—种携带TGF-β R II和NKG2D基因的ΝΚ92细胞株、制备方法及用途
技术领域
[0001] 本
发明属于
肿瘤过继
治疗领域，具体涉及一种携带TGF-β R II和NKG2D基因的ΝΚ92细胞株、制备方法及用途。
背景技术
[0002] 上世纪80年代相继发现了 TGF- β 1，TGF- β 2，TGF- β 3，到目前为止，该家族成员又增加了 TGF-β 4，TGF-β 5。该家族成员的受体有TGF-β R I，TGF-β R II (转化生长因子β II型受体)和TGF-β R III三种类型。在
炎症及肿瘤发生的早期TGF-β主要抑制炎症及肿瘤的发展，但是在肿瘤发生的晚期，其主要促进细胞的发生、分化、粘附、迁移等作用从而促进了肿瘤的转移。肿瘤细胞会分泌大量的TGF-β，造成了肿瘤局部微环境中存在大量的TGF-β，在肿瘤发生的早期，一些肿瘤细胞可以通过改变其受体或者是SMAD等途径来逃脱TGF-β诱导的生长，在肿瘤发生的晚期TGF-β主要促进了肿瘤细胞的生长，分化，迁移等从而促进了肿瘤的发展。同时在肿瘤微环境中TGF-β可以抑制杀伤性T细胞和NK细胞的杀伤功能。TGF-β R主要有三种受体，TGF-β首先要与细胞表面II型受体结合后才能与I型受体结合形成复合物进而传导
信号，而TGF-β III型受体没有信号转导的功能，所以TGF-β R II是最重要的信号受体。一项研究表明低表达TGF-13RlI增加了
乳腺癌的发生
风险，同时还发现从人的肿瘤病灶中分离出来的细胞其TGF-β R II的基因也发生了突变。NK92细胞是1994年建立的来自非何杰金淋巴瘤病人的NK细胞系，其免疫表型为CD56brightCD16-，无ADCC效应，具有高效广谱的抗肿瘤作用，故成为临床应用研究中的最为关注的一个NK细胞系。本研究拟构建表达TGF-13R II胞外段跨膜区及NKG2D (NK细胞的活化型受体、可识 别MHC-1类分子，在天然免疫中发挥重要作用)胞内段的融合基因的NK92细胞，达到能够靶向肿瘤微环境并被激活的目的，同时减少TGF- β对其他细胞的影响。 发明内容
[0003] 本发明的目的在于克服上述问题，提供一种通过慢病毒
转染方法得到的、靶向肿瘤
抗原、减少肿瘤转移、适用于肿瘤的临床过继免疫治疗的携带TGF-β R II和NKG2D基因的ΝΚ92细胞株、制备方法及用途。
[0004] 携带TGF-PR II和NKG2D基因的ΝΚ92细胞株、制备方法及用途这三项发明创造具有共同的
特定技术特征:重组有TGF-β R II胞外段跨膜区和NKG2D胞内段构成的融合基因TN,属于一个相同的发明构思，符合单一'I"生要求。
[0005] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为:一种携带TGF_i3R II和NKG2D基因的ΝΚ92细胞株，其特征在于:所述的ΝΚ92细胞株转染有TGF-β R II胞外段跨膜区和NKG2D胞内段构成的融合基因ΤΝ。
[0006] 前述的一种携带TGF-β R II和NKG2D基因的ΝΚ92细胞株，所述的ΝΚ92细胞株的免疫表型为⑶56强阳性、⑶16阴性和⑶3阴性，呈抱团悬浮生长状态。
[0007] 前述的一种携带TGF-β R II和NKG2D基因的ΝΚ92细胞株，所述的融合基因TN位于重组慢病毒穿梭载体上。
[0008] 前述的一种携带TGF- β R II和NKG2D基因的ΝΚ92细胞株，所述的重组慢病毒穿梭载体设有YFP筛选基因。
[0009] 制备上述的ΝΚ92细胞株的方法，包括如下步骤:a)克隆TGF- β R II胞外段跨膜区和NKG2D胞内段构成的融合基因TN ;b)构建重组TGF-β R II胞外段跨膜区和NKG2D胞内段的慢病毒穿梭载体，联同
包装载体转染293Τ细胞，获得慢病毒颗粒；c)转导NK92细胞；d)分选成功转染融合基因TN的NK92细胞。
[0010] 所述的步骤a具体为:提取人外周血淋巴细胞的总RNA，经RT-PCR获得cDNA，分别用两对引物经PCR扩增出TGF-13R II胞外段跨膜区和NKG2D的胞内段两段基因，采用重叠延伸拼接PCR法将TGF- β R II和NKG2D基因连接成单链基因ΤΝ。
