天然加工的HLA限制性癌肽绝对定量方法
阅读：289发布：2020-05-17
专利汇可以提供天然加工的HLA限制性癌肽绝对定量方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种天然加工的HLA限制性癌肽绝对定量方法，即，每细胞提呈肽拷贝数的测定。本发明不仅可用于开发 抗体 疗法或肽 疫苗 ，而且对分子免疫监测有很高的价值，对识别免疫 治疗 策略中新肽 抗原 的过程有用，如，各个疫苗、基于抗体的疗法或癌症中过继T细胞转移方法、感染性和/或自身免疫性 疾病 。，下面是天然加工的HLA限制性癌肽绝对定量方法专利的具体信息内容。
1.细胞上至少一种MHC肽配体的绝对定量方法，所述方法包括
a)制备提呈来自包含细胞的生物样本的所述至少一种MHC肽配体的细胞，b)测定步骤a)所述制备的细胞数，
c)添加已知量待量化的所述至少一种肽-MHC配体和/或肽-MHC配体复合物至步骤a)所述制备品(″加样I″)，
d)分离来自步骤c)所述制备品的至少一种MHC肽配体，以获得肽洗脱物，e)添加已知量待量化的所述至少一种MHC肽配体至所述肽洗脱物(″加样II″)，f)对所述至少一种MHC肽配体进行质谱分析，以产生至少一个
aa)用于步骤d)中分离效率的信号，
bb)步骤e)中添加的已知量的所述至少一种MHC肽配体的信号，以及
cc)来自步骤a)所述制备细胞的所述至少一种MHC肽配体的信号，和；
g)定量基于步骤f)中获得的信号与以下步骤中获得的信号比较的所述至少一种MHC肽配体
aa)获得的细胞计数，
bb)步骤c)中添加的待量化的已知量所述至少一种肽-MHC配体和/或肽-MHC配体复合物，和
cc)步骤e)中添加的待量化的已知量所述至少一种MHC肽配体，
其中，实现了细胞上至少一种MHC肽配体的绝对定量。
2.根据权利要求1中所述的方法，其中所述至少一种MHC肽配体选自一种肿瘤相关肽(TAA)或疾病相关肽(DAA)。
3.根据权利要求1或2中所述的方法，其中所述包括细胞的生物样本选自一份组织样本、血液样本、肿瘤样本或一份受感染组织样本。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中制备细胞包括组织的酶消化和/或细胞裂解。
5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述细胞计数使用选自计数细胞核、亮度DNA测定法、荧光DNA测定法或定量PCR的一种方法进行测定。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，进一步包括测定在步骤a)所述制备品中至少一种类型HLA分子的量。
7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中添加的至少一种MHC复合物和/或添加的至少一种MHC肽配体被标记，优选为差异性标记。
8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其中分离包括层析，如：亲和层析。
9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，包括供分析的过量提呈、过量表达的和/或肿瘤特异性MHC肽配体的选择。
10.根据权利要求1至9任一项中所述的方法，其中所述方法能够在高通量的基础上被执行或在高通量的基础上执行。
11.根据权利要求1至10任一项所述的方法，其中，所述方法由所示步骤组成。
12.根据权利要求1至11任一项所述的方法，其中，分析的所述生物样本源自个体或有相同病症的一群个体。
13.根据权利要求12所述的方法，进一步包括基于量化的所述MHC配体肽生成个性化MHC配体图，优选为个性化疾病特异性MHC配体图的步骤。
天然加工的HLA限制性癌肽绝对定量方法
[0001] 本发明涉及一种天然加工的HLA限制性癌肽绝对定量方法，即，每细胞提呈肽拷贝数的测定。本发明不仅可用于开发抗体疗法或肽疫苗，而且对分子免疫监测有很高的价值，对识别免疫治疗策略中新肽抗原的过程有用，如，各个疫苗、基于抗体的疗法或癌症、感染性和/或自身免疫性疾病中过继T细胞转移方法。发明领域
[0002] 深入了解人类白细胞抗原(HLA)结合肽在原发疾病组织中的表达水平可大大改进开发癌症免疫疗法以及自身免疫和感染疾病的免疫治疗，从而诱发免疫系统T细胞对抗癌症。该信息与基于抗体疗法或肽疫苗相关，特别地，与基于蛋白质、DNA或RNA等分子实体的任何其他类型的T细胞疫苗相关。对于患者来源组织，之前没有每个细胞规模绝对拷贝的这种量化数据。
[0003] EP1508047B1中披露了上述避免“反向免疫学”相关问题的肽的一种识别方法。如上所述，该方法不能用于所述肽的定量分析。WO 2005/076009中披露了运用标记策略的另一种方法，其中允进行一些定量分析，但不能在绝对的规模上进行。例如，WO 03/025576中披露了其他标记方法，Martin等人在《蛋白质组学》(Proteomics 2003，3，2208-2220)一文中也进行了披露。
[0004] Fortier等人披露了另一种方法(The MHC class I peptide repertoire is molded by the transcriptome，JEM，Vol.205，No.3，March 17，2008 595-610)。该方法的缺点是：由于酸洗脱，需要从非MHC结合肽中剥离出MHC结合肽。这使用b2m-敲除细胞株实施。因此，该方法不能用于原发患者肿瘤材料。在该方法中，原发鼠胸腺细胞与鼠EL4细胞株进行了对比。起始量透过测量MHC-I分子进行了调整。仅此一项大大限制了Fortier等人披露的方法。另外，没有应用不同尺寸和来源的原发组织所需要的正态化。相反，使用均衡的起始原料，让正态化过时。然而，对于主要(患者)材料正态化是绝对必要的。
[0005] WO2011/128448披露了从大规模原生组织标本中定量识别相关HLA-结合肽抗原而无需标记的一种方法。该方法包括提供至少一个患病初生组织样本和至少一个初生健康组织样本的步骤，初生健康组织优选对应于患病组织，从所述样本中分离MHC肽配体，对所述MHC配体肽执行HPLC-MS分析，提取每个信号的前体离子信号强度(面积)(如来自于分析)，确定所述MHC配体肽的序列，和使其他步骤以及数据质量控制步骤正常化，以便相对量化所述MHC肽配体而无须标记。
