后，用20个、50个、100个、250个、500个、750个或1000个编码GFP-ffluc的慢病毒颗粒(LP)/细胞(含有Vpx)，或1000个LP/细胞(不含Vpx)，对巨噬细胞进行感染。感染后7天(分离后14天)，通过流式细胞术对对于HLA-DR和GFP(右上象限)均呈阳性的群体的频率进行量化。数据代表了3个独立重复。(图29B)与图29A类似，但感染与分化同时进行，分离/感染后14天进行分析。(图29C)相对于回收的未感染细胞的数量，作为单核细胞的感染的细胞的产率。误差棒代表使用从3个健康供体分离的CD14+单核细胞的独立实验的标准偏差。非配对t-检验，*p<0.05。
[0054] 图30示出了每个细胞的慢病毒整合事件。用100个或250个编码GFP-ffluc的LP/细胞转导细胞，(图30A)作为巨噬细胞(第7天)或(图30B)作为单核细胞(第0天)。转导后3天对基因组DNA进行分离。为了计算每个细胞的载体整合位点的数量，对于WPRE和白蛋白基因进行qPCR。通过将WPRE/白蛋白的pg比乘以2，来计算每个细胞的慢病毒拷贝数。
[0055] 图31示出了病毒转导后的细胞因子产生。在转导后24小时或7天，通过Luminex，就(图31A)IL12(p40/p70)、(图31B)TNF和(图31C)IFNα对来自野生型(WT)和病毒转导的单核细胞的条件培养基样品进行分析。无论何种处理，所有3种分析物均低于检测限(虚线)。
[0056] 图32和图33示出了对经扩张和低温保存的CD4和CD8选择的T细胞进行工程化，以表达EGFRvIII 806CAR以及与IL2受体(CD122)胞内信号转导结构域融合的嵌合IL7受体(CD127)胞外结构域，并在冷冻前经CD3/CD28激活。将解冻的CD4或CD8T细胞用Cell Trace Violet标记，用作为对照的重组IL-7(500ng/ml)(从表达IL-7或EGFRt(仅载体)的GEM冻起来的条件培养基)培养7天，或用分泌IL-7或EGFRt的自体GEM共培养，并使用流式细胞术对Cell Trace Violet稀释度(作为增殖的量度)进行分析。这些都未用CD3/CD28再刺激，它们没有接受除IL-7之外的任何细胞因子。
[0057] 定义
[0058] 在接着的描述中，广泛地使用了大量术语。提供以下定义以便于理解本发明的可选方式。
[0059] 如本文使用的，“一”或“一个/种”可意味着一个/种或多于一个/种。
[0060] 如本文使用的，术语“约/大约”表示包括为确定数值所采用的方法的固有误差或者实验之间存在的误差在内的数值。
[0061] 如本文所述，“肿瘤微环境”(TME)是与肿瘤细胞不断相互作用的周围微环境，其有利于允许肿瘤细胞与其环境之间的交互作用。肿瘤微环境在破坏癌症免疫循环中发挥作用，并在癌症进展的多个方面发挥关键作用。例如，TME可降低药物渗透，向存活细胞赋予增殖和抗凋亡优势，促进抗性而不引起遗传突变和表观遗传变化，并共同地修饰疾病模式以及扭转临床指标。不受限制地，肿瘤微环境可包括肿瘤的细胞环境、周围血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓来源的炎性细胞、淋巴细胞、信号转导分子和胞外基质。肿瘤环境可包括肿瘤细胞或恶性细胞，所述细胞受肿瘤微环境帮助和影响以确保生长和存活。肿瘤微环境还可包括肿瘤浸润免疫细胞(例如淋巴样细胞和髓系细胞，其可刺激或抑制抗肿瘤免疫应答)和基质细胞(例如肿瘤相关成纤维细胞和内皮细胞，其有助于肿瘤的结构完整性)。不受限制地，基质细胞可包括：组成肿瘤相关血管的细胞，例如内皮细胞和周细胞(pericytes)，其为有助于结构完整性的细胞(成纤维细胞)；以及肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)和浸润的免疫细胞，包括单核细胞、中性粒细胞(PMN)、树突状细胞(DC)、T细胞和B细胞、肥大细胞和自然杀伤(NK)细胞。基质细胞组成肿瘤细胞结构(cellularity)的大部分，而实体瘤中的主要细胞类型是巨噬细胞。
[0062] 肿瘤微环境还可包括微小生境(microniche)，其中小生境(niche)充分灌注并充氧、或灌注不足并缺氧。在其中小生境灌注不足并缺氧的情况下，该小生境对于宿主而已可能特别危险，因为该小生境可能怀有能够在缺乏营养和氧的环境中存活的抗性肿瘤细胞(resistant tumor cells)。
[0063] 肿瘤可通过释放胞外信号来影响其周围环境使其成为免疫抑制性的，从而促进肿瘤血管生成(例如通过上调VEGF)；并可诱导外周免疫耐受。
[0064] 在本文所述的一些可选方式中，提供了制造用于对肿瘤微环境(TME)进行修饰的遗传修饰的免疫细胞的方法，其中，所述方法包括向免疫细胞递送第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，提供了在有需要的受试者的肿瘤微环境中对免疫应答的抑制进行调节的方法，其中，所述方法包括：向有需要的受试者(例如人)给予本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种；并任选地，对所述受试者进行选择或鉴定以接受所述遗传修饰的免疫细胞，和/或在给予所述遗传修饰的免疫细胞后，对所述受试者的肿瘤微环境中的免疫应答抑制的调节进行测量。在一些可选方式中，提供了在有需要的受试者中使抑制性细胞和肿瘤的增殖最小化的方法，其中，所述方法包括：向有需要的受试者(例如人)给予本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种；任选地，对所述受试者进行选择或鉴定以接受所述遗传修饰的免疫细胞，和/或在给予所述遗传修饰的免疫细胞后，对所述受试者中的抑制性细胞和肿瘤的增殖进行测量。在一些可选方式中，增殖的T细胞选自于由以下所组成的组：T辅助细胞、记忆T细胞、细胞毒性T细胞、抑制T细胞、自然杀伤T细胞和γδT细胞。图9示出的是本文所述的遗传修饰的免疫细胞的一些用于增加抗肿瘤免疫力的用途。
[0065] 在一些可选方式中，将小的设计蛋白用于占据PD-1结合位点，而不递送激动信号。可使用计算程序、诱变以及其它方法来确定结合位点。在本文所述的一些可选方式中，如Lin等所述(“The PD-1/PD-L1complex resembles the antigen-binding Fv domains of antibodies and T-cell receptors,”Proc Natl Acad Sci U S A.2008Feb 26；105(8):
3011–3016；以引用的方式将其整体并入本文)，可将PD-L1残基62-136用于占据的PD-1结合位点。另外，可在PD-1的结合时，就拮抗功能，对多种PD-1结合分子进行测试。不传递抑制信号的PD-1结合分子可用于抑制PD-1/PD-L1复合激动活性(complex agonist activity)或PD-1/PD-L2激动活性。另外，在一些可选方式中，可将单链抗体或抗体样蛋白用于阻止复合激动活性，所述单链抗体或抗体样蛋白使用开发用于抑制PD-1信号转导的单克隆抗体序列产生。实例描述于US8008449B2中(在此以引用的方式将其整体明确地并入)。
3011–3016；以引用的方式将其整体并入本文)，可将PD-L1残基62-136用于占据的PD-1结合位点。另外，可在PD-1的结合时，就拮抗功能，对多种PD-1结合分子进行测试。不传递抑制信号的PD-1结合分子可用于抑制PD-1/PD-L1复合激动活性(complex agonist activity)或PD-1/PD-L2激动活性。另外，在一些可选方式中，可将单链抗体或抗体样蛋白用于阻止复合激动活性，所述单链抗体或抗体样蛋白使用开发用于抑制PD-1信号转导的单克隆抗体序列产生。实例描述于US8008449B2中(在此以引用的方式将其整体明确地并入)。
[0066] 如本文所述的“蛋白”是指包含一个或多个多肽链的大分子。因此，蛋白可包括肽，所述肽是由肽(酰胺)键连接的氨基酸单体的链，由任一种或多种氨基酸形成。蛋白或肽可包含至少两个氨基酸，并且对可组成蛋白或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。不受限制地，氨基酸为例如精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、pyrolysine、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、鸟氨酸、S-腺苷甲硫氨酸和硒代半胱氨酸。例如，蛋白还可包含非肽组分，如糖类基团。可通过产生该蛋白的细胞将糖类和其它非肽取代基添加到蛋白中，并且糖类和其它非肽取代基将随着细胞类型而变化。在本文中蛋白根据它们的氨基酸骨架结构来定义；取代基(例如糖类基团)通常不指明，但是它们可以存在。在本文所述的一些可选方式中，提供了制造用于对肿瘤微环境(TME)进行修饰的遗传修饰的免疫细胞的方法，其中，所述方法包括向免疫细胞递送第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，基因递送多核苷酸进一步包含用于至少一种蛋白的序列。在一些可选方式中，所述蛋白诱导或促进T细胞增殖。在一些可选方式中，所述蛋白诱导产生白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白和干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，增殖的T细胞选自于由以下所组成的组：T辅助细胞、记忆T细胞、细胞毒性T细胞、抑制T细胞、自然杀伤T细胞和γδT细胞。
[0067] 还能够对可由遗传修饰的免疫细胞表达的蛋白进行遗传修饰，来增强治疗效果，例如较长的半衰期和对蛋白酶的抗性。文献中描述了例如蛋白与多肽(例如PAS、白蛋白和XTEN)融合的方法(Schlapschy等，Protein Eng Des Sel.2013Aug；26(8):489–501；Kontermann等，Current Opinion in Biotechnology，第22卷，第6期，2011年12月，868–
876；Schulte等，Thrombosis Research，第122卷，增刊4，2008，第S14–S19页；以引用的方式将它们全部整体并入本文)。增加蛋白半衰期的方法可包括，但不限于：通过重组技术，将感兴趣的蛋白与白蛋白或其部分融合以扩大半衰期；通过重组技术，将蛋白与IgG Fc区融合以延长蛋白的半衰期；通过重组技术，将抗体Fc结构域融合至感兴趣的蛋白上以扩大半衰期；通过重组技术，将感兴趣的蛋白与864个氨基酸的多肽XTEN融合以扩大蛋白半衰期；以及通过重组技术，将感兴趣的蛋白与多肽PAS(XL-蛋白GmbH)9)融合，以便扩大蛋白半衰期。
具有Fc、人血清白蛋白(HSA)、设计的多肽融合体XTEN和PAS的遗传融合体是本领域技术人员已知的，并且可通过重组技术与感兴趣的蛋白融合，以便为蛋白增添较长的半衰期或者抵抗蛋白水解。在本文所述的一些可选方式中，提供了制造用于对肿瘤微环境(TME)进行修饰的遗传修饰的免疫细胞的方法，其中，所述方法包括向免疫细胞递送第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，通过重组技术将蛋白与多肽融合，以增加蛋白的半衰期和/或增加蛋白对降解的抗性。在一些可选方式中，多肽包括抗体Fc结构域或其部分、IgG Fc结构域或其部分、XTEN或其部分、PAS或其部分、或者人血清白蛋白或其部分。
876；Schulte等，Thrombosis Research，第122卷，增刊4，2008，第S14–S19页；以引用的方式将它们全部整体并入本文)。增加蛋白半衰期的方法可包括，但不限于：通过重组技术，将感兴趣的蛋白与白蛋白或其部分融合以扩大半衰期；通过重组技术，将蛋白与IgG Fc区融合以延长蛋白的半衰期；通过重组技术，将抗体Fc结构域融合至感兴趣的蛋白上以扩大半衰期；通过重组技术，将感兴趣的蛋白与864个氨基酸的多肽XTEN融合以扩大蛋白半衰期；以及通过重组技术，将感兴趣的蛋白与多肽PAS(XL-蛋白GmbH)9)融合，以便扩大蛋白半衰期。
具有Fc、人血清白蛋白(HSA)、设计的多肽融合体XTEN和PAS的遗传融合体是本领域技术人员已知的，并且可通过重组技术与感兴趣的蛋白融合，以便为蛋白增添较长的半衰期或者抵抗蛋白水解。在本文所述的一些可选方式中，提供了制造用于对肿瘤微环境(TME)进行修饰的遗传修饰的免疫细胞的方法，其中，所述方法包括向免疫细胞递送第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，通过重组技术将蛋白与多肽融合，以增加蛋白的半衰期和/或增加蛋白对降解的抗性。在一些可选方式中，多肽包括抗体Fc结构域或其部分、IgG Fc结构域或其部分、XTEN或其部分、PAS或其部分、或者人血清白蛋白或其部分。
[0068] 在一些可选方式中，编码蛋白的载体可以是RNA或编码RNA的核酸(用于蛋白的翻译)，所述蛋白用于诱导T细胞增殖，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。正如本领域已知的，可对RNA进行构建，以便将其修饰为含有不同的密码子，从而优化在所选的宿主细胞(例如人)中的表达。可对RNA进行构建，以增加其在细胞中的半衰期并增加蛋白翻译的效率。在一些可选方式中，可将多聚腺苷酸化用于增加细胞中RNA的稳定性以及增加RNA的半衰期。在一些可选方式中，对RNA进行修饰以增加RNA的半衰期或者增加细胞中的翻译水平。在一些可选方式中，RNA可包含多聚(A)尾巴，所述多聚(A)尾巴具有50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、或500个共价连接的腺苷残基，或者具有由上述任何两个值所限定的范围内的量的残基。
[0069] 在一些可选方式中，免疫细胞包含第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。对可促进抗肿瘤活性的蛋白的实例进行了描述，所述实例不限于：p53(肿瘤抑制因子(tumor suppressor))、核糖体失活蛋白(RIP；抑制蛋白质合成和抗肿瘤活性)、和细胞因子。在一些可选方式中，所述蛋白是p53、核糖体失活蛋白、细胞因子或趋化因子。细胞因子可包括但不限于：IL-2(NK细胞的增殖和发育)、IL-1β(增加免疫细胞的裂解活性)、IFNγ、IL-1、IL-7(促进T细胞增殖/存活以及溶细胞效应物功能的发育)、IL-15(促进T细胞增殖/存活以及溶细胞效应物功能的发育)、IL12(促进T细胞增殖/存活以及溶细胞效应物功能的发育)、IL-18(促进CD8和Th1效应物功能)、IL-21(对免疫系统细胞的调节作用，包括可破坏病毒感染细胞或癌性细胞的自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T细胞)、或IL-33(促进CD8和Th1效应物功能)。在由免疫细胞表达的蛋白的一些可选方式中，所述蛋白是细胞因子。在一些可选方式中，所述细胞因子是IL-2、IL-1β、IFNγ、IL-1、IL-7、IL-15、IL12、IL-18、IL-21或IL-33。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。
在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列进行编码
在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列进行编码
[0070]
[0071]在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。更多的可选方式涉及上述遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种单独或组合用作药物，例如来治疗或抑制癌症，例如乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。
[0072] “对免疫应答进行调节”或“调节免疫应答”是指例如在免疫增强、免疫抑制或诱导免疫耐受方面，将免疫应答调整至期望水平。在本文所述的可选方式中，提供了遗传修饰的免疫细胞，以用分泌的蛋白来对肿瘤微环境进行调节，所述蛋白能够改变免疫力。这些蛋白或免疫调节剂可包括，但不限于：白细胞介素、细胞因子、免疫调节抗体和趋化因子。不受限制地，所述免疫调节剂可以是IL-2、G-CSF、咪喹莫特(Imiquimod)、CCL3、CCL26、CSCL7、TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18、IL21、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、PD-1检查点结合抑制剂、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。免疫调节剂可增强免疫应答或抑制免疫应答。在一些可选方式中，所述免疫调节可增强免疫系统的活性，以增加人体对抗疾病的自然防御机制。免疫调节剂还可对免疫抑制进行调节，以增加抗癌治疗的功效。在肿瘤环境中，所述肿瘤可抑制或阻遏免疫应答的抗肿瘤作用。在本文所述的一些可选方式中，在癌症和/或中。
[0073] 如本文所述的“趋化因子”是小细胞因子的家族，或由细胞分泌的信号转导蛋白。趋化因子可以是基本的(basal)或炎性的。炎性趋化因子在炎性刺激(如IL-1、TNF-α、LPS或通过病毒)时形成，并参与了将免疫细胞吸引到炎症部位的炎性应答。不受限制地，炎性趋化因子可包括CXCL-8、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL11或CXCL10。在一些可选方式中，免疫细胞包含第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子是CXCL-8、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL11或CXCL10。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL17、CCL22、CCL24或CCL26。在一些可选方式中，所述趋化因子是CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述趋化因子选自于由以下所组成的组：EGF、Eotaxin、FGF-2、FLT-3L、Fractalkine、G-CSF、GM-CSF、GRO、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-13、IL-15、Il18A、IL-1RA、Il-1a、IL-1b、Il-2、Il-3、Il-4、Il-5、Il-6、Il-7、IL-8、IL-9、INF-α2、INFγ、IP-10、MCP-1、MCP-3、MDC、MIP-1a、MIP-1b、PDGF-AA、PDGF-BB、RANTES、TGF-α、TGF-β、VEGF、sCD401、6CKINE、BCA-1、CTACK、ENA78、Eotaxin-2、Eotaxin-3、1309、IL-16、IL-20、IL-21、IL-23、IL-28a、IL-33、LIF、MCP-2、MCP-
4、MIP-1d、SCF、SDF-1atb、TARC、TPO、TRAIL、TSLP、CCL1ra/HCC-1、CCL19/MIPβ、CCL20/MIPα、CXCL11/1-TAC、CXCL6/GCP2、CXCL7/NAP2、CXCL9/MIG、IL-11、IL-29/ING-γ、M-CSF和XCL1/淋巴细胞趋化因子。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列进行编码[0074]
4、MIP-1d、SCF、SDF-1atb、TARC、TPO、TRAIL、TSLP、CCL1ra/HCC-1、CCL19/MIPβ、CCL20/MIPα、CXCL11/1-TAC、CXCL6/GCP2、CXCL7/NAP2、CXCL9/MIG、IL-11、IL-29/ING-γ、M-CSF和XCL1/淋巴细胞趋化因子。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列进行编码[0074]
[0075] 如本文所述的“干扰素”(IFN)是在对病原体(例如病毒、细菌、寄生虫或肿瘤细胞)的存在的应答中，由宿主细胞合成和释放的信号转导蛋白。例如，病毒感染的细胞将释放干扰素，引起附近的细胞提高它们的抗病毒防御。已证明干扰素(如I型IFN)在动物中抑制肿瘤生长。干扰素还可增加p53活性，p53可促进癌细胞的凋亡。干扰素与p53的结合与对抗多种癌症的保护作用有关。已将干扰素β1a、干扰素β1b、干扰素α和干扰素β用于一些癌症的治疗。在一些可选方式中，免疫细胞包含第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述干扰素是I型IFN。在一些可选方式中，所述干扰素是干扰素β1a、干扰素β1b、干扰素α或干扰素β。
[0076] “程序性细胞死亡蛋白1”或PD-1是起到免疫检查点作用以及通过阻止T细胞激活来减少自身免疫和促进自我耐受从而在下调免疫系统中发挥作用的蛋白。PD-1具有对淋巴结中的抗原特异性T细胞中的程序性凋亡的抑制作用，同时在调节性T细胞中减少凋亡。然而，PD-1抑制剂可用于激活免疫系统来攻击肿瘤，并可用于治疗一些类型的癌症。PD-1具有两个配体PD-L1和PD-L2。PD-L1与PD-1的结合允许抑制性信号的传输，该抑制性信号减少淋巴结处的CD8+T细胞的增殖。PD-L1还可结合激活的T细胞、B细胞和髓系细胞上的PD-1以对激活或抑制进行调节。PD-L1的上调还能够允许癌症逃避宿主免疫系统。因此，阻止PD-L1-PD-1复合物形成的PD-L1或PD-1的抑制剂对于阻遏一些癌症而言是重要的。
[0077] 在一些可选方式中，提供了PD-1抑制剂。在一些可选方式中，所述抑制剂是scFv。scFv PD1-抑制剂(Nivolimumab)包含SEQ ID NO:39中所示的氨基酸序列
[0078]轻链包含SEQ ID NO:40中所示的序列
可变重链包含SEQ ID NO:41中所示的序列
可变轻链包含SEQ ID NO:42中的序列
可变重链包含SEQ ID NO:41中所示的序列
可变轻链包含SEQ ID NO:42中的序列
[0079] 在一些可选方式中，对所述重链和轻链进行优化。优化的重链包含SEQ ID NO:43中所示的序列 其由SEQ ID NO:44中所示的序列进行编码
优化的轻链包含SEQ ID NO:45中所示的序列 其由
SEQ ID NO:46所示的序列进行编码
优化的轻链包含SEQ ID NO:45中所示的序列 其由
SEQ ID NO:46所示的序列进行编码
[0080] 如本文所述的“PD-L2”是可抑制T细胞激活的PD-1的第二配体。因此，结合PD1、PD-L1或PD-L2以阻止PD1-PD-L1复合物或PD1-PDL2复合物形成的抑制剂可抑制一些癌症。在本文所述的方法的一些可选方式中，所述蛋白质是可结合PD1、PD-L1或PD-L2以阻止PD1-PD-L1复合物或PD1-PD-L2复合物的抑制剂。
[0081] 在一些可选方式中，免疫细胞包含第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-1检查点抑制剂与PD1、PD-L1或PD-L2结合以阻止PD1-PD-L1复合物或PD1-PD-L2复合物形成或存留。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白或其活性片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白或其活性片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。更多的可选方式涉及上述遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种单独或组合作为药物，例如来抑制或治疗癌症，例如乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。
[0082] 如本文使用的，“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸(例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA))；寡核苷酸；由聚合酶链式反应(PCR)产生的片段；以及由连接、断裂、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用中的任何方式产生的片段。核酸分子可由天然存在的核苷酸(例如DNA和RNA)或天然存在的核苷酸的类似物(例如天然存在的核苷酸的对映体形式)的单体或两者的组合组成。修饰的核苷酸可在糖部分中和/或在嘧啶碱基或嘌呤碱基部分具有改变。糖修饰包括例如用卤素、烷基、胺基和叠氮基取代一个或多个羟基，或者可将糖官能化为醚或酯。此外，整个糖部分可被空间上和电子上相似的结构(如氮杂糖和碳环糖类似物)替代。碱基部分中的修饰的实例包括烷基化嘌呤和嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶、或其它众所周知的杂环替代物。核酸单体可通过磷酸二酯键或这种键的类似物进行连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)、氨基磷酸酯等。术语“核酸分子”还包括“肽核酸”，其包含连接至聚酰胺骨架的天然存在的核酸碱基或修饰的核酸碱基。核酸可为单链的或者双链的。
[0083] “载体”或“构建体”是用于将异源核酸引入细胞的核酸，其还可具有调控元件以在所述细胞中提供异源核酸的表达。载体包括但不限于质粒、微环(minicircles)、酵母和病毒基因组。在一些可选方式中，所述载体是质粒、微环、病毒载体、DNA或mRNA。在一些可选方式中，所述载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。在一些可选方式中，所述载体是慢病毒载体。
[0084] 如本文所述的“Vpx”是由2型HIV编码并处于一些猿猴免疫缺陷病毒株中的病毒粒子相关蛋白。Vpx可在人中增强HIV-2复制。当用于转染时，包装有Vpx蛋白的慢病毒载体可导致髓系细胞的感染增加。在本文描述的一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。
[0085] 如本文所述的“Vpr”蛋白是指病毒蛋白R(14kDa蛋白)，其在调控HIV-1前整合复合物(preintegration complex)的核输入中起重要作用，并且在非分裂细胞中对于病毒复制是必需的。例如，非分裂细胞可包括巨噬细胞。在本文所述的一些可选方式中，慢病毒载体可包装有Vpr蛋白或其Vpr蛋白部分。在一些可选方式中，慢病毒载体包装有病毒辅助蛋白。在一些可选方式中，所述病毒辅助蛋白选自于由Vif、Vpx、Vpu、Nef和Vpr所组成的组。这些辅助蛋白(例如vif、Vpx、vpu和nef)与细胞配体相互作用，以充当衔接分子来重定向宿主因子的正常功能，以用于病毒特异性目的。HIV辅助蛋白描述于Strebel等中(“HIV Accessory Proteins versus Host Restriction Factors”，Curr Opin Virol.2013Dec；3(6):
10.1016/j.coviro.2013.08.004；以引用的方式将其整体并入本文)。
10.1016/j.coviro.2013.08.004；以引用的方式将其整体并入本文)。
[0086] 如本文所述的“CRISPR”(成簇规律间隔短回文重复，clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是含有短碱基序列重复的原核DNA的片段。每个重复之后是来自以前暴露的细菌病毒或质粒的“间隔区DNA”的短片段。CRISPR/Cas系统是原核生物免疫系统，该系统赋予了对外源遗传元件(例如质粒和噬菌体)的抗性，并提供了获得性免疫力的形式。CRISPR间隔区以类似于真核生物有机体中的RNAi的方式识别和切割这些外来遗传元件。CRISPR/Cas系统已被用于在整个生命树的物种中进行基因编辑(添加、破坏或改变特定基因的序列)和基因调控。通过将Cas9蛋白和恰当的向导RNA递送到细胞中，可在任何所期望的位置处对有机体的基因组进行切割。人们可使用CRISPR来建立能够改变整个群体的基因组的RNA向导的基因编辑工具。在一些可选方式中，提供了用于对细胞中的至少一个靶基因进行编辑的系统。在本文所述的一些可选方式中，提供了制造用于对肿瘤微环境(TME)进行修饰的遗传修饰的免疫细胞的方法，其中，所述方法包括向免疫细胞递送第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述方法进一步包括向所述细胞递送第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸并向所述细胞递送编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，所述细胞中的靶基因编码TGF-β或IL-
10。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β和/或PGE。
10。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β和/或PGE。
[0087] CRISPR/Cas系统已被用于在各种物种中进行基因编辑(例如，添加、破坏或改变特定基因的序列)和基因调控。如本文所述的“Cas9”是Cas9是与细菌中的CRISPR适应性免疫系统相关的RNA向导的DNA核酸内切酶。通过将Cas9蛋白和恰当的向导RNA递送到细胞中，在任何所期望的位置处对有机体的基因组切割。CRISPR/Cas9系统的基本组分包括靶基因，向导RNA，以及Cas9核酸内切酶、其衍生物或片段。应用CRISPR/Cas9进行基因编辑的重要方面在于需要有效地将向导RNA递送至各种各样的细胞类型中的系统。这可能例如涉及体外产生的向导RNA作为核酸(由体外转录或化学合成产生的向导RNA)的递送。在一些可选方式中，通过掺入修饰的碱基(例如2’O-甲基碱基)，使编码向导RNA的核酸获得核酸酶抗性。此外，在该上下文中，用于表达向导RNA的重要系统基于腺相关病毒(AAV)载体的使用，因为AAV载体能够转导范围广泛的原代细胞。AAV载体不会引起感染，也不会整合到基因组中。因此，使用AAV载体具有既安全又有效的益处。在一些可选方式中，所述载体是AAV载体。在一些可选方式中，所述载体是慢病毒载体。
[0088] CRISPR/Cas9系统还可用作模块化蛋白效应物募集系统(modular protein effector recruitment system)，在与转录激活因子偶联时，该系统可用于基因激活。可将Cas9遗传工程化为具有转录激活因子的结构域的融合蛋白。不受限制地，激活结构域可包含来自例如转录激活因子VP16、VP64或p65激活结构域的单个或多个结构域。因此，Cas9融合体可作为RNA向导的DNA结合蛋白以将任何蛋白靶向至任何DNA序列，并提供用于将蛋白靶向至DNA的通用平台。Cas9融合蛋白还可用于靶向增强子、内含子和其它非编码元件，以映射这些元件对转录的调控功能。在本文所述的一些可选方式中，提供了制造用于对肿瘤微环境(TME)进行修饰的遗传修饰的免疫细胞的方法，其中，所述方法包括向免疫细胞递送第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述方法进一步包括：向所述细胞递送第四载体，其中，所述第四载体编码与转录激活因子结构域融合的Cas9蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及向所述细胞递送第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，转录激活结构域包括VP16、VP64或p65激活结构域。
在一些可选方式中，所述方法进一步包括：向所述细胞递送第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及向所述细胞递送第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因是IFN-γ、IL-12和/或IL-18。在一些可选方式中，IL-12由SEQ ID NO:27中所示的序列进行编码
在一些可选方式中，所述方法进一步包括：向所述细胞递送第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及向所述细胞递送第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因是IFN-γ、IL-12和/或IL-18。在一些可选方式中，IL-12由SEQ ID NO:27中所示的序列进行编码
[0089]在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因编码IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。
[0090] 最大的蛋白选择的另一因素是将转录基因的密码子适配成宿主(例如人)的典型密码子使用。在这方面，可设计多种合成基因来增加其蛋白表达水平。密码子优化的设计过程可为，将稀有密码子改变成已知密码子，来增加最大的蛋白表达效率。在一些可选方式中，对密码子选择进行了描述，其中，可通过使用算法来进行密码子选择，以创建为了高蛋白产率而优化的合成遗传转录子。包含用于密码子优化的算法的程序是可得的，包括例如TMOptimumGene 和 在本文提供的方法的一些可选方式中，对提供用于所述方法
的载体进行密码子优化，以用于在人中表达。
的载体进行密码子优化，以用于在人中表达。
[0091] “遗传修饰的免疫细胞”或“遗传工程化的细胞”通过称为遗传工程的工艺制成，该工艺可包括但不限于，操纵细胞自身基因组或将新核酸插入细胞中。在一些可选方式中，这些细胞可以是巨噬细胞，还可以被称为遗传工程化的巨噬细胞(GEM)。这些技术可用于改变细胞的遗传组成，并且可包括将编码感兴趣基因的载体插入细胞中，以及使用RNAi系统、大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator like effector nucleases，TALENS)或CRISPR的基因组编辑。不受限制地，所述编码感兴趣基因的载体可以是病毒载体、DNA或mRNA。在本文所述的一些可选方式中，提供遗传修饰的免疫细胞。在一些可选方式中，遗传修饰的免疫细胞使用基因组编辑蛋白或系统(例如大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENS)、CRISPR/VP64-Cas9系统或CRISPR/CAS9系统)来制造。在一些可选方式中，其中，所述遗传修饰的免疫细胞使用载体制成，所述载体是病毒载体、DNA或mRNA。在一些可选方式中，所述T细胞是遗传修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述T细胞进行遗传修饰，以表达嵌合抗原受体。在一些可选方式中，对所述遗传修饰的T细胞进行遗传修饰，以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。更多的可选方式涉及上述遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种单独或组合作为药物，例如来治疗或抑制癌症，例如乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。
[0092] 如本文所使用的，“嵌合受体”是指包含抗体或其它蛋白序列的配体结合结构域的综合设计的受体，所述配体结合结构域结合与疾病或病症相关的分子，并经由间隔区结构域与T细胞或其它受体的一个或多个胞内信号转导结构域(例如共刺激结构域)连接。嵌合受体还可称为人造T细胞受体、嵌合T细胞受体、嵌合免疫受体和嵌合抗原受体(CAR)。这些受体可用于将单克隆抗体或其结合片段的特异性移植到T细胞上，通过病毒载体(如逆转录病毒载体或慢病毒载体)促进它们的编码序列的转移。CAR是遗传工程化的T细胞受体，该遗传工程化的T细胞受体被设计用于重定向T细胞，以靶向表达特定细胞表面抗原的细胞。可将T细胞从受试者中移出并进行修饰，从而通过称为过继性细胞转移的过程，可使它们表达可对抗原具有特异性的受体。将T细胞重新引入患者，然后T细胞可在患者中识别并靶向抗原。这些CAR是可将任意特异性移植到免疫受体细胞上的工程化受体。一些研究者还认为术语嵌合抗原受体或“CAR”包括抗体或抗体片段、间隔区、信号转导结构域和跨膜区。由于修饰本文所述的CAR的不同组件或结构域(例如表位结合区(例如抗体片段、scFv、或其部分)、间隔区、跨膜结构域和/或信号转导结构域)的令人惊讶的效果，就独立元件而言，CAR的组件在本公开整个内容中经常是有区别的。例如，CAR的不同元件的变化可引起对特定表位或抗原有较强的结合亲和力。在一些可选方式中，本文提供的CAR包含T2A切割序列。所述切割序列由SEQ ID NO：13中所示的序列进行编码
[0093] “T细胞受体”或Tcr是T淋巴细胞表面上的分子，其负责识别和结合与主要组织相容性复合物分子结合的抗原。在一些可选方式中，所述遗传修饰的T细胞表达Tcr。
[0094] 如本文所述的，“自杀基因疗法”、“自杀基因”和“自杀基因系统”可以指通过凋亡破坏细胞的方法，所述方法需要会通过凋亡导致细胞杀死自身的自杀基因。由于对需要使用遗传修饰的免疫细胞来治疗或修饰肿瘤环境的患者的安全性顾虑，正在开发策略以预防或减轻不良事件。将遗传修饰的免疫细胞掺入受试者中以用于预治疗步骤的不良作用可包括“细胞因子风暴(cytokine storm)”，细胞因子风暴是一种细胞因子释放综合征，其中，输注的T细胞将细胞因子释放到血流中，可导致危险的高热以及血压急剧下降。
[0095] 如本文所述的，“前药”是能够被机体代谢成为药理活性药物的化合物、制剂或药物。前药是药物分子的衍生物，其可在体内通过酶和/或化学修饰来释放活性母体药物，以发挥期望的药理作用。因此，一旦这些非活性前药被代谢，它们就变成活化形式。不受限制地，前药可用于改善药物如何被吸收、分布、代谢、排泄；改善药物的生物利用度；或者改善药物可如何选择性地与并非其目的靶标的细胞或过程相互作用。
[0096] 存在根据机体如何将前药转化成药物的最终活性形式进一步定义的几种类型的前药。I型前药在细胞内(细胞内)被生物活化，II型前药在细胞外(胞外)被生物活化。基于如下因素，还可将这两种类型进一步分类为亚型：例如，细胞内生物活化位置是否也是治疗作用的位点，或者生物活化是否可在胃肠液或循环系统中发生。
[0097] 本文还描述了在癌症疗法中使用前药。在癌症疗法期间，主要挑战是破坏癌细胞和恶性肿瘤或肿瘤细胞，而不破坏健康宿主细胞。这可例如通过使用自杀基因来实现。自杀基因可用于通过凋亡使细胞杀死自身。使用自杀基因的两种方法包括基因导向酶产生疗法(gene-directed enzyme producing therpy)和病毒导向酶前药疗法。
[0098] 对于基因导向酶产生疗法，从癌细胞中获取基因，然后用其它基因进行修饰，从而形成对健康细胞无害的酶。然后，将外源酶插入肿瘤细胞中，其在此处可释放对健康细胞无害但在癌细胞中造成伤害的前药。然后，修饰的自杀基因可将无毒的前药转化为细胞毒性物质。
[0099] 在病毒导向酶前药疗法中，运载体可用于将修饰的基因递送至癌细胞。不受限制地，所述运载体可以是病毒(例如疱疹病毒)或载体，以递送修饰的基因。
[0100] 自杀基因疗法可被用于增加遗传修饰的免疫细胞的安全性并管理输注遗传修饰的免疫细胞后可能发生的不良事件。需要药理学疗法、自杀基因或新策略来将细胞毒性作用限制为仅针对恶性细胞。有几种方法针对自杀基因疗法。不受限制地，所述方法可包括基因导向酶产生疗法或病毒导向酶前药疗法。对于基因导向酶产生疗法(GDEPT)而言，从癌细胞中获取基因，并然后用其它基因对其进行修饰以形成对健康细胞无害的酶。将这种外源酶插入肿瘤细胞中，其在此处释放前药(对健康细胞无害但对癌性细胞具有破坏性的小分子)。修饰的自杀基因将无毒前药转化为细胞毒性物质。对病毒导向酶前药疗法而言，使用作为运载体或载体的病毒(例如单纯疱疹病毒或感冒病毒)将修饰的基因递送至癌细胞中。对所有癌性肿瘤而言，自杀基因疗法并不是必然有望能完全消除对化疗和放射治疗的需要。然而，对肿瘤细胞造成的损伤使得它们更容易受到化疗或放射的影响。这种方法已被证明对前列腺癌和膀胱癌有效。自杀基因疗法的应用也正在扩展到几种其它形式的癌症。癌症患者的免疫系统通常受到抑制，因此他们可能会受到使用病毒作为递送剂的一些副作用。对遗传修饰的免疫细胞的不良作用的管理可通过在启动子的控制下表达遗传修饰的免疫细胞来进行。如之前在几篇综述中所述的，遗传修饰的免疫细胞可进一步用自杀基因进行离体(ex vivo)遗传修饰。不受限制地，自杀基因可为编码能够在细胞水平上将无毒前药转化毒性化合物的因子的基因。在通过过继性细胞转移输注遗传修饰的免疫细胞之后可能发生的不良作用期间，可将该前药给予遭受不良作用的受试者，该前药可选择性地消除自杀基因修饰的遗传修饰免疫细胞而不干扰由未修饰的T细胞操作的免疫重建过程。使用单纯疱疹胸苷激酶(Hsv-tk)/更昔洛韦(GCV)自杀系统的自杀系统已有描述(Casucci等，
2011，Journal of Cancer 2011，2；在此以引用的方式将其整体明确地并入本文)。在一些可选方式中，提供了对肿瘤微环境(TME)进行修饰的方法，其中，所述方法包括向免疫细胞递送第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白和干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。
2011，Journal of Cancer 2011，2；在此以引用的方式将其整体明确地并入本文)。在一些可选方式中，提供了对肿瘤微环境(TME)进行修饰的方法，其中，所述方法包括向免疫细胞递送第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白和干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。
[0101] 在一些可选方式中，所述自杀基因系统是EGFRt自杀基因系统，其中，将爱必妥作为前药给予患者。在一些可选方式中，每天给予受试者0.04mg/cm2爱必妥。在一些可选方式中，其中爱必妥是前药，0.04mg/cm2可被认为是初始剂量，而在一些可选方式中，在给予初始剂量后每周给予0.025mg/cm2剂量的爱必妥。在一些可选方式中，其中患者出现皮疹(rash)，每周剂量可降至0.03mg/cm2、0.02mg/cm2或0.01mg/cm2，或者上述值中任何两个之间的任何其它剂量。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是Her2tG自杀基因系统，其中，将赫赛汀作为前药给予患者。在一些可选方式中，给予受试者2mg/kg、3mg/kg或4mg/kg或者上述值中任何两个之间的任何剂量的赫赛汀。
[0102] 如本文所述的，“调控元件”可以指调控序列，所述调控序列是负责基因表达的调控的任何DNA序列，例如启动子和操纵子。调控元件可为核酸分子的片段，所述片段能够增加或降低有机体内特定基因的表达。在本文所述的一些可选方式中，所述蛋白处于调控元件的控制下。
[0103] “启动子”是指导结构基因转录的核苷酸序列。在一些可选方式中，启动子位于基因的5'非编码区中，临近结构基因的转录起始位点。在转录起始中发挥功能的启动子中的序列元件通常特征在于共有核苷酸序列。不受限制地，这些启动子元件可包括：RNA聚合酶结合位点、TATA序列、CAAT序列、分化特异性元件(DSE；McGehee等，Mol.Endocrinol.7:551(1993)；在此以引用的方式将其整体明确地并入)、环AMP应答元件(CRE)、血清应答元件(SRE；Treisman等，Seminars in Cancer Biol.1:47(1990)；以引用的方式将其整体并入)、糖皮质激素应答元件(GRE)以及其它转录因子的结合位点，例如CRE/ATF(O'Reilly等，J.Biol.Chem.267:19938(1992)；以引用的方式将其整体并入)、AP2(Ye等，J.Biol.Chem.269:25728(1994)；以引用的方式将其整体并入)、SP1、cAMP应答元件结合蛋白(CREB；Loeken等，Gene Expr.3:253(1993)；在此以引用的方式将其整体明确地并入)以及八聚体因子(octamer factors)(总体上见：Watson等编，Molecular Biology of the Gene，第4版(TheBenjamin/Cummings Publishing Company,Inc.，1987；以引用的方式将其整体并入)以及Lemaigre和Rousseau，Biochem.J.303:1(1994)；以引用的方式将其整体并入)。如本文使用的，启动子可为组成型激活、阻遏型或诱导型。如果启动子是诱导型启动子，则转录速率应答于诱导剂而增加。反之，如果启动子是组成型启动子，则转录速率不受诱导剂调控。阻遏型启动子也是公知的。在本文所述的一些可选方式中，提供了制造用于对肿瘤微环境(TME)进行修饰的遗传修饰的免疫细胞的方法，其中，所述方法包括向免疫细胞递送第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。
[0104] 在一些可选方式中，本文使用的启动子可为诱导型启动子或组成型启动子。不受限制地，诱导型启动子可包括：例如他莫西芬诱导型启动子、四环素诱导型启动子或多西环素(doxocycline)诱导型启动子(例如tre启动子)。组成型启动子可包括：例如SV40、CMV、UBC、EF1α、PGK或CAGG。在一些可选方式中，调控元件是启动子。在一些可选方式中，所述启动子为他莫西芬诱导型启动子、四环素诱导型启动子或多西环素诱导型启动子(例如tre启动子)。在本文提供的一些可选方式中，蛋白的表达由他莫西芬和/或其代谢物进行诱导。他莫西芬的代谢物为活性代谢物(如4-羟基他莫西芬(afimoxifene)和N-去甲基-4-羟基他莫西芬(endoxifen))，其与雌激素受体的亲和力可比他莫西芬本身提高30-100倍。在一些可选方式中，他莫西芬代谢物是4-羟基他莫西芬(afimoxifene)和/或N-去甲基-4-羟基他莫西芬(endoxifen)。
[0105] 如本文所述的，“免疫细胞”是参与传染病防护和避免癌细胞的免疫系统的细胞。在本文所述的一些可选方式中，提供了制造用于对肿瘤微环境(TME)进行修饰的遗传修饰的免疫细胞的方法，其中，所述方法包括向免疫细胞递送第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。
[0106] 癌症与不受控制或调节异常的细胞生长有关。癌症可表现为具有异常细胞生长的恶性肿瘤或恶性赘生物，其可以侵入并扩散到身体的其它部位。在本文所述的一些可选方式中，提供了对有需要的受试者(例如人)的肿瘤微环境中的免疫应答的抑制进行调节的方法，其中，所述方法包括向有需要的受试者(例如人)给予本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种；并任选地，对所述受试者进行选择或鉴定以接受所述遗传修饰的免疫细胞，和/或在给予所述遗传修饰的免疫细胞后，对所述受试者的肿瘤微环境中的免疫应答抑制的调节进行测量。在一些可选方式中，所述肿瘤环境内的肿瘤是胶质瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质母细胞瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是肺肿瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是前列腺肿瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是胃肿瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是乳腺肿瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是结肠直肠肿瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是脑肿瘤。
[0107] “自然杀伤细胞”或NK细胞是对先天免疫系统而言重要的一类细胞毒性淋巴细胞。NK细胞发挥的作用类似于脊椎动物适应性免疫应答中细胞毒性T细胞发挥的作用。NK细胞对病毒感染的细胞提供快速应答，并应答于肿瘤形成。NK细胞的功能对于通过称为免疫监视的过程来预防肿瘤的重新生长而言是重要的(Dunn等，Cancer immunoediting:from immunosurveillance to tumor escape.Nat Immunol 3,991-998(2002)；Langers等，Natural killer cells:role in local tumor growth and metastasis.Biologics:
targets&therapy 6，73-82(2012)；以引用的方式将这两篇参考文献整体并入本文)。
targets&therapy 6，73-82(2012)；以引用的方式将这两篇参考文献整体并入本文)。
[0108] “髓系细胞”可指骨髓或脊髓中的粒细胞或单核细胞前体细胞、或骨髓或脊髓中发现的上述细胞的相似物。髓系细胞谱系包括外周血中的循环单核细胞以及成熟、分化和/或激活后它们所成为的细胞群体。这些群体包括非终末分化的髓系细胞、髓源抑制性细胞和分化的巨噬细胞。分化的巨噬细胞包括非极化巨噬细胞和极化巨噬细胞、静息巨噬细胞和激活巨噬细胞。不受限制地，髓系谱系还可包括粒细胞前体细胞、多形核来源的抑制性细胞(polymorphonuclear derived suppressor cell)、分化的多形核白血细胞、中性粒细胞、粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、小胶质细胞、髓源抑制性细胞、树突状细胞和红细胞。例如，小胶质细胞可从髓系祖细胞分化。
[0109] 如本文所述的“小胶质细胞”是胶质细胞，其为脑和脊髓的驻留巨噬细胞(resident macrophages)，因此在中枢神经系统(CNS)中充当了主动免疫防御的第一主要形式。