[0011] 所述的步骤b)具体为:将单链基因TN重组到质粒载体；将重组有TN的质粒载体及空载慢病毒穿梭载体酶切并连接，得到重组慢病毒穿梭载体；重组慢病毒穿梭载体联同包装载体Λ R、VSV-G、Rev通过
磷酸钙法转染293T细胞，并培养一定时间。
[0012] 所述的步骤d具体为:培养经转导的NK92细胞并收集，通过流式细胞分选仪分选YFP阳性的细胞并进行优化培养。
[0013] 前述的携带TGF-PR II和NKG2D基因的NK92细胞株的用途在于:靶向肿瘤微环境，抗肿瘤并抑制肿瘤扩散作用下，所述的细胞株的激活程度增加。
[0014] 本发明公开了一种携带TGF-β R II胞外段跨膜区及NKG2D胞内段的自然杀伤细胞株(NK92-TN)及其制备方法、用 途，制备时首先将TGF-13R II胞外段跨膜区和NKG2D胞内段两段基因融合，将融合基因TN插入慢病毒制备的穿梭质粒中，与其他包装质粒通过磷酸钙方法转染293T细胞，获得慢病毒颗粒，进而转导NK92细胞，通过流式细胞分选仪分选YFP阳性的细胞，适用于临床过继免疫治疗肿瘤，这一细胞株的抗肿瘤能
力优于其他靶向肿瘤抗原的细胞株，在TGF-β环境下能被有效激活，并有效抑制肿瘤的转移。
附图说明
[0015] 图1为TGF-β R II胞外段跨膜区及NKG2D胞内段融合基因的结构示意图；
[0016] 图2为流式细胞术检测TGF-β R II基因的表达的结果；
[0017] 图3为非
放射性细胞毒性检测ΝΚ92-ΤΝ细胞杀伤的结果，其中TN+TGF- β指ΝΚ92内转染有TN基因并且在TGF-β环境下，TN指ΝΚ92内转染有TN基因并且不在TGF-β环境下，Venus+TGF-β指的是ΝΚ92内转染有空载慢病毒载体并且在TGF-β环境下，Venus指的是NK92内转染有空载慢病毒载体并且不在TGF-β环境下；
[0018] 图4为通过裸鼠肝癌模型验证ΝΚ92-ΤΝ的抗肿瘤能力的结果图。
具体实施方式
[0019] 下面结合附图和具体
实施例对本发明作进一步说明。
[0020] 实施例一:携带TN基因的ΝΚ92细胞株的构建[0021 ] (I)构建重组融合基因TN的质粒载体[0022] 1.1融合基因TN的制备过程为:提取人外周血淋巴细胞的总RNA，RT-PCR获得cDNA,以cDNA为模板，分别用引物P1/P2和P3/P4，PCR扩增出TGF-β R II胞外段跨膜区和NKG2D的胞内段两段基因。采用重叠延伸拼接PCR法(splicing by overlapping extensionPCR，SOE-PCR)用Pl和P4将TGF-β R II和NKG2D基因连接成单链基因TN。引物见下述的表I。
[0023] 表I构建融合基因TN的引物
[0024]
[0025] 上述PCR产物经1%琼脂糖凝胶
电泳鉴定，在750bp
位置上有明显的条带，与预期(720bp)分子量一致，该结果表明我们已经获得融合基因TN的DNA
片段。
[0026] 1.2将上述PCR所得的片段通过A尾连接到pGEM-T (promega公司产品)载体上，转化大肠杆菌DH5 α (由无
锡贝瑞康
生物科技有限公司保存)，取3-4个重组菌落克隆的重组转移载体pGEM-T-TN进行基因的测序(测序工作由上海生工完成)，测序结果与GENBANK公布的cDNA序列一致。
[0027] (2)重组慢病毒穿梭载体的构建
[0028] 取测序鉴定正确的pEGM-T-TN质粒及空载的慢病毒穿梭载体pRRL-Venus，进行BamHI酶切，回收酶切所得片段。按以下体系连接:pRRL_Venus3 μ 1，pEGM_T_TN5 μ I，Τ4连接酶I μ 1，IOx连接缓冲液I μ l，4°c连接过夜。将连接产物转化感受态DH5a菌，挑菌BamH I 30°酶切3h，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，在8kb和0.7kb处有条带，并将重组质粒送至上海生工测序。测序结果表明，我们获得了重组慢病毒穿梭载体。
[0029] (3)慢病毒的包装及获取
[0030] 接种2x106293T细胞于60mm细胞培养皿，培养至细胞铺满皿底的70 %以上，于包装病毒前3-4h换液备用。分光光度计分别检测所