[0006] Hassan等人(在：Hassan C，et al，Accurate quantitation of MHC-bound peptides by application of isotopically labeled peptide MHC complexes，J Prot(2014)，http://dx.doi.org/10.1016/j.jprot.2014.07.009)中披露一种方法，在这种方法中，在细胞裂解后(即，正常样本加工之前)制备和直接加入同位素标记肽MHC单体(hpMHC)。使用这种方法，样本加工期间所有的损失均可计入，并且可对特定的MHC I类提呈配体进行准确测定。该研究查明了免疫纯化步骤是样本预处理期间极端损失的原因，并为这些损失提供了解决方案。提出的策略可用于获得表位拷贝数的可靠视图，因此，可改进疫苗设计和免疫治疗策略。
[0007] 能否刺激免疫反应取决于是否存在被宿主免疫系统视为异物的抗原。发现存在肿瘤相关以及疾病抗原增加了运用宿主免疫系统干预肿瘤生长的可能性。目前，针对癌症免疫治疗，正在探索利用免疫系统的体液和细胞进行免疫的各种机制。
[0008] 细胞免疫反应的特定元素能特异性地识别和破坏肿瘤细胞。从肿瘤浸润细胞群或外周血中分离出的细胞毒性T-细胞(CTL)表明，这些细胞在癌症的天然免疫防御中发挥了重要作用。尤其是识别与主要组织兼容性复合体(MHC)I类分子结合的肽的CD8阳性T细胞+(T-CD8)。通常8至12个氨基酸残基的这些肽源自蛋白质或位于细胞质的缺损核糖体产物(DRIP)，在这种反应中发挥重要作用。人MHC分子也称为人白细胞-抗原(HLA)。
[0009] MHC分子有两类：大部分有细胞核的细胞上都可发现的MHC-I类分子。MHC分子分别由一条α重链和β-2-微球蛋白(MHC-I类受体)或一条α和一条β链(MHC-II类受体)组成。其三维构造形成一个结合槽，用于与肽进行非共价相互作用。MHC-I类分子提呈主要为内源性的蛋白、DRIPS和较大肽裂解生成的肽。MHC II类分子主要发现于专业抗原提呈细胞(APC)上，并且主要提呈在内吞作用过程中由APC占据并且随后被加工的外源性或跨膜蛋白的肽。肽和MHC I类分子的复合体由负载相应TCR(T细胞受体)的CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞进行识别，而肽和MHC II类分子的复合体由负载相应TCR的CD4阳性辅助T细胞进行识别。因此，TCR、肽和MHC按照1∶1∶1的化学计量呈现，这一点已是共识。
[0010] 对于触发(引发)细胞免疫反应的肽，它必须与MHC分子结合。这一过程依赖于MHC分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特异性多态性。MHC-I类-结合肽的长度通常为8-12个氨基酸残基，并且在其与MHC分子相应结合沟槽相互作用的序列中通常包含两个保守残基(″锚″)。这样，每个MHC等位基因都有一个″结合基序″，可控制肽与结合沟槽特异性结合的能力。
[0011] 在MHC-I类依赖性免疫反应中，肽不仅能与肿瘤细胞表达的某些MHC-I类分子结合，而且它们还必须能被T细胞特异性T细胞受体(TCR)识别。
[0012] 肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞所识别的抗原，即它们的表位，可以是源自所有蛋白类型的分子，如酶、受体、转录因子等，它们在相应的肿瘤细胞中被表达，并且与同源未变的细胞相比，其表达上调。
[0013] 目前将肿瘤相关抗原或疾病相关抗原分类为以下主要几组：
[0014] 癌-睾丸抗原：T细胞能够识别的最先确认的TAA[肿瘤相关抗原；疾病相关抗原缩写为DAA]属于这一类抗原，由于其成员表达于组织学相异的人肿瘤中、正常组织中、仅在睾丸的精母细胞/精原细胞中、偶尔在胎盘中，因此，它最初被称为癌-睾丸(CT)抗原。由于睾丸细胞不表达HLA I类和II类分子，所以，在正常组织中，这些抗原不能被T细胞识别，因此在免疫学上可考虑为具有肿瘤特异性。CT抗原大家熟知的例子是MAGE家族成员或NY-ESO-1。
[0015] 分化抗原：肿瘤和正常组织(肿瘤源自该组织)都含有TAA，大多数TAA发现于黑色素瘤和正常黑色素细胞中。许多此类黑色素细胞谱系相关蛋白参与黑色素的生物合成，因此这些蛋白不具有肿瘤特异性，但是仍然被广泛地用于癌症的免疫治疗。例子包括，但不仅限于，黑色素瘤的酪氨酸酶和Melan-A/MART-1或前列腺癌的PSA。
[0016] 过量表达的TAA：在组织学相异的肿瘤中以及许多正常组织中都检测到了基因编码被广泛表达的TAA，一般表达水平较低。有可能许多由正常组织加工和潜在提呈的表位低于T细胞识别的阈值水平，而它们在肿瘤细胞中的过量表达能够透过打破先前确立的耐受性而引发抗癌反应。这类TAA的典型例子为Her-2/neu、生存素、端粒酶或WT1。
[0017] 肿瘤特异性抗原：这些独特的TAA产生于正常基因(如β-catenin、CDK4等)的突变。这些分子变化中有一些与致瘤性转化和/或进展相关。肿瘤特异性抗原一般可在不对正常组织带来自体免疫反应风险的情况下诱导很强的免疫反应。另一方面，这些TAA在多数情况下只与其上确认了有TAA的确切肿瘤相关，并且通常在许多个体肿瘤之间并不都共享TAA。
[0018] 由异常翻译后修饰产生的TAA：此类TAA可能由肿瘤中既不具有特异性也不过量表达的蛋白产生，但其仍然具有肿瘤相关性(该相关性由主要对肿瘤具有活性的翻译后加工所致)。此类TAA产生于变糖基化模式的改变，导致肿瘤产生针对MUC1的新型表位或在降解过程中导致诸如蛋白拼接的事件，这可能具有也可能不具有肿瘤特异性。
[0019] 肿瘤病毒蛋白：这些TTA是病毒蛋白，可在致癌过程中发挥关键作用，并且由于它们是外源性蛋白(非人源蛋白)，所以能够激发T细胞反应。这类蛋白的例子有人乳头状瘤16型病毒蛋白、E6和E7，它们在宫颈癌中表达。
[0020] 对于被细胞毒性T淋巴细胞识别为肿瘤特异性或相关性抗原、或疾病特异性或相关性抗原以及用于治疗的蛋白质，必须具备特殊的条件。该抗原应主要由肿瘤细胞或受感染细胞表达，而并非完全由正常健康组织表达，或表达数量相对较少，例如：少于因子5、10或更多。
[0021] 在传染病中有两种可能性，第一，受感染细胞表达一种健康细胞不表达的抗原-与感染直接相关-或受感染细胞过量表达一种只有健康细胞极少量表达的抗原-抗原过量表达通常存在于健康细胞的多肽中。