[0110] 如本文所述的“联合疗法”是指使用多于一种的药物或模式进行治疗的疗法。例如联合疗法还可以指治疗单一疾病的多种疗法，通常所有的疗法都是药物产品组合。联合疗法还可涉及开出分开的药物的处方并给予分开的药物，其中制剂还可具有多于一种的活性成分。在一些可选方式中，提供了联合疗法。在一些可选方式中，所述联合疗法包括给予遗传修饰的免疫细胞，以用于修饰肿瘤微环境。在一些可选方式中，所述联合疗法包括给予遗传修饰的免疫细胞，以用于调节肿瘤微环境中的免疫应答抑制。在一些可选方式中，所述联合疗法包括给予遗传修饰的免疫细胞，以在有需要的受试者(例如人)中使抑制性细胞和肿瘤的增殖最小化。在一些可选方式中，所述联合疗法包括给予遗传修饰的免疫细胞，以用于在有需要的受试者(例如人)中增加抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒治疗疗法或抗肿瘤疗法的效率。在一些可选方式中，所述联合疗法进一步包括给予抑制剂。在一些可选方式中，所述抑制剂不是酶抑制剂。在一些可选方式中，所述抑制剂是酶抑制剂。在一些可选方式中，所述联合疗法包括给予治疗剂量的抑制剂、或者抗体或其结合片段。在一些可选方式中，这些抗体或其结合片段可被人源化。在一些可选方式中，所述联合疗法可进一步包括向有需要的受试者(例如人)给予携带CAR的T细胞。
[0111] “化疗药”是一类可使用的抗癌药物，例如化学物质，例如可作为标准化疗方案的部分进行给予的抗癌药(化疗试剂)。化疗药可以治疗意图而给予，或者其可旨在延长生命或减小症状(姑息性化疗)。另外的化疗还可包括激素疗法和靶向疗法，因为它是内科肿瘤学(用于癌症的药物疗法)的主要分类之一。这些模式通常与其它癌症疗法(例如放射疗法、手术和/或高热疗法(hyperthermia therapy))连同使用。在少数情况下，已知癌症因手术而扩散。在一些可选方式中，在手术程序之前或之后，向肿瘤位点给予遗传修饰的免疫细胞。
[0112] 一些较新的抗癌药(例如各种单克隆抗体、其人源化版本及其结合片段)不是无差别的细胞毒性的，而是靶向在癌细胞中异常表达且对癌细胞生长至关重要的蛋白。通常将此类治疗称为靶向疗法(与经典化疗不同)，并通常与传统的化疗试剂一起用于抗瘤治疗方案中。在一些可选方式中，本文所述的方法可进一步包括给予这些靶向抗癌疗法的任一种或多种(例如，各种单克隆抗体、其人源化版本及其结合片段)。
[0113] 其中给予化疗药的化疗可一次使用一种药(单一试剂化疗)，或一次使用几种药物(联合化疗或综合化疗)。化疗和放射疗法的联合是放化疗。使用仅在光暴露下转化为细胞毒性的药物的化疗称为光化疗或光动力学疗法。在给予本文所述的遗传修饰的免疫细胞的一些可选方式中，所述方法可进一步包括在接受遗传修饰的免疫细胞或遗传工程化的巨噬细胞(GEM)后，向具有癌症的受试者给予光化疗或光动力学疗法。
[0114] 化疗药可包括但不限于：抗体-药物缀合物(antibody-drug conjugate，例如通过接头连接至药物的抗体)、纳米颗粒(例如纳米颗粒可以是用于促进肿瘤选择性并有助于递送低溶解度药物的1纳米-1000纳米大小的颗粒)、电化疗、烷化剂、抗代谢物(例如5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)、卡培他滨 克拉屈滨(Cladribine Cladribine)、氯法拉滨、阿糖胞苷 氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨
羟基脲、甲氨蝶呤、培美曲塞 喷司他丁和硫鸟嘌呤)、抗肿瘤抗生素、拓扑异构
酶抑制剂、有丝分裂抑制剂、皮质类固醇、DNA嵌入剂或检查点抑制剂(例如检查点激酶CHK1或CHK2)。在本文所述的方法的一些可选方式中，将遗传修饰的免疫细胞或包含遗传修饰的免疫细胞的组合物与一种或多种抗癌剂(例如上述化合物或疗法中的任一种或多种)联合给予。在一些可选方式中，与遗传修饰的免疫细胞连同给予或共同给予的一种或多种抗癌试剂包括：抗体-药物缀合物、纳米颗粒、电化疗、烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂、皮质类固醇、DNA嵌入剂或检查点抑制剂。在一些可选方式中，所述抗代谢物包括：5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)、卡培他滨 克拉
屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷 氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨 羟基脲、甲
氨蝶呤、培美曲塞 喷司他丁或硫鸟嘌呤。
羟基脲、甲氨蝶呤、培美曲塞 喷司他丁和硫鸟嘌呤)、抗肿瘤抗生素、拓扑异构
酶抑制剂、有丝分裂抑制剂、皮质类固醇、DNA嵌入剂或检查点抑制剂(例如检查点激酶CHK1或CHK2)。在本文所述的方法的一些可选方式中，将遗传修饰的免疫细胞或包含遗传修饰的免疫细胞的组合物与一种或多种抗癌剂(例如上述化合物或疗法中的任一种或多种)联合给予。在一些可选方式中，与遗传修饰的免疫细胞连同给予或共同给予的一种或多种抗癌试剂包括：抗体-药物缀合物、纳米颗粒、电化疗、烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂、皮质类固醇、DNA嵌入剂或检查点抑制剂。在一些可选方式中，所述抗代谢物包括：5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)、卡培他滨 克拉
屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷 氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨 羟基脲、甲
氨蝶呤、培美曲塞 喷司他丁或硫鸟嘌呤。
[0115] “检查点阻断剂”是指一种免疫疗法的形式，意味着其旨在帮助患者的自身免疫系统来对抗癌症。检查点阻断剂可使用例如单克隆抗体或其结合片段的物质，所述物质可被设计用来靶向细胞表面上的极其特异的分子。例如，抗体开启使免疫系统对入侵癌细胞的天然攻击停止的反应。在另一实例中，已作为癌症治疗靶标进行研究的配体-受体相互作用是跨膜程序性细胞死亡1蛋白(PDCD1，PD-1；也称为CD279)与其配体PD-1配体1(PD-L1，CD274)之间的相互作用。在正常生理学中，细胞表面上的PD-L1与免疫细胞表面上的PD1结合，抑制了免疫细胞的活性。癌细胞表面上PD-L1的上调似乎能够允许PD-L1通过抑制T细胞(否则可能攻击肿瘤细胞)，来逃避宿主免疫系统。与PD-1或PD-L1结合并因此阻断相互作用的抗体可允许T细胞攻击肿瘤。在一些可选方式中，检查点阻断治疗学包括抗PD-1抗体或其结合片段(例如，单克隆抗体或其人源化版本或其结合片段)。在一些可选方式中，检查点阻断治疗学包括PD-L1。在一些可选方式中，与遗传修饰的免疫细胞或遗传工程化的巨噬细胞(GEM)连同给予或共同给予的一种或多种抗癌试剂包括一种或多种此类检查点阻断剂。
[0116] 如本文所述的“小分子抑制剂”是指可靶向感兴趣的蛋白的小抑制剂。所述蛋白可为由肿瘤细胞分泌的蛋白或细胞应激过程中分泌的蛋白。小分子抑制剂可包括，但不限于：激酶抑制剂、用于癌症疗法的Bcl-2家族蛋白的抑制剂、MC1-1抑制剂或酪氨酸激酶抑制剂。
酪氨酸激酶抑制剂可包括，但不限于：伊马替尼甲磺酸盐(批准用于慢性髓性白血病、胃肠间质瘤和一些其它类型的癌症)、吉非替尼((Iressa，也称为ZD1839)；靶向表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶))、埃罗替尼(作为Tarceva销售)、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)(Sutent)、达沙替尼(Srycel)、拉帕替尼(Lapatinib)(Tykerb)、尼罗替尼(Tasigna)、硼替佐米(Bortezomib)(Velcade)，Janus激酶抑制剂、ALK抑制剂、克唑替尼(crizotinib)、Bcl-2抑制剂、obatoclax、navitoclax、棉酚、PARP抑制剂、Iniparib、奥拉帕尼(Olaparib)、PI3K抑制剂、哌立福辛(perifosine)、阿帕替尼(Apatinib)、VEGF受体2抑制剂、AN-152、Braf抑制剂、威罗菲尼(vemurafenib)、达拉非尼(dabrafenib)、LGX818、MEK抑制剂、曲美替尼(trametinib)、MEK162、CDK抑制剂、PD-0332991、Hsp90抑制剂或盐霉素。在一些可选方式中，与遗传修饰的免疫细胞或遗传工程化的巨噬细胞(GEM)连同给予或共同给予的一种或多种抗癌试剂包含一种或多种此类小分子抑制剂。在一些可选方式中，所使用的小分子抑制剂包括激酶抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂包括Bcl-2家族蛋白的抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂包括MCl-1抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂包括酪氨酸激酶抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是伊马替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是甲磺酸盐。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是吉非替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是埃罗替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是索拉非尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是舒尼替尼(Sutent)。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是达沙替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是拉帕替尼(Tykerb)。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是尼罗替尼
(Tasigna)。在一些可选方式中，小分子抑制剂是硼替佐米(Velcade)。在一些可选方式中，小分子抑制剂是Janus激酶抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是ALK抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是克唑替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是Bcl-2抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是obatoclax。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是navitoclax。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是棉酚。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是PARP抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是
Iniparib。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是奥拉帕尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是PI3K抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是哌立福辛。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是阿帕替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是酪氨酸VEGF受体2抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是AN-152。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是Braf抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是威罗菲尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是达拉非尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是LGX818。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是MEK抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是曲美替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是MEK162。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是CDK抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是PD-0332991。
在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是Hsp90抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是盐霉素。
酪氨酸激酶抑制剂可包括，但不限于：伊马替尼甲磺酸盐(批准用于慢性髓性白血病、胃肠间质瘤和一些其它类型的癌症)、吉非替尼((Iressa，也称为ZD1839)；靶向表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶))、埃罗替尼(作为Tarceva销售)、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)(Sutent)、达沙替尼(Srycel)、拉帕替尼(Lapatinib)(Tykerb)、尼罗替尼(Tasigna)、硼替佐米(Bortezomib)(Velcade)，Janus激酶抑制剂、ALK抑制剂、克唑替尼(crizotinib)、Bcl-2抑制剂、obatoclax、navitoclax、棉酚、PARP抑制剂、Iniparib、奥拉帕尼(Olaparib)、PI3K抑制剂、哌立福辛(perifosine)、阿帕替尼(Apatinib)、VEGF受体2抑制剂、AN-152、Braf抑制剂、威罗菲尼(vemurafenib)、达拉非尼(dabrafenib)、LGX818、MEK抑制剂、曲美替尼(trametinib)、MEK162、CDK抑制剂、PD-0332991、Hsp90抑制剂或盐霉素。在一些可选方式中，与遗传修饰的免疫细胞或遗传工程化的巨噬细胞(GEM)连同给予或共同给予的一种或多种抗癌试剂包含一种或多种此类小分子抑制剂。在一些可选方式中，所使用的小分子抑制剂包括激酶抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂包括Bcl-2家族蛋白的抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂包括MCl-1抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂包括酪氨酸激酶抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是伊马替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是甲磺酸盐。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是吉非替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是埃罗替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是索拉非尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是舒尼替尼(Sutent)。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是达沙替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是拉帕替尼(Tykerb)。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是尼罗替尼
(Tasigna)。在一些可选方式中，小分子抑制剂是硼替佐米(Velcade)。在一些可选方式中，小分子抑制剂是Janus激酶抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是ALK抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是克唑替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是Bcl-2抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是obatoclax。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是navitoclax。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是棉酚。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是PARP抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是
Iniparib。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是奥拉帕尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是PI3K抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是哌立福辛。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是阿帕替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是酪氨酸VEGF受体2抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是AN-152。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是Braf抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是威罗菲尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是达拉非尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是LGX818。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是MEK抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是曲美替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是MEK162。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是CDK抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是PD-0332991。
在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是Hsp90抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是盐霉素。
[0117] 在本文提供的方法的一些可选方式中，所述方法进一步包括与遗传修饰的免疫细胞或遗传工程化的巨噬细胞(GEM)联合或连同给予免疫疗法治疗，其中，所述免疫疗法治疗对免疫细胞进行调节，其中，所述治疗或疗法包括检查点阻断剂、小分子抑制剂和/或过继性细胞疗法中的至少一种。在一些可选方式中，所述免疫疗法治疗对免疫细胞进行调节，其中，所述治疗或疗法包括如下中的至少一种：检查点阻断剂疗法、小分子抑制剂疗法和/或过继性细胞疗法。在一些可选方式中，所述检查点阻断剂治疗学包括抗PD-1抗体或其结合片段。在一些可选方式中，所述检查点阻断剂治疗学包括PD-L1。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞可与过继性细胞疗法结合使用。在一些可选方式中，过继性细胞疗法包括给予包含嵌合抗原受体的T细胞。在一些可选方式中，所述过继性细胞疗法包括给予包含嵌合抗原受体的T细胞。在一些可选方式中，所述嵌合抗原受体靶向肿瘤上的表位。在一些可选方式中，所述过继性细胞疗法包括给予包含特异性Tcr的T细胞。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是激酶抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子是Chk1抑制剂、Chk2抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂包括Bcl-2家族蛋白的抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂包括MCl-1抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂包括酪氨酸激酶抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是伊马替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是甲磺酸盐。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是吉非替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是埃罗替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是索拉非尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是舒尼替尼(Sutent)。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是达沙替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是拉帕替尼(Tykerb)。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是尼罗替尼(Tasigna)。在一些可选方式中，小分子抑制剂是硼替佐米(Velcade)。在一些可选方式中，小分子抑制剂是Janus激酶抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是ALK抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是克唑替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是Bcl-2抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是obatoclax。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是navitoclax。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是棉酚。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是PARP抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是Iniparib。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是奥拉帕尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是PI3K抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是哌立福辛。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是阿帕替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是酪氨酸VEGF受体2抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是AN-152。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是Braf抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是威罗菲尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是达拉非尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是LGX818。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是MEK抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是曲美替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是MEK162。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是CDK抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是PD-0332991。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是Hsp90抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是盐霉素。
[0118] 小抑制剂还可包括丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂。不受限制地，实例包括：Temsirolimus(Torisel)、依维莫司(Everolimus)(Afinitor)、威罗菲尼(Zelboraf)、曲美替尼(Mekinist)或达拉非尼(Tafinlar)。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是
Temsirolimus(Torisel)。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是依维莫司(Afinitor)。
在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是威罗菲尼(Zelboraf)。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是曲美替尼(Mekinist)。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是达拉非尼(Tafinlar)。
Temsirolimus(Torisel)。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是依维莫司(Afinitor)。
在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是威罗菲尼(Zelboraf)。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是曲美替尼(Mekinist)。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是达拉非尼(Tafinlar)。
[0119] 在本文提供的方法的一些可选方式中，特别是联合或连同以免疫细胞的激活为基础的治疗或疗法时，可遗传修饰的免疫细胞或遗传工程化的巨噬细胞(GEM)与检查点阻断剂、小分子抑制剂和/或过继性细胞疗法一起给予，例如抗CTLA-4抗体或其结合片段、抗PD1抗体或其结合片段、抗PD-L1抗体或其结合片段、Chk1抑制剂、Chk2抑制剂、CAR或TCR。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是Temsirolimus(Torisel)。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是依维莫司(Afinitor)。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是威罗菲尼(Zelboraf)。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是曲美替尼(Mekinist)。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是达拉非尼(Tafinlar)。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是激酶抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是Chk1抑制剂、Chk2抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂包含Bcl-2家族蛋白的抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂包含MCl-1抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂包含酪氨酸激酶抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是伊马替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是甲磺酸盐。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是吉非替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是埃罗替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是索拉非尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是舒尼替尼(Sutent)。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是达沙替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是拉帕替尼(Tykerb)。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是尼罗替尼(Tasigna)。在一些可选方式中，小分子抑制剂是硼替佐米(Velcade)。在一些可选方式中，小分子抑制剂是Janus激酶抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是ALK抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是克唑替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是Bcl-2抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是obatoclax。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是navitoclax。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是棉酚。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是PARP抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是Iniparib。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是奥拉帕尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是PI3K抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是哌立福辛。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是阿帕替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是酪氨酸VEGF受体2抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是AN-152。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是Braf抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是威罗菲尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是达拉非尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是LGX818。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是MEK抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是曲美替尼。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是MEK162。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是CDK抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是PD-0332991。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是Hsp90抑制剂。在一些可选方式中，所述小分子抑制剂是盐霉素。在一些可选方式中，本文所述的方法进一步包括过继性细胞疗法，其中，所述过继性细胞疗法包括给予包含嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。在一些可选方式中，对所述CAR进行工程化，以结合至肿瘤细胞上的表位。
具体实施方式
[0120] 尽管在本文提供的各种示例性可选方式和实施方式中对本发明进行了描述，但应该理解的是，在一个或多个单独的可选方式中各自描述的各种特征、方面和功能在它们的适用性方面并不限于特定可选方式(利用这些可选方式对它们进行描述)。相反，不管是否描述了该可选方式或者是否将该特征作为所描述的可选方式的一部分提出，它们都可单独或者以各种组合应用于本发明的一个或多个其它可选方式中。本发明的广度和范围不应受到本文描述或示出的任何示例性可选方式的限制。
[0121] 本发明的方面涉及用于对肿瘤环境进行修饰的方法、遗传修饰的免疫细胞和组合物。具体而言，用于对肿瘤环境进行修饰的方法、细胞和组合物包含能够编码蛋白的免疫细胞，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。
[0122] 免疫应答在癌症中具有重要作用，用于肿瘤的鉴定和消除。例如，肿瘤的转化细胞可表达未在正常细胞上发现的抗原。对于免疫系统，这些抗原似乎是外来的，并且它们的存在导致免疫细胞攻击转化的肿瘤细胞。由肿瘤表达的抗原具有几种来源，例如，一些来源于致癌病毒(oncogenic viruses)(例如人乳头瘤病毒，所述人乳头瘤病毒可引起宫颈癌)，而在其它实例中，在正常细胞中以低水平出现的生物体自己的蛋白可能在肿瘤细胞中达到高水平。一个实例是称为酪氨酸酶的酶，当以高水平表达时，该酶将某些皮肤细胞(例如黑素细胞)转化成肿瘤(称为黑色素瘤)。肿瘤抗原的第三种可能来源是通常对调控细胞生长和生存重要的蛋白，所述蛋白通常突变成癌症诱导分子(称为致癌基因)。
[0123] 免疫系统对肿瘤的主要应答是使用杀伤T细胞破坏异常细胞，有时在辅助T细胞的帮助下。以与病毒抗原类似的方式，肿瘤抗原提呈在MHC I类分子上。这使得杀伤T细胞将肿瘤细胞识别为异常。NK细胞也以类似的方式杀伤肿瘤细胞，尤其是如果肿瘤细胞在它们的表面上具有比正常少的MHC I类分子；这是肿瘤的常见现象。有时产生针对肿瘤细胞的抗体，允许它们被补体系统破坏。
[0124] 在本文所述的可选方式中，存在对促炎性巨噬细胞进行遗传工程化的几种新措施，以用于同种异体移植进脑中。然后，移植的巨噬细胞对肿瘤微环境(TME)进行转化，包括恢复免疫抑制性髓系细胞表型。预期在脑和其它实体瘤中，这些遗传工程化的巨噬细胞(GEM)将支持细胞毒性免疫功能，并支持有效的CAR T细胞免疫疗法。
[0125] 本文所述的可选方式利用新的遗传修饰的巨噬细胞(GEM)技术来开发可广泛适用的疗法，在具有实体瘤的患者以及具有转移性或不能手术的疾病、慢性病毒感染或自身免疫的患者中，所述疗法将调节或阻抑对抗肿瘤免疫应答的抑制、和/或促进或增强抗肿瘤应答，并且所述疗法包含新用途和一种或多种新产品。预期这些可选方式可用作独立疗法、或者辅助或“预处理步骤”，来对局部免疫抑制进行修饰和调节，并为进一步的应答和附加的疗法作好准备。
[0126] 在一些可选方式中，在受试者遭受自身免疫紊乱的情况中，将遗传修饰的髓系细胞用于对免疫应答进行调节，以减少或阻抑自身免疫应答。
[0127] 本文所述的可选方式包括通过过继性转移的巨噬细胞对TME进行修饰的新措施，所述巨噬细胞被工程化为表达使T细胞增殖和功能增强、和/或使抑制性细胞和肿瘤的增殖最小化的因子。众所周知，原代人单核细胞和巨噬细胞对遗传工程具有抗性。然而，使用髓系细胞特异性慢病毒包装系统，可对分离自外周血的原代人单核细胞和单核细胞来源的巨噬细胞进行感染。本文所述的可选方式已经证明了来自这些载体的稳定的基因整合以及稳健、稳定的表达。另外，在本文所述的可选方式中，GEM存留在TME中。
[0128] 尽管当前实践使用慢病毒载体来产生GEM，GEM的可选方式可通过各种基因转移方法来产生，包括mRNA的直接递送。此外，尽管当前迭代包括GBM肿瘤，它并不限于GBM或任何特定的癌症，并且可能对其中免疫应答的调节对治疗来说是障碍的任何病况有益。
[0129] 用于具有GBM的患者的治疗选择远远落后于其它癌症：很少有药物显示出效力，并且护理治疗的标准(手术切除，接着是放射和替莫唑胺化疗)在几十年内变化不大，表明对治疗具有GBM的患者的新措施的迫切需求。以前用于GBM的细胞免疫治疗措施在很大程度上是无效的，很大程度是由于免疫抑制性的TME。GBM和其它高级别胶质瘤的一个界定特征是调节性髓系细胞(regulatory myeloid cells)的大量浸润，所述调控性髓系细胞具有促进肿瘤的抗炎性表型。
[0130] 在一些可选方式中，提供了GEM以克服TME中的局部免疫抑制。能够感染髓系细胞的慢病毒的最近发展为对GEM进行工程化提供了独特的机会，在所述GEM中使构建体稳定地整合，并引起稳健、稳定的蛋白表达。本文所述的实施方式使用了多种措施来对这些GEM中的基因表达进行修饰。在一种措施中，对GEM进行工程化，以提供小分子和蛋白的局部源，所述小分子和蛋白增强NK细胞和T细胞增殖和功能。这些小分子和蛋白的实例包括：IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-21、1型干扰素(α和β)、PD-1检查点阻断剂、或应答于使用HMGB1B box结构域的TLR介导的激活而产生的各种细胞因子或趋化因子、或内源性组成型活化MyD88信号(Medzhitov MTA)。另一种措施利用Cas9/CRISPR介导的基因编辑来删除免疫抑制基因(例如TGF-β和IL-10)，一旦注射，使GEM对极化具有抗性。同样地，已将Cas9/CRISPR系统用于实现内源性促炎性基因的组成型或诱导型表达，以支持巨噬细胞、NK细胞和T细胞功能、和/或对肿瘤细胞生长的抑制。所靶向的基因的实例包括使用VP64反式激活的Cas9/CRISPR载体的IFN-γ、IL-12和IL-18。
[0131] 本文所述的可选方式可用于开发用于构建GEM的载体目录，该GEM允许根据需要来修饰细胞。在本文所述的可选方式中，目前开发了～10个载体，但是通过利用本文所述的措施可开发更多。
[0132] 在本文所述的一些可选方式中，已经产生了证明在GBM的颅内模型中这些GEM浸润肿瘤、存留并稳定生产转基因的数据。此外，在一些可选方式中，已经证明了在遗传操作之后这些GEM表现出稳定的促炎性细胞因子谱，提供了GEM是用于重构TEM以支持抗肿瘤免疫应答的理想载体的证据。
[0133] 本文所述的可选方式将用作独立疗法或用作其它癌症疗法或免疫疗法的辅助，以便对肿瘤微环境中的免疫应答抑制进行调节。因此，这些可选方式可与多种细胞免疫疗法联合或组合使用，所述细胞免疫疗法包括但不限于：CAR T细胞疗法、抗体或其结合片段、小分子、破伤风毒素、热休克蛋白-肽复合物、或脊髓灰质炎溶瘤病毒。
[0134] 在一些实施方式中，所述疗法利用自体细胞并直接注射到肿瘤床中，然而，在其它可选方式中，使用同种异体细胞和I.V.给予。如本文所述，肿瘤床是指围绕癌性肿瘤并为其提供氧气、生长因子和营养素的血管和基质组织。因此，本发明的实施方式的效用包括手术无法解决的肿瘤(non-surgically addressed tumor)和其它免疫抑制性病况，并且本文所述方面提供了现成的、即可给予的适合于具体病况的同种异体巨噬细胞产品，该产品支持其它形式的免疫疗法。在本文所述方法的一些可选方式中，将遗传修饰的细胞或组合物直接注射到肿瘤床中。在一些可选方式中，将1×105-2×107个遗传修饰的细胞注射到肿瘤床5 5 5 5 5 5
中。在一些可选方式中，将1×10个、2×10个、3×10个、4×10个、5×10个、6×10个、7×
105个、8×105个、9×105个、1×106个、2×106个、3×106个、4×106个、5×106个、6×106个、7×106个、8×106个、9×106个、1×107个、2×107个、3×107个、4×107个、5×107个、6×107个、或7×107的遗传修饰的细胞，或者任意两个上述值之间的任意其它量的遗传修饰的细胞注射到肿瘤床中。在一些可选方式中，将遗传修饰的细胞或组合物注射到1mm、2mm、5mm、10mm、
20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm、150mm、
160mm、170mm、180mm、190mm、或200mm半径的肿瘤床中，或者任意两个上述值之间的任意其它半径的肿瘤床中。
中。在一些可选方式中，将1×10个、2×10个、3×10个、4×10个、5×10个、6×10个、7×
105个、8×105个、9×105个、1×106个、2×106个、3×106个、4×106个、5×106个、6×106个、7×106个、8×106个、9×106个、1×107个、2×107个、3×107个、4×107个、5×107个、6×107个、或7×107的遗传修饰的细胞，或者任意两个上述值之间的任意其它量的遗传修饰的细胞注射到肿瘤床中。在一些可选方式中，将遗传修饰的细胞或组合物注射到1mm、2mm、5mm、10mm、
20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm、150mm、
160mm、170mm、180mm、190mm、或200mm半径的肿瘤床中，或者任意两个上述值之间的任意其它半径的肿瘤床中。
[0135] 本文可选方式中描述的这些GEM的使用通过恢复关键的免疫功能(例如T细胞或NK细胞的细胞毒性和细胞因子的产生、肿瘤微环境和肿瘤细胞的生长中髓系细胞的功能、以及肿瘤微环境的修饰)提供了可观的治疗益处。作为独立的治疗或作为其它免疫疗法的辅助或辅助疗法，用遗传修饰的巨噬细胞治疗患者可改善总存活，并且此类实施方式在本文中进行了描述。
[0136] 用于制造用于对肿瘤的肿瘤微环境(TME)进行修饰的遗传修饰的免疫细胞的方法[0137] 本文描述了制造用于对肿瘤微环境(TME)进行修饰的遗传修饰的免疫细胞的方法。所述肿瘤微环境可包含肿瘤。所述方法可包括向免疫细胞递送第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述第一载体是病毒载体。
在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白或其活性片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白或其活性片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-
136位氨基酸
在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查
点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、和单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述免疫细胞是T细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是遗传修饰的NK细胞。在一些可选方式中，所述T细胞是遗传修饰的T细胞，对其进行遗传修饰，以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质母细胞瘤。在一些可选方式中，所述方法进一步包括向所述免疫细胞递送第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸，并向所述免疫细胞递送编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二个载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述方法进一步包括：向所述免疫细胞递送第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及向所述免疫细胞递送第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的
CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因编码IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。
在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述方法进一步包括使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述细胞分化成抗炎性表型。
在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白或其活性片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白或其活性片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-
136位氨基酸
在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查
点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、和单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述免疫细胞是T细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是遗传修饰的NK细胞。在一些可选方式中，所述T细胞是遗传修饰的T细胞，对其进行遗传修饰，以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质母细胞瘤。在一些可选方式中，所述方法进一步包括向所述免疫细胞递送第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸，并向所述免疫细胞递送编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二个载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述方法进一步包括：向所述免疫细胞递送第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及向所述免疫细胞递送第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的
CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因编码IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。
