用于检测临床样品中的病原分枝杆菌的方法
阅读：156发布：2020-05-14
专利汇可以提供用于检测临床样品中的病原分枝杆菌的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及检测诸如痰、脑脊髓液、胃 洗出 物和组织 活体检测 物等临床样品中的病原分枝杆菌，其特征在于，利用设计的寡核苷酸引物对来延伸本发明的新DNA，所述寡核苷酸引物对能特异扩增来自于临床样品的靶DNA，所述DNA位于甲基分枝菌酸合成酶基因mmaA1和mmaA2之间的基因间区域以及mmaA1和mmaA2基因中的侧翼区域。，下面是用于检测临床样品中的病原分枝杆菌的方法专利的具体信息内容。
1.检测临床样品中病原分枝杆菌的方法，所述方法包括以下步骤：
a.通过常规方法净化临床样品，去除包括粘液的污染物，
b.用改进的裂解缓冲液处理步骤(a)所得的经处理的临床样品以使活病 原分枝杆菌失活，从而使过程对使用者安全，
c.利用改进的方法，从步骤(b)所得的经处理的临床样品中提取基因组 DNA，从而提高DNA的产量和质量，
d.从步骤(c)所得的DNA设计用于检测病原分枝杆菌的序列SEQ ID No. 4，所述设计的序列包括步骤(c)所得DNA所选出的SEQ ID No.3的基因间区 域、含SEQ ID No.1的mmaA1基因部分的侧翼区域和SEQ ID No.2的mmaA2 基因部分，
e.设计并合成一套用于扩增SEQ ID No.4的反向引物的特异寡核苷酸引 物，其中SEQ ID No.5的为正向引物，和SEQID No.6为用于聚合酶链式反 应(PCR)，
f.开发用于特异性扩增(d)的SEQID No.4的PCR扩增过程，所述过程 包括使用步骤(e)中设计并合成的特异性寡核苷酸引物，用于检测临床样品中 病原分枝杆菌的存在，和
g.通过限制酶片断长度多态性(RFLP)分析PCR扩增产物，用于区分病原 分枝杆菌菌种，用于快速评估HIV的共感染。
2.根据权利要求1所述的方法，其中设计的SEQ ID No.4具有以下序列：
5′GAGGTGTAATGCCTTTCCGGACCCTAGGTGGCCTTTCGGTGCTTG CACGGAACGCACCGATGCTTCCCCCTCCCCGCATGCTCGAGGCATGCTA TCCGATACAGGGCCGCCGCACTAAACCGCGATCGAATTTGCCCAGGTCA GGGAACGGATATGAGCGGACGAG 3′。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于临床样品选自痰、胃洗出物、 脑脊髓液、血液、组织活体检测物、或骨髓穿刺液和其他体液或组织。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过消化净化混合物，来 进行净化步骤(a)中的样品，去除污染物(除了分枝杆菌和粘液之外的活生物)， 接着通过离心浓缩样品，其中消化净化混合物包含温和的碱、NaOH、柠檬酸 三钠和粘液溶解剂和在约0.4-2.5M范围内的异硫氰酸胍。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，消化净化混合物包含温和 的碱、NaOH、柠檬酸三钠和粘液溶解剂和在约0.5-2.0M范围内的异硫氰酸 胍。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用改进的裂解缓冲液从 处理过的临床样品中提取步骤(c)中的DNA，并通过有机溶剂完全沉淀来纯化 DNA以提高产量，其中裂解缓冲液的成分包含在约0.5-8M范围内的异硫氰 酸胍、在约20-100mM范围内的pH 7.6的Tris.Cl、在约0.5-2％范围内的N- 月桂基肌氨酸(N lauryl sarcosyl)、在约0.1-20mM范围内的EDTA、在约1-25 mM范围内的β-巯基乙醇和在约0.3M-1M范围内的NH4COOH。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，异硫氰酸胍约为4M、pH 7.6 的Tris.Cl约为50mM、N-月桂基肌氨酸(N lauryl sarcosyl)约为1％内、EDTA 约为1mM、β-巯基乙醇约为10mM和NH4COOH约为0.7M。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，有机溶剂选自包括苯酚/氯 仿混合物和氯仿的组。
9.根据权利要求1和6所述的方法，其特征在于，基因组DNA产量的增 加范围约为25％至50％的范围内。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，基因组DNA产量的增加 范围约为30％至40％的范围内。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过改进的渐降式PCR (Touch down PCR)循环条件来达到步骤(f)中的DNA高扩增量，其中所述 条件包括在约62-72℃范围内的高起始退火温度，接着在最先的10-25个循环 中每个PCR循环降低约0.2-1℃范围内的温度，渐降步骤达到约56-62℃的最 优退火温度则进行另外30个PCR循环。
12.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，通过改进的渐降式PCR (Touch down PCR)循环条件来达到DNA高扩增量，其中所述条件包括的 步骤为约70℃的高起始退火温度，接着在最先约14个循环中每个PCR循环 降低约0.8℃的温度，至约58℃进行另外25个PCR循环。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于检测临床样品中病原 分枝杆菌的寡核苷酸引物，其能扩增SEQ ID No.4的基因间区域，其选自以 下组：
a.5′TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG 3′(SEQ ID No.5)，其是正 向引物。
b.5′GGAATTCCACTACCACGGACTCTC 3′(SEQ ID No.6)，其是反向引 物。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，寡核苷酸引物的长度在5 至100个碱基间。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，改进的裂解缓冲液提供更 净化的DNA制品。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用含4M异硫氰酸胍的改 进的裂解缓冲液处理使活分枝杆菌失活，从而使过程对操作者更安全。
17.用于检测临床样品中病原分枝杆菌的诊断试剂盒，其包含选自由以 下引物组成的组中的引物：
a.5′TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG 3′(SEQ ID No.5)，其是 正向引物，和
b.5′GGAATTCCACTACGCACGGACTCTC 3′(SEQ ID No.6)，其是反 向引物。
18.具有seq.ID No.5和Seq.ID No.6的引物用于检测病原分枝杆菌的应 用，所述方法包括以下步骤：
a.利用改进的方法从处理过的临床样品中提取基因组DNA以提高DNA 的产量和质量，
b.设计来自步骤(a)所得DNA的用于特异检测病原分枝杆菌的序列SEQ ID No.4，所述设计的序列包括步骤(a)所得DNA所选出的SEQ ID No.3的基 因间区域、含SEQ ID No.1的mmaA1基因部分的侧翼区域和SEQ ID No.2的 mmaA2基因部分，
c.开发用于特异性扩增步骤(b)的SEQ ID No.4的PCR扩增过程，和
d.通过限制酶片断长度多态性(RFLP)分析PCR扩增产物，用于区分病原 分枝杆菌菌种，用于快速评估HIV的共感染。
19.根据权利要求18所述的应用，其中设计的SEQ ID No.4具有如下序 列：
5′GAGGTGTAATGCCTTTCCGGACCCTAGGTGGCCTTTCGGTGCTTG CACGGAACGCACCGATGCTTCCCCCTCCCCGCATGCTCGAGGCATGCTA TCCGATACAGGGCCGCCGCACTAAACCGCGATCGAATTTGCCCAGGTCA GGGAACGGATATGAGCGG ACGAG 3′。
20.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，临床样品选自痰、胃洗 出物、脑脊髓液、血液、组织活体检测物、或骨髓穿刺液和其他体液或组织。
21.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，通过消化净化混合物， 来进行净化步骤(a)中的样品，去除污染物(除了分枝杆菌和粘液之外的活生 物)，接着通过离心浓缩样品，其中消化净化混合物包含温和的碱、NaOH、 柠檬酸三钠和粘液溶解剂和在约0.4-2.5M范围内的异硫氰酸胍。
发明领域
本发明涉及检测诸如痰、脑脊髓液、胃洗出物和组织活体检测物等临床 样品中的病原分枝杆菌，其特征在于，本发明的新DNA片段使用一对能够从 临床样品特异扩增靶DNA的设计的寡聚核苷酸引物，所述新DNA片段位于 甲基分枝菌酸合成酶基因mmaA1和mmaA2之间的基因间区域以及mmaA1 和mmaA2基因中的侧翼区域。
发明背景
肺结核是头号杀手疾病。对于单一传染病来说，每年它造成最多数量的 人死亡。根据世界卫生组织报告(WHO)，每年有800万例肺结核病例被报告， 有290万人死亡(Dolin等，1995)。由于利用有效的抗结核药，90年代早期前， 肺结核死亡数逐渐减少。肺结核病例和死亡再次上升，这主要是因为与人免 疫缺陷病毒(HIV)共感染的协同效应(Hopewell，P.C等，1992)和多药物抗性 (MDR)的结核分支杆菌(M.tuberculosis)菌株(M.tuberculosis)的出现 (Bloom，B.R，和C.L.Murray.，1992)以及所谓非结核分枝杆菌的介入。
已知有超过70种的分枝杆菌，其中大多数对人是不致病的。结核分支杆 菌(M.tuberculosis)的感染造成了肺结核，其中某些病例是牛分支杆菌(M. bovis)引起的。这些生物在遗传上非常接近，它们被称为结核分支杆菌(M. tuberculosis)复合(MTC)生物。另有超过一打的病原分枝杆菌，其造成肺部或 身体其他部分的肺结核样感染。这些生物被称为不同于结核杆菌的分枝杆菌 (MOTT)或非结核分枝杆菌(NTM)。随着AIDS的流行，这些所谓非结核分 枝杆菌变得重要起来，并从大量共感染HIV的肺结核患者中被分离出来。
在其他方面健康的个体中，早期肺结核通常无法被识别。缺乏简单、快 速和可靠、能特异检测在临床样品中的结核分支杆菌(M.tuberculosis)和其 他病原体的测试，这对患者个体的管理以及进行合适的传染控制和公共卫生 措施都带来了巨大的难题。
经典的诊断方法包括在显微镜下检查针对抗酸分枝杆菌的痰涂片和检查 肺部x光片。可是，在大量的病例中，在疾病的早期阶段，痰涂片检查呈分 枝杆菌阴性，而直至感染后几个月，x光片上的肺部变化才会明显。尽管为 抗酸细菌(AFB)涂片染色只需要不超过2小时，但其缺少灵敏度并在一些病 例中无特异性(Ebersole，L.L.1992)。另外AFB染色的阳性结果不能区分分枝 杆菌的菌种。
当前绝对可靠的诊断方法仅仅是基于培养来源于临床样品的结核分支杆 菌(M.tuberculosis)并进行形态学和生物化学鉴定。结核分支杆菌(M. tuberculosis)和其他相关生物的培养是灵敏而且特异的，但其麻烦，并需要 在固体培养基上培养6-12周并在液体培养基上进行3至6周，期间患者会病 情恶化并感染其他个体。所以，能可靠检测结核分支杆菌(M.tuberculosis) 存在的快速测试对于患者的早期检测、治疗和管理来说是至关重要的。
近来已开发出几种分子测试来快速检测和鉴定结核分支杆菌(M. tuberculosis)。Abe等和Miller等评估了商品化的测试，即Gen-Probe的“扩 增的结核分支杆菌(M.tuberculosis)直接测试”。该测试从呼吸样本中扩增结 核分支杆菌(M.tuberculosis)的16S核糖体RNA并利用化学荧光探针来检 测扩增的产物，其报道的灵敏度约为91％。其他基于连接酶链式反应(LCR) (Abbott Laboratories)、聚合酶链式反应(PCR)(Roche Diagnostics Systems， Eastman Kodak Co.，Johnson&Johnson)、Q-beta复制酶(GeneTrak)和链置换扩 增(Becton Dickinson)的商品化的测试在Forbes的综述中被论述。
其他通过非培养法基于免疫学检测结核分支杆菌(M.tuberculosis)感染 的方法有胶凝集、放射免疫测试和酶联免疫吸附测试等。这些方法的主要缺 点是其缺少灵敏性和或特异性(Kandival，G.V.等，1986；1984；Yenez，M.A.等， 1986)。血清学技术可用于一些临床设施，但该方法通常由于低灵敏性和或特 异性而受到限制(Daniel，T.M.和S.M.Debanne.1987)。
聚合酶链式反应(PCR)(Saiki等)的开发，能够从少量的核酸样品中扩增 和检测DNA，这能够检测临床样品中的结核分支杆菌(M.tuberculosis)特异 性核酸。一些较早的报道是基于检测16S核糖体RNA或其基因。首先通过利 用所有细菌的保守引物来扩增DNA部分，接着利用种特异性探针来检测不同 的分枝杆菌菌种，由此检测结核分支杆菌(M.tuberculosis)和相关生物。该 方法的主要缺点是它是繁琐的，需要超过24小时来完成。用于在扩增产物中 检测不同物种序列的种特异性探针仅变化很少的碱基，接着通过基于杂交的 试验来分析该扩增的DNA，如果在不够理想的条件下进行，它会造成假阳性 测试。