[0022] 更为适宜的情况是，该相应抗原不仅出现于一种肿瘤、感染或紧张中，而且浓度(即每个细胞的相应肽拷贝数目)高。肿瘤特异性和相关性抗原以及疾病特异性或相关性抗原往往是源自直接参与因细胞周期控制或凋亡抑制中的一项功能而发生的正常细胞向肿瘤细胞转化的蛋白。
[0023] 在癌症的情况下，这些直接导致转化的蛋白的其他下游靶标也可能会被上调，因此可能间接与肿瘤相关。这些间接肿瘤相关抗原也可能是预防接种方法的靶标(Singh-Jasuja H.，Emmerich N.P.，Rammensee H.G.，Cancer Immunol.Immunother.2004 Mar；453(3)：187-95).在这两种情况中，至关重要的是，都要存在抗原氨基酸序列的表位，所以这种来自肿瘤相关或疾病相关抗原的肽(″免疫原性肽″)可导致体外或体内T细胞反应。
[0024] 基本上，任何能与MHC分子结合的肽都可能充当一个T细胞表位。诱导体外或体内T细胞反应的前提是存在具有相应TCR的T细胞，并且不存在对该特定表位的免疫耐受性。
[0025] 因此，TAA和DAA是开发肿瘤疫苗的起点。识别和表征TAA和DAA的方法基于对患者或健康受试者CTL的使用情况，或基于肿瘤与正常组织肽之间差别转录特性或差别表达模式的产生。
[0026] 然而，对肿瘤组织或人肿瘤细胞株中过量表达或选择性表达的基因的识别并不提供在免疫疗法中使用这些基因所转录抗原的准确信息。这是因为，有着相应TCR的T细胞必须要存在，而且对这个特定表位的免疫耐受性必须不存在或为最低水平，因此，这些抗原的表位只有一部分适合这种应用。因此，只选择那些蛋白过量表达或选择性表达的肽，并且这些肽是与可找到对抗性功能性T细胞的MHC分子结合在一起被提呈，这一点非常重要。这种功能性T细胞被定义为在以特异性抗原刺激后能够克隆地扩展并能够执行效应子功能(″效应子T细胞″)的T细胞。
[0027] 辅助T细胞在编排抗肿瘤免疫的CTL效应子功能中发挥着重要作用。触发TH1细胞反应的辅助T细胞表位支持CD8阳性杀伤T细胞的效应子功能，其中包括直接作用于肿瘤细胞的细胞毒性功能(该类肿瘤细胞表面显示有肿瘤相关肽/MHC复合体)。这样，单独形式的或与其他肿瘤相关肽形成组合物的肿瘤相关T辅助细胞肽表位可作为刺激抗肿瘤免疫反应疫苗组合物的活性药物成分。
[0028] 了解HLA-I或II类提呈肽的准确拷贝数在基础与临床免疫学中非常重要。目前，拷贝数最好的确定方法是基于质谱法，采用单反应监测(SRM)结合已知量的同位素标记肽。然而，这些方法仍不足够精确以被有效地用在上述方法中。
[0029] 因此，鉴于上述情况，本发明的目的是提供一种HLA-I或II类提呈配体拷贝数的绝对判定方法，其精确、高效、易于处理，并且还可在″高通量″水平上进行。技术人员在研究本发明的以下说明时，本发明的其他目标和优势将变得明了。
[0030] 在本发明的第一个方面，本发明的目的透过一种方法解决，即细胞上至少一种MHC肽配体的绝对定量方法，所述方法包括
[0031] a)制备提呈来自包含细胞的生物样本的所述至少一种MHC肽配体的细胞，[0032] b)测定步骤a)所述制备的细胞数，
[0033] c)添加已知量待量化的所述至少一种肽-MHC配体和/或肽-MHC配体复合物至步骤a)所述制备品(″加样I″)，
[0034] d)分离来自步骤c)所述制备品的至少一种MHC肽配体，以获得肽洗脱物，[0035] e)添加已知量待量化的所述至少一种MHC肽配体至所述肽洗脱物(″加样II″)，[0036] f)在所述至少一种MHC肽配体上进行质谱分析，以产生至少一个
[0037] aa)用于步骤d)中分离效率的信号，
[0038] bb)步骤e)中添加的已知量的所述至少一种MHC肽配体的信号，以及
[0039] cc)来自步骤a)所述制备细胞的所述至少一种MHC肽配体的信号，
[0040] 和；
[0041] g)定量基于步骤f)中获得的信号与以下步骤中获得的信号比较的所述至少一种MHC肽配体
[0042] aa)获得的细胞计数，
[0043] bb)步骤c)中添加的待量化的已知量所述至少一种肽-MHC配体和/或肽-MHC配体复合物，和
[0044] cc)步骤e)中添加的待量化的已知量所述至少一种MHC肽配体，
[0045] 其中，至少部分实现了细胞上至少一种MHC肽配体的绝对定量。
[0046] 在根据本发明的一种方法中，其中几种样本进行了并行分析，如果分离效率已经确定可省略上述步骤c)，这是因为一个样本的效率可用来估计第二个MHC肽配体和/或MHC肽配体复合物的分离效率(即，可以作为一个交叉参考值)。
[0047] 优选方法进一步使用从e)中内部校准获得的信号(加样II)作为从至少一种MHC肽配体分离获得的信号的常数和保存(对照)参照物(透过计算这两信号之间的比例)。此比例与确定的校准曲线相比较，其中还包括在非常相同量的内部校准物，优选透过使用此类内部校准的相同等分试样。那么，校准曲线描述了这些比率和肽量之间的关系。参见图3及图例。
[0048] 令人惊讶的是，在本发明的背景下，发明人发现，透过组合上述分析步骤，与几种不同的非癌组织或未感染组织和器官相比癌症或其他受感染组织的MHC-(优选HLA限制)肽水平直接绝对定量首次成为可能。
[0049] 在本发明的背景中，″加样″是指加入已知量或浓度的至少一种，例如，未结合(″游离″)待量化MHC肽配体至一种样品，如，制备品(这里指定为″加样I″)或肽洗脱物(这里指定为″加样II″)。加入肽的量/浓度容易调节，并至少部分依赖于有待加样的样本以及用于分析的方法。
[0050] 根据本发明所述的一种方法为优选，其中至少一种MHC肽配体选自一种肿瘤相关肽(TAA)或疾病相关肽(DAA)。
[0051] 根据本发明所述的一种方法为更进一步优选，其中所述包括细胞的生物样本选自一份组织样本、血液样本、肿瘤样本或一份受感染组织样本。在本发明的情况下，直接源自受试者(例如：患者)的样本被称为「原发」样本，例如：原发组织或肿瘤样本，而细胞株样本为例如：已建立的肿瘤细胞系。样品可以是新鲜的也可以是保存的(如：冷冻或制备)，只要它们适用于根据本发明所述的方法即可。优选为一种不含永久细胞系的生物样本。
[0052] 作为一种优选实例，可使用与CNBr活化的琼脂糖凝胶耦合之后经酸处理和超滤的HLA-A、HLA-B、HLA-C特异性抗体W6/32或HLA-A*02特异性抗体BB7.2以固体组织的免疫沉淀法获得汇集自激冻(原发)组织样本的HLA肽。对于不同的HLA等位基因，本领域已知的其他特异性抗体可用作为，例如：A*03的GAP-A，B等位基因的B1.23.2。存在相应的方法来获得本领域已知的其他哺乳动物的MHC-I类肽。