在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述方法进一步包括使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述细胞分化成抗炎性表型。
[0138] 表达蛋白的细胞，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。
[0139] 根据一些优选的可选方式，存在所提供的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述细胞包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，提供了包含第一载体的遗传修饰的免疫细胞。所述第一载体可包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，存在所提供的制造用于对肿瘤微环境(TME)进行修饰的遗传修饰的免疫细胞的方法。在一些可选方式中，所述方法包括向免疫细胞递送第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白质诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。
[0140] 在一些可选方式中，所述免疫细胞是T细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是遗传修饰的NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述免疫细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述第一载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列进行编码：
[0141]在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白或其活性片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白或其活性片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二个载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。
在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二个载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。
在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。
[0142] 在一些可选方式中，所述第一载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，将包装有Vpx蛋白的慢病毒载体用于提供对髓系细胞的有效转染。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL17、CCL22、CCL24或CCL26。在一些可选方式中，所述T细胞是遗传修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述遗传修饰的T细胞进行遗传修饰，以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质母细胞瘤。在一些可选方式中，所述方法进一步包括向所述免疫细胞递送第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸，并向所述免疫细胞递送编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二个载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是TGF-β或IL-10。在一些可选方式中，该方法进一步包括：向所述免疫细胞递送第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白；以及向所述免疫细胞递送第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。
[0143] 在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因是IFN-γ、IL-12和/或IL-18。在一些可选方式中，IL-12由SEQ ID NO:27中所示的序列进行编码
[0144]
[0145]在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选
方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。
方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。
[0146] 在一些可选方式中，所述方法进一步包括使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述细胞分化成抗炎性表型。
[0147] 在一些可选方式中，提供了遗传修饰的免疫细胞，其中，所述遗传修饰的免疫细胞包含第一载体，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述T细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述T细胞进行遗传修饰，以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质母细胞瘤。在一些可选方式中，所述载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是TGF-β或IL-10。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因是IFN-γ、IL-12和/或IL-18。在一些可选方式中，IL-12由SEQ ID NO:27中所示的序列进行编码[0148]
[0149]在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选
方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。
方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。
[0150] 在GEM中表达髓系细胞表面标志物的方法
[0151] 根据一些优选的可选方式，存在提供的遗传修饰的免疫细胞，其中，所述细胞包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，提供了包含第一载体的遗传修饰的免疫细胞。所述第一载体可包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，存在所提供的制造用于对肿瘤微环境(TME)进行修饰的遗传修饰的免疫细胞的方法。在一些可选方式中，所述方法包括向免疫细胞递送第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖；促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和/或激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。
[0152] 在一些可选方式中，所述免疫细胞是T细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是遗传修饰的NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述免疫细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述第一载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-
1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白或其活性片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白或其活性片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-
18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。
1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白或其活性片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白或其活性片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-
18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。
[0153] 在一些可选方式中，所述第一载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，将包装有Vpx蛋白的慢病毒载体用于提供髓系细胞的有效转染。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL17、CCL22、CCL24或CCL26。在一些可选方式中，所述T细胞是遗传修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述遗传修饰的T细胞进行遗传修饰，以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述肿瘤是神经胶质瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质母细胞瘤。在一些可选方式中，所述方法进一步包括向所述免疫细胞递送第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸，并向所述免疫细胞递送编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二个载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是TGF-β或IL-10。在一些可选方式中，所述方法进一步包括：向所述免疫细胞递送第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白；以及向所述免疫细胞递送第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。
[0154] 在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因是IFN-γ、IL-12和/或IL-18。在一些可选方式中，IL-12由SEQ ID NO:27中所示的序列进行编码
[0155]
[0156]在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选
方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。
方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。
[0157] 在一些可选方式中，所述方法进一步包括使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述细胞分化成抗炎性表型。
[0158] 在一些可选方式中，提供了遗传修饰的免疫细胞，其中，所述遗传修饰的免疫细胞包含第一载体，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述T细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述T细胞进行遗传修饰，以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质母细胞瘤。在一些可选方式中，所述载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列进行编码
[0159]
[0160]在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是TGF-β或IL-10。
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因是IFN-γ、IL-12和/或IL-18。在一些可选方式中，IL-12由SEQ ID NO:27中所示的序列进行编码
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是TGF-β或IL-10。
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因是IFN-γ、IL-12和/或IL-18。在一些可选方式中，IL-12由SEQ ID NO:27中所示的序列进行编码
[0161]
[0162]在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选
方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，与未用所述载体诱导的免疫细胞相比，所述细胞的CD11b表达降低。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述免疫细胞具有增加的抗炎性巨噬细胞标志物表达。在一些可选方式中，所述抗炎性巨噬细胞标志物是CD163和CD80。在一些可选方式中，与未用所述载体转导的免疫细胞相比，所述免疫细胞表达较高浓度的抗炎性巨噬细胞标志物。
方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，与未用所述载体诱导的免疫细胞相比，所述细胞的CD11b表达降低。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述免疫细胞具有增加的抗炎性巨噬细胞标志物表达。在一些可选方式中，所述抗炎性巨噬细胞标志物是CD163和CD80。在一些可选方式中，与未用所述载体转导的免疫细胞相比，所述免疫细胞表达较高浓度的抗炎性巨噬细胞标志物。
[0163] 组合物
[0164] 在一些可选方式中，将本文所述的方法和组合物用于在遭受癌症、疾病或感染的受试者(例如人)中对肿瘤环境进行修饰。在本文提供的方法和组合物的一些可选方式中，有需要的患者是具有复发性顽固性神经母细胞瘤的小儿年龄(pediatric age)的人。在一些可选方式中，所述癌症是实体瘤。在一些可选方式中，所述实体瘤选自于由乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌所组成的组。
[0165] 在一些可选方式中，将向所述受试者提供的组合物用于在所述受试者中对肿瘤环境进行修饰。在一些可选方式中，将所述组合物用于在有需要的受试者的肿瘤微环境中对免疫应答的抑制进行调节，所述有需要的受试者例如具有癌症的受试者，所述癌症例如乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。在一些可选方式中，将所述组合物用于在有需要的受试者中使抑制性细胞和肿瘤的增殖最小化，所述有需要的受试者例如具有癌症的受试者，所述癌症例如乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。在一些可选方式中，将所述组合物用于在有需要的受试者中增加抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法的效率，所述有需要的受试者例如具有癌症的受试者，所述癌症例如乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。
[0166] 在一些可选方式中，所述组合物包含：本文所述的可选方式中的任一项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种、或由本文所述的可选方式中的任一项制造的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种，以及运载体、抗癌治疗剂、抗感染治疗剂、抗菌治疗剂、抗病毒治疗剂、或抗肿瘤治疗剂。在一些可选方式中，所述组合物的遗传修饰的免疫细胞包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和/或激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。
[0167] 在一些可选方式中，制造所述遗传修饰的免疫细胞的方法包括向免疫细胞递送第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。
[0168] 在一些可选方式中，所述载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，将包装有Vpx蛋白的慢病毒载体用于提供髓系细胞的有效转染。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL17、CCL22、CCL24或CCL26。在一些可选方式中，所述T细胞是遗传修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述遗传修饰的T细胞进行遗传修饰，以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质母细胞瘤。在一些可选方式中，所述方法进一步包括向所述免疫细胞递送第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸，并向所述免疫细胞递送编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是TGF-β或IL-10。在一些可选方式中，所述方法进一步包括：向所述免疫细胞递送第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白；以及向所述免疫细胞递送第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。
[0169] 在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因是IFN-γ、IL-12和/或IL-18。在一些可选方式中，IL-12由SEQ ID NO:27中所示的序列进行编码
[0170]
[0171]在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选
方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。
方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。
[0172] 在一些可选方式中，所述方法进一步包括使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述细胞分化成抗炎性表型。
[0173] 在一些可选方式中，所述遗传修饰的细胞包含第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述T细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述T细胞进行遗传修饰，以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质母细胞瘤。在一些可选方式中，所述载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列进行编码
[0174]在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-
2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是TGF-β或IL-10。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因是IFN-γ、IL-12和/或IL-18。
在一些可选方式中，IL-12由SEQ ID NO:27中所示的序列进行编码
2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是TGF-β或IL-10。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因是IFN-γ、IL-12和/或IL-18。
在一些可选方式中，IL-12由SEQ ID NO:27中所示的序列进行编码
[0175]
[0176]在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选
方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。
方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。
[0177] 所述组合物可进一步包含药物媒介物(pharmaceutical vehicle)或药物赋形剂。如本文所述的“药物赋形剂”或药物媒介物可指在其中配制和/或给予用于治疗或疗法的药用活性剂或T细胞的、作为溶剂使用的运载体或惰性介质。媒介物可包括聚合胶束、脂质体、基于脂蛋白的运载体、纳米粒子运载体、树状聚合物和/或其它媒介物。
[0178] 如本文所述的“媒介物”可指用于运送给予的活性药物或细胞的无治疗性价值的物质。如本文所述的药物媒介物可指在其中配制和/或给予药用活性剂的、作为溶剂使用的运载体或惰性介质。理想的媒介物可为无毒、生物相容、非免疫原性、可生物降解，并且可避免被宿主的防御机制识别。在几种可选方式中，提供了组合物，所述组合物包含促进或增强或稳定遗传修饰的免疫细胞的完整性的媒介物或赋形剂。在一些可选方式中，所述媒介物是药物媒介物。在一些可选方式中，所述药物媒介物包括药物组合物。在一些可选方式中，所述组合物进一步包含药物赋形剂，以及本文所述的可选方式中的任一项所述的遗传修饰的免疫细胞的至少一个群体。
[0179] 对有需要的受试者的肿瘤微环境中的免疫应答抑制进行调节的方法
[0180] 在一些可选方式中，提供了对有需要的受试者(例如人)的肿瘤微环境中的免疫应答抑制进行调节的方法，其中，所述方法包括：向所述有需要的受试者给予本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物的任一种或多种；并任选地，对所述受试者进行选择或鉴定以接受所述遗传修饰的免疫细胞，和/或在给予所述遗传修饰的免疫细胞后，对所述受试者的肿瘤微环境中的免疫应答抑制的调节进行测量。
[0181] 在一些可选方式中，所述遗传修饰的细胞包含第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述T细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述T细胞进行遗传修饰，以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质母细胞瘤。在一些可选方式中，所述载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列进行编码。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL17、CCL22、CCL24或CCL26。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是TGF-β或IL-10。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因是IFN-γ、IL-12和/或IL-18。在一些可选方式中，IL-12由SEQ ID NO:27中所示的序列进行编码
[0182]
[0183]在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选
方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。
方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。
[0184] 在一些可选方式中，将所述组合物用于对肿瘤微环境中的免疫应答抑制进行调节。在所述组合物的所述遗传修饰的细胞的一些可选方式中，所述遗传修饰的细胞包含第一载体，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和/或激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述T细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述T细胞进行遗传修饰，以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质母细胞瘤。在一些可选方式中，所述载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列进行编码。
在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第
62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-
2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是TGF-β或IL-10。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码
Cas9VP64融合蛋白；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因是IFN-γ、IL-12和/或IL-18。
在一些可选方式中，IL-12由SEQ ID NO:27中所示的序列进行编码
在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第
62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-
2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是TGF-β或IL-10。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码
Cas9VP64融合蛋白；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因是IFN-γ、IL-12和/或IL-18。
在一些可选方式中，IL-12由SEQ ID NO:27中所示的序列进行编码
[0185]
[0186]在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选
方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。
方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。
[0187] 在所述方法的一些可选方式中，给予通过过继性细胞转移来进行。在一些可选方式中，通过注射直接递送至肿瘤床，来给予所述遗传修饰的免疫细胞。在一些可选方式中，所述有需要的受试者遭受癌症。在一些可选方式中，所述癌症是实体瘤。在一些可选方式中，所述实体瘤选自于由如下所组成的组：乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。
[0188] 在一些可选方式中，所述方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向有需要的受试者(例如人)给予细胞疗法。在一些可选方式中，所述细胞疗法是CAR T细胞疗法。在一些可选方式中，所述方法进一步包括：在将本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种引入、提供或给予至受试者以进行治疗之前、之后或同时，向有需要的受试者递送抗体或其结合片段、小分子、热休克蛋白-肽复合物或溶瘤性脊髓灰质炎病毒。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段对以下具有特异性：甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、HER2和/或p53或ras的异常产物。在一些可选方式中，所述方法进一步包括向有需要的受试者给予前药。在一些可选方式中，所述前药是爱必妥、赫赛汀、更昔洛韦、FK506或二聚化的化学诱导剂。在一些可选方式中，所述方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向有所述受试者给予药物。在一些可选方式中，所述药物是他莫西芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，对所述受试者进行鉴定或选择，以接受抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法。在一些可选方式中，所述方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向所述受试者引入、提供或给予额外的治疗试剂(例如化疗试剂、抗病毒试剂、或抗菌试剂)或辅助疗法(例如放射疗法和/或手术)。在一些可选方式中，所述额外的治疗试剂是抗癌疗法，所述抗癌疗法包括激素阻断疗法、化疗、小分子、单克隆抗体或其结合片段、和/或放射。在一些可选方式中，所述单克隆抗体或其结合片段对以下具有特异性：Her2、CD52、CD20、CD25、VEGF或EGRF，这些抗体或其结合片段可被人源化。在一些可选方式中，所述激素阻断疗法包括他莫西芬、阿那曲唑和/或来曲唑的递送。在一些可选方式中，所述小分子包括酪氨酸激酶抑制剂、小分子药物缀合物、丝氨酸激酶抑制剂和/或苏氨酸激酶抑制剂。在一些可选方式中，所述方法并不负面地影响受试者的存活。在一些可选方式中，所述方法不造成不利的副作用。
[0189] 使抑制性细胞和肿瘤的增殖最小化的方法
[0190] 在一些可选方式中，提供了在有需要的受试者(例如人)中使抑制性细胞和肿瘤的增殖最小化的方法，其中，所述方法包括：向所述有需要的受试者给予本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物的任一种或多种；并任选地，对所述受试者进行选择或鉴定以接受所述遗传修饰的免疫细胞，和/或在给予所述遗传修饰的免疫细胞后，对所述受试者中的抑制性细胞和肿瘤的增殖进行测量。
[0191] 在一些可选方式中，所述遗传修饰的细胞包含第一载体，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述T细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述T-细胞进行遗传修饰，以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质母细胞瘤。在一些可选方式中，所述载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列进行编码。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL17、CCL22、CCL24或CCL26。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是TGF-β或IL-10。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因是IFN-γ、IL-12和/或IL-18。在一些可选方式中，IL-12由SEQ ID NO:27中所示的序列进行编码
[0192]
[0193]在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选
方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。
方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。
[0194] 在一些可选方式中，将所述组合物用于在有需要的受试者中使抑制性细胞和肿瘤的增殖最小化。在所述组合物的遗传修饰的细胞的一些可选方式中，所述遗传修饰的细胞包含第一载体，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和/或激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述T细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述T细胞进行遗传修饰，以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质母细胞瘤。在一些可选方式中，所述载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列进行编码。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-
2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述趋化因子是CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL17、CCL22、CCL24或CCL26。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是TGF-β或IL-10。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因是IFN-γ、IL-12和/或IL-18。在一些可选方式中，IL-12由SEQ ID NO:27中所示的序列进行编码
2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述趋化因子是CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL17、CCL22、CCL24或CCL26。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是TGF-β或IL-10。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因是IFN-γ、IL-12和/或IL-18。在一些可选方式中，IL-12由SEQ ID NO:27中所示的序列进行编码
[0195]
[0196]在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选
方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。所述组合物可进一步包括媒介物或药物媒介物。
方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。所述组合物可进一步包括媒介物或药物媒介物。
[0197] 在所述方法的一些可选方式中，给予通过过继性细胞转移来进行。在一些可选方式中，通过注射直接递送至肿瘤床，来给予所述遗传修饰的免疫细胞。在一些可选方式中，所述有需要的受试者遭受癌症。在一些可选方式中，所述癌症是实体瘤。在一些可选方式中，所述实体瘤选自于由如下所组成的组：乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。
[0198] 在一些可选方式中，所述方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向有需要的受试者给予细胞疗法。在一些可选方式中，所述细胞疗法是CAR T细胞疗法。在一些可选方式中，所述方法进一步包括：在将本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种引入、提供或给予至受试者以进行治疗之前、之后或同时，向有需要的受试者递送抗体或其结合片段、小分子、热休克蛋白-肽复合物或溶瘤性脊髓灰质炎病毒。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段对以下具有特异性：甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、HER2和/或p53或ras的异常产物。在一些可选方式中，所述方法进一步包括向有需要的受试者给予前药。在一些可选方式中，所述前药是爱必妥、赫赛汀、更昔洛韦、FK506或二聚化的化学诱导剂。在一些可选方式中，所述方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向有所述受试者给予药物。在一些可选方式中，所述药物是他莫西芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，对所述受试者进行鉴定或选择，以接受抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法。在一些可选方式中，所述方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向所述受试者引入、提供或给予额外的治疗试剂(例如化疗试剂、抗病毒试剂、或抗菌试剂)或辅助疗法(例如放射疗法和/或手术)。在一些可选方式中，所述额外的治疗试剂是抗癌疗法，所述抗癌疗法包括激素阻断疗法、化疗、小分子、单克隆抗体或其结合片段(可被人源化)、和/或放射。在一些可选方式中，所述单克隆抗体或其结合片段或其人源化变体对以下具有特异性：Her2、CD52、CD20、CD25、VEGF或EGRF。在一些可选方式中，所述激素阻断疗法包括他莫西芬、阿那曲唑和/或来曲唑的递送。在一些可选方式中，所述小分子包括酪氨酸激酶抑制剂、小分子药物缀合物、丝氨酸激酶抑制剂和/或苏氨酸激酶抑制剂。
[0199] 在受试者中增加抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法的效率的方法
[0200] 在一些可选方式中，提供了在有需要的受试者(例如人)中增加抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法的效率的方法，其中，所述方法包括：向有需要的受试者(例如人)给予本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物；并任选地，对所述受试者进行选择或鉴定以接受所述遗传修饰的免疫细胞，和/或在给予所述遗传修饰的免疫细胞后，对所述受试者中的癌症、感染、细菌、病毒或肿瘤的增殖进行测量。
[0201] 在一些可选方式中，遗传修饰的免疫细胞用于在所述有需要的受试者中增加抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法的效率，所述遗传修饰的免疫细胞包含第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和/或激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞是T细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是遗传修饰的NK细胞。在一些可选方式中，所述T细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述T细胞进行遗传修饰，以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质母细胞瘤。在一些可选方式中，所述载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-
18或IL21。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列进行编码。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-
1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-
2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是TGF-β或IL-10。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因是IFN-γ、IL-12和/或IL-18。在一些可选方式中，IL-12由SEQ ID NO:27中所示的序列进行编码
18或IL21。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列进行编码。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-
1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-
2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是TGF-β或IL-10。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因是IFN-γ、IL-12和/或IL-18。在一些可选方式中，IL-12由SEQ ID NO:27中所示的序列进行编码
[0202]在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选
方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。
方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。
[0203] 在一些可选方式中，将所述组合物用于在有需要的受试者(例如人)中增加或改善抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法的效率。在一些可选方式中，所述遗传修饰的细胞包含第一载体，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和/或激活，和/或产生白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的诱导。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述遗传修饰的细胞是T细胞。在一些可选方式中，所述T细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述T细胞进行遗传修饰，以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质母细胞瘤。在一些可选方式中，所述载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列进行编码。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-
2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是TGF-β或IL-10。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因是IFN-γ、IL-12和/或IL-18。在一些可选方式中，IL-12由SEQ ID NO:27中所示的序列进行编码
2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是TGF-β或IL-10。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9VP64融合蛋白；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因是IFN-γ、IL-12和/或IL-18。在一些可选方式中，IL-12由SEQ ID NO:27中所示的序列进行编码
[0204]
[0205]在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选
方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。所述组合物可进一步包含药物媒介物或药物赋形剂。媒介物可包括聚合胶束、脂质体、基于脂蛋白的载体、纳米粒子载体、树状聚合物和/或本领域技术人员已知的用于T细胞的其它媒介物。在所述方法的一些可选方式中，给予通过过继性细胞转移来进行。在一些可选方式中，通过注射直接递送至肿瘤床，来给予所述遗传修饰的免疫细胞。在一些可选方式中，所述有需要的受试者遭受癌症。
方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。所述组合物可进一步包含药物媒介物或药物赋形剂。媒介物可包括聚合胶束、脂质体、基于脂蛋白的载体、纳米粒子载体、树状聚合物和/或本领域技术人员已知的用于T细胞的其它媒介物。在所述方法的一些可选方式中，给予通过过继性细胞转移来进行。在一些可选方式中，通过注射直接递送至肿瘤床，来给予所述遗传修饰的免疫细胞。在一些可选方式中，所述有需要的受试者遭受癌症。
[0206] 在一些可选方式中，所述癌症是实体瘤。在一些可选方式中，所述实体瘤选自于由乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌所组成的组。在一些可选方式中，所述方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向有需要的受试者(例如人)给予细胞疗法。在一些可选方式中，所述细胞疗法是CAR T细胞疗法。在一些可选方式中，所述方法进一步包括：在将本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种引入、提供或给予至受试者以进行治疗之前、之后或同时，向有需要的受试者递送抗体或其结合片段、小分子、热休克蛋白-肽复合物或溶瘤性脊髓灰质炎病毒。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段对以下具有特异性：甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、HER2和/或p53或ras的异常产物。在一些可选方式中，所述方法进一步包括向有需要的受试者给予前药。在一些可选方式中，所述前药是爱必妥、赫赛汀、更昔洛韦、FK506或二聚化的化学诱导剂。在一些可选方式中，所述方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向有所述受试者给予药物。在一些可选方式中，所述药物是他莫西芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，对所述受试者进行鉴定或选择，以接受抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法。在一些可选方式中，所述方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向所述受试者引入、提供或给予额外的治疗试剂(例如化疗试剂、抗病毒试剂、或抗菌试剂)或辅助疗法(例如放射疗法和/或手术)。在一些可选方式中，所述额外的治疗试剂是抗癌疗法，所述抗癌疗法包括激素阻断疗法、化疗、小分子、单克隆抗体或其结合片段、和/或放射。在一些可选方式中，所述单克隆抗体或其结合片段以下具有特异性：Her2、CD52、CD20、CD25、VEGF或EGRF。在一些可选方式中，所述激素阻断疗法包括他莫西芬、阿那曲唑和/或来曲唑的递送。
[0207] 在小鼠中给予GEM后颅内肿瘤的生长。
[0208] 在所进行的一些实验中，从供体PBMC中分离CD14+单核细胞，并将其分化成M1型巨噬细胞(M1-like macrophage)，然后用髓系细胞特异性的慢病毒进行感染。通过qPCR、Bioplex分析和流式细胞术，对感染的巨噬细胞就促炎性细胞因子(如IL12、TNFα和/或I型干扰素)表达的上调进行测试。在存在和不存在CAR T细胞的情况下，还在胶质母细胞瘤的小鼠模型中对GEM就其减缓颅内肿瘤生长的能力进行了测试。
[0209] 众所周知，由于它们检测和消除外源遗传物质的免疫学功能，难以对巨噬细胞进行工程化以使其表达转基因。因此，能够感染髓系细胞的慢病毒的最新发展提供了使用多种措施来对巨噬细胞进行遗传工程化以转化脑TME的机会。在第一种措施中，GEM过度表达和分泌一种TLR激动剂高迁移率族匣B1(high mobility group box 1，HMGB1)，所述TLR激动剂蛋白既充当了用于持续表达促炎性因子的自分泌信号，又作为TME内免疫抑制性髓系细胞的旁分泌信号。定量PCR表明，HMGB处理的巨噬细胞使其IL1β和TNFα的表达上调。第二种措施涉及新型PD1结合蛋白的开发和表达；在通过移植的GEM分泌时，这些PD1结合剂(binders)阻断PD1与其天然配体之间的相互作用，减少CAR T细胞的衰竭。最后，使用Cas9-CRISPR系统来敲除用于抗炎性细胞因子的基因，这使得移植的GEM较不易受TME的影响。体内数据显示，移植到小鼠脑肿瘤中的巨噬细胞得到存留，并在动物的终生中表达转基因，而没有任何额外递送的细胞因子或生长因子。
[0210] Entolomid是一种TLR激动剂，由SEQ ID NO:38中所示的序列进行编码
[0211]
[0212] 巨噬细胞浸润