IS6110插入元件的发现(Cave等，Thierry等)和相信该元件仅存在于结核 分支杆菌(M.tuberculosis)复合物(结核分支杆菌M.tuberculosis、牛分支杆 菌M.bovis、非洲分支杆菌M.africanum和田鼠分支杆菌M.microti)中，孕育 了一整套快速诊断策略(Brisson-Noel等，Clarridge等，Forbes等，Hermans等， Kolk等，Kox等，Zambardi等)。这些测试利用各种技术从痰中提取离DNA。 PCR被用来从提取的DNA中扩增IS6110 DNA序列。成功扩增该DNA被认 为是结核分支杆菌感染(M.tuberculosis)存在的指标。颁发给Crawford等的 美国专利第5,168,039和5,370,998号是基于IS6110检测肺结核的。另一个 美国专利第5,731,150号被授予CIBA CORNING DIAGNOSTICS CORP (Gurpreet.S等)。颁发给Guesdon.J.L的欧洲专利EP 0,461,045是基于IS6110 检测肺结核的。有报道，在结核分支杆菌(M.tuberculosis)、牛分支杆菌(M. bovis)、牛分支杆菌(M.bovis)-BCG、非洲分支杆菌(M.africanum)和田 鼠分支杆菌(M.microti)中分别存在10、2、1、5和5个拷贝的IS6110元件 (Spargo等)。大多数的报道称，利用IS6110和其它基于PCR的肺结核检测 法声称具有超过75％的灵敏度和接近100％的特异性。
有关将该序列用作靶位根据PCR来诊断结核分支杆菌(M.tuberculosis) 的细致研究揭示出了几个缺点。Noordhoek等报道，7个主要实验室间的盲 比较研究浮现了一个主要关注点，其报道的假阳性率为3至77％，而灵敏度 的范围为2至90％。该研究是重要的，这是因为它使所有参与的实验室应用 他们自己的检测策略来鉴定IS6110，而且最终结果清楚显示现有的实验方案 在灵敏性和特异性方面都有严重的缺陷。
Lee等(1994)的另一个研究报道，分析从结核性脑膜炎患者中得到的脑脊 髓液样品时有62％的假阳性。尽管来源于相同实验室中的前处理样品的扩增 的IS6110 DNA的样品污染物可以解释一些假阳性，而这不是主要的误差来 源，因为大多数实验室具备极好的样品保存程序来避免污染。该大量假阳性 是因为IS6110样序列存在于结核分支杆菌(M.tuberculosis)之外的生物中。 IS6110是一个转座插入元件(Calos和Miller)，这些DNA片断具有“可移动 的”性质。IS6110也可能源自(或传递到过)其他生物，而且在进化期间， 这些生物间的DNA的某区域保持了保守性。Mariani等公开的报道论述了与 结核分支杆菌(M.tuberculosis)IS6110元件相关的序列在生物间的水平转移。 这可解释文献中报道的一些假阳性测试。另外，Kent等能扩增与来自除结核 分支杆菌(M.tuberculosis)之外的分枝杆菌的IS6110相关的序列，这确认了 这个怀疑即IS6110样序列存在于其他生物中，它们可在使用IS6110特异性引 物所进行的PCR中被检测到，所述特异性引物被设计为用于检测结核分支杆 菌(M.tuberculosis)。为了说明该问题，对存于GenBank中的核酸序列进行 系统分析，发现在除结核分支杆菌(M.tuberculosis)之外的生物中有与IS6110 相似的序列片段。在临床样品中可发现许多这样的生物。
使IS6110不适于作为检测肺结核的靶位的另一个事实是，一些近来的报 道显示一些结核分支杆菌(M.tuberculosis)分离株在其基因组中完全缺少 IS6110序列，因此造成假阴性结果。对亚洲分离株的研究报道了该序列可在 至少一些分离株中缺失(Yuen，L.K，等1993)。
检测、区别和治疗肺结核的另一个非常重要的方面是人免疫缺陷病毒 (HIV)的出现。肺结核的流行病学和病因学自从HIV(获得性免疫缺陷综合症 (AIDS)的病原体)的增加而发生了巨大的改变。自从出现AIDS(Bafica，A. 等)，肺结核的影响相当程度地增加了。在AIDS死亡中，超过30％归咎于肺 结核。自1991年，感染有HIV的肺结核患者数从3％增加到超过10％。仅在 AIDS患者中，结核分支杆菌(M.tuberculosis)和牛分支杆菌(M.bovis)不 只是肺结核的病原体。所谓非结核分枝杆菌在免疫力弱的肺结核患者中成为 重要的病原。不同实验室从源于共感染HIV的患者的临床样品中分离了其他 病原分枝杆菌，称作非结核分枝杆菌。它们中最重要的是鸟分支杆菌(M. avium)和密切相关的分枝杆菌组群，即胞内分支杆菌(M.intracellulare)和 龟分支杆菌(M.chelonae)。这些生物被称作鸟胞内分支杆菌复合(MAI复合) 生物。MAI复合生物带来无法与肺结核区别开的症状。它们对肺是有影响的， 并且在大量患者(尤其是人免疫缺陷病毒(HIV)感染的那些)中弥散形式的疾 病。从多至30％的肺结核患者临床样品中分离得到鸟分支杆菌(M.avium)， 并在弥散性肺结核患者中有甚至更高的数量。堪萨斯分支杆菌(M.kansassi) 和瘰疬分支杆菌(M.scrofulaceum)是其他的非结核分枝杆菌，其分离自相当 大量患有肺结核的AIDS患者。其他非结核分枝杆菌也正从源于AIDS患者 的临床样品中被分离到。较少分离到非结核分枝杆菌的原因可能是无法利用 简单、准确和可靠的测试来分离并分辨不同类型的非结核分枝杆菌。这些发 现提示，非结核分枝杆菌随着AIDS的出现而成为重要的病原体。
结合IS6110对于结核分支杆菌(M.tuberculosis)并非是特异性的以及会 在许多分离株中不存在的信息，和尤其在共感染有HIV的患者中其他非结核 分枝杆菌是肺结核病原体的事实。公开报道清楚表明，没有现存的基于IS6110 和其他靶序列的技术能提供临床诊断测试中所需的置信度水平。
这强调了需要改变检测肺结核的方式。这要求评估新的能检测临床样品 中所有病原分枝杆菌的靶位来而不是仅检测结核分支杆菌(M.tuberculosis) 复合生物。理想地，应有一种代替仅检测结核分支杆菌(M.tuberculosis)复 合细菌的诊断方法，能够检测临床样品中所有病原分枝杆菌，包括非结核分 枝杆菌。在临床样品中检测不同的病原分枝杆菌后，通过在该化验中所述的 PCR-RPLF法将不同类型的病原分枝杆菌区分成不同种的分枝杆菌。那些仅 感染有NTM或同时感染有NTM和结核分支杆菌(M.tuberculosis)复合生物 的患者为可能的HIV共感染提供快速的参考，因此可以有良好的参数来了解 群体中的HIV感染和传播。没有许多这类测试可用于检测临床样品中的病原 分枝杆菌并区分它们。
Abe等和Miller等评估了结核分支杆菌(M.tuberculosis)直接测试”。它 测试了来自呼吸样品的结核分支杆菌(M.tuberculosis)16S核糖体RNA并 用化学荧光探针来检测扩增的产物，其中报道的灵敏度约为91％。该测试是 复杂的，需要24小时来完成并使用探针来鉴定仅改变少数碱基的不同分枝杆 菌，如果在略微不严谨的条件下进行，其会产生假阳性结果。
基于PCR试验的成功依赖于几种因素。其中最重要的是提取高质量的用 于PCR的核酸，设计病原体特异性PCR引物和能从分离的DNA中特异扩增 靶序列的PCR条件。
当前基于PCR用于检测分枝杆菌的试验的主要弱点是缺少简单、有效并 能确保使用者安全的核酸提取方法。裂解分枝杆菌并从临床样品中纯化核酸 而不同时纯化已知存在于大多数临床样品中的杂质，这在基于PCR的试验中 是关键的步骤。公开的实验方案的主要缺点是大多数用于分离核酸的方法不 能容易地用于所有类型的样品。任何需要冗长和低效率的DNA纯化的核酸提 取，会降低测试的速度和灵敏度。另外，必须对不同类型的样品进行不同的 提取过程，也会使整个过程昂贵和缓慢。当处理包含活结核分支杆菌(M. tuberculosis)时，操作者的安全性也是一个主要的关注点。在如较早所述的 仔细分析不同DNA提取物的过程后，会发现它们要么是极不高效的，要么不 能去除通常存在于大多数临床样品中的杂质(Boom，R.C)。因此，需要简单、 有效并耐用的各种临床样品的核酸提取方法来确保基于PCR的试验的灵敏 度和重复性。
靶序列的特异和非特异扩增是的成功基于PCR试验的另一个关键因素。 在最不优化的条件下，即使特异而单一的引物也能导致非特异性扩增出同样 大小的条带，因此会导致假阳性结果(Gurpreet，S等)。这必须以实际和成本有 效的方式来得到解决。
发明目的
本发明的主要目的是提供检测临床样品中病原分枝杆菌的方法。
本发明的另一个目的涉及在各种临床样品中如痰、脑脊髓液、胃洗出物、 血液、骨髓穿刺液和组织活体检测物等中，通过扩增部分基因簇来检测DNA 片段以确定因分枝杆菌所引起感染的设计和组成。
本发明的另一个目的还涉及开发从所有类型的临床样品中提取DNA的 有效方法。
本发明的另一个目的还在于设计一套能在聚合酶链式反应中特异扩增部 分基因的寡核苷酸引物。
本发明的另一个目的还在于一种能特异扩增靶位的聚合酶链式反应方 法。
本发明的另一个目的还在于提供区分各种分枝杆菌的方法。
发明概述
本发明涉及在临床样品中检测病原分枝杆菌，如在痰、脑脊髓液、胃洗 出物和组织活体检测物等中。本发明的新颖性在于新的DNA片段，其位于甲 基分枝菌酸合成酶基因mmaA1和mmaA2间的基因间区域以及mmaA1和 mmaA2基因中的侧翼区域中。该测试使用能特异扩增来自临床样品的靶DNA 的寡核苷酸引物对。本发明描述了从临床样品中提取DNA的方法，其比现有 技术更安全并能从临床样品中获得更多的DNA。本发明也描述了一种扩增方 法，其产生对靶扩增子的特异扩增而不使用昂贵的试剂，因而使测试经济。 本发明阐述了通过限制酶片断长度多态性(RFLP)分析扩增的PCR产物来区分 在临床样品中不同种病原分枝杆菌的方法。
附图说明
图1分枝杆菌的甲基分枝菌酸合成酶mmaA 4-mmaA 1基因簇以及正向 A和反向D引物位置的示意图。
图2带有166个碱基对的基因间区域(用小写字母显示)的mmaA2和 mmaA1基因序列。正向A、SEQ ID 1和反向引物D、SEQ ID 2的位置。引 物序列都用下划线和斜体表示。
图3用引物A和D(电泳道1-15)进行不同分枝杆菌基因组DNA的PCR 扩增：1.鸟分支杆菌(M.avium)2.牛分支杆菌(M.bovis)3.龟分支杆 菌(M.chelonae)4.偶发分支杆菌(M.fortuitum)5.胞内分支杆菌(M. intracellulare)6.堪萨斯分支杆菌(M.kansassi)7.草分支杆菌(M.phlei) 8.100bp DNA分子量标记9.海分支杆菌(M.rnarinmn)10.瘰疬分支杆 菌(M.scrofulaceum)11.耻垢分支杆菌(M.smegmatis)12.M.szulgai 13. 结核分支杆菌(M.tuberculosis)和14.阴性对照。AD显示有363bp的扩增 产物。
图4显示AD内HaeI和Mspl的限制性内切酶图谱的线性图。
图5显示AD内FmuI、CviRI和Taq I的限制性内切酶图谱的线性图。
图6显示限制性内切酶AcaIV和HaeIII位点分布的限制性酶图谱。
图7显示PCR反应不同步骤的线性图。
发明详述
本工作的目的是开发一种全面的技术，能快速、安全并特异地检测致肺 结核的分枝杆菌。任何基于PCR诊断中的有限步骤为从临床样品中提取 DNA，设计能特异扩增靶序列的PCR引物和开发只允许特异性扩增靶序列 的PCR条件。可利用的测试的严重限制在于它们能检测但不能区别各种分枝 杆菌。
各种可用的实验方案描述了不同的核酸提取方法和混合试剂用以裂解分 枝杆菌并从临床样品中纯化核酸。在各种方法中，通过用碱、有机溶剂、变 性剂(chaotropic agent)、去污剂或它们混合物来处理样品，以此来进行裂解。 几种较简单的方法声称可通过在碱、PCR缓冲液或甚至在纯水中简单煮沸来 达到裂解。尽管这些方法简单并通常在纯培养物上运作良好，但它们不那么 适用于临床样品。PCR反应是耐用的而且通过粗裂解法释放出的核酸能直接 用于PCR反应，但这种普遍流行的观念并不正确。这些方法使用简单但经常 不能杀死存在于临床样品中的所有分枝杆菌，因此对使用者来说是危险的。 这类制剂被报道含有许多能轻易抑制PCR反应的杂质。已经观察到了，这类 制剂甚至在稀释几倍的DNA上也不能产生扩增结果。事实是，提取纯净的 DNA对于基于PCR的试验成功来说是最重要的。
本发明人仔细优化了核酸纯化中的所有步骤并开发出一种简单、耐用并 确保操作者完全安全的方法。进一步通过温和的碱和粘液溶解剂来处理像痰 的较脏样品，以此帮助去除许多污染剂并得到较纯净的核酸制剂。该步骤也 帮助去除其它存在于像痰和胃洗出物等的较脏的样品中的污染生物。由于痰 是针对肺结核的最常规收集和提交的临床样品，已知其包含几种污染物，所 述污染物是有效的PCR反应抑制剂。本发明开发的改进的裂解缓冲液使用强 变性剂(chaotropic agent)，即异硫氰酸胍。这帮助使所有存在于临床样品中 的分枝杆菌失活，裂解坚硬的分枝杆菌细胞并变性和去除蛋白质，从而形成 较纯净的DNA制剂(表1)，并能确保操作者的安全。通过加热改进的裂解缓 冲液中的标本，即使最坚硬的细胞和像孢子和多面体杆状病毒的物体都能轻 易地被裂解。相同组较早的报道披露了使用异硫氰酸胍来裂解并从像多面体 杆状病毒和分枝杆菌的坚硬材料中纯化核(Das等)和(Bose.M等)。
表1系列号1至3为通过本文所述而制备的样品，而系列号4至6为通 过Gurpreet等的方法而制备的样品。 系列号 稀释因子 260nm处 的OD 280nm处 的OD 260/280 比率 浓度 纯度 1 50 0.011 0.019 1.82 27.60μg/ml 无蛋白质污染 2 50 0.010 0.017 1.85 25.00μg/ml 无蛋白质污染 3 50 0.013 0.024 1.88 33.03μg/ml 无蛋白质污染 4 50 0.006 0.011 1.62 17.13μg/ml 蛋白质污染 5 50 0.009 0.015 1.66 23.46μg/ml 蛋白质污染 6 50 0.008 0.013 1.63 20.37μg/ml 蛋白质污染