[0053] 根据本发明所述的方法也可用于传染性疾病，例如：病毒或细菌感染，如：登革热、埃博拉病毒、马尔堡病毒，结核病(TB)、脑膜炎或梅毒，优选情况是，该方法用于抗生素耐药菌株的传染性生物体、自身免疫性疾病，如：关节炎、寄生虫感染，疟疾和其他疾病，如：MS和Morbus帕金森，只要靶向基团是MHC-I类结合肽。
[0054] 自身免疫性疾病的实例(包括未正式宣布为自身免疫性疾病的疾病)有慢性阻塞性肺疾病、强直性脊柱炎、克罗恩病(两种特发性炎症性肠道疾病[″IBD″]中的一种)、皮肌炎、I型糖尿病、子宫内膜异位症、Goodpasture氏征候群、Graves氏病、格林-巴利征候群(GBS)、桥本氏病、化脓性汗腺炎、川崎病、IgA肾病、原发性血小板减少性紫癜、间质性膀胱炎、红斑狼疮、混合性结缔组织病、硬斑病、重症肌无力、嗜睡症、神经性肌强直、寻常型天疱疮、恶性贫血、银屑病、银屑病关节炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、复发性多软骨炎、类风湿关节炎、精神分裂症、硬皮病、干燥征候群、僵人征候群、颞动脉炎(巨细胞动脉炎)、溃疡性结肠炎(特发性炎症性肠病[″IBD″]两种类型之一)、脉管炎、白癜风以及韦格纳肉芽肿。
[0056] 在本发明所述方法的另一优选实施方案中，细胞制备至少部分地包括组织的酶消化和/或细胞裂解。
[0058] 此外，根据本发明所述的方法为优选，进一步包括测定在步骤a)所述制备品中至少一种类型HLA分子的量。测定含量可使用本领域中常用的方法，例如涉及特异性抗体(如ELISA、凝胶、细胞分选和/或层析)的方法来完成。
[0059] 根据本发明所述的一种方法为进一步优选，其中添加的至少一种MHC复合物和/或添加的至少一种MHC肽配体被标记，优选为差异性标记。各标记物为本领域技术人员熟知，且包括同位素标记、放射性和非放射性标记、酶、和优选不同质量的其他基团。优选情况是，标记特异性针对待定量的特定肽。最优选的情况是双标记TAA/TUMAP，例如，在相同的实验中需要两种差异化标记进样的情况(参见下文的实施例)。
[0060] 根据本发明所述的一种方法为首选，其中分离包括层析，如：亲和层析。因此，孤立的MHC/HLA配体根据其疏水性可用反相色谱(例如：nanoAcquity UPLC系统，Waters)分离，之后在Orbitrap杂交质谱(ThermoElectron)中检测。每个样本透过采集复制LCMS(举例)操作结果而进行优选分析。然后，LCMS数据透过分析串联质谱(MS/MS)数据而进行处理。
[0061] 有针对性方法记录、着眼于待量化肽m/z值的串联MS谱优选透过一种提取预定义过渡预选碎片离子强度的软件进行评价。此类软件的一个实例为Skyline(MacLean B et al.Skyline：an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.Bioinformatics.2010 Apr 1；26(7)：966-8.，http://dx.doi.org/10.1093/bioinformatics/btq054)，分析数据独立采集(DIA)实验质谱仪数据进行并行反应监测的应用程序(PRM-靶向MS/MS)。此软件可为了特定目的而用于共洗脱同位素标记肽相关事项，也可用于提取单个过渡强度以便进一步处理。
[0062] 根据用于纯化的共同等位基因特异性抗体(如果有的话)、或者根据透过锚氨基酸模式将序列分配给共同HLA等位基因的情况，可以比较不同样本之间限于相同HLA等位基因的肽组别。
[0063] 由于统计的原因，根据本发明所述的一种方法为优选，其中对于每个至少一种MHC配体肽进行至少两次重复质谱运行。
[0064] 因此，本发明的另一个方面涉及根据本发明的一种方法，还包括选择过量提呈、过量表达的和/或肿瘤特异性的MHC肽配体进行分析。
[0065] 本发明的又一个方面涉及根据本发明的一种方法，其中所述方法能够在高通量的基础上正在执行或执行，优选至多 个肽配体可以并行进行分析。
[0067] 在本发明所述方法的另一方面，所述方法与个性化治疗和诊断相关。对于这一点，分析的所述样本源自个体或有如本文所述相同病症的一群个体。此外，基于量化的所述MHC肽配体，个性化MHC配体特点，优选为个性化量化疾病特定MHC配体特点，可用本文所述的本发明方法生成。
[0068] 最优选情况为，在体外实施本发明中所述的方法。
[0069] 在本发明所述方法的另一优选方面，所述方法进一步包括透过所述方法用合成器或手动定量而合成，优选为化学合成所述至少一个MHC配体肽的步骤。因此，本发明的另一个方面涉及到制备一种免疫活性肽的一种方法，其中，根据所披露的方法可量化一种肽，并且所述肽可在体外或体内进行化学合成。肽可用本领域已知的标准方法透过对氨基酸进行化学联接而制备。
[0070] 肽可在体外制备，例如，在无细胞系统中制备，以及使用细胞在体内制备。肽可按照披露的方法制备，例如：Lewandrowski等人的EP2111867发明中的方法。
[0071] 另一方面涉及根据本发明所述的方法，其中，实施另一步骤，其中，检测T淋巴细胞的存在。使用这种方法，可特定检测针对分离和确定肽的T淋巴细胞在多大程度上预先存在于患者中。透过实施此步骤，可将T淋巴细胞已经预先存在于患者时的那些肽用作一种疫苗。然后，肽可用来启动这些特异性T淋巴细胞。
[0072] 另一方面涉及根据本发明所述的方法，其中，透过用抗原提呈分子和抗原肽的重组复合物标记白细胞而检测预先存在的特定T淋巴细胞。
[0073] 在本发明所述方法的另一优选实施方案中，所述方法进一步排除了使用基因敲除细胞、细胞株或动物。
[0074] 本发明的进一步优选可选步骤为：根据掺入所定数量样本的加标分子而进行的自动质量控制。
[0075] 运用根据本发明所述的方法，可进一步确定患者特定肽，即，可将用作疫苗的肽与患者精确匹配，从而诱导特异性免疫反应。
[0076] 本发明的另外方面则涉及一种药物组合物，包括根据本发明所述的方法量化的确定量的一种或多种TAA和/或DAA肽。
[0077] 例如，组合物可应用于肠外、皮下、皮内或肌肉内，也可口服，这取决于剂型和目标疾病。为了达到这样的目的，肽在药用载体中溶解或悬浮，优选为水载体；组合物可进一步包括添加剂，例如缓冲剂、粘合剂等。肽也可与免疫刺激物质共同给药，例如：细胞因子。