[0213] 对小鼠中的高级别胶质瘤进行实验，以检查巨噬细胞浸润。正常细胞、1级胶质瘤、2级胶质瘤、3级胶质瘤、4级胶质瘤和脑膜瘤示于图1A中。如图1A-图1D中所示，高级别神经胶质瘤具有显著的巨噬细胞浸润。
[0214] 募集至U87肿瘤的小鼠巨噬细胞
[0215] 对8周龄的NSG小鼠颅内注射200,000个U87肿瘤细胞。28天后，以冠状方向收获脑，将其固定并包埋在石蜡中。用大鼠抗F4/80(Sigma)(以1：100)以及接着的山羊抗大鼠-HRP(Life technologies)对5μm切片进行染色，并使用酪胺信号放大-Alexa488进行检测。用Nikon Eclipse Ci，通过平铺(tiling)10×1720图像，对载玻片进行成像。染色的载玻片在图2中示出，示出了募集至植入的U87肿瘤的小鼠巨噬细胞。
[0216] 成功转导有含有VPX的慢病毒的HLA-DR+巨噬细胞
[0217] 从正常人PBMC中分离CD14+细胞，并用25nm/ml M-CSF处理6天。以0个、88个、220个和308个慢病毒(LV)颗粒每细胞，用含有Vpx的GFP报告子慢病毒(pLenti-CMV-eGFP)对所得到的单核细胞来源的巨噬细胞(MDM)进行转导。在第13天，用胰蛋白酶收获MDM，将其用抗HLA-DR-PE Cy7进行染色，并通过流式细胞术对GFP表达进行分析。分析MDM的流式细胞术的结果示于图3中，其中它们具有0个、88个、220个或308个LV颗粒每细胞。
[0218] GBM的小鼠模型中存留的转导有编码GFP和萤火虫萤光素酶的慢病毒的MDM
[0219] 用编码GFP和萤光素酶的慢病毒转导MDM，并在30天后通过流式细胞术对GFP的表达进行评价(图4A)。在第0天颅内注射有2×105个野生型U87细胞的NSG小鼠的结果示于图4B中。在第6天对背景发光进行测量。在U87注射后第7天，注射1.44×105个表达萤光素酶的GEM(65.5％GFP+，来自框图A)，每周收集图像两次。图4B和图4C示出了纵向GEM发光信号。
[0220] 其它实验中使用的几种慢病毒构建体示于图5中。
[0221] MDM中的TGFβRII表达和信号转导抑制
[0222] 将图5所示的在MDM中用于TGFβRII表达的载体用来转染免疫细胞。使用GM-CSF来源于原代单核细胞的巨噬细胞示于图6A中(顶部框图)，所述巨噬细胞用针对HLA-DR-PE-Cy7和TGFβRII-488的抗体染色并通过FCM进行分析。(底部框图，图6C)。HLA-DR+细胞的MFI(群体的-98％)。如图6B所示，用1ng/mL TGFβ1处理表达SBE(SMAD结合元件)萤光素酶报告子和/或dnTGFβRII的293T3小时。
[0223] 遗传修饰的免疫细胞中的PD-1/IFNα融合蛋白的表达
[0224] 将图5所示的在MDM中用于PD-1/IFNα融合蛋白表达的载体用来转染免疫细胞。如图7A所示，转导的H9细胞分泌PD-1/IFNα融合蛋白(PIFP)。将来自亲本H9细胞或PD1:IFNα转导的H9细胞的上清液浓缩，电泳并使用针对2A标签(由IFNα蛋白保留)(左，1:5000)或PD1(右，1:250)的单克隆抗体进行蛋白质印迹。图7B示出的是经Brefeldin A培养、固定并渗透的亲本H9细胞或PD1:IFNα转导的H9细胞，所述细胞用荧光团缀合的抗体进行了细胞内染色。通过FCM对细胞就抗-IFNα(左)和抗-PD1(右)进行分析。
[0225] VPX病毒生产
[0226] 如图8所示，将如下共转染到293T细胞系中：编码慢病毒包装组件(gag-pol、vsv-g和rev)的质粒、epHIV7慢病毒骨架中感兴趣的转基因(粉红色)、和允许髓系细胞转导的因子Vpx。转染后72小时，从293T培养物上清液中纯化包装含有Vpx蛋白的病毒粒子。将含有Vpx的病毒用于感染髓单核细胞(MMC-原代人单核细胞或体外分化的巨噬细胞)。如先前所述，Vpx介导的SAMHD1(由MMC表达的限制因子)的降解使病毒逆转录酶(允许稳定的基因整合和表达)失活。包装有Vpx蛋白的慢病毒载体导致允许髓系细胞的稳定转染。
[0227] 感染策略
[0228] 可用慢病毒对MMC(包括原代人外周血单核细胞和单核细胞衍生来源的巨噬细胞二者)进行感染。如图10A中所示，在第一方案中，通过外周血单核细胞(PBMC)的磁分离，来分离CD14+单核细胞，接着通过用10ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)培养将其分化成促炎性表型、或者用25ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)将其分化成抗炎性表型。分化7天后，用含有Vpx的慢病毒感染巨噬细胞，并在转基因被稳定表达后(一周后)将其用于实验。感染后7天(CD14+分离后14天)，关于转基因表达，超过95％的巨噬细胞呈阳性。如图10B中所示，从PBMC中分离CD14+单核细胞，并在同一天用含有Vpx的慢病毒感染，接着用GM-CSF或M-CSF分化7天，此时超过95％的巨噬细胞关于转基因表达呈阳性。
[0229] GM-CSF分化
[0230] 具有Vpx的慢病毒包装是成功感染GM-CSF来源的巨噬细胞所必需的。不用病毒、用未包装Vpx的GFP慢病毒或包装有Vpx的GFP慢病毒对巨噬细胞或单核细胞进行感染，然后在图表右侧指出的时间点，通过流式细胞术对GFP和HLA-DR(图11A)或CD11b(图11B)的共表达进行分析，示出了MMC-单核细胞(第0天感染)和巨噬细胞(第7天感染)的感染。
[0231] M-CSF分化图表
[0232] 具有Vpx的慢病毒包装是成功感染M-CSF来源的巨噬细胞所必需的。在CD14+分离后第7天，不用病毒、用未包装Vpx的GFP慢病毒或包装有Vpx的GFP慢病毒对巨噬细胞进行感染，然后在第21天通过流式细胞术，对GFP和HLA-DR(图12A)或CD11b(图12B)的共表达进行分析。
[0233] 从外周血单核细胞(PBMC)中分离CD14+单核细胞
[0234] 从Bloodworks Northwest(西雅图儿童研究所IRB#14412)获得健康供体全血和单采血液成分术产物(apheresis product)。使用标准方案15，用Ficoll-Paque密度梯度(GE Healthcare)分离PBMC。根据制造商的方案，用EasySep Human CD14阳性选择试剂盒(Stemcell Technologies)从PBMC中纯化CD14+单核细胞(Noble PB，Cutts JH.Separation of blood leukocytes by Ficoll gradient.Can Vet J 1967；8:110-111；以引用的方式将其整体并入本文)。
[0235] 巨噬细胞分化
[0236] 在25ng/mL M-CSF或10ng/mL GM-CSF(R&D Systems)的存在下，在37℃于5％CO2下以不超过250,000个细胞/cm2的密度，将分离的CD14+单核细胞铺于组织培养物处理的塑料皿上(Corning)的巨噬细胞培养基(补充有10％FBS(Hyclone)的RPMI1640培养基(Gibco))中。铺板后72小时，将一半的培养基更换为补充有M-CSF或GM-CSF(终浓度分别为25ng/ml和10ng/ml)的新鲜巨噬细胞培养基。分离后6天，认为单核细胞完全分化为巨噬细胞，并且在用0.25％胰蛋白酶(Gibco)脱落并温和刮擦后，可根据需要重新铺板。
[0237] 树突状细胞分化
[0238] 按照Spadaro等的方案，将分离的CD14+单核细胞分化成树突状细胞(DC)(Spadaro M，Montone M，Arigoni M等，Recombinant human lactoferrin induces human and mouse dendritic cell maturation via Toll-like receptors 2and 4.FASEB J 2014；28:416-429；以引用的方式将其整体并入本文)。简言之，将CD14+细胞铺于补充有10％FBS、100ng/mL GM-CSF和50ng/mL IL-4(R&D Systems)的RPMI-1640中。替换培养基，并在72小时后添加新的细胞因子。
[0239] 慢病毒载体
[0240] 除非另有说明，所有构建体均使用epHIV7或epHIV7.2慢病毒骨架(Michael Jensen博士(西雅图儿童研究所)的赠送物)。在epHIV7中，pHIV7的CMV启动子(Yam PY，Li S,Wu J等，Design of HIV vectors for efficient gene delivery into human
hematopoietic cells.Mol Ther 2002；5:479-484；以引用的方式将其整体并入本文)已被替换为EF1α启动子。对于epHIV7.2，EF1α启动子已替换为最小EF1α(缺乏HTLV-1结构域)，并且用于氨苄青霉素抗性的基因已被更换成用于卡那霉素抗性的基因。绿色荧光蛋白-萤火虫萤光素酶(GFP-ffluc)融合蛋白已在以前进行了描述(Brown CE，Starr R，Martinez C等，Recognition and killing of brain tumor stem-like initiating cells by CD8+cytolytic T cells.Cancer Res 2009；69:8886-8893；以引用的方式将其整体并入本文)。
epHIV7骨架中的GFP-ffluc是来自Michael Jensen博士的赠送物。绿色荧光蛋白-萤火虫萤光素酶(GFP-ffluc)融合蛋白由SEQ ID NO:29中所示的序列进行编码
hematopoietic cells.Mol Ther 2002；5:479-484；以引用的方式将其整体并入本文)已被替换为EF1α启动子。对于epHIV7.2，EF1α启动子已替换为最小EF1α(缺乏HTLV-1结构域)，并且用于氨苄青霉素抗性的基因已被更换成用于卡那霉素抗性的基因。绿色荧光蛋白-萤火虫萤光素酶(GFP-ffluc)融合蛋白已在以前进行了描述(Brown CE，Starr R，Martinez C等，Recognition and killing of brain tumor stem-like initiating cells by CD8+cytolytic T cells.Cancer Res 2009；69:8886-8893；以引用的方式将其整体并入本文)。
epHIV7骨架中的GFP-ffluc是来自Michael Jensen博士的赠送物。绿色荧光蛋白-萤火虫萤光素酶(GFP-ffluc)融合蛋白由SEQ ID NO:29中所示的序列进行编码
[0241]EGFP:ffluc-T2A-CD19t由SEQ ID NO:34中所示的序列进行编码
[0242]epHIV7.2慢病毒载体和epHIV7:GFP-ffluc，dnTGFBRII-t2a-Her2tg，以及sTGFBRII-
t2a-Her2tg是来自Michael Jensen博士的友好赠送物。T2A-sTGFBRII由SEQ ID NO:32中所示的序列进行编码
t2a-Her2tg是来自Michael Jensen博士的友好赠送物。T2A-sTGFBRII由SEQ ID NO:32中所示的序列进行编码
[0243]通过Gibson克隆到HIV7.2的NheI/NotI中，来创建mCherry构建体。为了生产先以前描
述的可溶性转化生长因子β受体II(sTβRII)构建体(Rowland-Goldsmith MA，Maruyama H，Kusama T等，Soluble type II transforming growth factor-beta(TGF-beta)receptor inhibits TGF-beta signaling in COLO-357pancreatic cancer cells in vitro and attenuates tumor formation.Clin Cancer Res 2001；7:2931-2940.；以引用的方式将其整体并入本文)，将人TGFβRII同种型A的胞外部分(aa 1-159；NCBI登录#NP_001020018.1)克隆到epHIV7.2的NheI/NotI位点中。通过Gibson克隆在sTβRII基因的上游(由T2A序列隔开)插入截短的CD19(CD19t)(Sato S，Miller AS，Howard MC等，Regulation of B
lymphocyte development and activation by the CD19/CD21/CD81/Leu13complex
requires the cytoplasmic domain of CD19.J Immunol1997；159:3278-3287；以引用的方式将其整体并入本文)。IL-21质粒购自Origene(质粒RC215235，含有NCBI RefSeq NM_
021803的编码序列)，并将其克隆到epHIV7.2的NheI/NotI中。通过Gibson克隆在IL-21基因的下游(由T2A序列隔开)插入CD19t(Sato S，Miller AS，Howard MC等，Regulation of B lymphocyte development and activation by the CD19/CD21/CD81/Leu 13complex
requires the cytoplasmic domain of CD19.J Immunol 1997；159:3278-3287；以引用的方式将其整体并入本文)。IL-21-T2A序列
述的可溶性转化生长因子β受体II(sTβRII)构建体(Rowland-Goldsmith MA，Maruyama H，Kusama T等，Soluble type II transforming growth factor-beta(TGF-beta)receptor inhibits TGF-beta signaling in COLO-357pancreatic cancer cells in vitro and attenuates tumor formation.Clin Cancer Res 2001；7:2931-2940.；以引用的方式将其整体并入本文)，将人TGFβRII同种型A的胞外部分(aa 1-159；NCBI登录#NP_001020018.1)克隆到epHIV7.2的NheI/NotI位点中。通过Gibson克隆在sTβRII基因的上游(由T2A序列隔开)插入截短的CD19(CD19t)(Sato S，Miller AS，Howard MC等，Regulation of B
lymphocyte development and activation by the CD19/CD21/CD81/Leu13complex
requires the cytoplasmic domain of CD19.J Immunol1997；159:3278-3287；以引用的方式将其整体并入本文)。IL-21质粒购自Origene(质粒RC215235，含有NCBI RefSeq NM_
021803的编码序列)，并将其克隆到epHIV7.2的NheI/NotI中。通过Gibson克隆在IL-21基因的下游(由T2A序列隔开)插入CD19t(Sato S，Miller AS，Howard MC等，Regulation of B lymphocyte development and activation by the CD19/CD21/CD81/Leu 13complex
requires the cytoplasmic domain of CD19.J Immunol 1997；159:3278-3287；以引用的方式将其整体并入本文)。IL-21-T2A序列
[0244]用正向引物SEQ ID NO:14
和反向引物SEQ ID NO:15
来结束。还可制造细胞以表达EGFRt-P2A-可溶性VEGF受体(由SEQ ID NO:28中所示的序列编码)。LentiCRISPRv2载体为来自Feng Zhang的赠送物(Addgene质粒#52961)，并使用标准方案，将IL-10 和PD-L 1
的向导序列插入BsmB1位点(Sanjana NE，Shalem O，Zhang F.Improved
vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.Nat Methods 2014；11:
783-784；和Shalem O，Sanjana NE，Hartenian E等，Genome-scale CRISPR-Cas9knockout screening in human cells.Science 2014；343:84-87；将这两篇参考文献整体并入本文)。插入截短的表皮生长因子受体(EGFRt)(Wang X，Chang WC，Wong CW等，A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection,in vivo tracking,and ablation of engineered cells.Blood 2011；118:1255-1263；以引用的方式将其整体并入本文)表位标签，以替换嘌呤霉素抗性序列。为了生产可溶性TGFβRII(sTGFβRII)构建体，人TGFβRII同种型A的胞外部分(aa 1-166；NCBI登录#NP_001020018.1)购自Gen9，并将其克隆到
epHIV7.2的NheI/NotI位点中。IL-21质粒购自Origene(质粒RC215235，含有NCBI RefSeq NM_021803的编码序列)，并将其克隆到epHIV7.2的NheI/NotI中。
和反向引物SEQ ID NO:15
来结束。还可制造细胞以表达EGFRt-P2A-可溶性VEGF受体(由SEQ ID NO:28中所示的序列编码)。LentiCRISPRv2载体为来自Feng Zhang的赠送物(Addgene质粒#52961)，并使用标准方案，将IL-10 和PD-L 1
的向导序列插入BsmB1位点(Sanjana NE，Shalem O，Zhang F.Improved
vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.Nat Methods 2014；11:
783-784；和Shalem O，Sanjana NE，Hartenian E等，Genome-scale CRISPR-Cas9knockout screening in human cells.Science 2014；343:84-87；将这两篇参考文献整体并入本文)。插入截短的表皮生长因子受体(EGFRt)(Wang X，Chang WC，Wong CW等，A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection,in vivo tracking,and ablation of engineered cells.Blood 2011；118:1255-1263；以引用的方式将其整体并入本文)表位标签，以替换嘌呤霉素抗性序列。为了生产可溶性TGFβRII(sTGFβRII)构建体，人TGFβRII同种型A的胞外部分(aa 1-166；NCBI登录#NP_001020018.1)购自Gen9，并将其克隆到
epHIV7.2的NheI/NotI位点中。IL-21质粒购自Origene(质粒RC215235，含有NCBI RefSeq NM_021803的编码序列)，并将其克隆到epHIV7.2的NheI/NotI中。
[0245] 慢病毒生产
[0246] 所有病毒制备均在BSL-2层流净化罩中进行。pcVpx和pMDL-X是Landau实验室的友好赠送物(Bobadilla，Gene Therapy 2013)(Bobadilla S，Sunseri N，Landau NR.Efficient transduction of myeloid cells by an HIV-1-derived lentiviral
vector that packages the Vpx accessory protein.Gene Ther 2013；20:514-520；以引用的方式将其整体并入本文)。RSV-Rev购自Addgene(质粒#12253)。pCMV-G是来自Michael Jensen博士的赠送物(Yee JK，Miyanohara A，LaPorte P等，A general method for the generation of high-titer,pantropic retroviral vectors:highly efficient
infection of primary hepatocytes.Proc Natl Acad Sci U S A1994；91:9564-9568；以引用的方式将其整体并入本文)。293T细胞购自ATCC(CRL-3216)，并使用下面传代20次的
293T细胞。以每15cm皿107个细胞，将293T细胞铺于293T培养基(补充有10mM HEPES、1％Glutamax(Gibco)和10％FBS的DMEM)中。过夜生长后，使用CalPhos哺乳动物转染试剂盒(Clontech)，用pcVpx(4.6μg)、pMDL-X(13.5μg)、RSV-Rev(6.8μg)、pCMV-G(9.5μg)和转基因载体(37.8μg)转染各板。16小时后，将培养基换成新鲜的293T培养基。在48小时收集含有病毒的上清液，接着用0.45μm过滤器过滤以移除碎片，并在4℃下，在Beckman Coulter Optima L-90K超速离心机(使用SW-28转子)中以108,000×g超速离心90分钟。将病毒沉淀重新悬浮于无血清的DMEM中，通过Quick Titer慢病毒效价试剂盒(用于慢病毒相关p24的ELISA(Cell Biolabs))确定完整的慢病毒颗粒(LP)的浓度。
vector that packages the Vpx accessory protein.Gene Ther 2013；20:514-520；以引用的方式将其整体并入本文)。RSV-Rev购自Addgene(质粒#12253)。pCMV-G是来自Michael Jensen博士的赠送物(Yee JK，Miyanohara A，LaPorte P等，A general method for the generation of high-titer,pantropic retroviral vectors:highly efficient
infection of primary hepatocytes.Proc Natl Acad Sci U S A1994；91:9564-9568；以引用的方式将其整体并入本文)。293T细胞购自ATCC(CRL-3216)，并使用下面传代20次的
293T细胞。以每15cm皿107个细胞，将293T细胞铺于293T培养基(补充有10mM HEPES、1％Glutamax(Gibco)和10％FBS的DMEM)中。过夜生长后，使用CalPhos哺乳动物转染试剂盒(Clontech)，用pcVpx(4.6μg)、pMDL-X(13.5μg)、RSV-Rev(6.8μg)、pCMV-G(9.5μg)和转基因载体(37.8μg)转染各板。16小时后，将培养基换成新鲜的293T培养基。在48小时收集含有病毒的上清液，接着用0.45μm过滤器过滤以移除碎片，并在4℃下，在Beckman Coulter Optima L-90K超速离心机(使用SW-28转子)中以108,000×g超速离心90分钟。将病毒沉淀重新悬浮于无血清的DMEM中，通过Quick Titer慢病毒效价试剂盒(用于慢病毒相关p24的ELISA(Cell Biolabs))确定完整的慢病毒颗粒(LP)的浓度。
[0247] 部分分化的巨噬细胞和DC的高MOI转导
[0248] 为了确定包装有Vpx或未包装Vpx的慢病毒的效价单位(TU)/mL，用一系列浓度的编码GFP-ffluc的病毒转导H9细胞，并通过流式细胞术进行分析。TU/mL＝(转导时的H9细胞#)×(GFP阳性细胞的比例)/(添加的病毒的体积(mL))。该值用于确定分化第3天时关于树突状细胞或巨噬细胞的感染的MOI(Breckpot K，Dullaers M，Bonehill A等，Lentivirally transduced dendritic cells as a tool for cancer immunotherapy.J Gene Med 2003；5:654-667；以引用的方式将其整体并入本文)。向病毒添加如上的新鲜培养基和细胞因子。添加鱼精蛋白硫酸盐(100μg/mL)来增强通过未包装Vpx的慢病毒的转导。
[0249] 单核细胞或巨噬细胞的慢病毒感染
[0250] 在巨噬细胞培养基(补充有适用于单核细胞的同时分化的M-CSF或GM-CSF)中，用20个-1000个LP/细胞感染新鲜分离的单核细胞或分化的巨噬细胞。培养基每三天更新一次。
[0251] U87细胞培养
[0252] 野生型U87胶质瘤细胞系购自ATCC(HTB-14)。稳定转导有epHIV7:GFP-ffluc的U87细胞是来自Michael Jensen博士实验室的赠送物。在37℃、5％CO2下，将所有U87在补充有1％Glutamax和10％FBS的DMEM中培养，并在形成神经球之前传代。不使用超过五代的表达GFP-ffluc的U87，并在使用前，使用荧光显微镜对GFP表达进行验证。
[0253] 慢病毒拷贝数分析
[0254] 为了确定每个细胞的慢病毒整合数，在分化第0天或在10ng/mL GM-CSF中分化7天后，用100个或250个编码GFP-ffluc的LP/细胞转导CD14+细胞。在分化的第10天，使用Qiagen DNA Mini试剂盒对基因组DNA进行分离。使用2×Power SYBR Green Master Mix(Thermo Fisher)在BioRad CFX96实时系统上，进行关于WPRE和白蛋白基因的qPCR。通过将Cq值与从已知浓度的质粒DNA的各自标准曲线获得的值进行比较，来确定慢病毒(WPRE)和基因组DNA(白蛋白)的皮克(Picogram)。每个细胞的病毒整合＝2×(pg WPRE)/(pg ALB)。
[0255]
[0256] 流式细胞术
[0257] 通过用Versene(Gibco)处理，接着温和刮擦，来收获用于流式细胞术的GEM。将脱落的细胞用Fc Block(BD Biosciences)处理以清除非特异性抗体结合，用荧光团缀合的抗体进行染色，用2％多聚甲醛固定，并用FACS DIVA软件在BD LSR Fortessa流式细胞仪上运行。用FlowJo for Mac，v10(Treestar)进行分析。抗人抗体包括CD16-V500、CD163-Alexa647、和CD80-BV786(BD Biosciences)、和CD11b-APC-Cy7、CD19-APC、HLA-DR-BV605或HLA-DR-APC、CD45-BV785、和PD-L1-PECy7(Biolegend)，以及Live/Dead可固定蓝色染色剂(Thermo Fisher)。使用EZ-link生物素化试剂盒(Thermo Scientific)将爱必妥(Bristol-Myers Squibb)生物素化，并与链霉亲和素-FITC(Biolegend)联合使用。
[0258] 免疫组织化学结果示于图21中。来自注射U87并仅在5天后模拟注射PBS的小鼠的代表性切片示于图21A中。来自注射U87细胞并在5天后注射表达CD45的GEM的小鼠的代表性切片示于图21B中。
[0259] 病毒诱导的细胞因子产生
[0260] 从健康供体PBMC中分离CD14+单核细胞，用0个或250个LP/细胞mCherry Vpx+慢病毒进行转导，并使其在GM-CSF中分化7天。在调理24小时后，在转导后24小时和7天以每500,000个细胞1mL的比例收集培养基。然后，在含有IL-12(p40/p70)、TNF和IFNα(Life
Technologies)的Luminex试剂盒上使用未经稀释的培养基样品。
Technologies)的Luminex试剂盒上使用未经稀释的培养基样品。
[0261] Surveyor分析
[0262] 用1000个LP/细胞的含有对照(无gRNA)、IL-10gRNA或PD-L1gRNA的Vpx+LentiCRISPRv2病毒感染GM-CSF分化的巨噬细胞。按照制造商的方案，培养5天后，使用DNeasy试剂盒(Qiagen)分离基因组DNA。用以下引物组对Cas9切割位点周围的基因组区域进行PCR扩增，并根据制造商的方案进行Surveyor分析(Integrated DNA Technologies)。
[0263] IL-10PCR引物：
[0264]
[0265] PD-L1PCR引物：
[0266]
[0267] PD-L1表达下调的验证
[0268] 用1000LP个/细胞的含有对照(无gRNA)或PD-L1gRNA的Vpx+LentiCRISPRv2-EGFRt病毒感染GM-CSF分化的巨噬细胞。培养6天后，用100ng/mL脂多糖(LPS)和20ng/mL干扰素γ(IFNγ)刺激GEM 24小时，并用抗-PD-L1和爱必妥进行用于流式细胞术的染色，从而基于表位标签EGFRt的表达来确定转导效率。
[0269] IL-10表达下调的验证
[0270] 用1000LP个/细胞的含有对照(无gRNA)或IL-10gRNA的Vpx+LentiCRISPRv2:EGFRt病毒感染GM-CSF分化的巨噬细胞。培养6天后，以1mL/500,000个细胞用100ng/mL LPS和20ng/mL IFNγ刺激GEM24小时。收集条件培养基，并在Bio-Plex 200仪器上将未经稀释的培养基用于Bio-Rad IL-10BioPlex Pro分析。用爱必妥对细胞进行用于流式细胞术的染色，从而基于表位标签EGFRt的表达确定转导效率。
[0271] 可溶性TGFβRII表达的验证
[0272] 为了检验sTβRII的表达，在第7天用250个LP/细胞的编码CD19t-T2A-sTβRII
[0273]或CD19t载体对照的慢病毒转导GM-CSF分化的巨噬细胞。在转导后第5、6和7天，以1mL/
500,000个细胞调理24小时后收集培养基。通过人TGFβRII DuoSet ELISA(R&D Systems)对分泌的蛋白进行检测。T2A-CD19t由SEQ ID NO:30中所示的序列进行编码
500,000个细胞调理24小时后收集培养基。通过人TGFβRII DuoSet ELISA(R&D Systems)对分泌的蛋白进行检测。T2A-CD19t由SEQ ID NO:30中所示的序列进行编码
[0274]
[0275]CD19t表位标签由SEQ ID NO:31中所示的序列进行编码
[0276]
[0277] IL-10表达的验证
[0278] 用1000个LP/细胞的含有对照(无gRNA)或IL-10gRNA的Vpx+LentiCRISPRv2病毒感染GM-CSF分化的巨噬细胞。还用1000个LP/细胞感染单核细胞，同时用GM-CSF使其分化。在培养6天后，将GEM重铺以包含相等的细胞数(24孔板每孔100,000个-200,000个)，并用100ng/mL LPS和20ng/mL IFNγ刺激48小时。收集条件培养基，并在Bio-Plex 200仪器上将未稀释的培养基用于Bio-Rad IL-10BioPlex Pro分析。
[0279] IL-10Bioplex分析
[0280] 用1000个LP/细胞的含有对照(无gRNA)或IL-10gRNA的Vpx+lentiCRISPRv2病毒感染GM-CSF分化的巨噬细胞。还用1000个LP/细胞感染单核细胞，同时使其分化。培养6天后，将GEM重铺以包含相等的细胞数(24孔板每孔100,000个-200,000个)，并用100ng/mL LPS/20ng/mL IFNγ刺激48小时。收集条件培养基，并在Bio-Plex 200仪器上将未稀释的培养基用于Bio-Rad IL-10BioPlex Pro分析。
[0281] sTGFβRII表达的验证
[0282] 将TGFBRII构建体和IL-21质粒克隆到先前描述的HIV7.2骨架中。分别使用TGFβR duoset试剂盒DY241(R&D)或IL-21Bioplex pro试剂盒(Biorad)，对GEM-条件培养基中的可溶性TGFβ受体或IL-21表达进行检测，所述培养基以24小时的间隔收集。对于这些分析，在分化的第7天转导GM-CSF来源的巨噬细胞。
[0283] 为检验可溶性TGFβ受体的表达，在第6天以每孔500,000个细胞将处于700μL中的GM-CSF分化的巨噬细胞播种于12孔板中。在第7天用250个或500个LP/细胞的编码sTGFβRII的慢病毒对细胞进行转导。在转导后第2天、第5天、第12天和第15天，在调理24小时后收集培养基。通过人TGFβRII DuoSet ELISA(R&D)对分泌的蛋白质进行检测。
[0284] IL-21表达的验证
[0285] 在一些可选方式中，为了检验IL-21的表达，在第7天用250个LP/细胞的编码IL-21-T2A-CD19t或CD19t载体对照的慢病毒对GM-CSF分化的巨噬细胞进行转导。在转导后7天(分化的第14天)，以1mL/500,000个细胞调理24小时后，收集培养基。使用BioPlex Pro分析(Bio-Rad)对IL-21分泌进行检测。
[0286] 在一些可选方式中，为了检验IL-21的表达，在分离后第6天，将GM-CSF分化的巨噬细胞播种，并在24孔板中以每孔200,000个细胞使其在500μL巨噬细胞培养基中进行分化。在第7天用1000个LP/细胞的编码IL-21的慢病毒转导细胞，在转导后第6天(分化的第13天)，在调理24小时后收集培养基。使用BioPlex Pro分析(Bio-Rad)对IL-21分泌进行检测。
[0287] 用epHIV7.2和LentiCRISPRv2Vpx+慢病毒共感染
[0288] 用250个LP/细胞的epHIV7.2:CD19t载体对照(SEQ ID NO:12)、CD19t-T2A-sTβRII或IL-21-T2A-CD19t病毒，并同时用1000个LP/细胞的lentiCRISPRv2:EGFRt载体对照、PD-L1gRNA-EGFRt或IL-10gRNA-EGFRt病毒，对GM-CSF分化的巨噬细胞进行感染。将用于表位标签的流式细胞术用来确定细胞双阳性的百分比，并且如上对各因子进行分析。
[0289] LPS/IFNγ诱导的因子的检测
[0290] 为了确定由脂多糖/干扰素-γ(LPS/IFNγ)刺激引发的白细胞介素、细胞因子、趋化因子和生长因子的纵向表达，在第6天以每孔200,000个细胞将GM-CSF分化的巨噬细胞播种到24孔板中。在第7天，在500μL培养基中用100ng/mL LPS、20ng/mL IFNγ或LPS+IFNγ刺激巨噬细胞18小时。在18小时(第1天)收集条件培养基，并更换为不含细胞因子的新鲜培养基。每24小时收获培养基，共10天。使用Luminex Human 30-plex细胞因子试剂盒(Life Tech)对细胞因子释放进行检测。
[0291] 动物研究
[0292] 所有小鼠研究均在西雅图儿童IACUC(方案#15181)的监督下进行，并根据研究所政策努力使使用最小化。出现继发于肿瘤植入的症状(包括恶病质、嗜睡、后肢麻痹)后、或当它们达到其原始体重的80％时，对动物进行安乐死。八周龄雄性NOD.Cg-Prkdcscid tm1WjlIl2rg /SzJ(NSG)小鼠购自Jackson实验室。将氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉的动物固定在立体定向仪(Stoelting)中，在覆盖颅骨的皮肤上做出0.5cm切口，并于前囟的前面0.5mm、侧面
2mm处钻出钻孔。以1μL/分钟的速率，在硬脑膜下2.5mm和2.25mm处以2μL的体积注射200,
000个野生型U87细胞或表达GFP-ffluc的U87细胞，每个位置1μL。伤口闭合后，小鼠接受乳酸林格氏溶液(用于流体补偿)和丁丙诺啡(作为镇痛药)。除了在脑硬膜下2.5mm、2.35mm和
2.25mm的3个步骤中以3μL总体积注射150,000个GEM外，用于GEM注射的手术与用于U87的手术类似。每周三次进行表达ffluc的GEM或U87的生物发光成像。将小鼠用异氟烷麻醉，腹膜内或皮下注射150μL的28.57mg/mL D-萤光素溶液(Perkin Elmer)到颈背中。用Xenogen IVIS光谱成像系统(Perkin Elmer)和Living图像软件(Perkin Elmer)(用于分析数据)，对生物发光图像进行收集。
2mm处钻出钻孔。以1μL/分钟的速率，在硬脑膜下2.5mm和2.25mm处以2μL的体积注射200,
000个野生型U87细胞或表达GFP-ffluc的U87细胞，每个位置1μL。伤口闭合后，小鼠接受乳酸林格氏溶液(用于流体补偿)和丁丙诺啡(作为镇痛药)。除了在脑硬膜下2.5mm、2.35mm和
2.25mm的3个步骤中以3μL总体积注射150,000个GEM外，用于GEM注射的手术与用于U87的手术类似。每周三次进行表达ffluc的GEM或U87的生物发光成像。将小鼠用异氟烷麻醉，腹膜内或皮下注射150μL的28.57mg/mL D-萤光素溶液(Perkin Elmer)到颈背中。用Xenogen IVIS光谱成像系统(Perkin Elmer)和Living图像软件(Perkin Elmer)(用于分析数据)，对生物发光图像进行收集。
[0293] 脑肿瘤异种移植物中的人CD45+细胞的免疫组织化学(IHC)
[0294] 达到定义的实验终点(在上文)后，用4％异氟烷将动物深度麻醉，打开胸腔，通过心脏和脉管系统灌注15mL PBS，接着灌注15mL 10％中性缓冲福尔马林(NBF)。使用标准方案对小鼠脑进行收获，福尔马林固定和石蜡包埋。为了鉴定肿瘤异种移植物内的注射的GEM，用抗人CD45(clone HI30，BioLegend)以1:100稀释度对脑切片进行免疫染色，并在Ventana Ultra自动化平台上用iVIEW DAB检测试剂盒进行检测。用带有DS-Ri1彩色照相机的20×PlanApo物镜(0.75NA)，在Nikon Eclipse Ci上获取图像。使用Nikon Elements软件将平铺扫描图像拼合在一起。
[0295] 来自脑异种移植物的人细胞的分离和流式细胞术
[0296] 达到确定定义的实验终点(在上文)后，用4％异氟烷将动物深度麻醉，打开胸腔，通过心脏和脉管系统灌注15mL PBS。剖开脑和肿瘤，带有1mm所分离的周围正常组织。用人肿瘤解离试剂盒(Miltenyi)进行脑肿瘤的解离，接着使用制造商的方案，用小鼠细胞消耗试剂盒(Miltenyi)移除小鼠细胞。如上所述，对人细胞的单细胞悬浮液进行染色以用于流式细胞术。
[0297] 统计和可重复性
[0298] 除非另有说明，所有实验均使用从不同供体分离的巨噬细胞进行最少三次。在Prism软件(GraphPad)中分析结果，并进行恰当的检验(配对T检验或ANOVA)。统计学显著性(p<0.05)用星号表示。
[0299] 单核细胞来源的巨噬细胞能够稳定表达慢病毒编码的基因
[0300] 近年来，使用慢病毒稳定转导T细胞以用于癌症免疫疗法已成为常规。相反，用于感染髓系细胞的标准系统尚不存在。最近的报道已经证明，当慢病毒颗粒包装有Vpx时，使用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4由单核细胞来源的树突状细胞(DC)或仅使用GM-CSF分化的促炎性巨噬细胞可被高效转导(Bobadilla S，Sunseri N，Landau NR.Efficient transduction of myeloid cells by an HIV-1-derived lentiviral
vector that packages the Vpx accessory protein.Gene Ther 2013；20:514-520；和Sunseri N，O'Brien M，Bhardwaj N等，Human immunodeficiency virus type 1modified to package Simian immunodeficiency virus Vpx efficiently infects macrophages and dendritic cells.J Virol 2011；85:6263-6274；以引用的方式将两者整体并入本文)。之前的研究报道，如果在分化过程中DC较早地暴露于高感染复数(MOI)，可在没有Vpx的情况下成功转导DC(Breckpot K，Dullaers M，Bonehill A等，Lentivirally transduced dendritic cells as a tool for cancer immunotherapy.J Gene Med 2003；5:654-667；
以及Chinnasamy N，Chinnasamy D，Toso JF等，Efficient gene transfer to human peripheral blood monocyte-derived dendritic cells using human
immunodeficiency virus type 1-based lentiviral vectors.Hum Gene Ther 2000；11:
1901-1909；以引用的方式将两者整体并入本文)。为了确定Vpx是否是成功转导单核细胞来源的巨噬细胞所必需的，使用标准慢病毒生产方案，使epHIV7:GFP-ffluc(目前用于临床试验中的慢病毒骨架，NCT01683279，NCT02311621)包装有Vpx，以及未包装有Vpx。使用GM-CSF和IL-4、或仅使用GM-CSF分别将分离自健康供体PBMC的CD14+细胞分化为DC或巨噬细胞。分离并开始分化后三天，对细胞进行计数，并将其重新铺于含有细胞因子和编码GFP-ffluc的慢病毒(包装或未包装有Vpx)的新鲜培养基中。感染不含Vpx的病毒的细胞还接受100ug/mL鱼精蛋白硫酸盐，以帮助病毒进入。在体外分化六天后，通过流式细胞术对细胞进行分析。
如在DC25和100ug/mL鱼精蛋白硫酸盐中证明的，使用为15的MOI，我们观察到20％的DC和
60％的巨噬细胞表达慢病毒编码的GFP(图28A和图28B)。然而，高病毒剂量和高浓度鱼精蛋白硫酸盐的组合对巨噬细胞生活力具有不利影响，检测到超过30％的细胞对标记死亡细胞或濒临死亡的细胞染料呈染色阳性(图28B)。对DC而言，没有观察到相同作用(图28A)。相比之下，当慢病毒包装有Vpx时，MOI为1足以感染几乎100％的第3天巨噬细胞，而对生活力没有负面影响。出于这些原因，对于其余研究选择使用Vpx+慢病毒开展。
vector that packages the Vpx accessory protein.Gene Ther 2013；20:514-520；和Sunseri N，O'Brien M，Bhardwaj N等，Human immunodeficiency virus type 1modified to package Simian immunodeficiency virus Vpx efficiently infects macrophages and dendritic cells.J Virol 2011；85:6263-6274；以引用的方式将两者整体并入本文)。之前的研究报道，如果在分化过程中DC较早地暴露于高感染复数(MOI)，可在没有Vpx的情况下成功转导DC(Breckpot K，Dullaers M，Bonehill A等，Lentivirally transduced dendritic cells as a tool for cancer immunotherapy.J Gene Med 2003；5:654-667；
以及Chinnasamy N，Chinnasamy D，Toso JF等，Efficient gene transfer to human peripheral blood monocyte-derived dendritic cells using human
immunodeficiency virus type 1-based lentiviral vectors.Hum Gene Ther 2000；11:
1901-1909；以引用的方式将两者整体并入本文)。为了确定Vpx是否是成功转导单核细胞来源的巨噬细胞所必需的，使用标准慢病毒生产方案，使epHIV7:GFP-ffluc(目前用于临床试验中的慢病毒骨架，NCT01683279，NCT02311621)包装有Vpx，以及未包装有Vpx。使用GM-CSF和IL-4、或仅使用GM-CSF分别将分离自健康供体PBMC的CD14+细胞分化为DC或巨噬细胞。分离并开始分化后三天，对细胞进行计数，并将其重新铺于含有细胞因子和编码GFP-ffluc的慢病毒(包装或未包装有Vpx)的新鲜培养基中。感染不含Vpx的病毒的细胞还接受100ug/mL鱼精蛋白硫酸盐，以帮助病毒进入。在体外分化六天后，通过流式细胞术对细胞进行分析。
如在DC25和100ug/mL鱼精蛋白硫酸盐中证明的，使用为15的MOI，我们观察到20％的DC和
60％的巨噬细胞表达慢病毒编码的GFP(图28A和图28B)。然而，高病毒剂量和高浓度鱼精蛋白硫酸盐的组合对巨噬细胞生活力具有不利影响，检测到超过30％的细胞对标记死亡细胞或濒临死亡的细胞染料呈染色阳性(图28B)。对DC而言，没有观察到相同作用(图28A)。相比之下，当慢病毒包装有Vpx时，MOI为1足以感染几乎100％的第3天巨噬细胞，而对生活力没有负面影响。出于这些原因，对于其余研究选择使用Vpx+慢病毒开展。
[0301] 因为所有随后的实验都评价了不同病毒载量的GEM表达，其无法使用基于传统流式细胞术的滴定进行归一化，基于病毒相关p24的量对病毒剂量进行标准化，其中1ng p24相当于1.25×107个慢病毒颗粒(LP)。为了确定持续实现高转基因表达所需的含有Vpx的病毒的最小剂量，用一系列每细胞慢病毒颗粒(LP/细胞)在分化的第7天，对在GM-CSF中分化的促炎性巨噬细胞(图25A，代表3个独立实验)和在M-CSF中分化的抗炎性巨噬细胞(图29A)两者进行转导。在培养另外7天后对GFP表达进行评价(图25A，图29A)。发现在测试的所有剂量下，在用含有Vpx的病毒粒子感染后，这两种表型均具有相似的转导效率，在低至250个LP/细胞的浓度下接近100％。重要的是，用GM-CSF分化后用250个LP/细胞感染不会显著影响生活力(图25C)。在测试的最高浓度(1000个LP/细胞)下，在GM-CSF(5.09％)和M-CSF(14.6％)分化的巨噬细胞中，未包装有Vpx的病毒粒子均具有非常差的转导效率(图25A，图29A)。
[0302] 治疗患有复发性疾病的患者的挑战之一是单采血液成分术和自体细胞疗法的递送之间的时间，对于CAR T细胞产物而言该时间可能为几天至几周(Kaiser AD，Assenmacher M，Schroder B等，Towards a commercial process for the manufacture of genetically modified T cells for therapy.Cancer Gene Ther 2015；22:72-78；以引用的方式将其整体并入本文)。为了确定是否可以减少为患者开发临床单核细胞来源的细胞产物的时间和成本，测试了是否可以同时对新鲜分离的CD14+单核细胞进行转导和分化。发现在GM-CSF或M-CSF中选择和诱导时(第0天)，单核细胞的转导产生与相继分化和转导类似的剂量依赖性的GFP+巨噬细胞比例(图25B，图29B)。然而，这种措施对巨噬细胞生活力具有显著影响。尽管相对于CD14+细胞的原始数量，在没有病毒的情况下在GM-CSF或M-CSF中的分化产生大约20％-30％的产率(图25E)，在GM-CSF中与用250LP个/细胞感染结合的分化进一步使产率减少了49.7％，在M-CSF分化的巨噬细胞中减少了67.4％(分别为图
25D，图29C)。
25D，图29C)。
[0303] 病毒转导的过继性细胞疗法的成功临床发展应该平衡效力和安全性。高转基因表达和转导效率通常与慢病毒整合到宿主细胞基因组中的高比率有关。控制整合比率很重要，因为增加的载体拷贝数使插入诱变的可能性或转基因合成的毒性水平增加。为了确定每细胞慢病毒拷贝数，从已用编码GFP-ffluc的含有Vpx的慢病毒在分化第0天或者在分化7天后对其进行转导的巨噬细胞中分离基因组DNA。在代表性实验中，当分别用250个LP/细胞或100个LP/细胞转导作为巨噬细胞的细胞时(图30A)，发现每细胞慢病毒拷贝数为34和22，当转导作为单核细胞的细胞时，每细胞慢病毒拷贝数为18和10(图30B)。
[0304] 单核细胞来源的巨噬细胞能够稳定表达慢病毒编码的基因
[0305] 先前的报道证明，当慢病毒颗粒包装有Vpx时，能够以高效率转导单核细胞来源的树突状细胞(使用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4分化)或促炎性巨噬细胞(仅使用GM-CSF分化)。为了确定这一系统是否适用于使用巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)分化为抗炎性群体的单核细胞，使用标准慢病毒生产方案，使epHIV7:GFP-ffluc(目前用于临床试验中的慢病毒骨架(NCT01683279，NCT02311621))包装有Vpx。用一系列慢病毒颗粒(LP)/细胞，在存在GM-CSF或M-CSF的情况下培养七天后，对单核细胞来源的巨噬细胞进行转导，并在培养另外的7天后对GFP表达进行评价(图13A，图13B)。发现在所有测试剂量下，在用含有Vpx的病毒粒子感染后，这两种表型均具有相似的转导效率，在低至250个LP/细胞的浓度下接近100％。相比之下，在GM-CSF(5.09％)和M-CSF(14.6％)分化的巨噬细胞中，未包装有Vpx的病毒粒子均具有非常差的转导效率(即使1000个LP/细胞)。
[0306] 治疗具有复发性疾病的患者的挑战之一是单采血液成分术和自体细胞疗法的递送之间的时间，对于CAR T细胞产物而言该时间可能为几天至几周。为了确定是否可以减少为患者开发临床产品的时间和成本，对以下进行了确定：是否可以对新鲜分离的CD14+单核细胞同时进行感染和分化。发现在GM-CSF或M-CSF中分化的过程中，在第0天的选择时的单核细胞的转导导致与相继分化和感染类似的剂量依赖性的GFP+巨噬细胞比例(图13C，图14)。
[0307] GEM表达髓系细胞表面标志物并应答于LPS/IFNγ刺激