使用该试剂的另一个好处是大多数蛋白质在该缓冲液中变性，造成完全 裂解存在于样品中的分枝杆菌。其他方法也描述了使用该试剂(Gurpreet，S 等)。本方法有几点不同于它们。本方法中改进的裂解缓冲液含有组合物，其 能达到更完全的裂解，更好地去除蛋白质并甚至帮助微量的DNA沉淀。这形 成了更纯净的DNA制剂并提高产量。本发明的裂解缓冲液代替使用异硫氰酸 胍-tris-苯酚来裂解，其包含去污剂N-月桂基肌氨酸(N lauryl sarcosyl)、200 mM NaCl和10mM 2′-巯基乙醇以及4M异硫氰酸胍。苯酚有很大的爆炸性， 因而是危险的，其不包括在改进的裂解缓冲液中。这些改进使本发明的改进 的裂解缓冲液完备并更有效。去污剂帮助溶解细胞壁的脂质和蛋白质，因而 造成完全裂解分枝杆菌细胞壁，该细胞壁富含不同类型的复合脂质。NaCl的 应用帮助沉淀微量存在的核酸，因而带来比Gurpreet等所述的方法多约 1.4-1.5倍的DNA产量。当处理每毫升样品中含有较少分枝杆菌的临床样品 时，这尤其关键。通过在改进的裂解缓冲液中以85℃加热消化并净化样品20 分钟，来使分枝杆菌细胞失活和裂解。与所述的几种方法中相比，这是安全 的，无需煮沸以及可能造成的盖子爆开或一些试管的爆裂。裂解液用碱性的 苯酚液抽提一次。已经注意到，如许多实验方案所声称的，无需用碱性的苯 酚液抽提以去除蛋白质。该简单步骤导致可去除所有蛋白质，包括与DNA紧 紧结合的蛋白质，因此可形成较纯净的核酸制剂。尤其在处理像痰和胃洗出 物的较脏的样品时，这提高了试验的可重复性。用等体积异丙醇从水相中沉 淀出核酸。
下一步，设计了一套病原分枝杆菌特异性的寡核苷酸引物。注意要确保 该序列在其他病原生物或人中并不存在，这是由于临床样品中不能排除掉这 类生物和人细胞的存在。为了该目的，利用分枝杆菌的mmaA1-mmaA4基因 簇(图1)，其登录号(accession number)为MTCY20H10.23c-MTCY20H10.26c。 该基因簇包含4个基因，它们由3个不同长度的间隔区域分隔(图1)。这些 甲基分枝菌酸合成酶基因负责合成以及修饰存在于病原分枝杆菌中的复杂的 末端分枝菌酸。这些分枝菌酸与分枝杆菌的病原性有关联。正向引物A、SEQ ID NO.3从mmaA2基因中的1-9位碱基起始，该11bp的寡核苷酸引物位于 基因mmaA2和mmaA1之间的167bp间隔区域中。反向引物D、SEQ ID NO. 4位于图1和图2所示的mmaA1基因中的688-705位碱基上。用Primer Select 软件(Lasergene，DNASTAR)来设计这些引物序列，使它们不同于除结核分支 杆菌(M.tuberculosis)和牛分支杆菌(M.bovis)之外的生物。
也用另一个方式来确保该引物序列特异于病原分枝杆菌。利用本研究所 (遗传和整体生物学研究所)开发的Genome Calculator软件，将寡核苷酸序 列转化成氨基酸(肽)，并同许多病原生物和人的基因互补序列相比较。该软 件将DNA序列转化成氨基酸(肽)，并通过将它们转化成短肽文库来将其与 数据库中可用的所有序列相比较。该软件发现了特异于结核分支杆菌(M. tuberculosis)和牛分支杆菌(M.bovis)的引物序列，而且其在其他24种病 原生物或人中并不存在，所述生物或人的基因组序列在数据库中可供利用。 用这些引物对待测的所有病原分支杆菌基因组DNA进行PCR，得到扩增结 果，同时用非病原分支杆菌基因组DNA进行PCR，并不能得到图3和表2 所示的扩增结果。
表2：PCR扩增来自不同病原和非病原分枝杆菌菌种的AD 分枝杆菌菌种 菌株 病原/非病原 PCR结果 鸟分支杆菌(M.avium) ATCC 病原性 阳性 牛分支杆菌(M.bovis) ATCC 病原性 阳性 龟分支杆菌(M.chelonae) ATCC 病原性 阳性 偶发分支杆菌(M.fortuitum) ATCC 病原性 阳性 胞内分支杆菌(M.intracellulare) ATCC 病原性 阳性 堪萨斯分支杆菌(M.kansassi) ATCC 病原性 阳性 海分支杆菌(M.marinum) ATCC 病原性 阳性 草分支杆菌(M.phlei) ATCC 非病原性 阴性 耻垢分支杆菌(M.smegmatis) ATCC 非病原性 阴性 瘰疬分支杆菌(M.scrofulaceum) ATCC 病原性 阳性 M.szulgai ATCC 病原性 阳性 结核分支杆菌(M.tuberculosis) ATCC 病原性 阳性 蟾分支杆菌(M.xenopi) ATCC 病原性 阳性
设计特异引物之后，下一个关键步骤是设计和开发PCR条件，其仅仅会 特异扩增所希望的靶位。由于在次最优条件下的PCR可造成非特异性扩增 出大小会与所希望的靶位类似的DNA片段，因而这个步骤是关键的(Gurpreet 等)。这会进而造成所希望的靶序列更少扩增，因而降低特异性和灵敏度。不 像Gurpreet等在他们的发明中所用的引物，我们的引物即使在次最优条件下 也不会造成从非病原分枝杆菌中扩增出相似大小的条带(图3)。
任何非特异性扩增是由于在PCR的退火步骤中的寡核苷酸引物非特异退 火而造成的。避免非特异性扩增的最常用策略是进行热启动PCR。通过在反 应物热的时候加入关键反应成分来实现这个策略。为了该目的，使用蜡珠包 裹的酶或者近来可利用新的耐热聚合酶(Thermopolymerase Gold，Perkin Elmer)。该酶能结合抗该酶的单克隆抗体，并仅仅在95℃孵育10-15分钟才 会变得有活性。可是应用这些措施会使测试贵10-20％。
进一步修改循环条件来防止引物在所希望位点之外的位点退火。如果最初 几次的PCR循环在比计算的寡核苷酸引物解链温度更高的退火温度进行，并 在随后在每次循环中逐渐降低退火温度，并在最优退火温度进行余下的25个 循环，就可达到该目的。一旦在最初的循环中得到了特异性扩增子，那么在 以后的循环中，它们不会使非特异产物与它们竞争。这种类型的循环条件被 称作渐降式PCR(Touch down PCR)，其有助于特异性扩增而无需昂贵的试 剂。该措施有助于使测试更具成本效益并更容易使用。
在试验中，下一步检是测扩增的PCR产物。扩增的PCR产物可通过几 种不同的方式来检测。在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上电泳是检测扩增的PCR 产物最常见和最普通的方式。应用琼脂糖胶较聚丙烯酰胺凝胶电泳或繁琐的 DNA ELISA(其需要更长时间来进行检测并需要更多的专门技能)更简单。 由于聚丙烯酰胺妨碍用于检测的溴化乙锭染料，因此聚丙烯酰胺凝胶比琼脂 糖胶更不灵敏。除此之外，丙烯酰胺是强力的神经毒素，因而对使用者有潜 在危险。水平琼脂糖胶电泳方法用于确定PCR产物。用UV短波瞬变显示器 来检测扩增的产物。
近来，用生物素或荧光染料标记PCR产物和或接着用ELISA检测产物已 经被论述过了。该方法可以轻易地和任何(包括我们的)基于PCR的试验一 起使用。
利用限制酶片断长度多态性(RFLP)分析PCR扩增片断，该基于PCR的检 测方法不但可用于检测临床样品中的不同类型的病原分枝杆菌，而且可用于 将它们区分成各种菌种。RFLP对于不同物种的种和株来说都是非常强大的工 具。它基于每种DNA具有一个或多个限制性内切酶位点的事实。这些位点可 被来源于不同细菌的II类限制性内切酶精确识别。在生物的自然进化过程中， 这些位点中的一个或多个被修饰或缺失。因而，对DNA片段用相同酶进行限 制性酶切导致不同种生物间片断长度的多态性，因此可用作辨别和流行病学 的的有效工具。由于该片段具有两个基因的167bp的基因间区域部分，因此 对于PCR-RFLP分析不同种分枝杆菌来说，AD是合适的候选物。该DNA片 段具有两个由几个碱基分隔的多限制性内切酶位点，其将产生的片断的大小 范围适于通过表3的聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析(图4、5和6)。这些位点位 于基因间以及在基因mmaA1中(图4、图5和图6)。对于不同种的RFLP图 谱来说，限制性产物能在10-12％聚丙烯酰胺凝胶上轻易分开。167的基因间 区域的存在，加上排布得好的一些常用限制性内切酶位点，使得AD是通过 PCR-RFLP分析来区分不同种病原分枝杆菌的合适候选物。
表3：DNA片段的多限制性内切酶位点 酶 位点数 位置 限制性片断 数 片断大小 HaeI 2 47bp 和 219bp 3 47bp，144bp 和172bp MspI 2 33bp 和 244bp 3 33bp，119bp 和211bp BsmNI 3 74bp，239bp 和333bp 4 30，74，94和 165bp CviRI 3 61，257 和 334bp 4 29，61，77和 196bp MwoI 3 67，237 和 331bp 4 32，67，94和 170bp TaqI 3 98，142 和 337bp 4 26，44，98和 195bp AcaIV 4 45，120，217 和326bp 5 37，45，75，97 和109bp HaeIII 4 47，122，219 和328 5 35，47，75，97 和109bp
为了得到PCR试剂制品，在干净房间中制备并分装PCR试剂。不让样品、 培养物或纯化的DNA导入PCR混合室。在另一间从未暴露于扩增的DNA 的房间中，将靶DNA加入到PCR混合物中。在MJ迷你热循环仪(M J Research) 上进行扩增，其中使用200μl带有单独盖子的薄壁试管(Axygen)。加入到PCR 管中的第一种溶液含有2.0μl 10x PCR缓冲液(100mM tris pH 8.3，500mM KCl，15mM MgCl2)、2.0μl dNTP混合物(各2.0mM dATP，dGTP，dTTP和 dCTP)、1.0μl引物SEQ ID NO.5＝ 5′TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG3′(5皮摩尔/μl)、1.0μl引物 SEQID NO.6＝5′GGAATTCCACTACGCACGGACTCTC 3′(5皮摩尔/μl) 和含1单位酶的0.2μl Taq聚合酶以及11.8μl水。将PCR管带入样品制备室 并向其中加入2.0μl DNA。轻弹试管混匀，进行渐降式PCR(Touch down PCR)(图7)。该程序有一个最初的95℃3分钟的变性过程。最初变性步骤后 有14个渐降循环，包括一次在94℃变性45秒，一次始于70℃的45秒的退 火，其在每个渐降循环中降低0.8℃，以及一次在72℃延伸1分钟。然后是 25个常规循环，其包括一次在94℃变性45秒，一次在58℃退火45秒，以 及一次在72℃延伸1分钟。完成PCR时，将试管放入另一室中进行扩增的 PCR产物的分析。在2.0％琼脂糖胶上上样10μl反应物，另外保存10μl反 应物在需要时进行PCR-RFLP分析。
总共使用142个临床样品来评估该基于PCR的用于检测临床样品中病原 分枝杆菌的试验。其中141个为痰样品，1个为脑脊髓液。
其中，用抗酸涂片法，74个样品呈阳性，而用PCR也有68个呈阳性。它 们中的4个用涂片呈阳性，而用PCR呈阴性。所有这些患者的涂片结果缺少 抗酸显微镜检报告。除了这些患者的重复样品用PCR都呈阳性之外。来自相 同患者的2个样品用涂片呈阳性，而用PCR呈阴性。在考察来自这些样品的 含DNA的反应物和纯化的DNA后，发现这些样品含有PCR抑制剂。用改 进的裂解缓冲液再次处理这些样品，用异丙醇沉淀浓缩。31个患者用抗酸显 微镜检呈阴性，而用PCR呈阳性。所有这些患者的临床病史显示，他们用涂 片法都呈分枝杆菌阳性并接受治疗，涂片呈阴性是由于在这些样品中细菌量 低造成的。余下的37个样品用涂片和PCR法均呈阴性。检查他们的临床报 告，发现他们的其他临床参数也呈阴性并由于类似发烧和咳嗽的初步症状而 住院。
因此，本发明的主要具体实施方式涉及检测临床样品中病原分枝杆菌的方 法，所述方法包括以下步骤：
(a)通过常规方法净化临床样品，去除包括粘液的污染物，
(b)用改进的裂解缓冲液处理步骤(a)所得的经处理的临床样品以使活病 原分枝杆菌失活，从而使过程对使用者安全，
(c)利用改进的方法，从步骤(b)所得的经处理的临床样品中提取基因组 DNA，从而提高DNA的产量和质量，
(d)从步骤(c)所得的DNA来设计用于检测病原分枝杆菌的序列SEQ ID No.4，所述设计的序列包括步骤(c)所得DNA所选出的SEQ ID No.3的基因 间区域、含SEQ ID No.1的mmaA1基因部分的侧翼区域和SEQ ID No.2的 mmaA2基因部分，
(e)设计并合成一套SEQ ID No.5的特异寡核苷酸引物，其为正向引物和 SEQID No.6，其为用于聚合酶链式反应(PCR)扩增SEQ ID No.4的反向引 物，
(f)开发用于特异性扩增(d)的SEQ ID No.4的PCR扩增过程，所述过程 包括使用步骤(e)中设计并合成的特异性寡核苷酸引物，用于检测临床样品中 病原分枝杆菌的存在，和
(g)通过限制酶片断长度多态性(RFLP)分析PCR扩增产物，用于区分病原 分枝杆菌菌种，用于快速评估HIV的共感染。
本发明另一个具体实施方式涉及SEQ ID No.4，其中所述SEQ ID.4具有 如下序列
5′GAGGTGTAATGCCTTTCCGGACCCTAGGTGGCCTTTCGGTGCTTGCAC
GGAACGCACCGATGCTTCCCCCTCCCCGCATGCTCGAGGCATGCTATCC
GATACAGGGCCGCCGCACTAAACCGCGATCGAATTTGCCCAGGTCAGG
GAACGGATATGAGCGGACGAG 3′
本发明另一个具体实施方式还涉及选自痰、胃洗出物、脑脊髓液、血液、 组织活体检测物、或骨髓穿刺液和其他体液或组织的临床样品。