[0078] 根据本发明的一个方面，肽可用于治疗肿瘤性疾病以及制备一种治疗肿瘤疾病的药物。要治疗的肿瘤疾病包括实体瘤，如肾、乳腺、胰腺、胃、睾丸和/或皮肤癌或血液癌症，如：AML。该肿瘤疾病清单仅为示例，并不用于限制应用领域。
[0079] 肽可以进一步用于评估肿瘤疾病的疗程。
[0080] 肽还可用于监测其他免疫接种的治疗或某些治疗。因此，肽不仅可用于治疗，还可用于诊断。
[0081] 本发明的另一方面涉及使用量化的肽生成抗体。多克隆抗体可用一般方式获得，方法是透过注射肽对动物进行免疫接种随后纯化免疫球蛋白。单克隆抗体可根据本领域已知的标准化方案产生。
[0082] 本发明与基于抗体的方法特别相关，因为靶细胞细胞表面上的靶拷贝数可确定和/或反映该靶是否可以由抗体解决问题，如果可以，可使用哪些效应功能，例如共轭药物、毒素、双特异性抗体招募T细胞或其他效应细胞。其他方面涉及在所谓的支架形成分子中的使用，如核酸适体(靶-结合寡核酸或肽分子)和/或可溶性T细胞受体(TCR)。在这里，类似于抗体，拷贝数量决定所需的亲合力和效应功能。对于所述支架分子。
[0083] 能否刺激免疫反应取决于是否存在被宿主免疫系统视为异物的抗原。发现肿瘤相关抗原增加了运用宿主免疫系统干预肿瘤生长的可能性。对于癌症免疫疗法，目前正在探索控制免疫系统中的体液和细胞免疫的各种机制。
[0084] 细胞免疫反应的特定元素能特异性地识别和破坏肿瘤细胞。从肿瘤浸润细胞群或外周血中分离出的细胞毒性T-细胞(CTL)表明，这些细胞在癌症的天然免疫防御中发挥了重要作用。特别是CD8阳性T细胞在这种反应中发挥重要作用，它能识别源自蛋白或位于细胞质的缺损核糖体产物(DRIP)的通常8至12个氨基酸残基，由主要组织兼容性复合体(MHC)I类分子所载的肽。人MHC分子也称为人白细胞-抗原(HLA)。
[0085] MHC-I类分子，在细胞核提呈因主要内源性、细胞质或细胞核蛋白质、DRIPS和较大肽，蛋白裂解产生的肽的大多数有核细胞上都能发现。然而，源自内体结构或外源性来源的肽也经常在MHC-I类分子上发现。这种I-类分子非经典提呈方式在文献中被称为交叉提呈。
[0086] 对于被细胞毒性T淋巴细胞识别为肿瘤特异性抗原或相关性抗原以及用于治疗的蛋白质，必须具备特殊的条件。该抗原应主要由肿瘤细胞表达，而正常健康组织根本不表达或表达数量较少。更为适宜的情况是，该相应抗原不仅出现于一种肿瘤中，而且浓度(即每个细胞的相应肽拷贝数目)高。肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原通常是源于由于细胞周期调控或凋亡等功能在正常细胞转化为肿瘤细胞中直接受累的蛋白。另外，这些直接导致转化的蛋白的下游靶标也可能会被上调，因此间接与肿瘤相关。这些间接肿瘤相关抗原也可能是预防接种方法的靶标。至关重要的是，在这两种情况中，都存在抗原氨基酸序列的表位，所以这种来自肿瘤相关或疾病相关抗原的肽(″免疫原性肽″)可导致体外或体内T细胞反应。
[0087] 基本上，任何能与MHC分子结合的肽都可能充当一个T细胞表位。诱导体外或体内T细胞反应的前提是存在具有相应TCR的T细胞并且不存在对该特定表位的免疫耐受性。因此，TAA是肿瘤疫苗研制的起点。识别和表征TAA的方法基于对患者或健康受试者CTL的使用情况，或基于肿瘤与正常组织肽之间差别转录特性或差别表达模式的产生(Lemmel et al.450-54；Weinschenk et al.5818-27)。然而，对肿瘤组织或人肿瘤细胞株中过量表达或选择性表达的基因的识别并不提供在免疫疗法中使用这些基因所转录抗原的准确信息。这是因为，有着相应TCR的T细胞必须要存在而且对这个特定表位的免疫耐受性必须不存在或为最低水平，因此，这些抗原的表位只有一部分适合这种应用。因此，只选择那些蛋白过量表达或选择性表达的肽，并且这些肽是与可找到对抗性功能性T细胞的MHC分子结合在一起被提呈，这一点非常重要。这种功能性T细胞被定义为在以特异性抗原刺激后能够克隆地扩展并能够执行效应子功能(″效应子T细胞″)的T细胞。
[0089] 本文所用″肽″这一术语，系指一系列氨基酸残基，通常透过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键来连接。这些肽的长度优选为9个氨基酸，但长度可短至8个氨基酸，以及可长至10、11、12、13或14个氨基酸长度。
[0090] 本文使用的术语″寡肽″是指一系列氨基酸残基，通常透过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键来连接。寡肽的长度对于本发明来说并不十分关键，只要在寡肽中保持正确的表位即可。通常，寡肽长度约小于30个氨基酸残基，约长于14个氨基酸。
[0091] ″多肽″这一术语是指一系列氨基酸残基，通常透过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键来连接。多肽的长度对于本发明来说并不十分关键，只要保持正确的表位即可。与术语肽或寡肽相对，″多肽″这一术语是指包含多于约30个氨基酸残基的分子。
[0092] 肽、寡肽、蛋白质或编码此类分子的核苷酸如果能诱导免疫反应，则具有″免疫原性″(因此是本发明中的一种″免疫原″)。在本发明的情况下，免疫原性的更具体定义是诱导T细胞反应的能力。因此，″免疫原性″是一种能够诱导免疫反应的分子，并且在本发明的情况下，是一种能诱导T细胞反应的分子。
[0093] T细胞″表位″要求的是一种结合至MHC I类受体上的短肽，从而形成一种三元复合体(MHC I类α链、β-2-微球蛋白和肽)，其可以透过T细胞负载匹配T细胞受体与具有适当亲和力的MHC/肽复合物结合来识别。结合至MHC I类分子的肽的典型长度为8-14个氨基酸，最典型的长度为9个氨基酸。
[0094] 在当前的描述中，以癌症为例对本发明进行说明。然而，只要各自的免疫应答是涉及MHC I类分子的应答，则本发明的方法也可以应用于感染性疾病、自身免疫性疾病和寄生虫感染。
[0096] 图1：显示了根据本发明的实验方法的一般示意图概述。
[0097] 图2：显示了TUMAP混合物与表1每TUMAP 10 fmol的比较MS分析。每个肽导致不同的MS信号，显示肽依赖性检测能力。肽5未在表1中列出，即表1中序列1-4对应于图2中的第1-4项，表1中序列5-11对应于图1中第6-12项。
[0098] 此外，图2中的肽19、21和22未在表2中列出，即图2中序列13-18对应于表2中的第12-17项，图2中序列20对应于表2中的第18项，图2中序列23-28对应于表2中的第19-24项。