[0308] 进行下一组实验，以确定病毒感染是否会影响单核细胞向促炎性或抗炎性巨噬细胞的分化。为了表征GM-CSF GEM(图13A)和M-CSF GEM(图13B)两者的表型，以250个LP/细胞的病毒浓度用编码红色荧光蛋白mCherry的epHIV7.2慢病毒转导单核细胞，并使细胞同时在GM-CSF或M-CSF中分化。无论何种分化条件，7天后使用流式细胞术对mCherry表达进行分析，GEM呈100％阳性(图15A)。通过流式细胞术对GEM就以下常见髓系标志物的表面表达进行进一步分析：CD163(清道夫受体)，HLA-DR(向T细胞提呈内化抗原的受体)，CD80(用于T细胞的共刺激信号)，PD-L1(T细胞抑制蛋白)，CD11b(负责细胞粘附的整合素)，CD16(Fc受体)(图15B-图15G)，CD80(向T细胞递送共刺激信号)，主要组织相容性复合体II(HLADR，向T细胞提呈内化抗原)，免疫抑制性蛋白PD-L1，以及清道夫受体CD163(图22C，图23A-图23F)。如预期的，与GM-CSF巨噬细胞相比，较高比例的M-CSF巨噬细胞表达标准抗炎性巨噬细胞标志物CD163(90％vs 5％)(图15B)。重要的是，GEM对强力的Toll样受体4(TLR4)激动剂LPS和促炎性细胞因子IFNγ的刺激有应答，通过与改善的抗原提呈相关的蛋白(HLA-DR、CD80以及PD-L1)的上调来证明，这与以前的发现一致(图15C-图15E)。用含有Vpx的病毒转导对许多此类标志物的表达没有显著影响，并且CD16不受任何处理影响(图15G)。然而有趣的是，发现病毒转导导致M-CSF分化的GEM中的CD11b表达减少60％(图15F)，并导致未刺激的GM-CSF分化的GEM中的CD80增加3倍(图15D)。增加的CD80表达对抗原提呈的影响将成为未来研究的主题。用于TLR4信号转导的EF1a-Her2tG蛋白由SEQ ID NO:26中所示的序列进行编码[0309]
[0310] 因为模式识别受体(例如TLR3和TLR7)识别病毒RNA，并且通过上调细胞因子和趋化因子进行应答以发动免疫应答(Xagorari A，Chlichlia K.Toll-like receptors and viruses:induction of innate antiviral immune responses.Open Microbiol J 2008；2:49-59；以引用的方式将其整体并入本文)，期望确定病毒感染是否影响典范促炎性细胞因子的GEM分泌。为了对此进行评价，用0或250个LP/细胞mCherry Vpx+慢病毒在第0天感染单核细胞，并使其在GM-CSF中分化。在转导后24小时和第7天收集培养基，以用于肿瘤坏死因子α(TNFα)、IL-12和I型干扰素的Luminex分析(图31)。所有3种分析物均低于分析的检测限，表明慢病毒转导不诱导促炎性细胞因子分泌。
[0311] 遗传工程化巨噬细胞存留于小鼠胶质瘤模型中
[0312] 存在对以下进行评价的第一个测试：过继性转移的、慢病毒工程化的巨噬细胞的治疗潜能，所述巨噬细胞来源于原代人单核细胞。支持促炎性巨噬细胞的抗肿瘤作用的证据来自若干小鼠研究，其中，局部或系统给予的TLR激动剂颠覆了TAM的肿瘤支持程序，并恢复了免疫监视。支持促炎性巨噬细胞的抗肿瘤作用的证据来自若干小鼠研究，其中，局部或系统给予的TLR激动剂颠覆了TAM的肿瘤支持程序，并恢复了免疫监视(Peng J，Tsang JY，Li D等，Inhibition of TGF-beta signaling in combination with TLR7ligation re-programs a tumoricidal phenotype in tumor-associated macrophages.Cancer Lett 2013；331:239-249；Huang Z，Gan J，Long Z等，Targeted delivery of let-7b to reprogramme tumor-associated macrophages and tumor infiltrating dendritic
cells for tumor rejection.Biomaterials 2016；90:72-84；Chang LS，Leng CH，Yeh YC等，Toll-like receptor 9agonist enhances anti-tumor immunity and inhibits
tumor-associated immunosuppressive cells numbers in a mouse cervical cancer model following recombinant lipoprotein therapy.Mol Cancer 2014；13:60；Yu Q,Nie SP,Wang JQ等，Toll-like receptor 4mediates the antitumor host response induced by Ganoderma atrum polysaccharide.J Agric Food Chem 2015；63:517-525；
以引用的方式将其全部整体并入本文)。理想的GEM被工程化为持续地释放由经典的LPS/IFNγ激活所引发的因子(如IL-12)，并刺激先天性和适应性免疫系统两者(参见图18A至图
18CC)(Hao NB，Lu MH，Fan YH等，Macrophages in tumor microenvironments and the progression of tumors.Clin Dev Immunol 2012；2012:948098；以引用的方式将其整体并入本文)。已证明GM-CSF分化的GEM对LPS/IFNγ有应答，期望测试采用激活的巨噬细胞作为直接注入脑的细胞治疗剂的可行性。具体而言，期望确定刺激和未刺激的GEM是否会在TME中存活，影响发病或者支持肿瘤生长。为了直接评估GEM的行为，在没有其它免疫细胞的混杂作用的情况下，使用颅内胶质瘤异种移植模型(经常用于细胞免疫疗法的临床前评估)，对T淋巴细胞和B淋巴细胞缺陷型NODSCIDγ(NSG)小鼠中的GEM进行评价(Miao H，Choi BD，Suryadevara CM等，EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor T cells
migrate to and kill tumor deposits infiltrating the brain parenchyma in an invasive xenograft model of glioblastoma.PLoS One2014；9:e94281；Kahlon KS，Brown C，Cooper LJ等，Specific recognition and killing of glioblastoma
multiforme by interleukin 13-zetakine redirected cytolytic T cells.Cancer Res
2004；64:9160-9166；Krenciute G,Krebs S,Torres D等，Characterization and
Functional Analysis of scFv-based Chimeric Antigen Receptors to Redirect T Cells to IL13Ralpha2-positive Glioma.Mol Ther 2016；24:354-363；Shiina S，Ohno M，Ohka F等，CAR T Cells Targeting Podoplanin Reduce Orthotopic Glioblastomas in Mouse Brains.Cancer Immunol Res 2016；4:259-268；KK，Naik S，Kakarla S等，T cells redirected to EphA2for the immunotherapy of glioblastoma.Mol Ther 2013；
21:629-637；Hegde M，Corder A，Chow KK等，Combinational targeting offsets antigen escape and enhances effector functions of adoptively transferred T cells in glioblastoma.Mol Ther 2013；21:2087-2101；以引用的方式将其全部整体并入本文)。在这些实验中，颅内注射200,000个U87细胞，并允许其建立肿瘤6天或7天(图16A，图17A)。对于初步实验，用250个LP/细胞epHIV7:GFP-ffluc转导新鲜分离的单核细胞，并在GM-CSF中使它们向促炎性表型分化6天(图16A)。在分化和转导后的第五天，将这些GEM的一半用LPS/IFNγ刺激18小时。将150,000个刺激的或未刺激的GEM注射到已建立的肿瘤中，并每周检测生物发光三次。
cells for tumor rejection.Biomaterials 2016；90:72-84；Chang LS，Leng CH，Yeh YC等，Toll-like receptor 9agonist enhances anti-tumor immunity and inhibits
tumor-associated immunosuppressive cells numbers in a mouse cervical cancer model following recombinant lipoprotein therapy.Mol Cancer 2014；13:60；Yu Q,Nie SP,Wang JQ等，Toll-like receptor 4mediates the antitumor host response induced by Ganoderma atrum polysaccharide.J Agric Food Chem 2015；63:517-525；
以引用的方式将其全部整体并入本文)。理想的GEM被工程化为持续地释放由经典的LPS/IFNγ激活所引发的因子(如IL-12)，并刺激先天性和适应性免疫系统两者(参见图18A至图
18CC)(Hao NB，Lu MH，Fan YH等，Macrophages in tumor microenvironments and the progression of tumors.Clin Dev Immunol 2012；2012:948098；以引用的方式将其整体并入本文)。已证明GM-CSF分化的GEM对LPS/IFNγ有应答，期望测试采用激活的巨噬细胞作为直接注入脑的细胞治疗剂的可行性。具体而言，期望确定刺激和未刺激的GEM是否会在TME中存活，影响发病或者支持肿瘤生长。为了直接评估GEM的行为，在没有其它免疫细胞的混杂作用的情况下，使用颅内胶质瘤异种移植模型(经常用于细胞免疫疗法的临床前评估)，对T淋巴细胞和B淋巴细胞缺陷型NODSCIDγ(NSG)小鼠中的GEM进行评价(Miao H，Choi BD，Suryadevara CM等，EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor T cells
migrate to and kill tumor deposits infiltrating the brain parenchyma in an invasive xenograft model of glioblastoma.PLoS One2014；9:e94281；Kahlon KS，Brown C，Cooper LJ等，Specific recognition and killing of glioblastoma
multiforme by interleukin 13-zetakine redirected cytolytic T cells.Cancer Res
2004；64:9160-9166；Krenciute G,Krebs S,Torres D等，Characterization and
Functional Analysis of scFv-based Chimeric Antigen Receptors to Redirect T Cells to IL13Ralpha2-positive Glioma.Mol Ther 2016；24:354-363；Shiina S，Ohno M，Ohka F等，CAR T Cells Targeting Podoplanin Reduce Orthotopic Glioblastomas in Mouse Brains.Cancer Immunol Res 2016；4:259-268；KK，Naik S，Kakarla S等，T cells redirected to EphA2for the immunotherapy of glioblastoma.Mol Ther 2013；
21:629-637；Hegde M，Corder A，Chow KK等，Combinational targeting offsets antigen escape and enhances effector functions of adoptively transferred T cells in glioblastoma.Mol Ther 2013；21:2087-2101；以引用的方式将其全部整体并入本文)。在这些实验中，颅内注射200,000个U87细胞，并允许其建立肿瘤6天或7天(图16A，图17A)。对于初步实验，用250个LP/细胞epHIV7:GFP-ffluc转导新鲜分离的单核细胞，并在GM-CSF中使它们向促炎性表型分化6天(图16A)。在分化和转导后的第五天，将这些GEM的一半用LPS/IFNγ刺激18小时。将150,000个刺激的或未刺激的GEM注射到已建立的肿瘤中，并每周检测生物发光三次。
[0313] 成像数据揭示，一旦植入，在动物的整个生命中GM-CSF分化的和GM-CSF分化的LPS/IFNγ刺激的GEM二者都具有稳定的萤光素信号(图16B和图16C)。重要的是，GEM对动物存活不具有不利影响，组间没有显著差异(图16D，图17D)，动物也没有显示出外在的痛苦迹象，表明LPS/IFNγ刺激的GEM甚至被良好耐受。此外，GEM不增强表达ffluc的U87肿瘤的生长(图17B，图17C)，并且尽管是稀少的细胞群体，可在肿瘤组织的酶解离后被回收(图20)。尽管是稀少的细胞群，通过对于人CD45的免疫染色，GEM也可在肿瘤块内被检测到(图17E-图17G)，并可在肿瘤组织的酶解离之后被回收(图20)。这些数据共同表明，GEM能够在体内长期表达转基因，而且既不支持肿瘤生长，也不使携带肿瘤的动物的存活减少。以后的实验将对组成性地表达激活信号的GEM进行评价，以确定当它们与其它免疫细胞相互作用时，它们是否能够支持内源性抗肿瘤应答，或者是否出现安全性问题。
[0314] 成像数据揭示，在动物的整个生命中，GM-CSF分化的GEM均具有稳定的萤光素信号，不依赖于使用强力TLR4激动剂LPS和促炎性细胞因子IFNγ的刺激(图16A，图16B)。如所显示的，GEM不负面地影响动物的存活(图16C，图17C)。此外，GEM不增强表达ffluc的U87肿瘤的生长(图17A，图17B)。数据表明，GEM能够在体内长期表达转基因，并且不支持肿瘤生长或使携带肿瘤的动物的存活减少。
[0315] 可对GEM进行工程化以抵消免疫抑制性TME
[0316] 鉴于颅内胶质瘤模型处于缺乏完整免疫系统的动物中，并且这些GEM未装备有抗肿瘤因子，未对携带肿瘤的动物的肿瘤生长或总存活的影响进行预期。然而，尽管LPS/IFNγ刺激支持抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，并且在18小时的IFNγ刺激后体外肿瘤坏死因子(TNF)分泌增加，来自1990年代的对IFNγ和/或LPS刺激的巨噬细胞进行评价的人临床试验显示缺乏效力(Andreesen，1998)。认为在这种设置下巨噬细胞无法提供存活益处部分归因于：通过肿瘤细胞使巨噬细胞转向促肿瘤表型或抗炎性表型，其它细胞毒性免疫细胞缺失或失效，或者缺乏持续的炎性LPS/IFNγ信号，如在体外所观察到的(图18A至图18CC)。事实上，使用强的TLR4激动剂(如LPS)可能会有非意愿的抗炎性后果，如IL-10分泌(图18J)，或增加的PD-L1表面表达(图15B)(已知这两个因子抑制肿瘤中有效的免疫应答(参考文献))。因此，随后的实验旨在生产能够抵抗由肿瘤引起的向抗炎性表型的极化，同时改善细胞毒性免疫细胞的效力的GEM。
[0317] 已证明能够阻止GEM表达有助于肿瘤免疫逃避的TAM相关因子。使用CRISPR/Cas9系统，选择用于IL-10和PD-L1的基因以进行删除，因为它们是由肿瘤微环境中与肿瘤相关的巨噬细胞表达的抑制有效抗肿瘤应答的因子(Sica，Antonio等，Autocrine production of IL-10mediates defective IL-12production and NF-kappa B activation in tumor-associated macrophages.J Immunol.2000Jan 15；164(2):762-7；Bloch等，
Gliomas promote immunosuppression through induction of B7-H1expression in
tumor-associated macrophages；Clin Cancer Res.2013Jun 15；19(12):3165-75；将参考文献整体并入本文)。
Gliomas promote immunosuppression through induction of B7-H1expression in
tumor-associated macrophages；Clin Cancer Res.2013Jun 15；19(12):3165-75；将参考文献整体并入本文)。
[0318] 使用编码Cas9和特定向导RNA的慢病毒载体(Sanjana Nat methods 2014)，来引入IL-10和PD-L1基因座的基因组中断(图19A和图19D)。当引入单核细胞或GM-CSF分化的巨噬细胞时，这些基因组中断导致LPS/IFNγ诱导的IL-10分泌(图19A、图19B和图19C)和表面PD-L1表达(图19D、图19E和图19F)减少。
[0319] 可进一步对GEM进行编程以抵抗和颠覆TME中的抑制性环境(milieu)，并支持失效的细胞毒性免疫细胞的激活、增殖和/或存活。例如，肿瘤生长因子β(TGFβ)是一种详细描述的肿瘤来源的因子，该因子以多种方式阻止细胞毒性免疫应答。在此，证明可对GEM进行工程化以分泌可溶性TGFβ受体II(sTGFβRII)(图19G和图19I)，一种抑制TGFβ信号转导和SMAD活性的诱饵受体(decoy receptor)。另外，可将GEM用于分泌激活NK和T细胞并支持ADCC的细胞因子，例如IL-21(25961061)(图19H)(一种信号分子，目前在多项临床试验中作为癌症单药疗法或者与治疗性抗体结合)。尽管最常见是由CD4辅助T细胞产生，IL-21向细胞毒性淋巴细胞(包括T细胞和自然杀伤细胞)递送了强力的增殖和激活信号。数据表明可将巨噬细胞工程化以表达和分泌显著浓度的IL-21，这表明在GEM存在下受损的细胞毒性免疫细胞功能能够得到恢复。总之，这些数据提供证据证明，可将GEM工程化以表达减少的抗炎性蛋白，或者可生产干扰免疫抑制性蛋白信号转导或支持促炎性蛋白生产的可溶性因子。在GEM的一些可选方式中，相比未由本文所述的可选方式中所述的慢病毒载体转导的蛋白，GEM可表达减少的抗炎性蛋白，或者可生产干扰免疫抑制性蛋白信号转导或支持促炎性蛋白生产的可溶性因子。在一些可选方式中，所表达的蛋白或减少的抗炎性蛋白是IL-21。在一些可选方式中，与野生型免疫细胞相比，工程化的GEM可表达减少的抗炎性蛋白，或者可以较高的表达水平生产干扰免疫抑制性蛋白信号转导或支持促炎性蛋白生产的可溶性因子。
[0320] GAM中TAM免疫抑制性基因的CRISPR靶向
[0321] 鉴于颅内胶质母细胞瘤模型缺乏完整免疫系统，并且GEM既不具备功能性负载，也不表达可检测水平的炎性细胞因子(图31A-图31C)，未预期会对携带异种移植物的动物中的肿瘤生长或总存活存在影响。然而，尽管有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)以及18小时的IFNγ刺激后体外肿瘤坏死因子α(TNFα)分泌增加，1980年代到1990年代的人临床试验(评价用于治疗具有实体瘤的患者的IFNγ和/或LPS离体刺激的巨噬细胞)也显示没有存活益处(Andreesen R，Hennemann B，Krause SW.Adoptive immunotherapy of cancer using monocyte-derived macrophages:rationale,current status,and
perspectives.J Leukoc Biol 1998；64:419-426；以引用的方式将其整体并入本文)。认为在完整免疫系统的情况下巨噬细胞无法提供存活益处归因于：1)由肿瘤细胞引起的巨噬细胞转向促肿瘤表型或抗炎性表型，或2)其它细胞毒性免疫细胞缺失或失效，或3)缺乏持续的炎性的、LPS/IFNγ诱导的细胞因子释放，如在18小时的刺激后在体外所观察到的(图
19)。事实上，使用强的TLR4激动剂(如LPS)可能会有非意愿的抗炎性后果，例如持续的IL-
10分泌(图19)或增加的PD-L1表面表达(图15E)(已知由于肿瘤分泌信号而由TAM表达的两个因子)(Bloch O，Crane CA，Kaur R等，Gliomas promote immunosuppression through induction of B7-H1expression in tumor-associated macrophages.Clin Cancer Res
2013；19:3165-3175；以引用的方式将其整体并入本文)。因此，使用CRISPR/Cas9介导的基因编辑，旨在防止有助于免疫逃避的此类因子的GEM表达(Sanjana NE，Shalem O，Zhang F.Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.Nat Methods
2014；11:783-784；Shalem O，Sanjana NE，Hartenian E等，Genome-scale CRISPR-Cas9knockout screening in human cells.Science 2014；343:84-87；以引用的方式将两者整体并入本文)。使用编码Cas9和特定向导RNAs19的慢病毒载体，中断了用于IL-10和PD-L1的基因组基因座。这一点通过以下表明：在用Surveyor核酸内切酶(在错配的碱基对处切割)与扩增和重新退火的基因组区域孵育后产生的切割产物(图19A、图19D、图24A和
Barrows)(Qiu P，Shandilya H，D'Alessio JM等，Mutation detection using Surveyor nuclease.Biotechniques 2004；36:702-707；以引用的方式将其整体并入本文)。当引入单核细胞或GM-CSF分化的巨噬细胞时，IL-10基因座的中断导致LPS/IFNγ诱导的IL-10分泌减少60％(图26B-图26C)。在用编码Cas9和PD-L1向导RNA的病毒感染GM-CSF分化的巨噬细胞后，作为LPS/IFNγ刺激的结果的表面PD-L1表达减少了40％(图26B-图26C)。这与其它研究者的发现一致，其报道了CRISPR系统通常仅修饰一个等位基因(Ran FA，Hsu PD，Wright J等，Genome engineering using the CRISPR-Cas9system.Nat Protoc 2013；8:2281-
2308；McComb S，Aguade-Gorgorio J，Harder L等，Activation of concurrent apoptosis and necroptosis by SMAC mimetics for the treatment of refractory and relapsed ALL.Sci Transl Med 2016；8:339ra370；以引用的方式将全部整体并入本文)。
perspectives.J Leukoc Biol 1998；64:419-426；以引用的方式将其整体并入本文)。认为在完整免疫系统的情况下巨噬细胞无法提供存活益处归因于：1)由肿瘤细胞引起的巨噬细胞转向促肿瘤表型或抗炎性表型，或2)其它细胞毒性免疫细胞缺失或失效，或3)缺乏持续的炎性的、LPS/IFNγ诱导的细胞因子释放，如在18小时的刺激后在体外所观察到的(图
19)。事实上，使用强的TLR4激动剂(如LPS)可能会有非意愿的抗炎性后果，例如持续的IL-
10分泌(图19)或增加的PD-L1表面表达(图15E)(已知由于肿瘤分泌信号而由TAM表达的两个因子)(Bloch O，Crane CA，Kaur R等，Gliomas promote immunosuppression through induction of B7-H1expression in tumor-associated macrophages.Clin Cancer Res
2013；19:3165-3175；以引用的方式将其整体并入本文)。因此，使用CRISPR/Cas9介导的基因编辑，旨在防止有助于免疫逃避的此类因子的GEM表达(Sanjana NE，Shalem O，Zhang F.Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.Nat Methods
2014；11:783-784；Shalem O，Sanjana NE，Hartenian E等，Genome-scale CRISPR-Cas9knockout screening in human cells.Science 2014；343:84-87；以引用的方式将两者整体并入本文)。使用编码Cas9和特定向导RNAs19的慢病毒载体，中断了用于IL-10和PD-L1的基因组基因座。这一点通过以下表明：在用Surveyor核酸内切酶(在错配的碱基对处切割)与扩增和重新退火的基因组区域孵育后产生的切割产物(图19A、图19D、图24A和
Barrows)(Qiu P，Shandilya H，D'Alessio JM等，Mutation detection using Surveyor nuclease.Biotechniques 2004；36:702-707；以引用的方式将其整体并入本文)。当引入单核细胞或GM-CSF分化的巨噬细胞时，IL-10基因座的中断导致LPS/IFNγ诱导的IL-10分泌减少60％(图26B-图26C)。在用编码Cas9和PD-L1向导RNA的病毒感染GM-CSF分化的巨噬细胞后，作为LPS/IFNγ刺激的结果的表面PD-L1表达减少了40％(图26B-图26C)。这与其它研究者的发现一致，其报道了CRISPR系统通常仅修饰一个等位基因(Ran FA，Hsu PD，Wright J等，Genome engineering using the CRISPR-Cas9system.Nat Protoc 2013；8:2281-
2308；McComb S，Aguade-Gorgorio J，Harder L等，Activation of concurrent apoptosis and necroptosis by SMAC mimetics for the treatment of refractory and relapsed ALL.Sci Transl Med 2016；8:339ra370；以引用的方式将全部整体并入本文)。
[0322] 抗炎性阻断剂或激活细胞因子的GEM分泌
[0323] 试图评价是否可对GEM进行编程以抵抗TME中的抑制性环境，并支持细胞毒性抗肿瘤免疫细胞的激活、增殖和存活。例如，转化生长因子β(TGFβ)是一种详细描述的肿瘤来源因子，该因子以多种方式阻止细胞毒性免疫应答(Crane CA，Han SJ，Barry JJ等，TGF-beta downregulates the activating receptor NKG2D on NK cells and CD8+T cells in glioma patients.Neuro Oncol 2010；12:7-13；Smyth MJ，Strobl SL，Young HA等，Regulation of lymphokine-activated killer activity and pore-forming protein gene expression in human peripheral blood CD8+T lymphocytes.Inhibition by transforming growth factor-beta.J Immunol 1991；146:3289-3297；Bright JJ，Sriram S.TGF-beta inhibits IL-12-induced activation of Jak-STAT pathway in T
lymphocytes.J Immunol 1998；161:1772-1777；Peng Y，Laouar Y，Li MO等，TGF-beta regulates in vivo expansion of Foxp3-expressing CD4+CD25+regulatory T cells responsible for protection against diabetes.Proc Natl Acad Sci U S A 2004；
101:4572-4577；Gorelik L，Flavell RA.Immune-mediated eradication of tumors through the blockade of transforming growth factor-beta signaling in T
cells.Nat Med 2001；7:1118-1122；以引用的方式将其全部整体并入本文)。如前所描述，证明了可将GEM工程化以分泌可溶性TGFβ受体II(sTGFβRII)(图19G和图26D)，以起到用于TGFβ的诱饵受体的作用，并减少TGFβ信号转导(Rowland-Goldsmith MA，Maruyama H，Kusama T等，Soluble type II transforming growth factor-beta(TGF-beta)receptor inhibits TGF-beta signaling in COLO-357pancreatic cancer cells in vitro and attenuates tumor formation.Clin Cancer Res 2001；7:2931-2940；以引用的方式将其整体包括在本文内)。还将GEM工程化以分泌IL-21(图19H和图26E)，一种通常由CD4+T细胞表达的细胞因子，其激活NK细胞和T细胞并支持ADCC44，并将TAM的极化转变为朝向M1表型(Qiu P，Shandilya H，D'Alessio JM等，Mutation detection using Surveyor
nuclease.Biotechniques 2004；36:702-707；Croce M，Rigo V，Ferrini S.IL-21：a pleiotropic cytokine with potential applications in oncology.J Immunol Res
2015；2015:696578；Skak K，Frederiksen KS，Lundsgaard D.Interleukin-21 activates human natural killer cells and modulates their surface receptor
expression.Immunology 2008；123:575-583；Xu M，Liu M，Du X等，Intratumoral Delivery of IL-21Overcomes Anti-Her2/Neu Resistance through Shifting Tumor-Associated Macrophages from M2to M1Phenotype.J Immunol 2015；194:4997-5006；以引用的方式将其全部整体并入本文)。重组IL-21目前作为癌症单药疗法或者与酪氨酸激酶抑制剂或治疗性抗体结合处于多项临床试验中(Croce M，Rigo V，Ferrini S.IL-21:a pleiotropic cytokine with potential applications in oncology.J Immunol Res
2015；2015:696578；Spolski R，Leonard WJ.Interleukin-21:a double-edged sword with therapeutic potential.Nat Rev Drug Discov 2014；13:379-395；以引用的方式将其全部整体并入本文)。能够将巨噬细胞工程化以分泌显著浓度的IL-21的观察结果提供证据证明，在表达IL-21的GEM存在下，能够使受损的细胞毒性免疫细胞功能得到恢复。总之，这些数据证明，可将GEM工程化以表达降低水平的抗炎性蛋白或者生产干扰免疫抑制性蛋白信号转导或支持抗肿瘤免疫应答的可溶性因子。
lymphocytes.J Immunol 1998；161:1772-1777；Peng Y，Laouar Y，Li MO等，TGF-beta regulates in vivo expansion of Foxp3-expressing CD4+CD25+regulatory T cells responsible for protection against diabetes.Proc Natl Acad Sci U S A 2004；
101:4572-4577；Gorelik L，Flavell RA.Immune-mediated eradication of tumors through the blockade of transforming growth factor-beta signaling in T
cells.Nat Med 2001；7:1118-1122；以引用的方式将其全部整体并入本文)。如前所描述，证明了可将GEM工程化以分泌可溶性TGFβ受体II(sTGFβRII)(图19G和图26D)，以起到用于TGFβ的诱饵受体的作用，并减少TGFβ信号转导(Rowland-Goldsmith MA，Maruyama H，Kusama T等，Soluble type II transforming growth factor-beta(TGF-beta)receptor inhibits TGF-beta signaling in COLO-357pancreatic cancer cells in vitro and attenuates tumor formation.Clin Cancer Res 2001；7:2931-2940；以引用的方式将其整体包括在本文内)。还将GEM工程化以分泌IL-21(图19H和图26E)，一种通常由CD4+T细胞表达的细胞因子，其激活NK细胞和T细胞并支持ADCC44，并将TAM的极化转变为朝向M1表型(Qiu P，Shandilya H，D'Alessio JM等，Mutation detection using Surveyor
nuclease.Biotechniques 2004；36:702-707；Croce M，Rigo V，Ferrini S.IL-21：a pleiotropic cytokine with potential applications in oncology.J Immunol Res
2015；2015:696578；Skak K，Frederiksen KS，Lundsgaard D.Interleukin-21 activates human natural killer cells and modulates their surface receptor
expression.Immunology 2008；123:575-583；Xu M，Liu M，Du X等，Intratumoral Delivery of IL-21Overcomes Anti-Her2/Neu Resistance through Shifting Tumor-Associated Macrophages from M2to M1Phenotype.J Immunol 2015；194:4997-5006；以引用的方式将其全部整体并入本文)。重组IL-21目前作为癌症单药疗法或者与酪氨酸激酶抑制剂或治疗性抗体结合处于多项临床试验中(Croce M，Rigo V，Ferrini S.IL-21:a pleiotropic cytokine with potential applications in oncology.J Immunol Res
2015；2015:696578；Spolski R，Leonard WJ.Interleukin-21:a double-edged sword with therapeutic potential.Nat Rev Drug Discov 2014；13:379-395；以引用的方式将其全部整体并入本文)。能够将巨噬细胞工程化以分泌显著浓度的IL-21的观察结果提供证据证明，在表达IL-21的GEM存在下，能够使受损的细胞毒性免疫细胞功能得到恢复。总之，这些数据证明，可将GEM工程化以表达降低水平的抗炎性蛋白或者生产干扰免疫抑制性蛋白信号转导或支持抗肿瘤免疫应答的可溶性因子。
[0324] GEM可表达来自多种病毒的基因
[0325] 由于TME的免疫抑制性环境引起的多重挑战，试图对巨噬细胞进行工程化，以使其既通过CRISPR介导的基因中断抵抗肿瘤微环境，又分泌sTβRII和IL-21。为此目的，将截短的CD19序列插入epHIV7.2载体中(图24C)，并添加表位标签EGFRt以替换lentiCRISPRv2载体的嘌呤霉素序列(图24D)。发现可在用编码各序列的慢病毒感染的巨噬细胞上检测到这两种表位标签(图24E和图24F)。当GEM感染有两种病毒时，30％-45％的细胞呈双阳性(通过流式细胞术)(图27A和图27E)。此外，在同时表达CD19t和EGFRt的细胞上，对PD-L1表达的评价显示在PD-L1方面有70％的减少(图27C)；在其sTβRII表达方面，这些GEM仍未受损(图27D)。有趣的是，IL-21似乎阻止了LPS诱导的IL-10表达。只编码IL-21的GEM使IL-10表达减少了76.4％，当IL-21与IL-10gRNA结合表达时，表达下降了87.3％。相比在IL-10gRNA+CD19t载体对照中观察到的，这些是显著较低的表达水平(38.5％)(图27F)。当靶向IL-10表达时，IL-21表达不变(图27G)。
[0326] 人GEM从注射位点分散开并浸润肿瘤组织
[0327] 在10ng/mL GM-CSF(R&D Systems)的存在下，在37℃于5％CO2下以不超过250,000个细胞/cm2的密度，将分离的CD14+单核细胞铺于在组织培养物处理的塑料皿上(Corning)的巨噬细胞培养基(补充有10％FBS(Hyclone)的RPMI1640培养基(Gibco))中。铺板后72小时，将一半的培养基更换为补充有20ng/mLGM-CSF的新鲜巨噬细胞培养基。在epHIV7中，将pHIV7的CMV启动子更换为EF1启动子。对于epHIV7.2，已将EF1启动子更换为最小EF1(缺乏HTLV-1结构域)，并将用于氨苄青霉素抗性的基因换成用于卡那霉素抗性的基因。mCherry构建体通过将该基因克隆到HIV7.2中来创建。八周龄雄性NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠购自Jackson实验室。将氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉的动物固定在立体定向仪(Stoelting)中，在覆盖颅骨的皮肤上做出0.5cm切口，并于前囟的前侧0.5mm、侧面2mm处钻出钻孔。以1μL/分钟的速率，在硬脑膜下2.5mm和2.25mm处以2μL的体积注射200,000个野生型U87细胞或表达GFP-ffluc的U87细胞，每个位置1μL。伤口闭合后，小鼠接受乳酸林格氏溶液(用于流体补偿)和丁丙诺啡(作为镇痛药)。除了在脑硬膜下2.5mm、2.35mm和2.25mm的3个步骤中以3μL总体积注射150,000个GEM外，用于GEM注射的手术与用于U87的手术类似。每周三次进行表达ffluc的GEM或U87的生物发光成像。将小鼠用异氟烷麻醉，腹膜内或皮下注射150μL的28.57mg/mL D-萤光素溶液(Perkin Elmer)到颈背中。用Xenogen IVIS光谱成像系统(Perkin Elmer)和Living图像软件(Perkin Elmer)(用于分析数据)，对生物发光图像进行收集。GEM注射后21天，对动物进行安乐死，收获并分离肿瘤。对单细胞悬浮液就CD45进行染色，在活细胞和单线态上设门，并通过流式细胞术对mCherry和CD45表达进行评价。参见图21A和图21B。
[0328] 本文提供了对使原代人单核细胞和巨噬细胞工程化的基于慢病毒的方法(其目的为产生用于实体瘤的新型免疫疗法)的验证。以前的研究报道了，当用每500,000个细胞600ng的p24转导DC时，感染率为80％(Firat H，Zennou V，Garcia-Pons F等，Use of a lentiviral flap vector for induction of CTL immunity against
melanoma.Perspectives for immunotherapy.J Gene Med 2002；4:38-45；以引用的方式将其整体并入本文)。如上所证明的，包装有Vpx的病毒在250个LP/细胞下达到接近100％的效率，相当于每500,000个细胞10ng p24，病毒少60倍。相比在临床上使用的一些工程化T细胞中所观察到的，这种措施导致更高数量的基因组整合事件。然而，如体内研究中所观察到的，由于本文所述的GEM不会分裂，且证明缺乏GEM扩张，预计插入诱变不会影响临床产品的安全性。此外，如果发现功能受到影响，或者插入率超过食品和药物管理局规定，可通过对中值基因表达子(median gene expresser)进行排序，来减少载体拷贝数。
melanoma.Perspectives for immunotherapy.J Gene Med 2002；4:38-45；以引用的方式将其整体并入本文)。如上所证明的，包装有Vpx的病毒在250个LP/细胞下达到接近100％的效率，相当于每500,000个细胞10ng p24，病毒少60倍。相比在临床上使用的一些工程化T细胞中所观察到的，这种措施导致更高数量的基因组整合事件。然而，如体内研究中所观察到的，由于本文所述的GEM不会分裂，且证明缺乏GEM扩张，预计插入诱变不会影响临床产品的安全性。此外，如果发现功能受到影响，或者插入率超过食品和药物管理局规定，可通过对中值基因表达子(median gene expresser)进行排序，来减少载体拷贝数。
[0329] 这种措施的灵活性允许用于重要的免疫抑制性因子IL-10和PD-L1的CRISPR介导的基因中断以及sTGFRβII和IL-21的过表达，分泌的蛋白将阻止固有抑制性信号并支持NK细胞和细胞毒性T细胞的抗肿瘤功能。有趣的是，当使用两种病毒载体共表达时，发现显著百分比的GEM表达两种病毒的表位标签，并发现当GEM还表达IL-21时，CRISPR介导的IL-10的减少显著增加。
[0330] 这种原代人巨噬细胞的慢病毒修饰的方法可用作新型的细胞免疫疗法，使用临床批准的慢病毒骨架，从患者血液中仅七天便可生成该方法。GEM可从患者的单核细胞群体(目前在治疗性TCR或CAR T细胞的制备过程中被丢弃)产生，减少了与开发用于临床产品的新基础设施有关的时间和成本。预计在临床中，在肿瘤手术切除后立即将GEM直接植入肿瘤位点。这种措施比以前在临床试验中采用的静脉输注和非特异性系统性措施具有益处，使GEM与肿瘤细胞相互作用的可能性最大化，并减轻了在外周循环过程中它们可能陷入狭窄毛细血管床的顾虑。
[0331] 肿瘤微环境通过多种冗余机制防止免疫应答(Razavi SM，Lee KE，Jin BE等，Immune Evasion Strategies of Glioblastoma.Front Surg 2016；3:11；Beavis PA，Slaney CY，Kershaw MH等，Reprogramming the tumor microenvironment to enhance adoptive cellular therapy.Semin Immunol 2016；28:64-72；以引用的方式将其全部整体并入本文)，认为调节免疫抑制可能比针对单个靶标设计的小分子、抗体或细胞疗法更有效地诱导抗肿瘤活性。当与其它细胞疗法(如CAR T细胞)一起使用时，颅内异种移植模型允许对GEM的辅助性能进行评价，随后将在免疫能力模型(immune-competent model)中对其进行评价，以确定在复杂TME中GEM起作用的能力。
[0332] 将巨噬细胞用于抗肿瘤疗法的概念起源于1974年，当时Fidler等证明了在B16黑色素瘤模型中离体刺激的巨噬细胞能够抑制肺转移瘤(Fidler IJ.Inhibition of pulmonary metastasis by intravenous injection of specifically activated
macrophages.Cancer Res 1974；34:1074-1078；以引用的方式将其整体并入本文)。随后的研究证实了这些发现，并为测试过继性转移的巨噬细胞用于治疗具有各种癌症(包括卵巢癌、结肠直肠癌和肾细胞癌)的患者的安全性和效力的多项临床试验奠定了基础
(Andreesen R，Hennemann B，Krause SW.Adoptive immunotherapy of cancer using monocyte-derived macrophages:rationale,current status,and perspectives.J
Leukoc Biol 1998；64:419-426；以引用的方式将其整体并入本文)。在输注前用IFNγ或LPS/IFNγ激活的自体巨噬细胞的剂量递增研究显示，该疗法是安全的，仅诱发流感样症状，但没有临床益处(Andreesen R，Hennemann B，Krause SW.Adoptive immunotherapy of cancer using monocyte-derived macrophages:rationale,current status,and
perspectives.J Leukoc Biol 1998；64:419-426；以引用的方式将其整体并入本文)。未能改善患者结果可能归因于支持效应细胞的细胞毒性功能的LPS/IFNγ诱导因子(例如IL-
12、TNFα或IL-6)的有限表达(Hao NB，Lu MH，Fan YH等，Macrophages in tumor
microenvironments and the progression of tumors.Clin Dev Immunol 2012；2012:
948098；以引用的方式将其整体并入本文)。另外，肿瘤来源因子(如TGFβ、M-CSF、IL-4和IL-
10)可改变过继性转移的巨噬细胞的极化，修饰其细胞因子的产生以促进Tregs的功能，同时抑制肿瘤特异性T细胞应答(Glass R，Synowitz M.CNS macrophages and peripheral myeloid cells in brain tumours.Acta Neuropathol 2014；128:347-362；以引用的方式将其整体并入本文)。
macrophages.Cancer Res 1974；34:1074-1078；以引用的方式将其整体并入本文)。随后的研究证实了这些发现，并为测试过继性转移的巨噬细胞用于治疗具有各种癌症(包括卵巢癌、结肠直肠癌和肾细胞癌)的患者的安全性和效力的多项临床试验奠定了基础
(Andreesen R，Hennemann B，Krause SW.Adoptive immunotherapy of cancer using monocyte-derived macrophages:rationale,current status,and perspectives.J
Leukoc Biol 1998；64:419-426；以引用的方式将其整体并入本文)。在输注前用IFNγ或LPS/IFNγ激活的自体巨噬细胞的剂量递增研究显示，该疗法是安全的，仅诱发流感样症状，但没有临床益处(Andreesen R，Hennemann B，Krause SW.Adoptive immunotherapy of cancer using monocyte-derived macrophages:rationale,current status,and
perspectives.J Leukoc Biol 1998；64:419-426；以引用的方式将其整体并入本文)。未能改善患者结果可能归因于支持效应细胞的细胞毒性功能的LPS/IFNγ诱导因子(例如IL-
12、TNFα或IL-6)的有限表达(Hao NB，Lu MH，Fan YH等，Macrophages in tumor
microenvironments and the progression of tumors.Clin Dev Immunol 2012；2012:
948098；以引用的方式将其整体并入本文)。另外，肿瘤来源因子(如TGFβ、M-CSF、IL-4和IL-
10)可改变过继性转移的巨噬细胞的极化，修饰其细胞因子的产生以促进Tregs的功能，同时抑制肿瘤特异性T细胞应答(Glass R，Synowitz M.CNS macrophages and peripheral myeloid cells in brain tumours.Acta Neuropathol 2014；128:347-362；以引用的方式将其整体并入本文)。
[0333] 支持持续极化的巨噬细胞的效力的证据来自最近的动物研究，在所述研究中，将过继性转移或肿瘤浸润的巨噬细胞(被工程化以抑制NFκB介导的替代激活或过表达IFNα)颠覆免疫抑制性TME并抑制肿瘤生长(Hagemann T，Lawrence T，McNeish I等，"Re-educating"tumor-associated macrophages by targeting NF-kappaB.J Exp Med 2008；