本发明另一个具体实施方式还涉及通过消化净化混合物，来进行净化步骤 (a)中的样品，去除污染物(除了分枝杆菌和粘液之外的活生物)，接着通过离 心浓缩样品，其中消化净化混合物包含温和的碱、NaOH、柠檬酸三钠和粘液 溶解剂和在约0.4-2.5M范围内的异硫氰酸胍。
本发明另一个具体实施方式涉及消化净化混合物，其包含温和的碱、 NaOH、柠檬酸三钠和粘液溶解剂和在约0.5-2.0M范围内的异硫氰酸胍。
本发明另一个具体实施方式还涉及利用改进的裂解缓冲液从处理过的临 床样品中提取步骤(c)中的DNA，并通过有机溶剂完全沉淀来纯化DNA以提 高产量，其中裂解缓冲液的成分包含在约0.5-8M范围内的异硫氰酸胍、在 约20-100mM范围内的pH 7.6的Tris.Cl、在约0.5-2％范围内的N-月桂基肌 氨酸(N lauryl sarcosyl)、在约0.1-20mM范围内的EDTA、在约1-25mM范 围内的β-巯基乙醇和在约0.3M-1M范围内的NH4COOH。
本发明另一个具体实施方式涉及约为4M的异硫氰酸胍、约为50mM的 pH 7.6的Tris.Cl、约为1％内的N-月桂基肌氨酸(N lauryl sarcosyl)、约为1 mM的EDTA、约为10mM的β-巯基乙醇和约为0.7M的NH4COOH。
本发明另一个具体实施方式还涉及有机溶剂，其中有机溶剂选自包括苯酚 /氯仿混合物和氯仿的组。
本发明另一个具体实施方式涉及基因组DNA产量的增加范围约为25％至 50％的范围内。
本发明另一个具体实施方式还涉及基因组DNA产量的增加范围约为30％ 至40％的范围内。
本发明另一个具体实施方式还涉及改进的裂解缓冲液，其中改进的裂解缓 冲液提供更净化的DNA制品。
本发明另一个具体实施方式涉及处理方法，其中用含4M异硫氰酸胍的改 进的裂解缓冲液处理使活分枝杆菌失活，从而使过程对操作者更安全。
本发明另一个具体实施方式还涉及通过改进的渐降式PCR(Touch down PCR)循环条件来达到步骤(f)中的DNA高扩增量，其中所述条件包括在约 62-72℃范围内的高起始退火温度，接着在最先的10-25个循环中每个PCR循 环降低约0.2-1℃范围内的温度，渐降步骤达到约56-62℃的最优退火温度则 进行另外30个PCR循环。
本发明另一个具体实施方式涉及通过改进的渐降式PCR(Touch down PCR)循环条件来达到DNA高扩增量，其中所述条件包括的步骤为约70℃ 的高起始退火温度，接着在最先约14个循环中每个PCR循环降低约0.8℃的 温度，至约58℃进行另外25个PCR循环。
本发明另一个具体实施方式中涉及用于检测临床样品中病原分枝杆菌的 寡核苷酸引物，其能扩增SEQ ID No.4的基因间区域，其选自以下组
a.5′TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG 3′(SEQ ID No.5)，其是正 向引物。
a.5′GGAATTCCACTACCACGGACTCTC 3′(SEQ ID No.6)，其是反向引 物。
本发明另一个具体实施方式涉及寡核苷酸引物的长度，其中寡核苷酸引物 的长度在5至100个碱基间。
本发明另一个具体实施方式涉及用于检测临床样品中病原分枝杆菌的诊 断试剂盒，其包含选自由以下引物组成的组中的引物：
(a)5′TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG 3′(SEQ ID No.5)，其是 正向引物，和
(b)5′GGAATTCCACTACGCACGGACTCTC 3′(SEQ ID No.6)，其是反向 引物
本发明另一个具体实施方式还涉及具有seq.ID No.5和Seq.ID No.6的引 物用于检测病原分枝杆菌的应用，所述方法包括以下步骤：
a.利用改进的方法从处理过的临床样品中提取基因组DNA以提高DNA 的产量和质量，
b.设计来自步骤(a)所得DNA的用于特异检测病原分枝杆菌的序列SEQ ID No.4，所述设计的序列包括步骤(a)所得DNA所选出的SEQ ID No.3的基 因间区域、含SEQ ID No.1的mmaA1基因部分的侧翼区域和SEQ ID No.2的 mmaA2基因部分
c.开发用于特异性扩增步骤(b)的SEQID No.4的PCR扩增过程，和
d.通过限制酶片断长度多态性(RFLP)分析PCR扩增产物，用于区分病原 分枝杆菌菌种，用于快速评估HIV的共感染
本发明另一个具体实施方式还涉及SEQ ID No.4，其中SEQ ID No.4具有 如下序列：
5′GAGGTGTAATGCCTTTCCGGACCCTAGGTGGCCTTTCGGTGCTTGC
ACGGAACGCACCGATGCTTCCCCCTCCCCGCATGCTCGAGGCATGCTAT
CCGATACAGGGCCGCCGCACTAAACCGCGATCGAATTTGCCCAGGTCAG
GGAACGGATATGAGCGGACGAG 3′
本发明另一个具体实施方式涉及应用，其中临床样品选自痰、胃洗出物、 脑脊髓液、血液、组织活体检测物、或骨髓穿刺液和其他体液或组织。
本发明另一个具体实施方式涉及通过消化净化混合物，来进行净化步骤(a) 中的样品，去除污染物(除了分枝杆菌和粘液之外的活生物)，接着通过离心 浓缩样品，其中消化净化混合物包含温和的碱、NaOH、柠檬酸三钠和粘液溶 解剂和在约0.4-2.5M范围内的异硫氰酸胍。
本发明通过以下实施例来举例说明，其中以下实施例是作为举例说明本发 明的方式给出的，不应被理解为构成对本发明范围的限制：
实施例
实施例：1试剂
购自于Sigma Aldrich.美国的Trizma(Tris碱)、N-乙酰基-L-半胱氨酸 (NALC)、溴化乙锭、琼脂糖、K2HPO4、KH2PO4、柠檬酸钠、N-月桂基肌氨 酸(N lauryl sarcosyl)、EDTA、2-巯基乙醇。
得自New England Biolabs.美国的耐热聚合酶和dNTP。
得自Axygen美国和Corning-Costar美国的塑料制品。
实施例：2临床样品的收集和处理：
在印度新德里的Ramakrishna Mission Free Tuberculosis Clinic Karol Bagh 中，将得自患者的142份痰和1份脑脊髓液装入无菌样品管中。要么在可能 时立即处理样品，要么在处理前储存于4℃。
痰
通过NALC-NaOH法处理样品。将约1-3ml痰转移进15ml带盖的螺旋 离心管(Coming Costar Corp美国)中。对每个样品，加入1-3ml消化净化缓 冲液，轻轻混合并在室温放置15分钟。用3倍体积的0.67M pH 6.8磷酸缓冲 液稀释样品并在旋转转子(Remi cetrifuge印度)中以3500g离心15分钟。沉淀 重悬于300μl无菌蒸馏水中。需要时将处理过的样品的三分之一用于培养， 另三分之二用于PCR。指定用于PCR的那部分通过向试管加入0.5ml裂解缓 冲液并在85℃加热20分钟来进行失活和裂解。
脑脊髓液
脑脊髓液(CSF)通常被认为是无菌的，无需消化和净化。将1-2ml脑脊 髓液(CSF)转移进微离心管(MCT)中并在微离心器(Eppendorf，A.G德国)中 以12000g离心3分钟。用pH 7.0的0.067M磷酸缓冲液洗涤沉淀，并重悬于 300μl无菌蒸馏水中。全部都用于PCR。
实施例：3制备涂片
根据Zeihl-Neelsen染色过程，用碱性品红染料进行抗酸染色。将痰的粘液 部分的一小部分涂于1×2平方厘米的区域内。简单加热固定样品，用碱性品 红染料覆盖，在Bunsen炉上简单加热。用溶于95％乙醇中含3％硫酸的酸性 醇脱色。用蒸馏水洗片并用亚甲蓝(0.3％亚甲蓝氯)复染1-2分钟。水洗并 在空气中干燥。用双筒显微镜(Zeiss，德国)以400x在油镜下检查涂片。根据 各项WHO的指南来给涂片评分。
实施例：4利用改进的裂解缓冲液从处理过的临床样品中提取DNA
将一部分(200μl)被消化并净化的样品转移进微离心管中。向其中加入500 μl改进的裂解缓冲液，其含4M异硫氰酸胍、50mM Tris.Cl(pH 8.0)、1％N- 月桂基肌氨酸(N lauryl sarcosyl)、1mM EDTA、10mM 2-巯基乙醇和0.2M NaCl，翻转试管使之混匀。于85℃孵育试管20分钟并间歇震荡以裂解细胞。 向裂解液中加入200μl 2.5M pH 7.6的醋酸铵，翻转试管使之混匀。以12000g 离心混合物5分钟。用苯酚和氯访抽提上清液一次。用0.8倍体积的异丙醇 沉淀DNA。用70％乙醇完全洗涤沉淀，在空气中简单干燥并溶于30μl TE缓 冲液(10mM Tris.Cl pH 8.3和0.01mM EDTA pH 8.0)，将其中的2μl用于 PCR扩增。
实施例：5引物设计
用引物选择软件(DNASTAR，LASERGENE INC的软件)设计2个寡核苷 酸引物，其能扩增病原分枝杆菌的基本基因部分。甲基分枝菌酸合成酶是4 个基因(mmaA1-mmaA4)的簇。这些基因与分枝菌酸的合成和修饰有关，报 道其仅存在于病原分枝杆菌中。11bp的正向引物位于mmaA1和mmaA2基因 的基因间区域，而反向引物在甲基分枝菌酸合成酶1基因(mmaA1)中。这些 引物用本中心生物信息学组开发的软件GENOME CALCULATOR来检验对 于分枝杆菌的特异性。正向寡核苷酸引物、SEQ ID 5有27bp的长度。反向 引物SEQ ID NO.6有25个碱基对的长度。正向引物A从mmaA2基因中的 1-9位碱基开始，该11bp寡核苷酸引物位于mmaA2和mmaA1基因间的167 bp间隔区域。反向引物D、SEQ ID 2从图1和2的mmaA1基因中的688-705 位碱基开始。在含有Bam HI限制性内切酶位点的5′处，引物序列外伸出7 个碱基对。在含有EcoRI位点的5′末端处，寡核苷酸引物D也有7bp的外伸。 这些引物特异扩增出373个碱基对的部分，其被命名为病原分枝杆菌基本基 因的AD。
正向引物SEQ ID NO.5
5′TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG 3′
反向引物SEQ ID NO.6
5′GGAATTCCACTACGCACGGACTCTC 3′
实施例：6PCR扩增分离自临床样品的DNA的AD
以20ul反应体积进行PCR反应，其中包含2.0μl来自以上制品的 DNA、50mmKCl、10mM pH 8.3的Tris.Cl、1.5mM MgCl2、10皮摩尔每种 寡核苷酸引物和1单位耐热聚合酶。重复进行反应，其中含有2.0μl以上 DNA.的10倍稀释液。
几种不同的循环条件用以获得净化的PCR产物，避免非特异性扩增。一 开始，常规的循环条件包括在95℃最初变性3分钟一次。接着，在94℃变性 45秒一次，在60℃引物退火45秒一次和在72℃延伸1分钟一次，以此共进 行30各循环。然后在72℃最终延伸5分钟。
用纯化的DNA能良好地运作，而用分离自临床样品的DNA会带来非特 异性扩增。为了克服它，采用新的聚合酶链式反应方法。
渐降式PCR(Touch down PCR)
渐降式PCR(Touch down PCR)方法是有效消除非特异性扩增的方法， 因而可提高PCR反应的产量和效率。在渐降法中，寡核苷酸引物的退火略 高于确定的(解链温度)Tm，在每个循环中降低退火Tm，直至达到所希望 的退火温度。该措施不会在最初的循环中产生非特异性产物，以及能帮助提 高特异性扩增并提高PCR反应的效率许多倍。
渐降式PCR(Touch down PCR)的循环条件
在该程序中，在95℃最初变性3分钟一次，接着进行14个渐降式循环(在 94℃变性45秒一次，开始在70℃退火45秒一次，在每个循环降低0.8℃， 在72℃延伸1分钟一次)。渐降法后，进行25个循环(在94℃变性45秒一 次，在58℃退火45秒一次和在72℃延伸1分钟一次)。
实施例：7检测扩增的PCR产物
在琼脂糖凝胶上电泳分析扩增的PCR产物。PCR反应物同1.0μl 6x胶 上样缓冲液混合，并将全部反应液上样到1.8％琼脂糖凝胶上。制备凝胶并在 1x TAE缓冲液(0.04M Tris-醋酸和0.001M EDTA)中进行电泳。电泳后，在 含有0.5μg/ml溴化乙锭的染色液中对凝胶进行染色。利用鹰眼凝胶文档系统 (Stratagene)对凝胶照相并归档。
本发明的优点
如上所述，有几种基于PCR的检测临床样品中分枝杆菌的方法可供使用。 可是每种方法都有其自身的缺点，它们中没有一种是完善的。主要的缺点在 于从临床样品中分离DNA。送到实验室进行检测的临床样品包含几种杂质， 所述杂质通过所述的方法同DNA一起纯化而且会干扰以后的检测步骤。我们 的DNA分离方法取消了分离并提供了对于PCR来说纯净的DNA。本方法 的另一个优点是选出了寡核苷酸引物，其用于特异性扩增出特异于病原分枝 杆菌的靶DNA片段。设计一套引物，其中引物之一位于分枝杆菌基本基因间 的基因间区域，而另一个位于分枝杆菌的基本基因中。因而，该引物对对病 原分枝杆菌来说是非常特异的，并能从病原分枝杆菌中特异扩增出DNA片 段，而且不能像许多可用的引物所报道的那样从其它分枝杆菌中扩增。本方 法的另一个优点是它不使用昂贵的试剂，为了获得特异性扩增，在严谨的条 件下PCR扩增靶序列，这会增加测试的成本。该方法代替使用独特的循环条 件，从而达到靶DNA的特异性扩增。因此测试的成本降低了约10-20％。本 方法的另一个优点是因为扩增的DNA的独特结构使其成为理想的靶位，所述 独特结构包含基因间区域和其坐落于分枝杆菌基本基因中的侧翼序列，所述 靶位用于根据限制酶片断长度多态性(RFLP)来鉴定病原分枝杆菌的不同菌 株。本方法的另一个优点是该方法在测试的开始就整合了使临床样品中的病 原分枝杆菌失活的步骤，因而使过程对于使用者来说是安全的。
以下给出的是序列表信息SEQ ID No.1、2、3、4、5和6
序列表
整体信息
申请人：CSIR
发明名称：用于检测临床样品中的病原分枝杆菌的方法
序列数：6
通信地址：遗传和综合生物学研究所(以前的生物化学技术中心)，Mall Road， 德里-110007，印度，Tel 00-91-11-7666158 Fax.00-91-7667471
SEQ ID No.1的信息
1.序列特征：
1.长度：861bp.