[0099] 图3：显示了内部标准方法的原则。校准曲线由TUMAP同位素标记版本(浅灰色示出)的滴定生成。对于所有的MS测量值，TUMAP内标肽(暗灰色示出)另一同位素标记版本的恒定量掺入MS样本。校准曲线函数根据MS信号的比值用逻辑回归法来计算。LLOQ用目视检查法确定，并考虑与线性的偏差。″定量样本″(以绿色示出)表示选择用于TUMAP数量绝对定量的肿瘤样本中测得的信号强度。
[0100] 图4：显示了选择用于绝对定量的HLA-A*02 TUMAP的校准曲线。每个图表中包括了用于每个细胞绝对TUMAP数量(″定量样本″)分析的肿瘤组织样本中各TUMAP的MS结果。
[0101] 图5：显示了选择用于绝对定量的HLA-A*02 TUMAP的其他校准曲线。每个图表中包括了用于每个细胞绝对TUMAP数量(″定量样本″)分析的肿瘤组织样本中各TUMAP的MS结果。
[0102] 图6：显示了选择用于绝对定量的HLA-A*24 TUMAP的校准曲线。每个图表中包括了用于每个细胞绝对TUMAP数量(″定量样本″)分析的肿瘤组织样本中各TUMAP的MS结果。
[0103] 图7：显示了选择用于绝对定量的HLA-A*24 TUMAP的其他校准曲线。每个图表中包括了用于每个细胞绝对TUMAP数量(″定量样本″)分析的肿瘤组织样本中各TUMAP的MS结果。
[0104] 图8：显示了所分析的所有TUMAP的MS反复测量值的估计变化。每个点表示一个特定组织样本个体TUMAP MS复制的变异系数(CV，％)。所有TUMAP的中值CV被认为MS复制操作的平均变异。
[0105] 图9：显示了肽MHC分离的效率。对于肽MHC分离的效率，A*02 TUMAP在8个A*02阳性样本中确定(A)，A*24 TUMAP在6个A*24阳性样本确定(B)。平均来说，对于分离效率，A*02 TUMAP变化为24％，A*24 TUMAP为32％(C)。
[0106] 图10：显示了DNA含量分析的评价方法。A.给定DNA量细胞计数插补三种不同方法比较：使用来自肿瘤细胞系(深灰)、来自健康供体PBMC(灰色)并使用人二倍体基因组理论重量(浅灰色)绘制的标准曲线。生物学复制，即来自相同肿瘤不同部分的独立组织溶解液制备品(以灰色突出显示)。B.PBMC标准曲线绘制图，其用于确定TUMAP绝对定量中分析组织样本的总细胞计数。
[0107] 图11显示了固体、冷冻组织样本细胞计数的测定。A*02-和A*24阳性肿瘤样本的细胞计数分析(A)和细胞计数分析估计变异(B)。生物学复制用灰色突出显示。
[0108] 图12显示了HLA-A*02 TUMAP的每细胞肽拷贝数的结果。分析了八种不同GC肿瘤，其中三种重复(生物重复进行分组，并以灰色突出显示)。LLOQ指一种MS实验中的定量范围，并外推至一种样本和TUMAP特异性LLOQ，即一种特定TUMAP特定样本的可定量最低拷贝数(以灰色示出)。
[0109] 图13显示了HLA-A*02 TUMAP的每细胞肽拷贝数的其他结果。分析了八种不同GC肿瘤，其中三种重复(生物重复进行分组，并以灰色突出显示)。LLOQ指一种MS实验中的定量范围，并外推至一种样本和TUMAP特异性LLOQ，即一种特定TUMAP特定样本的可定量最低拷贝数(以灰色示出)。
[0110] 图14显示了HLA-A*24 TUMAP的每细胞肽拷贝数的结果。分析了六种不同GC肿瘤，其中三种重复(生物重复进行分组，并以灰色突出显示)。LLOQ指一种MS实验中的定量范围，并外推至一种样本和TUMAP特异性LLOQ，即一种特定TUMAP特定样本的可定量最低拷贝数(以灰色示出)。
[0111] 图15显示了HLA-A*24 TUMAP的每细胞肽拷贝数的其他结果。分析了六种不同GC肿瘤，其中三种重复(生物重复进行分组，并以灰色突出显示)。LLOQ指一种MS实验中的定量范围，并外推至一种样本和TUMAP特异性LLOQ，即一种特定TUMAP特定样本的可定量最低拷贝数(以灰色示出)。
[0112] 图16显示了在MHC/肽单体制备中使用500fmol游离肽测试样本进样的影响。分析中游离肽对所示的肽无实质性影响。
[0113] 图17显示了使用Qubit HS(荧光)与标准曲线的DNA分离再现性测试的结果。样本(癌组织样本，如NSCLC)显示出足够的同构型。从3X50μl等分样本中分离DNA。
[0115] 以下实施例描述了在TAA/癌症情况下的发明方法。本发明不仅限于这些实施例，因为他们仅仅是本发明的一个优选实施方案。考虑到本发明的目的，文中引用的所有参考文献透过引用的方式并入在本文中。
[0116] 表1：选择用于绝对定量的HLA-A＊02 TUMAP
[0117] 11种肽被选择用于绝对定量。
[0118]
[0119]
[0120] 表2：选择用于绝对定量的HLA-A＊24 TUMAP
[0121] 14种肽被选择用于绝对定量。一种肽(PLK4-001)的性质被证明不适合于进一步的实验。对于其余的13种肽，完成了绝对定量实验。
[0122]
[0123]
[0124] 实体肿瘤样本中每个细胞的TUMAP拷贝数定量需要(子)定量
[0125] a)分离的TUMAP，
[0126] b)分离期间TUMAP的损失，以及
[0127] c)所分析的组织样本细胞计数。
[0128] 图1中给出了根据本发明所述实验方法的概述。
[0129] nanoLC-MS/MS肽定量
[0130] 为了透过质谱法准确定量肽，首先需要学习肽量和MS信号肽特异性相关性的基础知识。例如，每肽10fmol肽混合物的MS测定值显示，MS信号存在较大的肽特异性差异(图2)。这也暗示了MS可靠量化肽的范围取决于个体的肽特性。
[0131] 此外，只能在一定范围内预期特定肽的量和MS信号之间线性相关。因此，发明人决定确定每种肽的个体校准曲线。选定的每个校准曲线的范围可不仅反映肽的个体定量范围，而且也可反映先前分析的肿瘤样本中每种肽的MS信号范围。目标是，每个校准曲线应包含至少80％常规样本的肽特异性MS信号范围。
[0132] 精确校准曲线的产生需要合成标准，其必须用采用一种独立的方法进行定量，并与天然TUMAP具有相同的特性。发明人使用了双同位素标记版本的TUMAP，即TUMAP合成期间纳入2个同位素标记的氨基酸。根据标记的氨基酸，双标记版本可采用12-18道尔顿的质量差异与天然TUMAP区分。除了质量外，同位素标记不会改变MS中肽的性质，即，具有相同序列但不同同位素标记的肽MS信号强度相同(Anderson et al.，2012)。合成后，双标记TUMAP透过氮分析法精确定量，以得出肽量和MS信号之间的精确相关性。