抽取的重组的慢病毒穿梭载体pRRL-Venus-TN、空的慢病毒穿梭载体pRRL-Venus、包装载体Λ R、VSV-G、Rev的质粒浓度。取1(^8重组或空的慢病毒穿梭载体，6.5“8厶1?、3.54 8 VSV-G.2.5μ g Rev混匀，加无菌
水补充总体积至450 μ 1，再加入50 μ 12mol / L无菌CaCl2并轻轻混匀。将该混合物缓缓滴入500ul经过滤的2xHBS(pH7.05-7.10)中，静置5分钟后将I ml上述混合物缓缓滴入一个培养293T细胞的培养皿中，37°C>5% CO2
培养箱培养12h_18h后轻柔换液，再过12h后将2x106NK92细胞分别加入不同病毒制备的培养皿中，大约20h后从培养皿中收集上清，1200r/min, 5min,离心收集 NK92 细胞。
[0031] (4)携带NK92-TN细胞系的制备
[0032] 将上述获得的NK92细胞用a -MEM完全培养基培养48h后，1200r/min, 5min离心收集细胞，用2ml a -MEM重悬，流式细胞分选仪分选YFP阳性的细胞并进行优化培养。NK92-TN细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心，
请求保藏人为苏州大学，保藏单位地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC No:C2012188，保藏名称为人NK-92-TN细胞，保藏日期为2012年12月2日。
[0033] (5)稳定转染TN基因的NK92细胞株的鉴定
[0034] 收集稳定转染TN基因的NK92细胞，通过TGF- β R II流式
抗体检测目的基因的表达，流式分析结果如图2。
[0035] 图2中I是指阴性对照组ΝΚ92细胞(不含慢病毒载体)的YFP和TGF- β R II的表达情况图；2是指对照组NK92-Venus细胞(含空载慢病毒载体)中YFP和TGF- β R II的表达情况图；3是指ΝΚ92-ΤΝ细胞(含重组慢病毒载体)中YFP和TGF- β R II的表达情况图，由此可知，2中表达了 YFP，而3中既表达YFP又表达TGF-PR II，显示我们构建的ΝΚ92-ΤΝ细胞能够稳定表达目的基因。(其中横纵轴坐标分别显示YFP和TGF- β R II的信号强度，数值越大强度越大，表达量越高。)
[0036] 不同浓度的TGF- β和ΝΚ92-ΤΝ及其对照组细胞NK92_Venus (带空载慢病毒载体)共培养5h后，流式细胞术检测其胞膜NKG2D的表达和IFN-Y的分泌，检测结果显示插入TN基因的NK92细胞的抗肿瘤能力增强；且NK92-TN在TGF-β作用下，其NKG2D的表达比对照组要高，其IFN-Y的分泌也比对照组要高。
[0037] 实施例二:体外 在TGF- β的作用下ΝΚ92-ΤΝ对肝癌细胞SMMC7721的杀伤能力试验
[0038] 用Promega的Cytotox96非放射性细胞毒性检测
试剂盒检测NK92-TN对SMMC7721的杀伤，2ng的TGF-β与效应细胞(NK92-TN和NK92-Venus)和靶细胞(SMMC7721)共培养5h后，检测结果如图3所示，NK92-TN的杀伤作用更强，与对照组差异显著，而且NK92-TN的杀伤作用比没有TGF- β时强，说明ΝΚ92-ΤΝ被(TGF- β )有效的激活了。
[0039] 实施例三:ΝΚ92-ΤΝ的体内抗肿瘤治疗试验
[0040] 裸鼠肝癌模型的建立:在鼠龄6-8W的裸鼠皮下接种2Χ IO6个SMMC7721细胞，一周后即可见接种部位出现肿瘤。
[0041] 治疗试验:试验分3组，一周后分别在肿瘤位置接种PBS、NK92_Venus和NK92-TN。每三天测量一次肿瘤的大小。结果如图4所示，相对于对照组(接种NK92-Venus)，NK92-TN组肿瘤生长速度明显降低，该结果表明，携带TN的NK92细胞具有良好的抗肿瘤作用。
[0042] 采用上述方法获得的NK92-TN细胞株，经体外和体内实验证明具有良好的杀伤作用及抗肿瘤作用。因此本发明要求保护NK92-TN这一具有临床价值的细胞株，优选在肿瘤微环境中高表达TGF-β时使用。上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围。