2.类型：DNA
5′CTACTTGGTCATGGTGAACTGGGCGACGTTGATTAGGCCTCTGCGGAAGCGCTCCGCG
CATCCGGTCAGATAGTGCATGAAGTTGTTGTAGACCTCTTCGGACTGTACGGCGATGGC
GCGTTCGCGGGCAGCCTGTAGGTTGGCGGCCCATGCATCGAGAGTCCGTGCGTAGTGCT
GCTGCAGCAGCTGGACATGCTCGATGGTGAAGCCCGCGGCCTGCGCATTGTCGACAATG
TCGGGCTCCGATGGCAGCTCGCCGCCCGGGAAGATCGACTCCCGCAGGAATTTGAGGA
ATCGAAGGTCGCTCATCGTCAGCCGCAATGCCCTGTTCGTGCAGCCACCTGCGGTCGTAG
GTGAACAGGCTGTGCAGTAGCATCCGCCCGTCATCGGGCAGGATGTCGTAGGAGCGTTC
GAAGAACGTCAGATACCGCTCCTTTTTGAACGCGTCGAATGCCTCAAAGCTGACGATCC
GGTCGACGTTCTCTTCAAACTCTTCCCAGCCCTGCAGCCGGGCCTCGGCGCGCCGTTGCG
TTCCGATTGCGGCCAGGCGGTCTTTGCTGCGTTCATAGTGATTCCGGCTGAGCGTGAGG
CCGATGACATTGACGTCGTACTTCTCCACGGCCCGAACGAGCGCCCCGCCCCACCCGCA
ACCCACGTCGAGTAGCGTCATCCCCGGTTCGAGGTTCAGCTTGTCCAACGCCAGATCCA
CCTTGGCCAGTTGCGCCTCTTCCAGCGTCATATCGTCACGCTCGAAATAGGCGCAGGTG
TAGACCCAGGTGGGATCGAGGAACAACGCGAAGAAGTCATCCGAAATGTCGTAAGCCG
ACTGTGACTCTTCGTAATATGGTCTCAGCTTGGCCAT 3′
3.生物体：结核分支杆菌(M.tuberculosis)
4.来源：天然序列
5.名称/要素：mmaA 1
6.SEQ ID No.1
SEQ ID No.2的信息
1.序列特征：
1.长度：864bp.
2.类型：DNA
5’CTACTTCGCCAGCGTGAACTGGTTGACGTCGATGTAGCCGACCCGGAACAGCTTGGCG
CAGCCGGTCAGGTATTTCATGTACCGCTCGTAGACCTCTTCGGACTGGATCGCGATGGC
CTCGCTTTTGTGTTCCTGCAGCGCCTCGGCCCACAGGTCGAGGGTCCTGGCGTAATGCG
GCTGCAGCGACTGGCGGCGAGTCAGCGTGAAACCCGTCTTCGCCGACTGTTCCTCAACC
ATTTCAATCGTCGGAGGTTGGCCCCCCGGGAAGATTTCGGTCGCGATGAACTTGAGAAA
GCGGGCCAGCCACAACGTGAGCGGCAAGCCGTGGTCGACCATCTGCTGCCTGGTCAGG
CCGGTGATCGTGTGCAGCAGCAACACGCCATCGGGCGGCAGGATTTTGTGGGCCCGGGC
GAAGAAGTCGGCGTGACGATCGTGGCCGAAGTGCTCGAACGCGCCGATCGACACGATG
CGGTCGACGGGCTCGTTGAACTGCTCCCATCCCGCCAGCAACACTCGCCTGTCGCGCGG
GGTGTCCATCTCGTCGAACGACTTCTGCACATGGGCGGCCTGGTTCTTCGACAATGTCA
GGCCGACGACGTTGACGTCATACTGCGCGATCGCGCGCCGCATGGTGGCGCCCCAGCCG
CAACCGATATCGAGCAGCGTCATGCCGGGCTGCAGACCTAGCTTGCCCAGCGCCAGGTC
GATCTTGGCGATCTGGGCCTCTTCCAGCGTCATGTCCTCGCGTTCGAAATGCGCGCAGCT
GTAGGTCTGGGTCGGATCCAGGAACAGCCGGAAGAAGTCGTCGGACAGGTCGTAGTGT
GCCTGCACGTCCTCGAAGTGCGGCGTTAGGTCGTTGACCAT 3’
3.生物体：结核分支杆菌(M.tuberculosis)
4.来源：天然序列
5.名称/要素：mmaA 2
6.SEQ ID#2
SEQ ID No.3的信息
1.序列特征：
1.长度：166bp.
2.类型：DNA
5’GAGGTGTAATGCCTTTCCGGACCCTAGGTGGCCTTTCGGTGCTTGCACGGAACGCACC
GATGCTTCCCCCTCCCCGCATGCTCGAGGCATGCTATCCGATACAGGGCCGCCGCACTA
AACCGCGATCGAATTTGCCCAGGTCAGGGAACGGATATGAGCGGACGAG 3’
3.生物体：结核分支杆菌(M.tuberculosis)
4.来源：天然序列
5.名称/要素：mmaA 1和mmaA 2间的基因间区域
6.SEQ ID#3
SEQ ID No.4的信息
1.序列特征：
1.长度：363bp.
2.类型：DNA
5’TGGATCCGTTGACCATGAGGTTGTAATGCCTTTCCGGACCCTAGGTGGCCTTTCGGTGCTT
GCACGGAACGCACCGATGCTTCCCCCTCCCCGCATGCTCGAGGCATGCTATCCGATACA
GGGCCGCCGCACTAAACCGCGATCGAATTTGCCCAGGTCAGGGAACGGATATGAGCGG
ACGAGCTACTTGGTCATGGTGAACTGGGCGACGTTTGATTAGGCCTCTGCGGAAGCGCTC
CGCGCATCCGGTCAGATAGTGCATGAAGTTGTTGTTAGACCTCTTCGGACTGTACGGCGA
TGGCGCGTTCGCGGGCAGCCTGTAGGTTGGCGGCCCATGCATCGAGAGTCCGTGCGTAGT
GGGAATTC3’
3.生物体：结核分支杆菌(M.tuberculosis)
4.来源：天然序列和人工序列
5.名称/要素：正向引物(SEQ.ID 5和反向引物(SEQ.ID 6)间的区域
SEQ ID#4
SEQ ID No.5的信息
1.序列特征：
1.长度：27bp.
2.类型：DNA
5’TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG3’
3.生物体：人工序列
4.来源：人工合成的寡核苷酸
5.名称/要素：正向引物
6.SEQ ID#5
SEQ ID No.6的信息
1.序列特征：
1.长度：25bp.
2.类型：DNA
5’GGAATTCCACTACGCACGGACTCTC3’
3.生物体：人工序列
4.来源：人工合成的寡核苷酸
5.名称/要素：反向引物
6.SEQ ID#6
参考文献：
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Zambardi等，Annales de Biologie Clinique 50：893-897，1993.
权利要求书
(按照条约第19条的修改)
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于检测临床样品中病原 分枝杆菌的寡核苷酸引物，其能扩增SEQ ID No.4的基因间区域，其选自以 下组：
a.5′TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG 3′(SEQ ID No.5)，其是正 向引物。
b.5′GGAATTCCACTACGACGGACTCTC 3′(SEQ ID No.6)，其是反向引 物。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，寡核苷酸引物的长度在5 至100个碱基间。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，改进的裂解缓冲液提供更 净化的DNA制品。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用含4M异硫氰酸胍的改 进的裂解缓冲液处理使活分枝杆菌失活，从而使过程对操作者更安全。
17.用于检测临床样品中病原分枝杆菌的诊断试剂盒，其包含选自由以 下引物组成的组中的引物：
a.5′TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG 3′(SEQ ID No.5)，其是 正向引物，和
b.5′GGAATTCCACTACGCACGGACTCTC 3′(SEQ ID No.6)，其是反 向引物。
18.具有seq.ID No.5和Seq.ID No.6的引物用于检测病原分枝杆菌的应 用，所述方法包括以下步骤：
a.利用改进的方法从处理过的临床样品中提取基因组DNA以提高DNA 的产量和质量，
b.设计来自步骤(a)所得DNA的用于特异检测病原分枝杆菌的序列SEQ ID No.4，所述设计的序列包括步骤(a)所得DNA所选出的SEQ ID No.3的基 因间区域、含SEQ ID No.1的mmaA1基因部分的侧翼区域和SEQ ID No.2的 mmaA2基因部分，
c.开发用于特异性扩增步骤(b)的SEQ ID No.4的PCR扩增过程，和
d.通过限制酶片断长度多态性(RFLP)分析PCR扩增产物，用于区分病原
已知有超过70种的分枝杆菌，其中大多数对人是不致病的。结核分支杆 菌(M.tuberculosis)的感染造成了肺结核，其中某些病例是牛分支杆菌(M. bovis)引起的。这些生物在遗传上非常接近，它们被称为结核分支杆菌(M. tuberculosis)复合(MTC)生物。另有超过一打的病原分枝杆菌，其造成肺部或 身体其他部分的肺结核样感染。这些生物被称为不同于结核杆菌的分枝杆菌 (MOTT)或非结核分枝杆菌(NTM)。随着AIDS的流行，这些所谓非结核分 枝杆菌变得重要起来，并从大量共感染HIV的肺结核患者中被分离出来。
在其他方面健康的个体中，早期肺结核通常无法被识别。缺乏简单、快 速和可靠、能特异检测在临床样品中的结核分支杆菌(M.tuberculosis)和其 他病原体的测试，这对患者个体的管理以及进行合适的传染控制和公共卫生 措施都带来了巨大的难题。
经典的诊断方法包括在显微镜下检查针对抗酸分枝杆菌的痰涂片和检查 肺部x光片。可是，在大量的病例中，在疾病的早期阶段，痰涂片检查呈分 枝杆菌阴性，而直至感染后几个月，x光片上的肺部变化才会明显。尽管为 抗酸细菌(AFB)涂片染色只需要不超过2小时，但其缺少灵敏度并在一些病 例中无特异性(Ebersole，L.L.1992)。另外AFB染色的阳性结果不能区分分枝 杆菌的菌种。
当前绝对可靠的诊断方法仅仅是基于培养来源于临床样品的结核分支杆 菌(M.tuberculosis)并进行形态学和生物化学鉴定。结核分支杆菌(M. tuberculosis)和其他相关生物的培养是灵敏而且特异的，但其麻烦，并需要 在固体培养基上培养6-12周并在液体培养基上进行3至6周，期间患者会病 情恶化并感染其他个体。所以，能可靠检测结核分支杆菌(M.tuberculosis) 存在的快速测试对于患者的早期检测、治疗和管理来说是至关重要的。
近来已开发出几种分子测试来快速检测和鉴定结核分支杆菌(M. tuberculosis)。Abe等和Miller等评估了商品化的测试，即Gen-Probe的“扩 增的结核分支杆菌(M.tuberculosis)直接测试”。该测试从呼吸样本中扩增结 核分支杆菌(M.tuberculosis)的16S核糖体RNA并利用化学荧光探针来检 测扩增的产物，其报道的灵敏度约为91％。其他基于连接酶链式反应(LCR) (Abbott Laboratories)、聚合酶链式反应(PCR)(Roche Diagnostics Systems， Eastman Kodak Co.，Johnson&Johnson)、Q-beta复制酶(GeneTrak)和链置换扩 增(Becton Dickinson)的商品化的测试在Forbes的综述中被论述。
其他通过非培养法基于免疫学检测结核分支杆菌(M.tuberculosis)感染 的方法有胶凝集、放射免疫测试和酶联免疫吸附测试等。这些方法的主要缺 点是其缺少灵敏性和或特异性(Kandival，G.V.等，1986；1984；Yenez，M.A.等， 1986)。血清学技术可用于一些临床设施，但该方法通常由于低灵敏性和或特 异性而受到限制(Daniel，T.M.和S.M.Debanne.1987)。
聚合酶链式反应(PCR)(Saiki等)的开发，能够从少量的核酸样品中扩增 和检测DNA，这能够检测临床样品中的结核分支杆菌(M.tuberculosis)特异 性核酸。一些较早的报道是基于检测16S核糖体RNA或其基因。首先通过利 用所有细菌的保守引物来扩增DNA部分，接着利用种特异性探针来检测不同 的分枝杆菌菌种，由此检测结核分支杆菌(M.tuberculosis)和相关生物。该 方法的主要缺点是它是繁琐的，需要超过24小时来完成。用于在扩增产物中 检测不同物种序列的种特异性探针仅变化很少的碱基，接着通过基于杂交的 试验来分析该扩增的DNA，如果在不够理想的条件下进行，它会造成假阳性 测试。
IS6110插入元件的发现(Cave等，Thierry等)和相信该元件仅存在于结核 分支杆菌(M.tuberculosis)复合物(结核分支杆菌M.tuberculosis、牛分支杆 菌M.bovis、非洲分支杆菌M.africanum和田鼠分支杆菌M.microti)中，孕育 了一整套快速诊断策略(Brisson-Noel等，Clarridge等，Forbes等，Hermans等， Kolk等，Kox等，Zambardi等)。这些测试利用各种技术从痰中提取离DNA。 PCR被用来从提取的DNA中扩增IS6110 DNA序列。成功扩增该DNA被认 为是结核分支杆菌感染(M.tuberculosis)存在的指标。颁发给Crawford等的 美国专利第5,168,039和5,370,998号是基于IS6110检测肺结核的。另一个 美国专利第5,731,150号被授予CIBA CORNING DIAGNOSTICS CORP (Gurpreet.S等)。颁发给Guesdon.J.L的欧洲专利EP 0,461,045是基于IS6110 检测肺结核的。有报道，在结核分支杆菌(M.tuberculosis)、牛分支杆菌(M. bovis)、牛分支杆菌(M.bovis)-BCG、非洲分支杆菌(M.africanum)和田 鼠分支杆菌(M.microti)中分别存在10、2、1、5和5个拷贝的IS6110元件 (Spargo等)。大多数的报道称，利用IS6110和其它基于PCR的肺结核检测 法声称具有超过75％的灵敏度和接近100％的特异性。