205:1261-1268；Escobar G，Gentner B，Naldini L等，Engineered tumor-infiltrating macrophages as gene delivery vehicles for interferon-alpha activates immunity and inhibits breast cancer progression.Oncoimmunology2014；3:e28696；以引用的方式将其全部整体并入本文)。另外，通过抑制肿瘤支持行为并恢复抗肿瘤免疫应答，用如下对内源性巨噬细胞的抗炎性表型进行的逆转减少了肿瘤进展：Ang2/VEGF双特异性抗体(Kloepper J，Riedemann L，Amoozgar Z等，Ang-2/VEGF bispecific antibody
reprograms macrophages and resident microglia to anti-tumor phenotype and
prolongs glioblastoma survival.Proc Natl Acad Sci U S A 2016；113:4476-4481；以引用的方式将其整体并入本文)、M-CSF的拮抗剂(Pyonteck SM，Akkari L，Schuhmacher AJ等，CSF-1R inhibition alters macrophage polarization and blocks glioma
progression.Nat Med 2013；19:1264-1272；Ries CH，Cannarile MA，Hoves S等，
Targeting tumor-associated macrophages with anti-CSF-1R antibody reveals a strategy for cancer therapy.Cancer Cell 2014；25:846-859；以引用的方式将其全部整体并入本文)、或者CD40的激动剂(Beatty GL，Chiorean EG，Fishman MP等，
CD40agonists alter tumor stroma and show efficacy against pancreatic
carcinoma in mice and humans.Science 2011；331:1612-1616；以引用的方式将其整体并入本文)或TLR通路的激动剂(Peng J，Tsang JY，Li D等，Inhibition of TGF-beta signaling in combination with TLR7 ligation re-programs a tumoricidal
phenotype in tumor-associated macrophages.Cancer Lett 2013；331:239-249；Huang Z，Gan J，Long Z等，Targeted delivery of let-7b to reprogramme tumor-associated macrophages and tumor infiltrating dendritic cells for tumor
rejection.Biomaterials 2016；90:72-84；Yu Q，Nie SP，Wang JQ等，Toll-like receptor
4mediates the antitumor host response induced by Ganoderma atrum
polysaccharide.J Agric Food Chem 2015；63:517-525；El Andaloussi A，Sonabend AM，Han Y等，Stimulation of TLR9with CpG ODN enhances apoptosis of glioma and
prolongs the survival of mice with experimental brain tumors.Glia 2006；54:
526-535；以引用的方式将其全部整体并入本文)。值得注意的是，这些抗肿瘤机制可能是直接的，例如通过巨噬细胞自身诱导杀肿瘤活性(Peng J，Tsang JY，Li D等，Inhibition of TGF-beta signaling in combination with TLR7ligation re-programs a tumoricidal phenotype in tumor-associated macrophages.Cancer Lett 2013；331:239-249；Beatty GL，Chiorean EG，Fishman MP等，CD40agonists alter tumor stroma and show efficacy against pancreatic carcinoma in mice and humans.Science 2011；331:1612-1616；
Hagemann T，Lawrence T，McNeish I等，"Re-educating"tumor-associated macrophages by targeting NF-kappaB.J Exp Med 2008；205:1261-1268；以引用的方式将其全部整体并入本文)；或间接的，通过支持NK细胞介导的细胞毒性(Yu Q，Nie SP，Wang JQ等，Toll-like receptor 4mediates the antitumor host response induced by Ganoderma
atrum polysaccharide.J Agric Food Chem 2015；63:517-525；Hagemann T，Lawrence T，McNeish I等，"Re-educating"tumor-associated macrophages by targeting NF-
kappaB.J Exp Med 2008；205:1261-1268；以引用的方式将其全部整体并入本文)和T细胞介导的细胞毒性(Yu Q，Nie SP，Wang JQ等，Toll-like receptor 4mediates the
antitumor host response induced by Ganoderma atrum polysaccharide.J Agric
Food Chem 2015；63:517-525；El Andaloussi A，Sonabend AM，Han Y等，Stimulation of TLR9with CpG ODN enhances apoptosis of glioma and prolongs the survival of mice with experimental brain tumors.Glia 2006；54:526-535；以引用的方式将其全部整体并入本文)、或经由DC的激活(Van der Jeught K，Bialkowski L，Daszkiewicz L等，Targeting the tumor microenvironment to enhance antitumor immune
responses.Oncotarget 2015；6:1359-1381；以引用的方式将其整体并入本文)。此外，对来自GBM患者的肿瘤髓系细胞的TLR3介导的复极化进行证明的研究表明，它们固有的可塑性支持其起始局部免疫激活的潜力(Kees T，Lohr J，Noack J等，Microglia isolated from patients with glioma gain antitumor activities on poly(I:C)stimulation.Neuro Oncol 2012；14:64-78；以引用的方式将其整体并入本文)。因此，可以预期巨噬细胞可诱导免疫系统应答肿瘤的方式的多方面变化，并强调利用这种细胞群体重构TME的能力。
205:1261-1268；Escobar G，Gentner B，Naldini L等，Engineered tumor-infiltrating macrophages as gene delivery vehicles for interferon-alpha activates immunity and inhibits breast cancer progression.Oncoimmunology2014；3:e28696；以引用的方式将其全部整体并入本文)。另外，通过抑制肿瘤支持行为并恢复抗肿瘤免疫应答，用如下对内源性巨噬细胞的抗炎性表型进行的逆转减少了肿瘤进展：Ang2/VEGF双特异性抗体(Kloepper J，Riedemann L，Amoozgar Z等，Ang-2/VEGF bispecific antibody
reprograms macrophages and resident microglia to anti-tumor phenotype and
prolongs glioblastoma survival.Proc Natl Acad Sci U S A 2016；113:4476-4481；以引用的方式将其整体并入本文)、M-CSF的拮抗剂(Pyonteck SM，Akkari L，Schuhmacher AJ等，CSF-1R inhibition alters macrophage polarization and blocks glioma
progression.Nat Med 2013；19:1264-1272；Ries CH，Cannarile MA，Hoves S等，
Targeting tumor-associated macrophages with anti-CSF-1R antibody reveals a strategy for cancer therapy.Cancer Cell 2014；25:846-859；以引用的方式将其全部整体并入本文)、或者CD40的激动剂(Beatty GL，Chiorean EG，Fishman MP等，
CD40agonists alter tumor stroma and show efficacy against pancreatic
carcinoma in mice and humans.Science 2011；331:1612-1616；以引用的方式将其整体并入本文)或TLR通路的激动剂(Peng J，Tsang JY，Li D等，Inhibition of TGF-beta signaling in combination with TLR7 ligation re-programs a tumoricidal
phenotype in tumor-associated macrophages.Cancer Lett 2013；331:239-249；Huang Z，Gan J，Long Z等，Targeted delivery of let-7b to reprogramme tumor-associated macrophages and tumor infiltrating dendritic cells for tumor
rejection.Biomaterials 2016；90:72-84；Yu Q，Nie SP，Wang JQ等，Toll-like receptor
4mediates the antitumor host response induced by Ganoderma atrum
polysaccharide.J Agric Food Chem 2015；63:517-525；El Andaloussi A，Sonabend AM，Han Y等，Stimulation of TLR9with CpG ODN enhances apoptosis of glioma and
prolongs the survival of mice with experimental brain tumors.Glia 2006；54:
526-535；以引用的方式将其全部整体并入本文)。值得注意的是，这些抗肿瘤机制可能是直接的，例如通过巨噬细胞自身诱导杀肿瘤活性(Peng J，Tsang JY，Li D等，Inhibition of TGF-beta signaling in combination with TLR7ligation re-programs a tumoricidal phenotype in tumor-associated macrophages.Cancer Lett 2013；331:239-249；Beatty GL，Chiorean EG，Fishman MP等，CD40agonists alter tumor stroma and show efficacy against pancreatic carcinoma in mice and humans.Science 2011；331:1612-1616；
Hagemann T，Lawrence T，McNeish I等，"Re-educating"tumor-associated macrophages by targeting NF-kappaB.J Exp Med 2008；205:1261-1268；以引用的方式将其全部整体并入本文)；或间接的，通过支持NK细胞介导的细胞毒性(Yu Q，Nie SP，Wang JQ等，Toll-like receptor 4mediates the antitumor host response induced by Ganoderma
atrum polysaccharide.J Agric Food Chem 2015；63:517-525；Hagemann T，Lawrence T，McNeish I等，"Re-educating"tumor-associated macrophages by targeting NF-
kappaB.J Exp Med 2008；205:1261-1268；以引用的方式将其全部整体并入本文)和T细胞介导的细胞毒性(Yu Q，Nie SP，Wang JQ等，Toll-like receptor 4mediates the
antitumor host response induced by Ganoderma atrum polysaccharide.J Agric
Food Chem 2015；63:517-525；El Andaloussi A，Sonabend AM，Han Y等，Stimulation of TLR9with CpG ODN enhances apoptosis of glioma and prolongs the survival of mice with experimental brain tumors.Glia 2006；54:526-535；以引用的方式将其全部整体并入本文)、或经由DC的激活(Van der Jeught K，Bialkowski L，Daszkiewicz L等，Targeting the tumor microenvironment to enhance antitumor immune
responses.Oncotarget 2015；6:1359-1381；以引用的方式将其整体并入本文)。此外，对来自GBM患者的肿瘤髓系细胞的TLR3介导的复极化进行证明的研究表明，它们固有的可塑性支持其起始局部免疫激活的潜力(Kees T，Lohr J，Noack J等，Microglia isolated from patients with glioma gain antitumor activities on poly(I:C)stimulation.Neuro Oncol 2012；14:64-78；以引用的方式将其整体并入本文)。因此，可以预期巨噬细胞可诱导免疫系统应答肿瘤的方式的多方面变化，并强调利用这种细胞群体重构TME的能力。
[0334] 为了支持这一观点，评价TME中先天性免疫细胞激活的影响的多项研究表明，它是具有实体瘤的患者的临床效力的重要组件。例如，基于其在具有去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer)的患者中诱导抗肿瘤免疫应答的能力，基于DC的细胞疗法是获得食品和药物管理局批准的第一个疗法(Kantoff PW，Higano CS，Shore ND等，Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer.N Engl J Med 2010；363:411-422；以引用的方式将其整体并入本文)。其它实验研究试图使用如下来提高免疫力：佐剂(Crane CA，Han SJ，Ahn B等，Individual patient-specific immunity against high-grade glioma after vaccination with autologous tumor derived peptides bound to the 96KD chaperone protein.Clin Cancer Res 2013；19:
205-214；通过引用将其全部内容并入本文)、活的溶瘤病毒(Suryadevara CM，Riccione KA，Sampson JH.Immunotherapy gone viral:Bortezomib and oHSV enhance antitumor NK cell activity.Clin Cancer Res 2016；通过引用将其全部内容并入本文)、或工程化为特异性感染肿瘤固有APC(tumor resident APC)的物质(Goyvaerts C，De Groeve K，Dingemans J等，Development of the Nanobody display technology to target
lentiviral vectors to antigen-presenting cells.Gene Ther 2012；19:1133-1140；
Cire S，Da Rocha S，Yao R等，Immunization of mice with lentiviral vectors
targeted to MHC class II+cells is due to preferential transduction of
dendritic cells in vivo.PLoS One 2014；9:e101644；以引用的方式将两者整体并入本文)。这些措施可能在肿瘤中引起显著的先天性免疫细胞激活，包括其促炎介质(pro-
inflammatory mediators)的产生，以及对细胞毒性免疫细胞功能的支持。尽管这些措施证明了增强先天性和适应性免疫细胞交互作用对临床效力的影响，对肿瘤微环境和抗肿瘤免疫力的多效性影响的基本机制尚未明确定义。预计在动物研究和临床试验中使用基于巨噬细胞的免疫疗法将与这些类措施协同，来描绘对克服抑制性和抗炎性TME而言至关重要的机制。
205-214；通过引用将其全部内容并入本文)、活的溶瘤病毒(Suryadevara CM，Riccione KA，Sampson JH.Immunotherapy gone viral:Bortezomib and oHSV enhance antitumor NK cell activity.Clin Cancer Res 2016；通过引用将其全部内容并入本文)、或工程化为特异性感染肿瘤固有APC(tumor resident APC)的物质(Goyvaerts C，De Groeve K，Dingemans J等，Development of the Nanobody display technology to target
lentiviral vectors to antigen-presenting cells.Gene Ther 2012；19:1133-1140；
Cire S，Da Rocha S，Yao R等，Immunization of mice with lentiviral vectors
targeted to MHC class II+cells is due to preferential transduction of
dendritic cells in vivo.PLoS One 2014；9:e101644；以引用的方式将两者整体并入本文)。这些措施可能在肿瘤中引起显著的先天性免疫细胞激活，包括其促炎介质(pro-
inflammatory mediators)的产生，以及对细胞毒性免疫细胞功能的支持。尽管这些措施证明了增强先天性和适应性免疫细胞交互作用对临床效力的影响，对肿瘤微环境和抗肿瘤免疫力的多效性影响的基本机制尚未明确定义。预计在动物研究和临床试验中使用基于巨噬细胞的免疫疗法将与这些类措施协同，来描绘对克服抑制性和抗炎性TME而言至关重要的机制。
[0335] 当直接注射到脑肿瘤异种移植物中时，GEM稳定产生慢病毒编码的萤火虫萤光素酶，并长期存活而不扩张或负面地影响动物存活。这种措施的灵活性允许用于重要的免疫抑制性因子IL-10和PD-L1的CRISPR介导的基因中断以及sTGFRβII和IL-21的过表达，分泌的蛋白将阻止固有抑制性信号并支持NK细胞和T细胞的抗肿瘤功能。
[0336] 将巨噬细胞用于抗肿瘤疗法的概念起源于1974年，当时Fidler等证明了在B16黑色素瘤模型中离体刺激的巨噬细胞能够抑制肺转移瘤。随后的研究证实了这些发现，并为测试过继性转移的巨噬细胞用于治疗具有各种癌症(包括卵巢癌、结肠直肠癌和肾细胞癌)的患者的安全性和效力的多项临床试验奠定了基础。在输注前用IFNγ或LPS/IFNγ激活的自体巨噬细胞的剂量递增研究显示，该疗法是安全的，仅诱发流感样症状，但没有临床益处。未能改善患者结果可能归因于支持效应细胞的细胞毒性功能的LPS/IFNγ诱导因子(例如IL-12、TNFα或IL-6)的有限表达。另外，肿瘤来源因子(如TGFβ、M-CSF、IL-4和IL-10)可改变过继性转移的巨噬细胞的极化，修饰其细胞因子的产生以促进Tregs的功能，同时抑制肿瘤特异性T细胞应答。
[0337] 支持持续极化的巨噬细胞的效力的证据来自最近的动物研究，在所述研究中，将过继性转移或肿瘤浸润的巨噬细胞(被工程化以抑制NFκB介导的替代激活或过表达IFNα)颠覆免疫抑制性TME并抑制肿瘤生长。另外，通过抑制肿瘤支持行为并恢复抗肿瘤免疫应答，用Ang2/VEGF双特异性抗体、M-CSF的拮抗剂、或者CD40或TLR通路的拮抗剂对内源性巨噬细胞的抗炎性表型进行的逆转减少了肿瘤进展。值得注意的是，这些抗肿瘤机制可能是直接的，例如通过巨噬细胞自身诱导杀肿瘤活性；或间接的，通过支持NK细胞和T细胞介导的细胞毒性。此外，对来自GBM患者的肿瘤髓系细胞的TLR3介导的复极化进行证明的研究表明，它们固有的可塑性支持其起始局部免疫激活的潜力。因此，可以预期巨噬细胞可单独诱导免疫系统应答肿瘤的方式的多方面变化，并强调利用这种细胞群体作为工具重构TME的能力。
[0338] 首次证实，使用临床批准的慢病毒骨架，从患者血液中仅七天便可生成新型的基于巨噬细胞的免疫疗法。GEM可从患者的单核细胞群体(在治疗性TCR或CAR T细胞的制备过程中被丢弃)产生，减少了与开发用于临床产品的新基础设施有关的时间和成本。预计在临床中，在肿瘤手术切除过程中将GEM直接植入肿瘤。这种措施比以前在临床试验中采用的静脉输注具有益处，因为它使GEM与肿瘤细胞相互作用的可能性最大化，并减轻了在外周循环过程中它们可能陷入狭窄毛细血管床的顾虑。
[0339] 肿瘤微环境通过多种冗余机制防止免疫应答。因此，调节免疫抑制可能比针对单个靶标设计的小分子、抗体或细胞疗法更有效地诱导抗肿瘤活性。
[0340] CD4和CD8T细胞表达EGFRvIII 806CAR和嵌合IL7受体
[0341] 对经扩张和低温保存的CD4和CD8选择的T细胞进行工程化，以表达EGFRvIII 806CAR以及与IL2受体(CD122)胞内信号转导结构域融合的嵌合IL7受体(CD127)胞外结构域，并在冷冻前经CD3/CD28激活。将解冻的CD4或CD8T细胞用Cell Trace Violet标记，用作为对照的重组IL-7(500ng/ml)(从表达IL-7或EGFRt(仅载体)的GEM冻起来的条件培养基)培养7天，或用分泌IL-7或EGFRt的自体GEM共培养，并使用流式细胞术对CellTrace Violet稀释度(作为增殖的量度)进行分析。这些都未用CD3/CD28再刺激，它们没有接受除IL-7之外的任何细胞因子(参见图32和图33)。
[0342] 使用SEQ ID NO:17 中所示的正向引物和SEQ ID NO:18 中所示的反向引物，对IL-7序列(SEQ
ID NO:19
ID NO:19
[0343]进行扩增。
[0344] 在本文所述的一些可选方式中，提供了制造用于对肿瘤微环境(TME)进行修饰的遗传修饰的免疫细胞的方法，所述方法包括：向免疫细胞递送第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和/或激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述T细胞是遗传修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述遗传修饰的T细胞进行遗传修饰，以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质母细胞瘤。在一些可选方式中，该方法进一步包括向所述免疫细胞递送第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸，并向所述免疫细胞递送编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，用于PDL1 CRISPR删除的小向导RNA的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:20中所示的序列 和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO:21中所示的序列 在
一些可选方式中，PD-L1小向导RNA序列包含SEQ ID NO:22中所示的序列
在一些可选方式中，用于IL-10小向导RNA序列的引物包括：正向引
物，所述正向引物包含SEQ ID NO:23中所示的序列 和反
向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO:24中所示的序列
在一些可选方式中，IL-10小向导RNA序列包含SEQ ID NO:25中所示的序列
在一些可选方式中，该方法进一步包括：向所述免疫
细胞递送第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及向所述免疫细胞递送第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因编码IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。
在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，该方法进一步包括使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，增殖的T细胞选自于由以下所组成的组：T辅助细胞、记忆T细胞、细胞毒性T细胞、抑制T细胞、自然杀伤T细胞和γδT细胞。在一些可选方式中，将小的设计蛋白用于占据PD-1结合位点，而不递送激动信号。另外，在一些可选方式中，单链抗体样蛋白(使用开发用于抑制PD-1信号转导的单克隆抗体的序列产生)可用于防止复合激动活性，其描述于US8008449B2中(以引用的方式将其整体并入)。在一些可选方式中，趋化因子是CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-
2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，趋化因子选自于由以下所组成的组：EGF、Eotaxin、FGF-2、FLT-3L、Fractalkine、G-CSF、GM-CSF、GRO、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-13、IL-15、Il18A、IL-1RA、Il-1a、IL-1b、Il-2、Il-3、Il-4、Il-5、Il-6、Il-7、IL-8、IL-9、INF-α2、INFγ、IP-10、MCP-1、MCP-3、MDC、MIP-1a、MIP-1b、PDGF-AA、PDGF-BB、RANTES、TGF-α、TGF-β、VEGF、sCD401、6CKINE、BCA-1、CTACK、ENA78、Eotaxin-2、Eotaxin-3、1309、IL-16、IL-20、IL-21、IL-23、IL-28a、IL-33、LIF、MCP-2、MCP-4、MIP-1d、SCF、SDF-1atb、TARC、TPO、TRAIL、TSLP、CCL1ra/HCC-1、CCL19/MIPβ、CCL20/MIPα、CXCL11/1-TAC、CXCL6/GCP2、CXCL7/NAP2、CXCL9/MIG、IL-11、IL-29/ING-γ、M-CSF和XCL1/淋巴细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，该方法进一步包括：向所述细胞递送第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸，并向所述细胞递送编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，所述细胞中的靶基因编码TGF-β或IL-10。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，该方法进一步包括：向所述细胞递送第四载体，其中，所述第四载体编码与转录激活因子结构域融合的Cas9蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及向所述细胞递送第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，转录激活结构域包括VP16、VP64或p65激活结构域。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-
12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。
在一些可选方式中，所述促炎性基因编码IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，通过OptimumGeneTM、 算法和本领域技术人员已知的
其它程序完成密码子优化。
一些可选方式中，PD-L1小向导RNA序列包含SEQ ID NO:22中所示的序列
在一些可选方式中，用于IL-10小向导RNA序列的引物包括：正向引
物，所述正向引物包含SEQ ID NO:23中所示的序列 和反
向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO:24中所示的序列
在一些可选方式中，IL-10小向导RNA序列包含SEQ ID NO:25中所示的序列
在一些可选方式中，该方法进一步包括：向所述免疫
细胞递送第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及向所述免疫细胞递送第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因编码IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。
在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞和单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，该方法进一步包括使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，增殖的T细胞选自于由以下所组成的组：T辅助细胞、记忆T细胞、细胞毒性T细胞、抑制T细胞、自然杀伤T细胞和γδT细胞。在一些可选方式中，将小的设计蛋白用于占据PD-1结合位点，而不递送激动信号。另外，在一些可选方式中，单链抗体样蛋白(使用开发用于抑制PD-1信号转导的单克隆抗体的序列产生)可用于防止复合激动活性，其描述于US8008449B2中(以引用的方式将其整体并入)。在一些可选方式中，趋化因子是CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-
2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，趋化因子选自于由以下所组成的组：EGF、Eotaxin、FGF-2、FLT-3L、Fractalkine、G-CSF、GM-CSF、GRO、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-13、IL-15、Il18A、IL-1RA、Il-1a、IL-1b、Il-2、Il-3、Il-4、Il-5、Il-6、Il-7、IL-8、IL-9、INF-α2、INFγ、IP-10、MCP-1、MCP-3、MDC、MIP-1a、MIP-1b、PDGF-AA、PDGF-BB、RANTES、TGF-α、TGF-β、VEGF、sCD401、6CKINE、BCA-1、CTACK、ENA78、Eotaxin-2、Eotaxin-3、1309、IL-16、IL-20、IL-21、IL-23、IL-28a、IL-33、LIF、MCP-2、MCP-4、MIP-1d、SCF、SDF-1atb、TARC、TPO、TRAIL、TSLP、CCL1ra/HCC-1、CCL19/MIPβ、CCL20/MIPα、CXCL11/1-TAC、CXCL6/GCP2、CXCL7/NAP2、CXCL9/MIG、IL-11、IL-29/ING-γ、M-CSF和XCL1/淋巴细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，该方法进一步包括：向所述细胞递送第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸，并向所述细胞递送编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，所述细胞中的靶基因编码TGF-β或IL-10。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，该方法进一步包括：向所述细胞递送第四载体，其中，所述第四载体编码与转录激活因子结构域融合的Cas9蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及向所述细胞递送第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，转录激活结构域包括VP16、VP64或p65激活结构域。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-
12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。
在一些可选方式中，所述促炎性基因编码IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，通过OptimumGeneTM、 算法和本领域技术人员已知的
其它程序完成密码子优化。
[0345] 在一些可选方式中，提供了包含第一载体的遗传修饰的免疫细胞，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和/或激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88或细胞因子的产生。在一些可选方式中，所述T细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述T-细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质母细胞瘤。在一些可选方式中，所述载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-
1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，用于PDL1 CRISPR删除的小向导RNA的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:20中所示的序列
和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO:21中所示的序列
在一些可选方式中，PD-L1小向导RNA序列包含SEQ ID
NO:22中所示的序列 在一些可选方式中，用于
IL-10小向导RNA序列的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:23中所示的序列 和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID
NO:24中所示的序列 在一些可选方式中，IL-10
小向导RNA序列包含SEQ ID NO:25中所示的序列
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。
在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶
(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，将小的设计蛋白用于占据PD-1结合位点，而不递送激动信号。在一些可选方式中，将包含残基62-136的PD-L1蛋白用于阻断结合。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述细胞因子是IL-2、IL-1β、IFNγ、IL-1、IL-7、IL-15、IL12、IL-18、IL-21或IL-33。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，所述趋化因子是CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述趋化因子选自于由如下所组成的组：EGF、Eotaxin、FGF-2、FLT-3L、Fractalkine、G-CSF、GM-CSF、GRO、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-13、IL-15、Il18A、IL-1RA、Il-1a、IL-1b、Il-2、Il-3、Il-4、Il-5、Il-6、Il-7、IL-8、IL-9、INF-α2、INFγ、IP-10、MCP-1、MCP-3、MDC、MIP-1a、MIP-
1b、PDGF-AA、PDGF-BB、RANTES、TGF-α、TGF-β、VEGF、sCD401、6CKINE、BCA-1、CTACK、ENA78、Eotaxin-2、Eotaxin-3、1309、IL-16、IL-20、IL-21、IL-23、IL-28a、IL-33、LIF、MCP-2、MCP-
4、MIP-1d、SCF、SDF-1atb、TARC、TPO、TRAIL、TSLP、CCL1ra/HCC-1、CCL19/MIPβ、CCL20/MIPα、CXCL11/1-TAC、CXCL6/GCP2、CXCL7/NAP2、CXCL9/MIG、IL-11、IL-29/ING-γ、M-CSF和XCL1/淋巴细胞趋化因子。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，所述细胞中的靶基因编码TGF-β或IL-10。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码与转录激活因子结构域融合的Cas9蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，转录激活结构域包括VP16、VP64或p65激活结构域。更多的可选方式涉及上述遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种单独或组合用作药物，例如来治疗或抑制癌症，例如乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞表达EGFRvIII806CAR和与CD122融合的嵌合IL7受体。
1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，用于PDL1 CRISPR删除的小向导RNA的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:20中所示的序列
和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO:21中所示的序列
在一些可选方式中，PD-L1小向导RNA序列包含SEQ ID
NO:22中所示的序列 在一些可选方式中，用于
IL-10小向导RNA序列的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:23中所示的序列 和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID
NO:24中所示的序列 在一些可选方式中，IL-10
小向导RNA序列包含SEQ ID NO:25中所示的序列
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。
在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶
(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，将小的设计蛋白用于占据PD-1结合位点，而不递送激动信号。在一些可选方式中，将包含残基62-136的PD-L1蛋白用于阻断结合。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述细胞因子是IL-2、IL-1β、IFNγ、IL-1、IL-7、IL-15、IL12、IL-18、IL-21或IL-33。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，所述趋化因子是CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述趋化因子选自于由如下所组成的组：EGF、Eotaxin、FGF-2、FLT-3L、Fractalkine、G-CSF、GM-CSF、GRO、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-13、IL-15、Il18A、IL-1RA、Il-1a、IL-1b、Il-2、Il-3、Il-4、Il-5、Il-6、Il-7、IL-8、IL-9、INF-α2、INFγ、IP-10、MCP-1、MCP-3、MDC、MIP-1a、MIP-
1b、PDGF-AA、PDGF-BB、RANTES、TGF-α、TGF-β、VEGF、sCD401、6CKINE、BCA-1、CTACK、ENA78、Eotaxin-2、Eotaxin-3、1309、IL-16、IL-20、IL-21、IL-23、IL-28a、IL-33、LIF、MCP-2、MCP-
4、MIP-1d、SCF、SDF-1atb、TARC、TPO、TRAIL、TSLP、CCL1ra/HCC-1、CCL19/MIPβ、CCL20/MIPα、CXCL11/1-TAC、CXCL6/GCP2、CXCL7/NAP2、CXCL9/MIG、IL-11、IL-29/ING-γ、M-CSF和XCL1/淋巴细胞趋化因子。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，所述细胞中的靶基因编码TGF-β或IL-10。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码与转录激活因子结构域融合的Cas9蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，转录激活结构域包括VP16、VP64或p65激活结构域。更多的可选方式涉及上述遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种单独或组合用作药物，例如来治疗或抑制癌症，例如乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞表达EGFRvIII806CAR和与CD122融合的嵌合IL7受体。
[0346] 在一些可选方式中，提供了组合物，其中，所述组合物包含本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种，以及运载体、抗癌治疗剂、抗感染治疗剂、抗菌治疗剂、抗病毒治疗剂或抗肿瘤治疗剂。在一些可选方式中，增殖的T细胞选自于由以下所组成的组：T辅助细胞、记忆T细胞、细胞毒性T细胞、抑制T细胞、自然杀伤T细胞和γδT细胞。
[0347] 在一些可选方式中，提供了组合物。该组合物可包含本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种，和运载体、抗癌治疗剂、抗感染治疗剂、抗菌治疗剂、抗病毒治疗剂或抗肿瘤治疗剂。在一些可选方式中，提供了包含第一载体的遗传修饰的免疫细胞，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子的产生。在一些可选方式中，所述T细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述T-细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质母细胞瘤。在一些可选方式中，所述载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，用于PDL1CRISPR删除的小向导RNA的引物包括： 正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO: 20中所示的序列 和反向引物， 所述反向引物包含 SEQ ID NO: 21 中所示的序列 在
一些可选方式中，PD-L1 小向导 RNA 序列包含 SEQ ID NO: 22 中所示的序列
在一些可选方式中，用于IL-10小向导
RNA序列的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO: 23中所示的序列
和反向引物， 所述反向引物包含 SEQ ID NO:
24 中所示的序列 在一些可选方式中，IL-10小向
导 RNA 序列包含 SEQ ID NO: 25 中所示 的序列
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白， 以激活第二蛋白的转录和翻译； 以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO: 35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化， 以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-
4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，将小的设计蛋白用于占据PD-1结合位点，而不递送激动信号。在一些可选方式中，将包含残基62-136的PD-L1蛋白用于阻断结合。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述细胞因子是IL-2、IL-1β、IFNγ、IL-1、IL-7、IL-15、IL12、IL-18、IL-21或IL-33。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，所述趋化因子是CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述趋化因子选自于由如下所组成的组：EGF、Eotaxin、FGF-2、FLT-3L、Fractalkine、G-CSF、GM-CSF、GRO、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-13、IL-15、Il18A、IL-1RA、Il-1a、IL-1b、Il-2、Il-3、Il-4、Il-5、Il-6、Il-
7、IL-8、IL-9、INF-α2、INFγ、IP-10、MCP-1、MCP-3、MDC、MIP-1a、MIP-1b、PDGF-AA、PDGF-BB、RANTES、TGF-α、TGF-β、VEGF、sCD401、6CKINE、BCA-1、CTACK、ENA78、Eotaxin-2、Eotaxin-3、
1309、IL-16、IL-20、IL-21、IL-23、IL-28a、IL-33、LIF、MCP-2、MCP-4、MIP-1d、SCF、SDF-
1atb、TARC、TPO、TRAIL、TSLP、CCL1ra/HCC-1、CCL19/MIPβ、CCL20/MIPα、CXCL11/1-TAC、CXCL6/GCP2、CXCL7/NAP2、CXCL9/MIG、IL-11、IL-29/ING-γ、M-CSF和XCL1/淋巴细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，所述细胞中的靶基因编码TGF-β或IL-
10。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码与转录激活因子结构域融合的Cas9蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，转录激活结构域包括VP16、VP64或p65激活结构域。
一些可选方式中，PD-L1 小向导 RNA 序列包含 SEQ ID NO: 22 中所示的序列
在一些可选方式中，用于IL-10小向导
RNA序列的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO: 23中所示的序列
和反向引物， 所述反向引物包含 SEQ ID NO:
24 中所示的序列 在一些可选方式中，IL-10小向
导 RNA 序列包含 SEQ ID NO: 25 中所示 的序列
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白， 以激活第二蛋白的转录和翻译； 以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO: 35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化， 以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-