[0133] 校准曲线用至少三种不同的矩阵绘制，即，来自于类似于常规MS样本的天然样本的HLA肽洗脱液，并且每个制备品以重复MS运行进行测量。为了补偿MS运行之间的任何技术变化，内标肽被纳入所有的测量中。对滴定肽与固定内标物MS信号的比例进行作图，并且校准曲线采用逻辑回归进行计算(图3)。定量下限(LLOQ)采用目视法确定，并考虑与线性的偏差。如果线性偏差不明显，如：肽FAP-003(图4)，在使用最低肽量的平均比值来计算LLOQ。定量上限，即在较高浓度时线性偏差，在任何校准曲线上均未达到。
[0134] 在实际定量实验中，相同量的内标物被加入各样本中以作出校准曲线，并计算天然肽与内标肽的比率。这种「内部标准法」是基于MS蛋白质定量的一种常用方法，例如，用于生物样本的生物标志物分析(Sturm et al.，2012；Prasad and Unadkat，2014；Sato et al.，2012)。对于选定绝对定量的所有TUMAP，校准曲线和实际肿瘤样本中测得的值，示于图4和图5(HLA-A*02)以及图6和图7(HLA-A*24)中。
[0135] 为了估计定量MS测量值的变化，计算了每个MS样本肽含量的变异系数(CV，％)。对每个MS样本的CV进行作图，并且MS测量值的整体变化估计为中值CV(图8)。
[0136] 肽/MHC分离的效率
[0137] 对于任何蛋白质纯化过程，来自组织样本蛋白的分离与相关蛋白的一定损失相关联。为了确定TUMAP分离的效率，针对选定为绝对定量的所有TUMAP产生了肽MHC复合物。为了能够区别天然肽MHC复合物与加样物，使用了单同位素标记版本的TUMAP，即TUMAP合成期间引入1个同位素标记的氨基酸。这些复合物被掺入新制备的组织裂解物中，例如，在TUMAP分离过程中最早可能时间点，然后在之后的亲和纯化中像天然肽MHC复合物被获取。因此，测量单标记TUMAP的恢复可得到个体TUMAP分离效率相关的结论。
[0138] 分离效率在被选作绝对TUMAP定量的13个样本(7个HLA-A*02阳性样本、5个HLA-A*24阳性样本和1个HLA-A*02/A*24双阳性样本)中进行了测定。8个A*02阳性样本进行了A*02 TUMAP分离效率分析，6个A*24阳性样本进行了A*24 TUMAP分离效率分析(图9A、B)。结果表明，在不同组织样本中，大部分肽的分离效率相当。与此相反，个体肽之间的分离效率不同。
这表明，分离效率虽然只在有限数量的样本中进行测定，但可外推至任何其他组织制备品中。但是，由于分离效率不能从一种肽外推至其他肽，因此，有必要单独分析每个TUMAP。
这表明，分离效率虽然只在有限数量的样本中进行测定，但可外推至任何其他组织制备品中。但是，由于分离效率不能从一种肽外推至其他肽，因此，有必要单独分析每个TUMAP。
[0139] 在少数情况下，对于肽NCAPG-001，分离效率不切实际的高和/或变化强烈(图9A)。分离效率例如由于定量肽依赖性困难无法确定(例如，肽CCNB1-002、ASPM-001的高LLOQ水平)或分离效率经计算高于100％的情况下，发明人假定分离效率为100％。这是一种保守的方法，其中最有可能高估了分离效率，从而最终导致低估了每个细胞的肽拷贝量。
[0140] 为了估算TUMAP分离效率的变化，绘制了来自6-8个样本的个体TUMAP分离的变异系数(CV，％)(图9C)。总体来说，A*02 TUMAP的平均偏差为24％，A*24 TUMAP为32％。
[0141] 固体、冷冻组织中细胞计数的测定
[0142] 用于计算每个细胞肽拷贝数的另一个关键因素是用于TUMAP分离组织样本的总细胞计数的估计值。发明人决定使用DNA含量分析法，因为此方法适用于不同来源的广泛样本，而最重要的是，冷冻样本(Forsey and Chaudhuri，2009；Alcoser et al.，2011；Alcoser et al.，2011；Silva et al.，2013)。
[0143] 考虑肿瘤内的异质性，有必要确定来自代表用于TUMAP分离的完整组织样本的组织片段的细胞计数。TUMAP分离期间制备的组织裂解液进行DNA分析的合适样本，因为它相比于固体组织片段更均匀。DNA分离后，用基于荧光的测定法对总DNA浓度进行定量(Life Technologies公司，Qubit HS DNA分析法)并计算样本的总DNA含量。
[0144] 为了计算来自给定DNA量的细胞数，发明人考虑了两种不同的方法：首先，细胞数可使用人类基因组的理论质量(被估计为每二倍体基因组约6.67pg DNA)进行计算(Alcoser et al.，2011；Konigshoff et al.，2003)。另外，可使用含已知细胞数的样本以采用组织样本同样的方法来绘制DNA标准曲线。这种方法已补偿了DNA分离和定量程序的任何影响，从而提高了我们结果的准确性。发明人绘制了两个不同的标准曲线，一个来自七种不同肿瘤细胞系和另一个来自六个不同健康供体的外周血单个核细胞(PBMC)。
[0145] 为了比较所有三种评价方法(理论DNA质量和两种不同基于细胞的标准曲线)，计算了几个样本的每1g组织的细胞数(图10A)。与使用PBMC标准相比，使用细胞系标准的计算导致细胞计数大大降低(最大3.6倍的低估)。这是预期情况，因为考虑到与健康二倍体PBMC相比，肿瘤细胞系常常非整倍体细胞比例更高且DNA含量较高。在文献中，不同研究中二倍体胃肿瘤的比例为25-67％(Hiyama et al.，1995；Tamura et al.，1991；Wiksten et al.，2008；Zhang et al.，2005；Sugai et al.，2005)。由于组织样本的倍性和非整倍体细胞的分数未知，因此，这两种标准曲线可能只对真实细胞计数提供估计，但没有考虑个体组织样本的所有特性。变化的另一个来源是组织样本的未知增殖状态或坏死细胞的存在。特别是，增殖细胞中DNA含量的倍增增加了相对于细胞数的DNA量，并因而导致细胞计数计算值的偏差。在两种正常胃组织样本中，发明人用三种方法均计算出每1g组织相较于肿瘤样本，细胞数较低。
[0146] 作为一种保守方法，发明人决定使用PBMC标准曲线(图10B)，这可能会导致过高估计超二倍体组织样本部分中的细胞计数，从而低估此类样本中每个细胞的肽拷贝数，但决不应过高估计任何样本中每个细胞的肽拷贝数。