有关将该序列用作靶位根据PCR来诊断结核分支杆菌(M.tuberculosis) 的细致研究揭示出了几个缺点。Noordhoek等报道，7个主要实验室间的盲 比较研究浮现了一个主要关注点，其报道的假阳性率为3至77％，而灵敏度 的范围为2至90％。该研究是重要的，这是因为它使所有参与的实验室应用 他们自己的检测策略来鉴定IS6110，而且最终结果清楚显示现有的实验方案 在灵敏性和特异性方面都有严重的缺陷。
Lee等(1994)的另一个研究报道，分析从结核性脑膜炎患者中得到的脑脊 髓液样品时有62％的假阳性。尽管来源于相同实验室中的前处理样品的扩增 的IS6110 DNA的样品污染物可以解释一些假阳性，而这不是主要的误差来 源，因为大多数实验室具备极好的样品保存程序来避免污染。该大量假阳性 是因为IS6110样序列存在于结核分支杆菌(M.tuberculosis)之外的生物中。 IS6110是一个转座插入元件(Calos和Miller)，这些DNA片断具有“可移动 的”性质。IS6110也可能源自(或传递到过)其他生物，而且在进化期间， 这些生物间的DNA的某区域保持了保守性。Mariani等公开的报道论述了与 结核分支杆菌(M.tuberculosis)IS6110元件相关的序列在生物间的水平转移。 这可解释文献中报道的一些假阳性测试。另外，Kent等能扩增与来自除结核 分支杆菌(M.tuberculosis)之外的分枝杆菌的IS6110相关的序列，这确认了 这个怀疑即IS6110样序列存在于其他生物中，它们可在使用IS6110特异性引 物所进行的PCR中被检测到，所述特异性引物被设计为用于检测结核分支杆 菌(M.tuberculosis)。为了说明该问题，对存于GenBank中的核酸序列进行 系统分析，发现在除结核分支杆菌(M.tuberculosis)之外的生物中有与IS6110 相似的序列片段。在临床样品中可发现许多这样的生物。
使IS6110不适于作为检测肺结核的靶位的另一个事实是，一些近来的报 道显示一些结核分支杆菌(M.tuberculosis)分离株在其基因组中完全缺少 IS6110序列，因此造成假阴性结果。对亚洲分离株的研究报道了该序列可在 至少一些分离株中缺失(Yuen，L.K，等1993)。
检测、区别和治疗肺结核的另一个非常重要的方面是人免疫缺陷病毒 (HIV)的出现。肺结核的流行病学和病因学自从HIV(获得性免疫缺陷综合症 (AIDS)的病原体)的增加而发生了巨大的改变。自从出现AIDS(Bafica，A. 等)，肺结核的影响相当程度地增加了。在AIDS死亡中，超过30％归咎于肺 结核。自1991年，感染有HIV的肺结核患者数从3％增加到超过10％。仅在 AIDS患者中，结核分支杆菌(M.tuberculosis)和牛分支杆菌(M.bovis)不 只是肺结核的病原体。所谓非结核分枝杆菌在免疫力弱的肺结核患者中成为 重要的病原。不同实验室从源于共感染HIV的患者的临床样品中分离了其他 病原分枝杆菌，称作非结核分枝杆菌。它们中最重要的是鸟分支杆菌(M. avium)和密切相关的分枝杆菌组群，即胞内分支杆菌(M.intracellulare)和 龟分支杆菌(M.chelonae)。这些生物被称作鸟胞内分支杆菌复合(MAI复合) 生物。MAI复合生物带来无法与肺结核区别开的症状。它们对肺是有影响的， 并且在大量患者(尤其是人免疫缺陷病毒(HIV)感染的那些)中弥散形式的疾 病。从多至30％的肺结核患者临床样品中分离得到鸟分支杆菌(M.avium)， 并在弥散性肺结核患者中有甚至更高的数量。堪萨斯分支杆菌(M.kansassi) 和瘰疬分支杆菌(M.scrofulaceum)是其他的非结核分枝杆菌，其分离自相当 大量患有肺结核的AIDS患者。其他非结核分枝杆菌也正从源于AIDS患者 的临床样品中被分离到。较少分离到非结核分枝杆菌的原因可能是无法利用 简单、准确和可靠的测试来分离并分辨不同类型的非结核分枝杆菌。这些发 现提示，非结核分枝杆菌随着AIDS的出现而成为重要的病原体。
结合IS6110对于结核分支杆菌(M.tuberculosis)并非是特异性的以及会 在许多分离株中不存在的信息，和尤其在共感染有HIV的患者中其他非结核 分枝杆菌是肺结核病原体的事实。公开报道清楚表明，没有现存的基于IS6110 和其他靶序列的技术能提供临床诊断测试中所需的置信度水平。
这强调了需要改变检测肺结核的方式。这要求评估新的能检测临床样品 中所有病原分枝杆菌的靶位来而不是仅检测结核分支杆菌(M.tuberculosis) 复合生物。理想地，应有一种代替仅检测结核分支杆菌(M.tuberculosis)复 合细菌的诊断方法，能够检测临床样品中所有病原分枝杆菌，包括非结核分 枝杆菌。在临床样品中检测不同的病原分枝杆菌后，通过在该化验中所述的 PCR-RPLF法将不同类型的病原分枝杆菌区分成不同种的分枝杆菌。那些仅 感染有NTM或同时感染有NTM和结核分支杆菌(M.tuberculosis)复合生物 的患者为可能的HIV共感染提供快速的参考，因此可以有良好的参数来了解 群体中的HIV感染和传播。没有许多这类测试可用于检测临床样品中的病原 分枝杆菌并区分它们。
Abe等和Miller等评估了结核分支杆菌(M.tuberculosis)直接测试”。它 测试了来自呼吸样品的结核分支杆菌(M.tuberculosis)16S核糖体RNA并 用化学荧光探针来检测扩增的产物，其中报道的灵敏度约为91％。该测试是 复杂的，需要24小时来完成并使用探针来鉴定仅改变少数碱基的不同分枝杆 菌，如果在略微不严谨的条件下进行，其会产生假阳性结果。
基于PCR试验的成功依赖于几种因素。其中最重要的是提取高质量的用 于PCR的核酸，设计病原体特异性PCR引物和能从分离的DNA中特异扩增 靶序列的PCR条件。
当前基于PCR用于检测分枝杆菌的试验的主要弱点是缺少简单、有效并 能确保使用者安全的核酸提取方法。裂解分枝杆菌并从临床样品中纯化核酸 而不同时纯化已知存在于大多数临床样品中的杂质，这在基于PCR的试验中 是关键的步骤。公开的实验方案的主要缺点是大多数用于分离核酸的方法不 能容易地用于所有类型的样品。任何需要冗长和低效率的DNA纯化的核酸提 取，会降低测试的速度和灵敏度。另外，必须对不同类型的样品进行不同的 提取过程，也会使整个过程昂贵和缓慢。当处理包含活结核分支杆菌(M. tuberculosis)时，操作者的安全性也是一个主要的关注点。在如较早所述的 仔细分析不同DNA提取物的过程后，会发现它们要么是极不高效的，要么不 能去除通常存在于大多数临床样品中的杂质(Boom，R.C)。因此，需要简单、 有效并耐用的各种临床样品的核酸提取方法来确保基于PCR的试验的灵敏 度和重复性。
靶序列的特异和非特异扩增是的成功基于PCR试验的另一个关键因素。 在最不优化的条件下，即使特异而单一的引物也能导致非特异性扩增出同样 大小的条带，因此会导致假阳性结果(Gurpreet，S等)。这必须以实际和成本有 效的方式来得到解决。
发明目的
本发明的主要目的是提供检测临床样品中病原分枝杆菌的方法。
本发明的另一个目的涉及在各种临床样品中如痰、脑脊髓液、胃洗出物、 血液、骨髓穿刺液和组织活体检测物等中，通过扩增部分基因簇来检测DNA 片段以确定因分枝杆菌所引起感染的设计和组成。
本发明的另一个目的还涉及开发从所有类型的临床样品中提取DNA的 有效方法。
本发明的另一个目的还在于设计一套能在聚合酶链式反应中特异扩增部 分基因的寡核苷酸引物。
本发明的另一个目的还在于一种能特异扩增靶位的聚合酶链式反应方 法。
本发明的另一个目的还在于提供区分各种分枝杆菌的方法。
发明概述
本发明涉及在临床样品中检测病原分枝杆菌，如在痰、脑脊髓液、胃洗 出物和组织活体检测物等中。本发明的新颖性在于新的DNA片段，其位于甲 基分枝菌酸合成酶基因mmaA1和mmaA2间的基因间区域以及mmaA1和 mmaA2基因中的侧翼区域中。该测试使用能特异扩增来自临床样品的靶DNA 的寡核苷酸引物对。本发明描述了从临床样品中提取DNA的方法，其比现有 技术更安全并能从临床样品中获得更多的DNA。本发明也描述了一种扩增方 法，其产生对靶扩增子的特异扩增而不使用昂贵的试剂，因而使测试经济。 本发明阐述了通过限制酶片断长度多态性(RFLP)分析扩增的PCR产物来区分 在临床样品中不同种病原分枝杆菌的方法。
附图说明
图1分枝杆菌的甲基分枝菌酸合成酶mmaA 4-mmaA 1基因簇以及正向 A和反向D引物位置的示意图。
图2带有166个碱基对的基因间区域(用小写字母显示)的mmaA2和 mmaA1基因序列。正向A、SEQ ID 1和反向引物D、SEQ ID 2的位置。引 物序列都用下划线和斜体表示。
图3用引物A和D(电泳道1-15)进行不同分枝杆菌基因组DNA的PCR 扩增：1.鸟分支杆菌(M.avium)2.牛分支杆菌(M.bovis)3.龟分支杆 菌(M.chelonae)4.偶发分支杆菌(M.fortuitum)5.胞内分支杆菌(M. intracellulare)6.堪萨斯分支杆菌(M.kansassi)7.草分支杆菌(M.phlei) 8.100bp DNA分子量标记9.海分支杆菌(M.rnarinmn)10.瘰疬分支杆 菌(M.scrofulaceum)11.耻垢分支杆菌(M.smegmatis)12.M.szulgai 13. 结核分支杆菌(M.tuberculosis)和14.阴性对照。AD显示有363bp的扩增 产物。
图4显示AD内HaeI和Mspl的限制性内切酶图谱的线性图。
图5显示AD内FmuI、CviRI和Taq I的限制性内切酶图谱的线性图。
图6显示限制性内切酶AcaIV和HaeIII位点分布的限制性酶图谱。
图7显示PCR反应不同步骤的线性图。
发明详述
本工作的目的是开发一种全面的技术，能快速、安全并特异地检测致肺 结核的分枝杆菌。任何基于PCR诊断中的有限步骤为从临床样品中提取 DNA，设计能特异扩增靶序列的PCR引物和开发只允许特异性扩增靶序列 的PCR条件。可利用的测试的严重限制在于它们能检测但不能区别各种分枝 杆菌。
各种可用的实验方案描述了不同的核酸提取方法和混合试剂用以裂解分 枝杆菌并从临床样品中纯化核酸。在各种方法中，通过用碱、有机溶剂、变 性剂(chaotropic agent)、去污剂或它们混合物来处理样品，以此来进行裂解。 几种较简单的方法声称可通过在碱、PCR缓冲液或甚至在纯水中简单煮沸来 达到裂解。尽管这些方法简单并通常在纯培养物上运作良好，但它们不那么 适用于临床样品。PCR反应是耐用的而且通过粗裂解法释放出的核酸能直接 用于PCR反应，但这种普遍流行的观念并不正确。这些方法使用简单但经常 不能杀死存在于临床样品中的所有分枝杆菌，因此对使用者来说是危险的。 这类制剂被报道含有许多能轻易抑制PCR反应的杂质。已经观察到了，这类 制剂甚至在稀释几倍的DNA上也不能产生扩增结果。事实是，提取纯净的 DNA对于基于PCR的试验成功来说是最重要的。
本发明人仔细优化了核酸纯化中的所有步骤并开发出一种简单、耐用并 确保操作者完全安全的方法。进一步通过温和的碱和粘液溶解剂来处理像痰 的较脏样品，以此帮助去除许多污染剂并得到较纯净的核酸制剂。该步骤也 帮助去除其它存在于像痰和胃洗出物等的较脏的样品中的污染生物。由于痰 是针对肺结核的最常规收集和提交的临床样品，已知其包含几种污染物，所 述污染物是有效的PCR反应抑制剂。本发明开发的改进的裂解缓冲液使用强 变性剂(chaotropic agent)，即异硫氰酸胍。这帮助使所有存在于临床样品中 的分枝杆菌失活，裂解坚硬的分枝杆菌细胞并变性和去除蛋白质，从而形成 较纯净的DNA制剂(表1)，并能确保操作者的安全。通过加热改进的裂解缓 冲液中的标本，即使最坚硬的细胞和像孢子和多面体杆状病毒的物体都能轻 易地被裂解。相同组较早的报道披露了使用异硫氰酸胍来裂解并从像多面体 杆状病毒和分枝杆菌的坚硬材料中纯化核(Das等)和(Bose.M等)。
表1系列号1至3为通过本文所述而制备的样品，而系列号4至6为通 过Gurpreet等的方法而制备的样品。 系列号 稀释因子 260nm处 的OD 280nm处 的OD 260/280 比率 浓度 纯度 1 50 0.011 0.019 1.82 27.60μg/ml 无蛋白质污染 2 50 0.010 0.017 1.85 25.00μg/ml 无蛋白质污染 3 50 0.013 0.024 1.88 33.03μg/ml 无蛋白质污染 4 50 0.006 0.011 1.62 17.13μg/ml 蛋白质污染 5 50 0.009 0.015 1.66 23.46μg/ml 蛋白质污染 6 50 0.008 0.013 1.63 20.37μg/ml 蛋白质污染
使用该试剂的另一个好处是大多数蛋白质在该缓冲液中变性，造成完全 裂解存在于样品中的分枝杆菌。其他方法也描述了使用该试剂(Gurpreet，S 等)。本方法有几点不同于它们。本方法中改进的裂解缓冲液含有组合物，其 能达到更完全的裂解，更好地去除蛋白质并甚至帮助微量的DNA沉淀。这形 成了更纯净的DNA制剂并提高产量。本发明的裂解缓冲液代替使用异硫氰酸 胍-tris-苯酚来裂解，其包含去污剂N-月桂基肌氨酸(N lauryl sarcosyl)、200 mM NaCl和10mM 2′-巯基乙醇以及4M异硫氰酸胍。苯酚有很大的爆炸性， 因而是危险的，其不包括在改进的裂解缓冲液中。这些改进使本发明的改进 的裂解缓冲液完备并更有效。去污剂帮助溶解细胞壁的脂质和蛋白质，因而 造成完全裂解分枝杆菌细胞壁，该细胞壁富含不同类型的复合脂质。NaCl的 应用帮助沉淀微量存在的核酸，因而带来比Gurpreet等所述的方法多约 1.4-1.5倍的DNA产量。当处理每毫升样品中含有较少分枝杆菌的临床样品 时，这尤其关键。通过在改进的裂解缓冲液中以85℃加热消化并净化样品20 分钟，来使分枝杆菌细胞失活和裂解。与所述的几种方法中相比，这是安全 的，无需煮沸以及可能造成的盖子爆开或一些试管的爆裂。裂解液用碱性的 苯酚液抽提一次。已经注意到，如许多实验方案所声称的，无需用碱性的苯 酚液抽提以去除蛋白质。该简单步骤导致可去除所有蛋白质，包括与DNA紧 紧结合的蛋白质，因此可形成较纯净的核酸制剂。尤其在处理像痰和胃洗出 物的较脏的样品时，这提高了试验的可重复性。用等体积异丙醇从水相中沉 淀出核酸。