4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，将小的设计蛋白用于占据PD-1结合位点，而不递送激动信号。在一些可选方式中，将包含残基62-136的PD-L1蛋白用于阻断结合。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述细胞因子是IL-2、IL-1β、IFNγ、IL-1、IL-7、IL-15、IL12、IL-18、IL-21或IL-33。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，所述趋化因子是CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述趋化因子选自于由如下所组成的组：EGF、Eotaxin、FGF-2、FLT-3L、Fractalkine、G-CSF、GM-CSF、GRO、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-13、IL-15、Il18A、IL-1RA、Il-1a、IL-1b、Il-2、Il-3、Il-4、Il-5、Il-6、Il-
7、IL-8、IL-9、INF-α2、INFγ、IP-10、MCP-1、MCP-3、MDC、MIP-1a、MIP-1b、PDGF-AA、PDGF-BB、RANTES、TGF-α、TGF-β、VEGF、sCD401、6CKINE、BCA-1、CTACK、ENA78、Eotaxin-2、Eotaxin-3、
1309、IL-16、IL-20、IL-21、IL-23、IL-28a、IL-33、LIF、MCP-2、MCP-4、MIP-1d、SCF、SDF-
1atb、TARC、TPO、TRAIL、TSLP、CCL1ra/HCC-1、CCL19/MIPβ、CCL20/MIPα、CXCL11/1-TAC、CXCL6/GCP2、CXCL7/NAP2、CXCL9/MIG、IL-11、IL-29/ING-γ、M-CSF和XCL1/淋巴细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，所述细胞中的靶基因编码TGF-β或IL-
10。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码与转录激活因子结构域融合的Cas9蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，转录激活结构域包括VP16、VP64或p65激活结构域。
[0348] 在一些可选方式中，提供了在有需要的受试者(例如人)的肿瘤微环境中对免疫应答的抑制进行调节的方法，其中，所述方法包括：向有需要的受试者给予本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物的任一种或多种；并任选地，对所述受试者进行选择或鉴定以接受所述遗传修饰的免疫细胞，和/或在给予所述遗传修饰的免疫细胞后，对所述受试者的肿瘤微环境中免疫应答抑制的调节进行测量。在一些可选方式中，提供了包含第一载体的遗传修饰的免疫细胞，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88或细胞因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述T细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述T-细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质母细胞瘤。在一些可选方式中，所述载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，用于PDL1CRISPR删除的小向导RNA的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ IDNO:20中所示的序列 和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO:21中所示的序列 在一些可选方
式中，PD-L1小向导RNA序列包含SEQ ID NO:22中所示的序列
在一些可选方式中，用于IL-10小向导RNA序列的引物包括：正向
引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:23中所示的序列
和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO:24中所示的序列
在一些可选方式中，IL-10小向导RNA序列包含SEQ ID NO:25中所
示的序列 在一些可选方式中，所述遗传修饰的免
疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:
35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，将小的设计蛋白用于占据PD-1结合位点，而不递送激动信号。在一些可选方式中，将包含残基62-136的PD-L1蛋白用于阻断结合。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述细胞因子是IL-2、IL-1β、IFNγ、IL-1、IL-7、IL-15、IL12、IL-18、IL-21或IL-33。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，所述趋化因子是CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述趋化因子选自于由如下所组成的组：EGF、Eotaxin、FGF-2、FLT-3L、Fractalkine、G-CSF、GM-CSF、GRO、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-13、IL-15、Il18A、IL-1RA、Il-1a、IL-1b、Il-2、Il-3、Il-4、Il-5、Il-6、Il-7、IL-8、IL-9、INF-α2、INFγ、IP-10、MCP-1、MCP-3、MDC、MIP-1a、MIP-1b、PDGF-AA、PDGF-BB、RANTES、TGF-α、TGF-β、VEGF、sCD401、6CKINE、BCA-1、CTACK、ENA78、Eotaxin-2、Eotaxin-3、1309、IL-16、IL-20、IL-
21、IL-23、IL-28a、IL-33、LIF、MCP-2、MCP-4、MIP-1d、SCF、SDF-1atb、TARC、TPO、TRAIL、TSLP、CCL1ra/HCC-1、CCL19/MIPβ、CCL20/MIPα、CXCL11/1-TAC、CXCL6/GCP2、CXCL7/NAP2、CXCL9/MIG、IL-11、IL-29/ING-γ、M-CSF和XCL1/淋巴细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，所述细胞中的靶基因编码TGF-β或IL-10。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码与转录激活因子结构域融合的Cas9蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，转录激活结构域包括VP16、VP64或p65激活结构域。在一些可选方式中，给予通过过继性细胞转移来进行。在一些可选方式中，通过注射直接递送至肿瘤床，来给予所述遗传修饰的免疫细胞。在一些可选方式中，所述有需要的受试者遭受癌症。在一些可选方式中，所述癌症是实体瘤。在一些可选方式中，所述实体瘤选自于由如下所组成的组：乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞表达EGFRvIII 806CAR和与CD122融合的嵌合IL7受体。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向有需要的受试者给予细胞疗法。在一些可选方式中，细胞疗法是CAR T细胞疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在将本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种引入、提供或给予至受试者以进行治疗之前、之后或同时，向有需要的受试者递送抗体或其结合片段、小分子、热休克蛋白-肽复合物或溶瘤性脊髓灰质炎病毒。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段对以下具有特异性：甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、HER2和/或p53或ras的异常产物。在一些可选方式中，该方法进一步包括向有需要的受试者给予前药。在一些可选方式中，所述前药是爱必妥、赫赛汀、更昔洛韦、FK506或二聚化的化学诱导剂。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向有所述受试者给予药物。在一些可选方式中，所述药物是他莫西芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，对所述受试者进行鉴定或选择，以接受抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向受试者引入、提供或给予额外的治疗试剂(例如化疗试剂、抗病毒试剂、或抗菌试剂)或辅助疗法(例如放射疗法和/或手术)。在一些可选方式中，所述额外的治疗试剂是抗癌疗法，所述抗癌疗法包括激素阻断疗法、化疗、小分子、单克隆抗体或其结合片段、和/或放射。在一些可选方式中，所述单克隆抗体或其结合片段对以下具有特异性：Her2、CD52、CD20、CD25、VEGF或EGRF。在一些可选方式中，所述激素阻断疗法包括他莫西芬、阿那曲唑和/或来曲唑的递送。在一些可选方式中，所述小分子包括酪氨酸激酶抑制剂、小分子药物缀合物、丝氨酸激酶抑制剂和/或苏氨酸激酶抑制剂。
式中，PD-L1小向导RNA序列包含SEQ ID NO:22中所示的序列
在一些可选方式中，用于IL-10小向导RNA序列的引物包括：正向
引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:23中所示的序列
和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO:24中所示的序列
在一些可选方式中，IL-10小向导RNA序列包含SEQ ID NO:25中所
示的序列 在一些可选方式中，所述遗传修饰的免
疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:
35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，将小的设计蛋白用于占据PD-1结合位点，而不递送激动信号。在一些可选方式中，将包含残基62-136的PD-L1蛋白用于阻断结合。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述细胞因子是IL-2、IL-1β、IFNγ、IL-1、IL-7、IL-15、IL12、IL-18、IL-21或IL-33。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，所述趋化因子是CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述趋化因子选自于由如下所组成的组：EGF、Eotaxin、FGF-2、FLT-3L、Fractalkine、G-CSF、GM-CSF、GRO、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-13、IL-15、Il18A、IL-1RA、Il-1a、IL-1b、Il-2、Il-3、Il-4、Il-5、Il-6、Il-7、IL-8、IL-9、INF-α2、INFγ、IP-10、MCP-1、MCP-3、MDC、MIP-1a、MIP-1b、PDGF-AA、PDGF-BB、RANTES、TGF-α、TGF-β、VEGF、sCD401、6CKINE、BCA-1、CTACK、ENA78、Eotaxin-2、Eotaxin-3、1309、IL-16、IL-20、IL-
21、IL-23、IL-28a、IL-33、LIF、MCP-2、MCP-4、MIP-1d、SCF、SDF-1atb、TARC、TPO、TRAIL、TSLP、CCL1ra/HCC-1、CCL19/MIPβ、CCL20/MIPα、CXCL11/1-TAC、CXCL6/GCP2、CXCL7/NAP2、CXCL9/MIG、IL-11、IL-29/ING-γ、M-CSF和XCL1/淋巴细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，所述细胞中的靶基因编码TGF-β或IL-10。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码与转录激活因子结构域融合的Cas9蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，转录激活结构域包括VP16、VP64或p65激活结构域。在一些可选方式中，给予通过过继性细胞转移来进行。在一些可选方式中，通过注射直接递送至肿瘤床，来给予所述遗传修饰的免疫细胞。在一些可选方式中，所述有需要的受试者遭受癌症。在一些可选方式中，所述癌症是实体瘤。在一些可选方式中，所述实体瘤选自于由如下所组成的组：乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞表达EGFRvIII 806CAR和与CD122融合的嵌合IL7受体。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向有需要的受试者给予细胞疗法。在一些可选方式中，细胞疗法是CAR T细胞疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在将本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种引入、提供或给予至受试者以进行治疗之前、之后或同时，向有需要的受试者递送抗体或其结合片段、小分子、热休克蛋白-肽复合物或溶瘤性脊髓灰质炎病毒。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段对以下具有特异性：甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、HER2和/或p53或ras的异常产物。在一些可选方式中，该方法进一步包括向有需要的受试者给予前药。在一些可选方式中，所述前药是爱必妥、赫赛汀、更昔洛韦、FK506或二聚化的化学诱导剂。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向有所述受试者给予药物。在一些可选方式中，所述药物是他莫西芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，对所述受试者进行鉴定或选择，以接受抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向受试者引入、提供或给予额外的治疗试剂(例如化疗试剂、抗病毒试剂、或抗菌试剂)或辅助疗法(例如放射疗法和/或手术)。在一些可选方式中，所述额外的治疗试剂是抗癌疗法，所述抗癌疗法包括激素阻断疗法、化疗、小分子、单克隆抗体或其结合片段、和/或放射。在一些可选方式中，所述单克隆抗体或其结合片段对以下具有特异性：Her2、CD52、CD20、CD25、VEGF或EGRF。在一些可选方式中，所述激素阻断疗法包括他莫西芬、阿那曲唑和/或来曲唑的递送。在一些可选方式中，所述小分子包括酪氨酸激酶抑制剂、小分子药物缀合物、丝氨酸激酶抑制剂和/或苏氨酸激酶抑制剂。
[0349] 在一些可选方式中，提供了在有需要的受试者中使肿瘤和抑制性细胞的增殖最小化的方法，其中，所述方法包括：向有需要的受试者给予本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物的任一种或多种；并任选地，对所述受试者进行选择或鉴定以接受所述遗传修饰的免疫细胞，和/或在给予所述遗传修饰的免疫细胞后，对所述受试者中的肿瘤和抑制性细胞的增殖进行测量。在一些可选方式中，提供了包含第一载体的遗传修饰的免疫细胞，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88或细胞因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述T细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述T-细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质母细胞瘤。在一些可选方式中，所述载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，用于PDL1 CRISPR删除的小向导RNA的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:20中所示的序列和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID
NO:21中所示的序列 在一些可选方式中，PD-L1小
向导RNA序列包含SEQ ID NO:22中所示的序列
在一些可选方式中，用于IL-10小向导RNA序列的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:23中所示的序列 和反向引物，所述
反向引物包含SEQ ID NO:24中所示的序列
在一些可选方式中，IL-10小向导RNA序列包含SEQ ID NO:25中所示的序列
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包
含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，将小的设计蛋白用于占据PD-1结合位点，而不递送激动信号。在一些可选方式中，将包含残基62-136的PD-L1蛋白用于阻断结合。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述细胞因子是IL-2、IL-1β、IFNγ、IL-1、IL-7、IL-15、IL12、IL-18、IL-
21或IL-33。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，趋化因子是CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述趋化因子选自于由如下所组成的组：EGF、Eotaxin、FGF-2、FLT-3L、Fractalkine、G-CSF、GM-CSF、GRO、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-13、IL-15、Il18A、IL-1RA、Il-1a、IL-1b、Il-2、Il-3、Il-4、Il-5、Il-6、Il-7、IL-8、IL-9、INF-α2、INFγ、IP-10、MCP-1、MCP-3、MDC、MIP-1a、MIP-
1b、PDGF-AA、PDGF-BB、RANTES、TGF-α、TGF-β、VEGF、sCD401、6CKINE、BCA-1、CTACK、ENA78、Eotaxin-2、Eotaxin-3、1309、IL-16、IL-20、IL-21、IL-23、IL-28a、IL-33、LIF、MCP-2、MCP-
4、MIP-1d、SCF、SDF-1atb、TARC、TPO、TRAIL、TSLP、CCL1ra/HCC-1、CCL19/MIPβ、CCL20/MIPα、CXCL11/1-TAC、CXCL6/GCP2、CXCL7/NAP2、CXCL9/MIG、IL-11、IL-29/ING-γ、M-CSF和XCL1/淋巴细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:
7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，所述细胞中的靶基因编码TGF-β或IL-10。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码与转录激活因子结构域融合的Cas9蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，转录激活结构域包括VP16、VP64或p65激活结构域。在一些可选方式中，所述组合物包含：本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种，以及运载体、抗癌治疗剂、抗感染治疗剂、抗菌治疗剂、抗病毒治疗剂、或抗肿瘤治疗剂。在一些可选方式中，给予通过过继性细胞转移来进行。在一些可选方式中，通过注射直接递送至肿瘤床，来给予所述遗传修饰的免疫细胞。在一些可选方式中，所述有需要的受试者遭受癌症。在一些可选方式中，所述癌症是实体瘤。在一些可选方式中，所述实体瘤选自于由如下所组成的组：乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞表达EGFRvIII 806CAR和与CD122融合的嵌合IL7受体。在一些可选方式中，该方法进一步包括：
在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向有需要的受试者给予细胞疗法。在一些可选方式中，细胞疗法是CAR T细胞疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在将本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种引入、提供或给予至受试者以进行治疗之前、之后或同时，向有需要的受试者递送抗体或其结合片段、小分子、热休克蛋白-肽复合物或溶瘤性脊髓灰质炎病毒。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段对以下具有特异性：甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、HER2和/或p53或ras的异常产物。在一些可选方式中，该方法进一步包括向有需要的受试者给予前药。在一些可选方式中，所述前药是爱必妥、赫赛汀、更昔洛韦、FK506或二聚化的化学诱导剂。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向有受试者给予药物。在一些可选方式中，所述药物是他莫西芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，对所述受试者进行鉴定或选择，以接受抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向所述受试者引入、提供或给予额外的治疗试剂(例如化疗试剂、抗病毒试剂、或抗菌试剂)或辅助疗法(例如放射疗法和/或手术)。在一些可选方式中，所述额外的治疗试剂是抗癌疗法，所述抗癌疗法包括激素阻断疗法、化疗、小分子、单克隆抗体或其结合片段、和/或放射。在一些可选方式中，所述单克隆抗体对以下具有特异性：Her2、CD52、CD20、CD25、VEGF或EGRF。在一些可选方式中，所述激素阻断疗法包括他莫西芬、阿那曲唑和/或来曲唑的递送。在一些可选方式中，所述小分子包括酪氨酸激酶抑制剂、小分子药物缀合物、丝氨酸激酶抑制剂和/或苏氨酸激酶抑制剂。
NO:21中所示的序列 在一些可选方式中，PD-L1小
向导RNA序列包含SEQ ID NO:22中所示的序列
在一些可选方式中，用于IL-10小向导RNA序列的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:23中所示的序列 和反向引物，所述
反向引物包含SEQ ID NO:24中所示的序列
在一些可选方式中，IL-10小向导RNA序列包含SEQ ID NO:25中所示的序列
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包
含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，将小的设计蛋白用于占据PD-1结合位点，而不递送激动信号。在一些可选方式中，将包含残基62-136的PD-L1蛋白用于阻断结合。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述细胞因子是IL-2、IL-1β、IFNγ、IL-1、IL-7、IL-15、IL12、IL-18、IL-
21或IL-33。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，趋化因子是CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述趋化因子选自于由如下所组成的组：EGF、Eotaxin、FGF-2、FLT-3L、Fractalkine、G-CSF、GM-CSF、GRO、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-13、IL-15、Il18A、IL-1RA、Il-1a、IL-1b、Il-2、Il-3、Il-4、Il-5、Il-6、Il-7、IL-8、IL-9、INF-α2、INFγ、IP-10、MCP-1、MCP-3、MDC、MIP-1a、MIP-
1b、PDGF-AA、PDGF-BB、RANTES、TGF-α、TGF-β、VEGF、sCD401、6CKINE、BCA-1、CTACK、ENA78、Eotaxin-2、Eotaxin-3、1309、IL-16、IL-20、IL-21、IL-23、IL-28a、IL-33、LIF、MCP-2、MCP-
4、MIP-1d、SCF、SDF-1atb、TARC、TPO、TRAIL、TSLP、CCL1ra/HCC-1、CCL19/MIPβ、CCL20/MIPα、CXCL11/1-TAC、CXCL6/GCP2、CXCL7/NAP2、CXCL9/MIG、IL-11、IL-29/ING-γ、M-CSF和XCL1/淋巴细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:
7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，所述细胞中的靶基因编码TGF-β或IL-10。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码与转录激活因子结构域融合的Cas9蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，转录激活结构域包括VP16、VP64或p65激活结构域。在一些可选方式中，所述组合物包含：本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种，以及运载体、抗癌治疗剂、抗感染治疗剂、抗菌治疗剂、抗病毒治疗剂、或抗肿瘤治疗剂。在一些可选方式中，给予通过过继性细胞转移来进行。在一些可选方式中，通过注射直接递送至肿瘤床，来给予所述遗传修饰的免疫细胞。在一些可选方式中，所述有需要的受试者遭受癌症。在一些可选方式中，所述癌症是实体瘤。在一些可选方式中，所述实体瘤选自于由如下所组成的组：乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞表达EGFRvIII 806CAR和与CD122融合的嵌合IL7受体。在一些可选方式中，该方法进一步包括：
在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向有需要的受试者给予细胞疗法。在一些可选方式中，细胞疗法是CAR T细胞疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在将本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种引入、提供或给予至受试者以进行治疗之前、之后或同时，向有需要的受试者递送抗体或其结合片段、小分子、热休克蛋白-肽复合物或溶瘤性脊髓灰质炎病毒。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段对以下具有特异性：甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、HER2和/或p53或ras的异常产物。在一些可选方式中，该方法进一步包括向有需要的受试者给予前药。在一些可选方式中，所述前药是爱必妥、赫赛汀、更昔洛韦、FK506或二聚化的化学诱导剂。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向有受试者给予药物。在一些可选方式中，所述药物是他莫西芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，对所述受试者进行鉴定或选择，以接受抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向所述受试者引入、提供或给予额外的治疗试剂(例如化疗试剂、抗病毒试剂、或抗菌试剂)或辅助疗法(例如放射疗法和/或手术)。在一些可选方式中，所述额外的治疗试剂是抗癌疗法，所述抗癌疗法包括激素阻断疗法、化疗、小分子、单克隆抗体或其结合片段、和/或放射。在一些可选方式中，所述单克隆抗体对以下具有特异性：Her2、CD52、CD20、CD25、VEGF或EGRF。在一些可选方式中，所述激素阻断疗法包括他莫西芬、阿那曲唑和/或来曲唑的递送。在一些可选方式中，所述小分子包括酪氨酸激酶抑制剂、小分子药物缀合物、丝氨酸激酶抑制剂和/或苏氨酸激酶抑制剂。
[0350] 在一些可选方式中，提供了在有需要的受试者(例如人)中增加抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法的效率的方法，其中，所述方法包括：向有需要的受试者给予本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物的任一种或多种；并任选地，对所述受试者进行选择或鉴定以接受所述遗传修饰的免疫细胞，和/或在给予所述遗传修饰的免疫细胞后，对所述受试者中的癌症、感染、细菌、病毒或肿瘤的增殖进行测量。在一些可选方式中，提供了包含第一载体的遗传修饰的免疫细胞，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88或细胞因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述T细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述T-细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述骨髓髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质母细胞瘤。在一些可选方式中，所述载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。
在一些可选方式中，用于PDL1 CRISPR删除的小向导RNA的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:20中所示的序列 和反向引物，
所述反向引物包含SEQ ID NO:21中所示的序列
在一些可选方式中，PD-L1小向导RNA序列包含SEQ ID NO:22中所示的序列
在一些可选方式中，用于IL-10小向导RNA序列的引物包括：正向引物，
所述正向引物包含SEQ ID NO:23中所示的序列 和反
向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO:24中所示的序列
在一些可选方式中，IL-10小向导RNA序列包含SEQ ID NO:25中所示的序列
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进
一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-
10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，将小的设计蛋白用于占据PD-1结合位点，而不递送激动信号。在一些可选方式中，将包含残基62-136的PD-L1蛋白用于阻断结合。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述细胞因子是IL-2、IL-1β、IFNγ、IL-1、IL-7、IL-15、IL12、IL-
18、IL-21或IL-33。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-
2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，所述趋化因子是CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。
在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述趋化因子选自于由以下所组成的组：EGF、Eotaxin、FGF-2、FLT-3L、Fractalkine、G-CSF、GM-CSF、GRO、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-13、IL-15、Il18A、IL-1RA、Il-1a、IL-
1b、Il-2、Il-3、Il-4、Il-5、Il-6、Il-7、IL-8、IL-9、INF-α2、INFγ、IP-10、MCP-1、MCP-3、MDC、MIP-1a、MIP-1b、PDGF-AA、PDGF-BB、RANTES、TGF-α、TGF-β、VEGF、sCD401、6CKINE、BCA-
1、CTACK、ENA78、Eotaxin-2、Eotaxin-3、1309、IL-16、IL-20、IL-21、IL-23、IL-28a、IL-33、LIF、MCP-2、MCP-4、MIP-1d、SCF、SDF-1atb、TARC、TPO、TRAIL、TSLP、CCL1ra/HCC-1、CCL19/MIPβ、CCL20/MIPα、CXCL11/1-TAC、CXCL6/GCP2、CXCL7/NAP2、CXCL9/MIG、IL-11、IL-29/ING-γ、M-CSF和XCL1/淋巴细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，所述细胞中的靶基因编码TGF-β或IL-10。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-
10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码与转录激活因子结构域融合的Cas9蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，转录激活结构域包括VP16、VP64或p65激活结构域。在一些可选方式中，所述组合物包含：本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种，以及运载体、抗癌治疗剂、抗感染治疗剂、抗菌治疗剂、抗病毒治疗剂、或抗肿瘤治疗剂。在一些可选方式中，给予通过过继性细胞转移来进行。在一些可选方式中，通过注射直接递送至肿瘤床，来给予所述遗传修饰的免疫细胞。在一些可选方式中，所述有需要的受试者遭受癌症。在一些可选方式中，所述癌症是实体瘤。在一些可选方式中，所述实体瘤选自于由如下所组成的组：乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞表达EGFRvIII 806 CAR和与CD122融合的嵌合IL7受体。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向有需要的受试者给予细胞疗法。在一些可选方式中，所述细胞疗法是CAR T细胞疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在将本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种引入、提供或给予至受试者以进行治疗之前、之后或同时，向有需要的受试者递送抗体或其结合片段、小分子、热休克蛋白-肽复合物或溶瘤性脊髓灰质炎病毒。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段对以下具有特异性的：甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、HER2和/或p53或ras的异常产物。在一些可选方式中，该方法进一步包括向有需要的受试者给予前药。在一些可选方式中，所述前药是爱必妥、赫赛汀、更昔洛韦、FK506或二聚化的化学诱导剂。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向有受试者给予药物。在一些可选方式中，所述药物是他莫西芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，对所述受试者进行鉴定或选择，以接受抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法。在一些可选方式中，所述方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向所述受试者引入、提供或给予额外的治疗试剂(例如化疗试剂、抗病毒试剂、或抗菌试剂)或辅助疗法(例如放射疗法和/或手术)。在一些可选方式中，所述额外的治疗试剂是抗癌疗法，所述抗癌疗法包括激素阻断疗法、化疗、小分子、单克隆抗体或其结合片段、和/或放射。在一些可选方式中，所述单克隆抗体或其结合片段对以下具有特异性：Her2、CD52、CD20、CD25、VEGF或EGRF。在一些可选方式中，所述激素阻断疗法包括他莫西芬、阿那曲唑和/或来曲唑的递送。在一些可选方式中，所述小分子包括酪氨酸激酶抑制剂、小分子药物缀合物、丝氨酸激酶抑制剂和/或苏氨酸激酶抑制剂。
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。
在一些可选方式中，用于PDL1 CRISPR删除的小向导RNA的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:20中所示的序列 和反向引物，
所述反向引物包含SEQ ID NO:21中所示的序列
在一些可选方式中，PD-L1小向导RNA序列包含SEQ ID NO:22中所示的序列
在一些可选方式中，用于IL-10小向导RNA序列的引物包括：正向引物，
所述正向引物包含SEQ ID NO:23中所示的序列 和反
向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO:24中所示的序列
在一些可选方式中，IL-10小向导RNA序列包含SEQ ID NO:25中所示的序列
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进
一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-
10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，将小的设计蛋白用于占据PD-1结合位点，而不递送激动信号。在一些可选方式中，将包含残基62-136的PD-L1蛋白用于阻断结合。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述细胞因子是IL-2、IL-1β、IFNγ、IL-1、IL-7、IL-15、IL12、IL-
18、IL-21或IL-33。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-
2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，所述趋化因子是CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。
在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述趋化因子选自于由以下所组成的组：EGF、Eotaxin、FGF-2、FLT-3L、Fractalkine、G-CSF、GM-CSF、GRO、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-13、IL-15、Il18A、IL-1RA、Il-1a、IL-
1b、Il-2、Il-3、Il-4、Il-5、Il-6、Il-7、IL-8、IL-9、INF-α2、INFγ、IP-10、MCP-1、MCP-3、MDC、MIP-1a、MIP-1b、PDGF-AA、PDGF-BB、RANTES、TGF-α、TGF-β、VEGF、sCD401、6CKINE、BCA-
1、CTACK、ENA78、Eotaxin-2、Eotaxin-3、1309、IL-16、IL-20、IL-21、IL-23、IL-28a、IL-33、LIF、MCP-2、MCP-4、MIP-1d、SCF、SDF-1atb、TARC、TPO、TRAIL、TSLP、CCL1ra/HCC-1、CCL19/MIPβ、CCL20/MIPα、CXCL11/1-TAC、CXCL6/GCP2、CXCL7/NAP2、CXCL9/MIG、IL-11、IL-29/ING-γ、M-CSF和XCL1/淋巴细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，所述细胞中的靶基因编码TGF-β或IL-10。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-
10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码与转录激活因子结构域融合的Cas9蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，转录激活结构域包括VP16、VP64或p65激活结构域。在一些可选方式中，所述组合物包含：本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种，以及运载体、抗癌治疗剂、抗感染治疗剂、抗菌治疗剂、抗病毒治疗剂、或抗肿瘤治疗剂。在一些可选方式中，给予通过过继性细胞转移来进行。在一些可选方式中，通过注射直接递送至肿瘤床，来给予所述遗传修饰的免疫细胞。在一些可选方式中，所述有需要的受试者遭受癌症。在一些可选方式中，所述癌症是实体瘤。在一些可选方式中，所述实体瘤选自于由如下所组成的组：乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞表达EGFRvIII 806 CAR和与CD122融合的嵌合IL7受体。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向有需要的受试者给予细胞疗法。在一些可选方式中，所述细胞疗法是CAR T细胞疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在将本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种引入、提供或给予至受试者以进行治疗之前、之后或同时，向有需要的受试者递送抗体或其结合片段、小分子、热休克蛋白-肽复合物或溶瘤性脊髓灰质炎病毒。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段对以下具有特异性的：甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、HER2和/或p53或ras的异常产物。在一些可选方式中，该方法进一步包括向有需要的受试者给予前药。在一些可选方式中，所述前药是爱必妥、赫赛汀、更昔洛韦、FK506或二聚化的化学诱导剂。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向有受试者给予药物。在一些可选方式中，所述药物是他莫西芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，对所述受试者进行鉴定或选择，以接受抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法。在一些可选方式中，所述方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种之前、之后或同时，向所述受试者引入、提供或给予额外的治疗试剂(例如化疗试剂、抗病毒试剂、或抗菌试剂)或辅助疗法(例如放射疗法和/或手术)。在一些可选方式中，所述额外的治疗试剂是抗癌疗法，所述抗癌疗法包括激素阻断疗法、化疗、小分子、单克隆抗体或其结合片段、和/或放射。在一些可选方式中，所述单克隆抗体或其结合片段对以下具有特异性：Her2、CD52、CD20、CD25、VEGF或EGRF。在一些可选方式中，所述激素阻断疗法包括他莫西芬、阿那曲唑和/或来曲唑的递送。在一些可选方式中，所述小分子包括酪氨酸激酶抑制剂、小分子药物缀合物、丝氨酸激酶抑制剂和/或苏氨酸激酶抑制剂。
[0351] 在一些可选方式中，提供了制造用于对肿瘤的肿瘤微环境(TME)进行修饰的遗传修饰的免疫细胞的方法。该方法可包括向免疫细胞递送第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述第一载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β
或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。
在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-
2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述免疫细胞是T细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是遗传修饰的NK细胞。在一些可选方式中，所述T细胞是遗传修饰的T细胞。在一些可选方式中，对遗传修饰的T细胞进行遗传修饰，以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质母细胞瘤。在一些可选方式中，该方法进一步包括向所述免疫细胞递送第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸，并向所述免疫细胞递送编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，用于PDL1 CRISPR删除的小向导RNA的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:20中所示的序列 和反向引物，所述反
向引物包含SEQ ID NO:21中所示的序列 在
一些可选方式中，PD-L1小向导RNA序列包含SEQ ID NO:22中所示的序列
在一些可选方式中，用于IL-10小向导RNA序
列的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:23中所示的序列
和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO:24中所示的
序列 在一些可选方式中，IL-10小向导RNA序列包
含SEQ ID NO:25中所示的序列 在一些可选
方式中，该方法进一步包括：向所述免疫细胞递送第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及向所述免疫细胞递送第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-
23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因编码IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，该方法进一步包括使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，所述组合物包含：本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种，以及运载体、抗癌治疗剂、抗感染治疗剂、抗菌治疗剂、抗病毒治疗剂、或抗肿瘤治疗剂。
或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。
在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-
2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述免疫细胞是T细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是遗传修饰的NK细胞。在一些可选方式中，所述T细胞是遗传修饰的T细胞。在一些可选方式中，对遗传修饰的T细胞进行遗传修饰，以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质瘤。在一些可选方式中，所述肿瘤是胶质母细胞瘤。在一些可选方式中，该方法进一步包括向所述免疫细胞递送第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸，并向所述免疫细胞递送编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，用于PDL1 CRISPR删除的小向导RNA的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:20中所示的序列 和反向引物，所述反