[0147] 为了分析选定作为绝对TUMAP定量的组织样本，发明人从2-3等份组织溶解液中分离出DNA，并且采用基于荧光的测定法以2-3次复制定量每种DNA制备品。使用PBMC标准曲线(图11A)根据DNA含量计算总细胞数和每1g组织的细胞计数数。为了获得细胞计数分析的整体变化的估计值，首先在每个样本的水平或如果可行用生物复制物(即来自相同肿瘤不同部分的独立组织裂解制备液)测定变异系数(％)。该计算考虑到了组织裂解液的等分试样之间的变化以及荧光测定法重复测量值之间的变化。这些CV示于图11B中，总体变化确定为所描绘CV的中位数。变化可部分地由以下事实进行说明：组织裂解物并非完全均质化，即含有未解离细胞的剩余组织颗粒导致个体分离复制物细胞计数较高(例如，参见图11A的GC816T)。
[0148] 每细胞的肽拷贝数
[0149] 采用nanoLC-MS/MS运行中肽定量数据(″总肽″)，TUMAP分离效率(″分离效率，％″)以及每个肿瘤样本可用的细胞计数，能够根据以下公式计算每个细胞的TUMAP拷贝数：
[0150] 总肽的量根据2-4个nanoLC-MS/MS实验结果使用图4至图7中所示的校准曲线计算(″肽/运行[fmol]″)。
[0151]
[0152] 只有使用校准曲线定义高于LLOQ的MS测量值用于绝对肽拷贝数的计算。此LLOQ是指nanoLC-MS/MS实验中的TUMAP量(″LLOQ/运行[fmol]″)。
[0153] 可量化的所有肽每个细胞的拷贝数从每个细胞50至30000的拷贝数(见表3)。
[0154] 表3：HLA-A＊02和HLA-A＊24 TUMAP每个细胞拷贝数概览
[0155] HLA-A*02 TUMAP在8个样本中分析，HLA-A*24 TUMAP在6个样本中分析。nq＝因肽数量低于LLOQ而没有定量
[0156]
[0157]
[0158] 为了使″每个细胞肽拷贝数″背景下的LLOQ可视，使用上面所示的两个公式计算每个样本中每个TUMAP的″每个细胞的LLOQ″。由于样本的总细胞计数不同，每个样本的每个细胞LLOQ不同(A*02 TUMAP参见图12和图13，A*24 TUMAP参见图14和图15)。
[0159] 绝对TUMAP定量误差估计
[0160] 为了估计绝对TUMAP定量的变化，发明人考虑了以下三个主要实验结果的相对变化：
[0161] a)分离TUMAP的数量：相对偏差1.8％(A*02)和2.1％(A*24)
[0162] b)MHC分离的效率：相对偏差24％(A*02)和32％(A*24)
[0163] c)组织样本的细胞计数：相对偏差27％
[0164] 假定变数值为正态分布，“每个细胞拷贝数”的相对误差(σ)可计算为每个变量的二次相对误差总和的平方根：
[0165]
[0166] 根据上面给出的值，每个细胞绝对肽拷贝数的变异系数HLA-A*02肽约为36％，HLA-A*24约为42％。为了提供结果变化的影响，计算了模型肽和样本的每个细胞肽拷贝数的绝对和相对误差(表4)。
[0167] 表4：模型肽绝对TUMAP定量中绝对和相对误差的示例性计算
[0168]
[0169] 该模型计算表明，对于绝对定量复杂的多步骤分析，结果的变化仍在可接受的范围内。对于个体TUMAP，相对误差可能偏离此处算出的平均误差。每个细胞的TUMAP拷贝数可在不同TUMAP之间进行定量比较，从而优化TUMAP以选择合适的抗体和/或可溶性T细胞受体靶标。
[0170] TUMAP定量方法与已发表方法的比较
[0171] 以前未曾显示每个细胞MHC相关肽拷贝数绝对定量的准确方法。最重要的是，先前发表的使用MS分析定量MHC结合肽的方法没有考虑样本制备过程中的抗原损失(Tan et al.，2011；Hogan et al.，2005)。Peter A.von Velen小组最近发表了「MHC结合肽准确定量」的一种方法(Hassan et al.，2014)。在此技术说明中，一种方法被用来量化EBV-LCL JYpp65细胞上的两种小组织兼容性抗原——LB-NISCH-1A和LB-SSR1-1S。但是，各个实验步骤大不相同，总结于下表：
[0172] 表5：Hassan等人的TUMAP定量方法与本发明的比较
[0173]
[0174]
[0175] Hassan等人分析的两种肽拷贝数在生物复制物中每个细胞为800至5300(相对偏差74％)和3000至12000(相对偏差60％)拷贝。这种偏差的原因没有明确讨论，但可能是由于使用不同的MS仪器所致。
[0176] 总之，本发明中改良的方法预期有助于得出更准确和可靠的结果。
[0177] 低拷贝数肽的定量
[0178] 为了显示本发明方法的功效，产生了如下表中呈现的数据。肽经确定只有非常少量的拷贝数存在，在他们之中有肽PDE11-001。由此可以看出，该方法可测定少至每个细胞约10个拷贝的肽。
[0179] 表6：低拷贝数肽的定量
[0180] PC-前列腺癌-序列PDE11-001为ALLESRVNL(序列号25)
[0181]
[0182] PDE11-001是一种源自磷酸二酯酶11A(PDE11A)的HLA-A*02结合肽，其催化cAMP和cGMP的水解，从而下调各信号通路。PDE11A突变与肾上腺皮质增生以及家族性睾丸生殖细胞肿瘤相关联。该肽在前列腺癌样本上检测到，也在肝细胞癌、胰腺癌和肾细胞癌中检测到，并且不能在任何正常组织中检测到。
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| 用于胶质母细胞瘤的EGFR导向的CAR疗法 | 2020-05-19 | 244 |
| 人CD3+CD56+CIK细胞的制备方法及其应用 | 2020-05-26 | 367 |
| 方法 | 2020-05-15 | 645 |
| 增强外源性施用T细胞的体内持久性和功效的方法、基因修饰的T细胞和方法以及使用方法 | 2020-05-18 | 486 |
| 药物相关的转基因表达 | 2020-05-27 | 144 |
| 一种T细胞高活性的启动子及其用途 | 2020-05-20 | 174 |
| 天然加工的HLA限制性癌肽绝对定量方法 | 2020-05-17 | 111 |
| 结合有免疫检查点阻断剂的T淋巴细胞及其在制备抗肿瘤药物中的应用 | 2020-05-23 | 601 |
| 能用于过继性细胞疗法的多肽 | 2020-05-25 | 912 |
| 具有表面缀合的载药纳米颗粒的CAR T细胞的过继转移及其用途 | 2020-05-11 | 808 |
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