下一步，设计了一套病原分枝杆菌特异性的寡核苷酸引物。注意要确保 该序列在其他病原生物或人中并不存在，这是由于临床样品中不能排除掉这 类生物和人细胞的存在。为了该目的，利用分枝杆菌的mmaA1-mmaA4基因 簇(图1)，其登录号(accession number)为MTCY20H10.23c-MTCY20H10.26c。 该基因簇包含4个基因，它们由3个不同长度的间隔区域分隔(图1)。这些 甲基分枝菌酸合成酶基因负责合成以及修饰存在于病原分枝杆菌中的复杂的 末端分枝菌酸。这些分枝菌酸与分枝杆菌的病原性有关联。正向引物A、SEQ ID NO.3从mmaA2基因中的1-9位碱基起始，该11bp的寡核苷酸引物位于 基因mmaA2和mmaA1之间的167bp间隔区域中。反向引物D、SEQ ID NO. 4位于图1和图2所示的mmaA1基因中的688-705位碱基上。用Primer Select 软件(Lasergene，DNASTAR)来设计这些引物序列，使它们不同于除结核分支 杆菌(M.tuberculosis)和牛分支杆菌(M.bovis)之外的生物。
也用另一个方式来确保该引物序列特异于病原分枝杆菌。利用本研究所 (遗传和整体生物学研究所)开发的Genome Calculator软件，将寡核苷酸序 列转化成氨基酸(肽)，并同许多病原生物和人的基因互补序列相比较。该软 件将DNA序列转化成氨基酸(肽)，并通过将它们转化成短肽文库来将其与 数据库中可用的所有序列相比较。该软件发现了特异于结核分支杆菌(M. tuberculosis)和牛分支杆菌(M.bovis)的引物序列，而且其在其他24种病 原生物或人中并不存在，所述生物或人的基因组序列在数据库中可供利用。 用这些引物对待测的所有病原分支杆菌基因组DNA进行PCR，得到扩增结 果，同时用非病原分支杆菌基因组DNA进行PCR，并不能得到图3和表2 所示的扩增结果。
表2：PCR扩增来自不同病原和非病原分枝杆菌菌种的AD 分枝杆菌菌种 菌株 病原/非病原 PCR结果 鸟分支杆菌(M.avium) ATCC 病原性 阳性 牛分支杆菌(M.bovis) ATCC 病原性 阳性 龟分支杆菌(M.chelonae) ATCC 病原性 阳性 偶发分支杆菌(M.fortuitum) ATCC 病原性 阳性 胞内分支杆菌(M.intracellulare) ATCC 病原性 阳性 堪萨斯分支杆菌(M.kansassi) ATCC 病原性 阳性 海分支杆菌(M.marinum) ATCC 病原性 阳性 草分支杆菌(M.phlei) ATCC 非病原性 阴性 耻垢分支杆菌(M.smegmatis) ATCC 非病原性 阴性 瘰疬分支杆菌(M.scrofulaceum) ATCC 病原性 阳性 M.szulgai ATCC 病原性 阳性 结核分支杆菌(M.tuberculosis) ATCC 病原性 阳性 蟾分支杆菌(M.xenopi) ATCC 病原性 阳性
设计特异引物之后，下一个关键步骤是设计和开发PCR条件，其仅仅会 特异扩增所希望的靶位。由于在次最优条件下的PCR可造成非特异性扩增 出大小会与所希望的靶位类似的DNA片段，因而这个步骤是关键的(Gurpreet 等)。这会进而造成所希望的靶序列更少扩增，因而降低特异性和灵敏度。不 像Gurpreet等在他们的发明中所用的引物，我们的引物即使在次最优条件下 也不会造成从非病原分枝杆菌中扩增出相似大小的条带(图3)。
任何非特异性扩增是由于在PCR的退火步骤中的寡核苷酸引物非特异退 火而造成的。避免非特异性扩增的最常用策略是进行热启动PCR。通过在反 应物热的时候加入关键反应成分来实现这个策略。为了该目的，使用蜡珠包 裹的酶或者近来可利用新的耐热聚合酶(Thermopolymerase Gold，Perkin Elmer)。该酶能结合抗该酶的单克隆抗体，并仅仅在95℃孵育10-15分钟才 会变得有活性。可是应用这些措施会使测试贵10-20％。
进一步修改循环条件来防止引物在所希望位点之外的位点退火。如果最初 几次的PCR循环在比计算的寡核苷酸引物解链温度更高的退火温度进行，并 在随后在每次循环中逐渐降低退火温度，并在最优退火温度进行余下的25个 循环，就可达到该目的。一旦在最初的循环中得到了特异性扩增子，那么在 以后的循环中，它们不会使非特异产物与它们竞争。这种类型的循环条件被 称作渐降式PCR(Touch down PCR)，其有助于特异性扩增而无需昂贵的试 剂。该措施有助于使测试更具成本效益并更容易使用。
在试验中，下一步检是测扩增的PCR产物。扩增的PCR产物可通过几 种不同的方式来检测。在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上电泳是检测扩增的PCR 产物最常见和最普通的方式。应用琼脂糖胶较聚丙烯酰胺凝胶电泳或繁琐的 DNA ELISA(其需要更长时间来进行检测并需要更多的专门技能)更简单。 由于聚丙烯酰胺妨碍用于检测的溴化乙锭染料，因此聚丙烯酰胺凝胶比琼脂 糖胶更不灵敏。除此之外，丙烯酰胺是强力的神经毒素，因而对使用者有潜 在危险。水平琼脂糖胶电泳方法用于确定PCR产物。用UV短波瞬变显示器 来检测扩增的产物。
近来，用生物素或荧光染料标记PCR产物和或接着用ELISA检测产物已 经被论述过了。该方法可以轻易地和任何(包括我们的)基于PCR的试验一 起使用。
利用限制酶片断长度多态性(RFLP)分析PCR扩增片断，该基于PCR的检 测方法不但可用于检测临床样品中的不同类型的病原分枝杆菌，而且可用于 将它们区分成各种菌种。RFLP对于不同物种的种和株来说都是非常强大的工 具。它基于每种DNA具有一个或多个限制性内切酶位点的事实。这些位点可 被来源于不同细菌的II类限制性内切酶精确识别。在生物的自然进化过程中， 这些位点中的一个或多个被修饰或缺失。因而，对DNA片段用相同酶进行限 制性酶切导致不同种生物间片断长度的多态性，因此可用作辨别和流行病学 的的有效工具。由于该片段具有两个基因的167bp的基因间区域部分，因此 对于PCR-RFLP分析不同种分枝杆菌来说，AD是合适的候选物。该DNA片 段具有两个由几个碱基分隔的多限制性内切酶位点，其将产生的片断的大小 范围适于通过表3的聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析(图4、5和6)。这些位点位 于基因间以及在基因mmaA1中(图4、图5和图6)。对于不同种的RFLP图 谱来说，限制性产物能在10-12％聚丙烯酰胺凝胶上轻易分开。167的基因间 区域的存在，加上排布得好的一些常用限制性内切酶位点，使得AD是通过 PCR-RFLP分析来区分不同种病原分枝杆菌的合适候选物。
表3：DNA片段的多限制性内切酶位点 酶 位点数 位置 限制性片断 数 片断大小 HaeI 2 47bp 和 219bp 3 47bp，144bp 和172bp MspI 2 33bp 和 244bp 3 33bp，119bp 和211bp BsmNI 3 74bp，239bp 和333bp 4 30，74，94和 165bp CviRI 3 61，257 和 334bp 4 29，61，77和 196bp MwoI 3 67，237 和 331bp 4 32，67，94和 170bp TaqI 3 98，142 和 337bp 4 26，44，98和 195bp AcaIV 4 45，120，217 和326bp 5 37，45，75，97 和109bp HaeIII 4 47，122，219 和328 5 35，47，75，97 和109bp
为了得到PCR试剂制品，在干净房间中制备并分装PCR试剂。不让样品、 培养物或纯化的DNA导入PCR混合室。在另一间从未暴露于扩增的DNA 的房间中，将靶DNA加入到PCR混合物中。在MJ迷你热循环仪(M J Research) 上进行扩增，其中使用200μl带有单独盖子的薄壁试管(Axygen)。加入到PCR 管中的第一种溶液含有2.0μl 10x PCR缓冲液(100mM tris pH 8.3，500mM KCl，15mM MgCl2)、2.0μl dNTP混合物(各2.0mM dATP，dGTP，dTTP和 dCTP)、1.0μl引物SEQ ID NO.5＝ 5′TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG3′(5皮摩尔/μl)、1.0μl引物 SEQID NO.6＝5′GGAATTCCACTACGCACGGACTCTC 3′(5皮摩尔/μl) 和含1单位酶的0.2μl Taq聚合酶以及11.8μl水。将PCR管带入样品制备室 并向其中加入2.0μl DNA。轻弹试管混匀，进行渐降式PCR(Touch down PCR)(图7)。该程序有一个最初的95℃3分钟的变性过程。最初变性步骤后 有14个渐降循环，包括一次在94℃变性45秒，一次始于70℃的45秒的退 火，其在每个渐降循环中降低0.8℃，以及一次在72℃延伸1分钟。然后是 25个常规循环，其包括一次在94℃变性45秒，一次在58℃退火45秒，以 及一次在72℃延伸1分钟。完成PCR时，将试管放入另一室中进行扩增的 PCR产物的分析。在2.0％琼脂糖胶上上样10μl反应物，另外保存10μl反 应物在需要时进行PCR-RFLP分析。
总共使用142个临床样品来评估该基于PCR的用于检测临床样品中病原 分枝杆菌的试验。其中141个为痰样品，1个为脑脊髓液。
其中，用抗酸涂片法，74个样品呈阳性，而用PCR也有68个呈阳性。它 们中的4个用涂片呈阳性，而用PCR呈阴性。所有这些患者的涂片结果缺少 抗酸显微镜检报告。除了这些患者的重复样品用PCR都呈阳性之外。来自相 同患者的2个样品用涂片呈阳性，而用PCR呈阴性。在考察来自这些样品的 含DNA的反应物和纯化的DNA后，发现这些样品含有PCR抑制剂。用改 进的裂解缓冲液再次处理这些样品，用异丙醇沉淀浓缩。31个患者用抗酸显 微镜检呈阴性，而用PCR呈阳性。所有这些患者的临床病史显示，他们用涂 片法都呈分枝杆菌阳性并接受治疗，涂片呈阴性是由于在这些样品中细菌量 低造成的。余下的37个样品用涂片和PCR法均呈阴性。检查他们的临床报 告，发现他们的其他临床参数也呈阴性并由于类似发烧和咳嗽的初步症状而 住院。
因此，本发明的主要具体实施方式涉及检测临床样品中病原分枝杆菌的方 法，所述方法包括以下步骤：
(a)通过常规方法净化临床样品，去除包括粘液的污染物，
(b)用改进的裂解缓冲液处理步骤(a)所得的经处理的临床样品以使活病 原分枝杆菌失活，从而使过程对使用者安全，
(c)利用改进的方法，从步骤(b)所得的经处理的临床样品中提取基因组 DNA，从而提高DNA的产量和质量，
(d)从步骤(c)所得的DNA来设计用于检测病原分枝杆菌的序列SEQ ID No.4，所述设计的序列包括步骤(c)所得DNA所选出的SEQ ID No.3的基因 间区域、含SEQ ID No.1的mmaA1基因部分的侧翼区域和SEQ ID No.2的 mmaA2基因部分，
(e)设计并合成一套SEQ ID No.5的特异寡核苷酸引物，其为正向引物和 SEQID No.6，其为用于聚合酶链式反应(PCR)扩增SEQ ID No.4的反向引 物，
(f)开发用于特异性扩增(d)的SEQ ID No.4的PCR扩增过程，所述过程 包括使用步骤(e)中设计并合成的特异性寡核苷酸引物，用于检测临床样品中 病原分枝杆菌的存在，和
(g)通过限制酶片断长度多态性(RFLP)分析PCR扩增产物，用于区分病原 分枝杆菌菌种，用于快速评估HIV的共感染。
本发明另一个具体实施方式涉及SEQ ID No.4，其中所述SEQ ID.4具有 如下序列
5′GAGGTGTAATGCCTTTCCGGACCCTAGGTGGCCTTTCGGTGCTTGCAC
GGAACGCACCGATGCTTCCCCCTCCCCGCATGCTCGAGGCATGCTATCC
GATACAGGGCCGCCGCACTAAACCGCGATCGAATTTGCCCAGGTCAGG
GAACGGATATGAGCGGACGAG 3′
本发明另一个具体实施方式还涉及选自痰、胃洗出物、脑脊髓液、血液、 组织活体检测物、或骨髓穿刺液和其他体液或组织的临床样品。
本发明另一个具体实施方式还涉及通过消化净化混合物，来进行净化步骤 (a)中的样品，去除污染物(除了分枝杆菌和粘液之外的活生物)，接着通过离 心浓缩样品，其中消化净化混合物包含温和的碱、NaOH、柠檬酸三钠和粘液 溶解剂和在约0.4-2.5M范围内的异硫氰酸胍。
本发明另一个具体实施方式涉及消化净化混合物，其包含温和的碱、 NaOH、柠檬酸三钠和粘液溶解剂和在约0.5-2.0M范围内的异硫氰酸胍。
本发明另一个具体实施方式还涉及利用改进的裂解缓冲液从处理过的临 床样品中提取步骤(c)中的DNA，并通过有机溶剂完全沉淀来纯化DNA以提 高产量，其中裂解缓冲液的成分包含在约0.5-8M范围内的异硫氰酸胍、在 约20-100mM范围内的pH 7.6的Tris.Cl、在约0.5-2％范围内的N-月桂基肌 氨酸(N lauryl sarcosyl)、在约0.1-20mM范围内的EDTA、在约1-25mM范 围内的β-巯基乙醇和在约0.3M-1M范围内的NH4COOH。
本发明另一个具体实施方式涉及约为4M的异硫氰酸胍、约为50mM的 pH 7.6的Tris.Cl、约为1％内的N-月桂基肌氨酸(N lauryl sarcosyl)、约为1 mM的EDTA、约为10mM的β-巯基乙醇和约为0.7M的NH4COOH。
本发明另一个具体实施方式还涉及有机溶剂，其中有机溶剂选自包括苯酚 /氯仿混合物和氯仿的组。
本发明另一个具体实施方式涉及基因组DNA产量的增加范围约为25％至 50％的范围内。
本发明另一个具体实施方式还涉及基因组DNA产量的增加范围约为30％ 至40％的范围内。
本发明另一个具体实施方式还涉及改进的裂解缓冲液，其中改进的裂解缓 冲液提供更净化的DNA制品。
本发明另一个具体实施方式涉及处理方法，其中用含4M异硫氰酸胍的改 进的裂解缓冲液处理使活分枝杆菌失活，从而使过程对操作者更安全。