向引物包含SEQ ID NO:21中所示的序列 在
一些可选方式中，PD-L1小向导RNA序列包含SEQ ID NO:22中所示的序列
在一些可选方式中，用于IL-10小向导RNA序
列的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:23中所示的序列
和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO:24中所示的
序列 在一些可选方式中，IL-10小向导RNA序列包
含SEQ ID NO:25中所示的序列 在一些可选
方式中，该方法进一步包括：向所述免疫细胞递送第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及向所述免疫细胞递送第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-
23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述促炎性基因编码IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，该方法进一步包括使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，所述组合物包含：本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种，以及运载体、抗癌治疗剂、抗感染治疗剂、抗菌治疗剂、抗病毒治疗剂、或抗肿瘤治疗剂。
[0352] 在一些可选方式中，提供了遗传修饰的免疫细胞作为药物的用途。所述遗传修饰的免疫细胞可包含第一载体，其中，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，诱导T细胞增殖，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述免疫细胞是T细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述免疫细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是遗传修饰的NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述第一载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:
35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白或其活性片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白或其活性片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-
1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，用于PDL1 CRISPR删除的小向导RNA的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:20中所示的序列
和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO:21中所示的序列
在一些可选方式中，PD-L1小向导RNA序列包含SEQ ID NO:22中所示
的序列 在一些可选方式中，用于IL-10小向导RNA序
列的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:23中所示的序列
和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO:24
中所示的序列 在一些可选方式中，IL-10小向导
RNA序列包含SEQ ID NO:25中所示的序列 在一些
可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。
35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白或其活性片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白或其活性片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-
1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，用于PDL1 CRISPR删除的小向导RNA的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:20中所示的序列
和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO:21中所示的序列
在一些可选方式中，PD-L1小向导RNA序列包含SEQ ID NO:22中所示
的序列 在一些可选方式中，用于IL-10小向导RNA序
列的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:23中所示的序列
和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO:24
中所示的序列 在一些可选方式中，IL-10小向导
RNA序列包含SEQ ID NO:25中所示的序列 在一些
可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。
[0353] 在一些可选方式中，提供了组合物。所述组合物可包含：本文所述的可选方式中的任一项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种，以及运载体、抗癌治疗剂、抗感染治疗剂、抗菌治疗剂、抗病毒治疗剂或抗肿瘤治疗剂。所述遗传修饰的免疫细胞可包含第一载体，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白诱导T细胞增殖，促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述免疫细胞是T细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述免疫细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是遗传修饰的NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述第一载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白或其活性片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白或其活性片段的结合不引起激动信号。
在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-
136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-
2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，用于PDL1CRISPR删除的小向导RNA的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:20中所示的序列 和反向引物，所述反向引物包含
SEQ ID NO:21中所示的序列 在一些可选方式中，PD-
L1小向导RNA序列包含SEQ ID NO:22中所示的序列
在一些可选方式中，用于IL-10小向导RNA序列的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:23中所示的序列 和反向引物，所述反
向引物包含SEQ ID NO:24中所示的序列 在
一些可选方式中，IL-10小向导RNA序列包含SEQ ID NO:25中所示的序列
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一
步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。
在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-
136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-
2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，用于PDL1CRISPR删除的小向导RNA的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:20中所示的序列 和反向引物，所述反向引物包含
SEQ ID NO:21中所示的序列 在一些可选方式中，PD-
L1小向导RNA序列包含SEQ ID NO:22中所示的序列
在一些可选方式中，用于IL-10小向导RNA序列的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:23中所示的序列 和反向引物，所述反
向引物包含SEQ ID NO:24中所示的序列 在
一些可选方式中，IL-10小向导RNA序列包含SEQ ID NO:25中所示的序列
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一
步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。
[0354] 在一些可选方式中，在有需要的受试者(例如人)的肿瘤微环境中对免疫应答的抑制进行调节的方法，所述方法可包括给予本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的组合物的任一种，以及运载体、抗癌治疗剂、抗感染治疗剂、抗菌治疗剂、抗病毒治疗剂、或抗肿瘤治疗剂。所述遗传修饰的免疫细胞可包含第一载体，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，诱导T细胞增殖，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，免疫细胞是T细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述免疫细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是遗传修饰的NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述第一载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白或其活性片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白或其活性片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，用于PDL1 CRISPR删除的小向导RNA的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:20中所示的序列 和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO:21中所示的序列
在一些可选方式中，PD-L1小向导RNA序列包含SEQ ID NO:22中所示的序列
在一些可选方式中，用于IL-10小向导RNA序列的引物包
括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:23中所示的序列
和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO:24中所示的序列
在一些可选方式中，IL-10小向导RNA序
列包含SEQ ID NO:25中所示的序列 在一些可选方
式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-
12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，所述组合物包含：本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种，以及运载体、抗癌治疗剂、抗感染治疗剂、抗菌治疗剂、抗病毒治疗剂、或抗肿瘤治疗剂。在一些可选方式中，给予通过过继性细胞转移来进行。在一些可选方式中，通过注射直接递送至肿瘤床，来给予所述遗传修饰的免疫细胞。在一些可选方式中，对有需要的受试者(其遭受癌症或患有癌症的受试者)进行选择，以接受抗癌疗法。在一些可选方式中，癌症是实体瘤。在一些可选方式中，所述实体瘤选自于由如下所组成的组：乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞表达EGFRvIII806CAR和与CD122融合的嵌合IL7受体。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向有需要的受试者给予细胞疗法。在一些可选方式中，所述细胞疗法是CAR T细胞疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在将本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物引入、提供或给予至受试者以进行治疗之前、之后或同时，向有需要的受试者递送抗体或其结合片段、小分子、热休克蛋白-肽复合物或溶瘤性脊髓灰质炎病毒。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段对以下具有特异性：甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、HER2和/或p53或ras的异常产物。在一些可选方式中，该方法进一步包括向有需要的受试者给予前药。在一些可选方式中，所述前药是爱必妥、赫赛汀、更昔洛韦、FK506或二聚化的化学诱导剂。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向有所述受试者给予药物。在一些可选方式中，对所述受试者进行鉴定或选择，以接受抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向所述受试者引入、提供或给予额外的治疗试剂(例如化疗试剂、抗病毒试剂、或抗菌试剂)或辅助疗法(例如放射疗法和/或手术)。在一些可选方式中，所述额外的治疗试剂是抗癌疗法，所述抗癌疗法包括激素阻断疗法、化疗、小分子、单克隆抗体或其结合片段、和/或放射。在一些可选方式中，所述单克隆抗体或其结合片段对以下具有特异性：Her2、CD52、CD20、CD25、VEGF或EGRF。在一些可选方式中，所述激素阻断疗法包括他莫西芬、阿那曲唑和/或来曲唑的递送。在一些可选方式中，所述小分子包括酪氨酸激酶抑制剂、小分子药物缀合物、丝氨酸激酶抑制剂和/或苏氨酸激酶抑制剂。
在一些可选方式中，PD-L1小向导RNA序列包含SEQ ID NO:22中所示的序列
在一些可选方式中，用于IL-10小向导RNA序列的引物包
括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:23中所示的序列
和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO:24中所示的序列
在一些可选方式中，IL-10小向导RNA序
列包含SEQ ID NO:25中所示的序列 在一些可选方
式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-
12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，所述组合物包含：本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种，以及运载体、抗癌治疗剂、抗感染治疗剂、抗菌治疗剂、抗病毒治疗剂、或抗肿瘤治疗剂。在一些可选方式中，给予通过过继性细胞转移来进行。在一些可选方式中，通过注射直接递送至肿瘤床，来给予所述遗传修饰的免疫细胞。在一些可选方式中，对有需要的受试者(其遭受癌症或患有癌症的受试者)进行选择，以接受抗癌疗法。在一些可选方式中，癌症是实体瘤。在一些可选方式中，所述实体瘤选自于由如下所组成的组：乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞表达EGFRvIII806CAR和与CD122融合的嵌合IL7受体。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向有需要的受试者给予细胞疗法。在一些可选方式中，所述细胞疗法是CAR T细胞疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在将本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物引入、提供或给予至受试者以进行治疗之前、之后或同时，向有需要的受试者递送抗体或其结合片段、小分子、热休克蛋白-肽复合物或溶瘤性脊髓灰质炎病毒。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段对以下具有特异性：甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、HER2和/或p53或ras的异常产物。在一些可选方式中，该方法进一步包括向有需要的受试者给予前药。在一些可选方式中，所述前药是爱必妥、赫赛汀、更昔洛韦、FK506或二聚化的化学诱导剂。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向有所述受试者给予药物。在一些可选方式中，对所述受试者进行鉴定或选择，以接受抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向所述受试者引入、提供或给予额外的治疗试剂(例如化疗试剂、抗病毒试剂、或抗菌试剂)或辅助疗法(例如放射疗法和/或手术)。在一些可选方式中，所述额外的治疗试剂是抗癌疗法，所述抗癌疗法包括激素阻断疗法、化疗、小分子、单克隆抗体或其结合片段、和/或放射。在一些可选方式中，所述单克隆抗体或其结合片段对以下具有特异性：Her2、CD52、CD20、CD25、VEGF或EGRF。在一些可选方式中，所述激素阻断疗法包括他莫西芬、阿那曲唑和/或来曲唑的递送。在一些可选方式中，所述小分子包括酪氨酸激酶抑制剂、小分子药物缀合物、丝氨酸激酶抑制剂和/或苏氨酸激酶抑制剂。
[0355] 在一些可选方式中，提供了在有需要的受试者中使肿瘤和抑制性细胞的增殖最小化的方法。所述方法可包括：向有需要的受试者给予本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种、或组合物的任一种；并任选地，对所述受试者进行选择或鉴定以接受所述遗传修饰的免疫细胞，和/或在给予所述遗传修饰的免疫细胞后，对所述受试者中的肿瘤和抑制性细胞的增殖进行测量。所述遗传修饰的免疫细胞可包含第一载体，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，诱导T细胞增殖，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述免疫细胞是T细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述免疫细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是遗传修饰的NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述第一载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白或其活性片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白或其活性片段的结合不引起激动信号。
在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-
136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-
2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-
10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，用于PDL1 CRISPR删除的小向导RNA的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:20中所示的序列 和反向引物，所述反
向引物包含SEQ ID NO:21中所示的序列
在一些可选方式中，PD-L1小向导RNA序列包含SEQ ID NO:22中所示的序列
在一些可选方式中，用于IL-10小向导RNA序
列的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:23中所示的序列
和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID
NO:24中所示的序列 在一些可选方式中，IL-10
小向导RNA序列包含SEQ ID NO:25中所示的序列 在
一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶
(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，所述组合物包含：本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种，以及运载体、抗癌治疗剂、抗感染治疗剂、抗菌治疗剂、抗病毒治疗剂、或抗肿瘤治疗剂。在一些可选方式中，给予通过过继性细胞转移来进行。在一些可选方式中，通过注射直接递送至肿瘤床，来给予遗传修饰的免疫细胞。在一些可选方式中，对有需要的受试者(其遭受癌症或患有癌症的受试者)进行选择，以接受抗癌疗法。在一些可选方式中，癌症是实体瘤。在一些可选方式中，所述实体瘤选自于由如下所组成的组：乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞表达EGFRvIII
806CAR和与CD122融合的嵌合IL7受体。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向有需要的受试者给予细胞疗法。在一些可选方式中，所述细胞疗法是CAR T细胞疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在将本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物引入、提供或给予至受试者以进行治疗之前、之后或同时，向有需要的受试者递送抗体或其结合片段、小分子、热休克蛋白-肽复合物或溶瘤性脊髓灰质炎病毒。
在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段对以下具有特异性：甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-
125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、HER2和/或p53或ras的异常产物。在一些可选方式中，该方法进一步包括向有需要的受试者给予前药。在一些可选方式中，所述前药是爱必妥、赫赛汀、更昔洛韦、FK506或二聚化的化学诱导剂。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向有所述受试者给予药物。在一些可选方式中，对所述受试者进行鉴定或选择，以接受抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向所述受试者引入、提供或给予额外的治疗试剂(例如化疗试剂、抗病毒试剂、或抗菌试剂)或辅助疗法(例如放射疗法和/或手术)。在一些可选方式中，所述额外的治疗试剂是抗癌疗法，所述抗癌疗法包括激素阻断疗法、化疗、小分子、单克隆抗体或其结合片段、和/或放射。在一些可选方式中，所述单克隆抗体或其结合片段对以下具有特异性：Her2、CD52、CD20、CD25、VEGF或EGRF。在一些可选方式中，所述激素阻断疗法包括他莫西芬、阿那曲唑和/或来曲唑的递送。在一些可选方式中，所述小分子包括酪氨酸激酶抑制剂、小分子药物缀合物、丝氨酸激酶抑制剂和/或苏氨酸激酶抑制剂。
在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-
136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-
2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-
10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，用于PDL1 CRISPR删除的小向导RNA的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:20中所示的序列 和反向引物，所述反
向引物包含SEQ ID NO:21中所示的序列
在一些可选方式中，PD-L1小向导RNA序列包含SEQ ID NO:22中所示的序列
在一些可选方式中，用于IL-10小向导RNA序
列的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:23中所示的序列
和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID
NO:24中所示的序列 在一些可选方式中，IL-10
小向导RNA序列包含SEQ ID NO:25中所示的序列 在
一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶
(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，所述组合物包含：本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种，以及运载体、抗癌治疗剂、抗感染治疗剂、抗菌治疗剂、抗病毒治疗剂、或抗肿瘤治疗剂。在一些可选方式中，给予通过过继性细胞转移来进行。在一些可选方式中，通过注射直接递送至肿瘤床，来给予遗传修饰的免疫细胞。在一些可选方式中，对有需要的受试者(其遭受癌症或患有癌症的受试者)进行选择，以接受抗癌疗法。在一些可选方式中，癌症是实体瘤。在一些可选方式中，所述实体瘤选自于由如下所组成的组：乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞表达EGFRvIII
806CAR和与CD122融合的嵌合IL7受体。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向有需要的受试者给予细胞疗法。在一些可选方式中，所述细胞疗法是CAR T细胞疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在将本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物引入、提供或给予至受试者以进行治疗之前、之后或同时，向有需要的受试者递送抗体或其结合片段、小分子、热休克蛋白-肽复合物或溶瘤性脊髓灰质炎病毒。
在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段对以下具有特异性：甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-
125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、HER2和/或p53或ras的异常产物。在一些可选方式中，该方法进一步包括向有需要的受试者给予前药。在一些可选方式中，所述前药是爱必妥、赫赛汀、更昔洛韦、FK506或二聚化的化学诱导剂。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向有所述受试者给予药物。在一些可选方式中，对所述受试者进行鉴定或选择，以接受抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向所述受试者引入、提供或给予额外的治疗试剂(例如化疗试剂、抗病毒试剂、或抗菌试剂)或辅助疗法(例如放射疗法和/或手术)。在一些可选方式中，所述额外的治疗试剂是抗癌疗法，所述抗癌疗法包括激素阻断疗法、化疗、小分子、单克隆抗体或其结合片段、和/或放射。在一些可选方式中，所述单克隆抗体或其结合片段对以下具有特异性：Her2、CD52、CD20、CD25、VEGF或EGRF。在一些可选方式中，所述激素阻断疗法包括他莫西芬、阿那曲唑和/或来曲唑的递送。在一些可选方式中，所述小分子包括酪氨酸激酶抑制剂、小分子药物缀合物、丝氨酸激酶抑制剂和/或苏氨酸激酶抑制剂。
[0356] 在一些可选方式中，提供了在有需要的受试者中增加抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法的效率的方法。所述方法可包括：向有需要的受试者给予本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种、或组合物的任一种；并任选地，选择或鉴定所述受试者以接受所述遗传修饰的免疫细胞，和/或在给予所述遗传修饰的免疫细胞后，对所述受试者中的癌症、感染、细菌、病毒或肿瘤的增殖进行测量。在一些可选方式中，所述组合物包含：本文所述的可选方式中的任一项或多项所述的遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种，以及运载体、抗癌治疗剂、抗感染治疗剂、抗菌治疗剂、抗病毒治疗剂、或抗肿瘤治疗剂。所述遗传修饰的免疫细胞可包含第一载体，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，诱导T细胞增殖，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述免疫细胞是T细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述免疫细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是遗传修饰的NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述第一载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白或其活性片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白或其活性片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。
在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-
2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，用于PDL1CRISPR删除的小向导RNA的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:20中所示的序列 和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO:
21中所示的序列 在一些可选方式中，PD-
L1小向导RNA序列包含SEQ ID NO:22中所示的序列
在一些可选方式中，用于IL-10小向导RNA序列的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:23中所示的序列 和反向引物，所述反
向引物包含SEQ ID NO:24中所示的序列
在一些可选方式中，IL-10小向导RNA序列包含SEQ ID NO:25中所示的序列
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步
包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，给予通过过继性细胞转移来进行。在一些可选方式中，通过注射直接递送至肿瘤床，来给予遗传修饰的免疫细胞。在一些可选方式中，对有需要的受试者(其遭受癌症或患有癌症的受试者)进行选择，以接受抗癌疗法。在一些可选方式中，所述癌症是实体瘤。在一些可选方式中，所述实体瘤选自于由如下所组成的组：
乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞表达EGFRvIII 806CAR和与CD122融合的嵌合IL7受体。在一些可选方式中，该方法进一步包括：
在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向有需要的受试者给予细胞疗法。在一些可选方式中，所述细胞疗法是CAR T细胞疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在将本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物引入、提供或给予至受试者以进行治疗之前、之后或同时，向有需要的受试者递送抗体或其结合片段、小分子、热休克蛋白-肽复合物或溶瘤性脊髓灰质炎病毒。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段对如下具有特异性：甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、HER2和/或p53或ras的异常产物。在一些可选方式中，该方法进一步包括向有需要的受试者给予前药。
在一些可选方式中，所述前药是爱必妥、赫赛汀、更昔洛韦、FK506或二聚化的化学诱导剂。
在一些可选方式中，对所述受试者进行鉴定或选择，以接受抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向所述受试者引入、提供或给予额外的治疗试剂(例如化疗试剂、抗病毒试剂、或抗菌试剂)或辅助疗法(例如放射疗法和/或手术)。在一些可选方式中，所述额外的治疗试剂是抗癌疗法，所述抗癌疗法包括激素阻断疗法、化疗、小分子、单克隆抗体或其结合片段、和/或放射。在一些可选方式中，所述单克隆抗体或其结合片段对以下具有特异性：Her2、CD52、CD20、CD25、VEGF或EGRF。在一些可选方式中，所述激素阻断疗法包括他莫西芬、阿那曲唑和/或来曲唑的递送。在一些可选方式中，所述小分子包括酪氨酸激酶抑制剂、小分子药物缀合物、丝氨酸激酶抑制剂和/或苏氨酸激酶抑制剂。更多的可选方式涉及上述遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种单独或组合用作药物。
在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-
2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，用于PDL1CRISPR删除的小向导RNA的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:20中所示的序列 和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO:
21中所示的序列 在一些可选方式中，PD-
L1小向导RNA序列包含SEQ ID NO:22中所示的序列
在一些可选方式中，用于IL-10小向导RNA序列的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:23中所示的序列 和反向引物，所述反
向引物包含SEQ ID NO:24中所示的序列
在一些可选方式中，IL-10小向导RNA序列包含SEQ ID NO:25中所示的序列
在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步
包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。在一些可选方式中，给予通过过继性细胞转移来进行。在一些可选方式中，通过注射直接递送至肿瘤床，来给予遗传修饰的免疫细胞。在一些可选方式中，对有需要的受试者(其遭受癌症或患有癌症的受试者)进行选择，以接受抗癌疗法。在一些可选方式中，所述癌症是实体瘤。在一些可选方式中，所述实体瘤选自于由如下所组成的组：
乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞表达EGFRvIII 806CAR和与CD122融合的嵌合IL7受体。在一些可选方式中，该方法进一步包括：
在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向有需要的受试者给予细胞疗法。在一些可选方式中，所述细胞疗法是CAR T细胞疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在将本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物引入、提供或给予至受试者以进行治疗之前、之后或同时，向有需要的受试者递送抗体或其结合片段、小分子、热休克蛋白-肽复合物或溶瘤性脊髓灰质炎病毒。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段对如下具有特异性：甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、HER2和/或p53或ras的异常产物。在一些可选方式中，该方法进一步包括向有需要的受试者给予前药。
在一些可选方式中，所述前药是爱必妥、赫赛汀、更昔洛韦、FK506或二聚化的化学诱导剂。
在一些可选方式中，对所述受试者进行鉴定或选择，以接受抗癌疗法、抗感染疗法、抗菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法。在一些可选方式中，该方法进一步包括：在引入、提供或给予本文所述的可选方式中的任一项所述的细胞的任一种或多种、或本文所述的可选方式中的任一项所述的组合物之前、之后或同时，向所述受试者引入、提供或给予额外的治疗试剂(例如化疗试剂、抗病毒试剂、或抗菌试剂)或辅助疗法(例如放射疗法和/或手术)。在一些可选方式中，所述额外的治疗试剂是抗癌疗法，所述抗癌疗法包括激素阻断疗法、化疗、小分子、单克隆抗体或其结合片段、和/或放射。在一些可选方式中，所述单克隆抗体或其结合片段对以下具有特异性：Her2、CD52、CD20、CD25、VEGF或EGRF。在一些可选方式中，所述激素阻断疗法包括他莫西芬、阿那曲唑和/或来曲唑的递送。在一些可选方式中，所述小分子包括酪氨酸激酶抑制剂、小分子药物缀合物、丝氨酸激酶抑制剂和/或苏氨酸激酶抑制剂。更多的可选方式涉及上述遗传修饰的免疫细胞的任一种或多种单独或组合用作药物。
[0357] 在一些可选方式中，将本文所述的可选方式中的任一项所述的遗传修饰的免疫细胞用作药物来例如治疗或抑制癌症。所述遗传修饰的免疫细胞可包含第一载体，所述第一载体包含编码蛋白的核酸，所述蛋白促进内源性或过继性转移的NK细胞或T细胞的存留和激活，诱导T细胞增殖，和/或诱导白细胞介素、干扰素、PD-1检查点结合蛋白、HMGB1、MyD88、细胞因子或趋化因子的产生。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述免疫细胞是T细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是修饰的T细胞。在一些可选方式中，对所述免疫细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)。在一些可选方式中，所述免疫细胞是NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是遗传修饰的NK细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞是髓系细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是巨噬细胞。在一些可选方式中，所述髓系细胞是小胶质细胞。在一些可选方式中，所述免疫细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述第一载体是病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些可选方式中，所述慢病毒载体包装用有Vpx蛋白。在一些可选方式中，所述蛋白支持或促进T细胞和/或NK细胞抗肿瘤活性。在一些可选方式中，所述蛋白是TGFΒRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL12、IL-18或IL21。在一些可选方式中，IL-15由SEQ ID NO:35中所示的序列编码。可用包含SEQ ID NO:36中所示的序列的正向克隆引物和包含SEQ ID NO:37中所示的序列的反向克隆引物扩增IL-15。在一些可选方式中，所述蛋白包括干扰素α、干扰素β或干扰素γ。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1检查点结合抑制剂。在一些可选方式中，所述PD-1检查点结合抑制剂是PD-L1蛋白或其活性片段，其中，在结合PD-1时，所述PD-L1蛋白或其活性片段的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述蛋白包括PD-1蛋白片段，其中，所述PD-1蛋白片段结合由肿瘤细胞和/或相关巨噬细胞表达的PD-L1或PD-L2，其中，在结合时，所述PD-1蛋白片段与PD-L1或PD-L2的结合不引起激动信号。在一些可选方式中，所述PD-L1蛋白片段包含PD-L1的第62-136位氨基酸(SEQ ID NO:7)。在一些可选方式中，所述蛋白是PD-1检查点结合蛋白与干扰素α、干扰素β或干扰素γ的融合体。在一些可选方式中，所述蛋白是T细胞趋化因子或NK细胞趋化因子。在一些可选方式中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、Eotaxin、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含第二载体，其中，所述第二载体包含编码Cas9核酸内切酶的核酸和编码CRISPR向导RNA的核酸，其中，所述CRISPR向导RNA与所述免疫细胞中的至少一个靶基因互补，其中，所述核酸可存在于所述第二载体或第三载体上。在一些可选方式中，所述第二载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述Cas9进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，所述靶基因是PD-L1、TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，用于PDL1 CRISPR删除的小向导RNA的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:20中所示的序列 和反向引物，所
述反向引物包含SEQ ID NO:21中所示的序列 在
一些可选方式中，PD-L1小向导RNA序列包含SEQ ID NO:22中所示的序列
在一些可选方式中，用于IL-10小向导RNA序
列的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:23中所示的序列
和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO:
24中所示的序列 在一些可选方式中，IL-10小向导
RNA序列包含SEQ ID NO:25中所示的序列 在一
些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。
在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。
述反向引物包含SEQ ID NO:21中所示的序列 在
一些可选方式中，PD-L1小向导RNA序列包含SEQ ID NO:22中所示的序列
在一些可选方式中，用于IL-10小向导RNA序
列的引物包括：正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:23中所示的序列
和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO:
24中所示的序列 在一些可选方式中，IL-10小向导
RNA序列包含SEQ ID NO:25中所示的序列 在一
些可选方式中，所述遗传修饰的免疫细胞进一步包含：第四载体，其中，所述第四载体编码Cas9 VP64融合蛋白，以激活第二蛋白的转录和翻译；以及第五载体，其中，所述第五载体包含与所述细胞中的至少一个靶基因互补的CRISPR向导RNA。在一些可选方式中，所述第二蛋白是IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23或GM-CSF。在一些可选方式中，所述第四载体是mRNA。在一些可选方式中，对所述mRNA进行密码子优化，以用于在真核细胞(例如人细胞)中表达。在一些可选方式中，至少一个靶基因是内源性促炎性基因。在一些可选方式中，所述至少一个靶基因编码TGF-β、IL-10、精氨酸酶、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7β或PGE。在一些可选方式中，所述第一载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统、或诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。
在一些可选方式中，编码所述蛋白的核酸处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述调控元件是可由药物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由类固醇(例如雌激素受体的配体)诱导的启动子。在一些可选方式中，所述调控元件是可由他莫西芬和/或其代谢物诱导的启动子。在一些可选方式中，所述细胞选自于由巨噬细胞、同种异体细胞、髓系细胞、单核细胞和原代人单核细胞所组成的组。在一些可选方式中，所述细胞是原代人单核细胞。在一些可选方式中，使所述免疫细胞分化。在一些可选方式中，通过将细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成促炎性表型。在一些可选方式中，通过将细胞与巨噬细胞集落刺激因子一起培养，来使所述免疫细胞分化成抗炎性表型。
[0358] 本领域技术人员将理解的是，一般而言，本文所使用的术语，特别是所附权利要求中(例如，在所附权利要求的主体部分中)使用的术语，一般地意为“开放”术语(例如，术语“包括/包含(including)”应解释为“包括/包含但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“包括/包含(includes)，应解释为“包括/包含但不限于”等)。本领域技术人员将进一步理解的是，如果意在所引入的权利要求中叙述具体数量，则这种意图将在该权利要求明确叙述，而在没有这种叙述的情况下，则不存在这种意图。例如，作为理解的辅助，以下所附权利要求可能包括引导短语“至少一个”和“一个以上”的使用，来引入权利要求叙述物。然而，即使当同一权利要求包括引导短语“一个或多个”或“至少一个”以及不定冠词如“一”或“一个”(例如，“一”和/或“一个”应解释为意指“至少一个”或“一个以上”)时，这种短语的使用不应被解释为意味着，由不定冠词“一”或“一个”引入的权利要求叙述物将包含该引入的权利要求叙述物的任何特定权利要求限制为仅包含一个这样的叙述物的实施方式；对于用于引入权利要求叙述物的定冠词的使用也同样适用。另外，即使明确叙述了所引入权利要求叙述物的具体数量，本领域技术人员应认识到，这种叙述应解释为意指至少是所叙述的数量(例如，不存在其它修饰语的简要叙述“两个叙述物”意指至少两个该叙述物，或者两个以上该叙述物)。此外，在使用惯例类似于“A、B和C等中至少一个”的那些情况下，一般而言该造句意为本领域技术人员理解该惯例所具有的含义(例如，“具有A、B和C中至少一个的系统”应包括但不限于单独具有A、单独具有B、单独具有C、具有A和B、具有A和C、具有B和C、和/或具有A、B和C的系统等)。本领域技术人员将会进一步理解的是，实质上表示两个以上可选项目的任意转折连词和/或短语，无论是在说明书、权利要求书或者附图中，都应被理解为考虑了包括这些项目之一、这些项目任一者、或两个项目的可能性。例如，短语“A或B”应被理解为包括“A”或“B”、或“A和B”的可能性。
[0359] 另外，在以马库什群组的方式描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员应认识到，本公开由此也是以该马库什群组中的任意单独成员或成员的子群组来描述的。
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