本发明另一个具体实施方式还涉及通过改进的渐降式PCR(Touch down PCR)循环条件来达到步骤(f)中的DNA高扩增量，其中所述条件包括在约 62-72℃范围内的高起始退火温度，接着在最先的10-25个循环中每个PCR循 环降低约0.2-1℃范围内的温度，渐降步骤达到约56-62℃的最优退火温度则 进行另外30个PCR循环。
本发明另一个具体实施方式涉及通过改进的渐降式PCR(Touch down PCR)循环条件来达到DNA高扩增量，其中所述条件包括的步骤为约70℃ 的高起始退火温度，接着在最先约14个循环中每个PCR循环降低约0.8℃的 温度，至约58℃进行另外25个PCR循环。
本发明另一个具体实施方式中涉及用于检测临床样品中病原分枝杆菌的 寡核苷酸引物，其能扩增SEQ ID No.4的基因间区域，其选自以下组
a.5′TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG 3′(SEQ ID No.5)，其是正 向引物。
a.5′GGAATTCCACTACCACGGACTCTC 3′(SEQ ID No.6)，其是反向引 物。
本发明另一个具体实施方式涉及寡核苷酸引物的长度，其中寡核苷酸引物 的长度在5至100个碱基间。
本发明另一个具体实施方式涉及用于检测临床样品中病原分枝杆菌的诊 断试剂盒，其包含选自由以下引物组成的组中的引物：
(a)5′TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG 3′(SEQ ID No.5)，其是 正向引物，和
(b)5′GGAATTCCACTACGCACGGACTCTC 3′(SEQ ID No.6)，其是反向 引物
本发明另一个具体实施方式还涉及具有seq.ID No.5和Seq.ID No.6的引 物用于检测病原分枝杆菌的应用，所述方法包括以下步骤：
a.利用改进的方法从处理过的临床样品中提取基因组DNA以提高DNA 的产量和质量，
b.设计来自步骤(a)所得DNA的用于特异检测病原分枝杆菌的序列SEQ ID No.4，所述设计的序列包括步骤(a)所得DNA所选出的SEQ ID No.3的基 因间区域、含SEQ ID No.1的mmaA1基因部分的侧翼区域和SEQ ID No.2的 mmaA2基因部分
c.开发用于特异性扩增步骤(b)的SEQID No.4的PCR扩增过程，和
d.通过限制酶片断长度多态性(RFLP)分析PCR扩增产物，用于区分病原 分枝杆菌菌种，用于快速评估HIV的共感染
本发明另一个具体实施方式还涉及SEQ ID No.4，其中SEQ ID No.4具有 如下序列：
5′GAGGTGTAATGCCTTTCCGGACCCTAGGTGGCCTTTCGGTGCTTGC
ACGGAACGCACCGATGCTTCCCCCTCCCCGCATGCTCGAGGCATGCTAT
CCGATACAGGGCCGCCGCACTAAACCGCGATCGAATTTGCCCAGGTCAG
GGAACGGATATGAGCGGACGAG 3′
本发明另一个具体实施方式涉及应用，其中临床样品选自痰、胃洗出物、 脑脊髓液、血液、组织活体检测物、或骨髓穿刺液和其他体液或组织。
本发明另一个具体实施方式涉及通过消化净化混合物，来进行净化步骤(a) 中的样品，去除污染物(除了分枝杆菌和粘液之外的活生物)，接着通过离心 浓缩样品，其中消化净化混合物包含温和的碱、NaOH、柠檬酸三钠和粘液溶 解剂和在约0.4-2.5M范围内的异硫氰酸胍。
本发明通过以下实施例来举例说明，其中以下实施例是作为举例说明本发 明的方式给出的，不应被理解为构成对本发明范围的限制：
实施例
实施例：1试剂
购自于Sigma Aldrich.美国的Trizma(Tris碱)、N-乙酰基-L-半胱氨酸 (NALC)、溴化乙锭、琼脂糖、K2HPO4、KH2PO4、柠檬酸钠、N-月桂基肌氨 酸(N lauryl sarcosyl)、EDTA、2-巯基乙醇。
得自New England Biolabs.美国的耐热聚合酶和dNTP。
得自Axygen美国和Corning-Costar美国的塑料制品。
实施例：2临床样品的收集和处理：
在印度新德里的Ramakrishna Mission Free Tuberculosis Clinic Karol Bagh 中，将得自患者的142份痰和1份脑脊髓液装入无菌样品管中。要么在可能 时立即处理样品，要么在处理前储存于4℃。
痰
通过NALC-NaOH法处理样品。将约1-3ml痰转移进15ml带盖的螺旋 离心管(Coming Costar Corp美国)中。对每个样品，加入1-3ml消化净化缓 冲液，轻轻混合并在室温放置15分钟。用3倍体积的0.67M pH 6.8磷酸缓冲 液稀释样品并在旋转转子(Remi cetrifuge印度)中以3500g离心15分钟。沉淀 重悬于300μl无菌蒸馏水中。需要时将处理过的样品的三分之一用于培养， 另三分之二用于PCR。指定用于PCR的那部分通过向试管加入0.5ml裂解缓 冲液并在85℃加热20分钟来进行失活和裂解。
脑脊髓液
脑脊髓液(CSF)通常被认为是无菌的，无需消化和净化。将1-2ml脑脊 髓液(CSF)转移进微离心管(MCT)中并在微离心器(Eppendorf，A.G德国)中 以12000g离心3分钟。用pH 7.0的0.067M磷酸缓冲液洗涤沉淀，并重悬于 300μl无菌蒸馏水中。全部都用于PCR。
实施例：3制备涂片
根据Zeihl-Neelsen染色过程，用碱性品红染料进行抗酸染色。将痰的粘液 部分的一小部分涂于1×2平方厘米的区域内。简单加热固定样品，用碱性品 红染料覆盖，在Bunsen炉上简单加热。用溶于95％乙醇中含3％硫酸的酸性 醇脱色。用蒸馏水洗片并用亚甲蓝(0.3％亚甲蓝氯)复染1-2分钟。水洗并 在空气中干燥。用双筒显微镜(Zeiss，德国)以400x在油镜下检查涂片。根据 各项WHO的指南来给涂片评分。
实施例：4利用改进的裂解缓冲液从处理过的临床样品中提取DNA
将一部分(200μl)被消化并净化的样品转移进微离心管中。向其中加入500 μl改进的裂解缓冲液，其含4M异硫氰酸胍、50mM Tris.Cl(pH 8.0)、1％N- 月桂基肌氨酸(N lauryl sarcosyl)、1mM EDTA、10mM 2-巯基乙醇和0.2M NaCl，翻转试管使之混匀。于85℃孵育试管20分钟并间歇震荡以裂解细胞。 向裂解液中加入200μl 2.5M pH 7.6的醋酸铵，翻转试管使之混匀。以12000g 离心混合物5分钟。用苯酚和氯访抽提上清液一次。用0.8倍体积的异丙醇 沉淀DNA。用70％乙醇完全洗涤沉淀，在空气中简单干燥并溶于30μl TE缓 冲液(10mM Tris.Cl pH 8.3和0.01mM EDTA pH 8.0)，将其中的2μl用于 PCR扩增。
实施例：5引物设计
用引物选择软件(DNASTAR，LASERGENE INC的软件)设计2个寡核苷 酸引物，其能扩增病原分枝杆菌的基本基因部分。甲基分枝菌酸合成酶是4 个基因(mmaA1-mmaA4)的簇。这些基因与分枝菌酸的合成和修饰有关，报 道其仅存在于病原分枝杆菌中。11bp的正向引物位于mmaA1和mmaA2基因 的基因间区域，而反向引物在甲基分枝菌酸合成酶1基因(mmaA1)中。这些 引物用本中心生物信息学组开发的软件GENOME CALCULATOR来检验对 于分枝杆菌的特异性。正向寡核苷酸引物、SEQ ID 5有27bp的长度。反向 引物SEQ ID NO.6有25个碱基对的长度。正向引物A从mmaA2基因中的 1-9位碱基开始，该11bp寡核苷酸引物位于mmaA2和mmaA1基因间的167 bp间隔区域。反向引物D、SEQ ID 2从图1和2的mmaA1基因中的688-705 位碱基开始。在含有Bam HI限制性内切酶位点的5′处，引物序列外伸出7 个碱基对。在含有EcoRI位点的5′末端处，寡核苷酸引物D也有7bp的外伸。 这些引物特异扩增出373个碱基对的部分，其被命名为病原分枝杆菌基本基 因的AD。
正向引物SEQ ID NO.5
5′TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG 3′
反向引物SEQ ID NO.6
5′GGAATTCCACTACGCACGGACTCTC 3′
实施例：6PCR扩增分离自临床样品的DNA的AD
以20ul反应体积进行PCR反应，其中包含2.0μl来自以上制品的 DNA、50mmKCl、10mM pH 8.3的Tris.Cl、1.5mM MgCl2、10皮摩尔每种 寡核苷酸引物和1单位耐热聚合酶。重复进行反应，其中含有2.0μl以上 DNA.的10倍稀释液。
几种不同的循环条件用以获得净化的PCR产物，避免非特异性扩增。一 开始，常规的循环条件包括在95℃最初变性3分钟一次。接着，在94℃变性 45秒一次，在60℃引物退火45秒一次和在72℃延伸1分钟一次，以此共进 行30各循环。然后在72℃最终延伸5分钟。
用纯化的DNA能良好地运作，而用分离自临床样品的DNA会带来非特 异性扩增。为了克服它，采用新的聚合酶链式反应方法。
渐降式PCR(Touch down PCR)
渐降式PCR(Touch down PCR)方法是有效消除非特异性扩增的方法， 因而可提高PCR反应的产量和效率。在渐降法中，寡核苷酸引物的退火略 高于确定的(解链温度)Tm，在每个循环中降低退火Tm，直至达到所希望 的退火温度。该措施不会在最初的循环中产生非特异性产物，以及能帮助提 高特异性扩增并提高PCR反应的效率许多倍。
渐降式PCR(Touch down PCR)的循环条件
在该程序中，在95℃最初变性3分钟一次，接着进行14个渐降式循环(在 94℃变性45秒一次，开始在70℃退火45秒一次，在每个循环降低0.8℃， 在72℃延伸1分钟一次)。渐降法后，进行25个循环(在94℃变性45秒一 次，在58℃退火45秒一次和在72℃延伸1分钟一次)。
实施例：7检测扩增的PCR产物
在琼脂糖凝胶上电泳分析扩增的PCR产物。PCR反应物同1.0μl 6x胶 上样缓冲液混合，并将全部反应液上样到1.8％琼脂糖凝胶上。制备凝胶并在 1x TAE缓冲液(0.04M Tris-醋酸和0.001M EDTA)中进行电泳。电泳后，在 含有0.5μg/ml溴化乙锭的染色液中对凝胶进行染色。利用鹰眼凝胶文档系统 (Stratagene)对凝胶照相并归档。
本发明的优点
如上所述，有几种基于PCR的检测临床样品中分枝杆菌的方法可供使用。 可是每种方法都有其自身的缺点，它们中没有一种是完善的。主要的缺点在 于从临床样品中分离DNA。送到实验室进行检测的临床样品包含几种杂质， 所述杂质通过所述的方法同DNA一起纯化而且会干扰以后的检测步骤。我们 的DNA分离方法取消了分离并提供了对于PCR来说纯净的DNA。本方法 的另一个优点是选出了寡核苷酸引物，其用于特异性扩增出特异于病原分枝 杆菌的靶DNA片段。设计一套引物，其中引物之一位于分枝杆菌基本基因间 的基因间区域，而另一个位于分枝杆菌的基本基因中。因而，该引物对对病 原分枝杆菌来说是非常特异的，并能从病原分枝杆菌中特异扩增出DNA片 段，而且不能像许多可用的引物所报道的那样从其它分枝杆菌中扩增。本方 法的另一个优点是它不使用昂贵的试剂，为了获得特异性扩增，在严谨的条 件下PCR扩增靶序列，这会增加测试的成本。该方法代替使用独特的循环条 件，从而达到靶DNA的特异性扩增。因此测试的成本降低了约10-20％。本 方法的另一个优点是因为扩增的DNA的独特结构使其成为理想的靶位，所述 独特结构包含基因间区域和其坐落于分枝杆菌基本基因中的侧翼序列，所述 靶位用于根据限制酶片断长度多态性(RFLP)来鉴定病原分枝杆菌的不同菌 株。本方法的另一个优点是该方法在测试的开始就整合了使临床样品中的病 原分枝杆菌失活的步骤，因而使过程对于使用者来说是安全的。
以下给出的是序列表信息SEQ ID No.1、2、3、4、5和6
序列表
整体信息
申请人：CSIR
发明名称：用于检测临床样品中的病原分枝杆菌的方法
序列数：6
通信地址：遗传和综合生物学研究所(以前的生物化学技术中心)，Mall Road， 德里-110007，印度，Tel 00-91-11-7666158 Fax.00-91-7667471
SEQ ID No.1的信息
1.序列特征：
1.长度：861bp.
2.类型：DNA
5′CTACTTGGTCATGGTGAACTGGGCGACGTTGATTAGGCCTCTGCGGAAGCGCTCCGCG
CATCCGGTCAGATAGTGCATGAAGTTGTTGTAGACCTCTTCGGACTGTACGGCGATGGC
GCGTTCGCGGGCAGCCTGTAGGTTGGCGGCCCATGCATCGAGAGTCCGTGCGTAGTGCT
GCTGCAGCAGCTGGACATGCTCGATGGTGAAGCCCGCGGCCTGCGCATTGTCGACAATG
TCGGGCTCCGATGGCAGCTCGCCGCCCGGGAAGATCGACTCCCGCAGGAATTTGAGGA
ATCGAAGGTCGCTCATCGTCAGCCGCAATGCCCTGTTCGTGCAGCCACCTGCGGTCGTAG
GTGAACAGGCTGTGCAGTAGCATCCGCCCGTCATCGGGCAGGATGTCGTAGGAGCGTTC
GAAGAACGTCAGATACCGCTCCTTTTTGAACGCGTCGAATGCCTCAAAGCTGACGATCC
GGTCGACGTTCTCTTCAAACTCTTCCCAGCCCTGCAGCCGGGCCTCGGCGCGCCGTTGCG
TTCCGATTGCGGCCAGGCGGTCTTTGCTGCGTTCATAGTGATTCCGGCTGAGCGTGAGG
CCGATGACATTGACGTCGTACTTCTCCACGGCCCGAACGAGCGCCCCGCCCCACCCGCA
ACCCACGTCGAGTAGCGTCATCCCCGGTTCGAGGTTCAGCTTGTCCAACGCCAGATCCA
CCTTGGCCAGTTGCGCCTCTTCCAGCGTCATATCGTCACGCTCGAAATAGGCGCAGGTG
TAGACCCAGGTGGGATCGAGGAACAACGCGAAGAAGTCATCCGAAATGTCGTAAGCCG
ACTGTGACTCTTCGTAATATGGTCTCAGCTTGGCCAT 3′
3.生物体：结核分支杆菌(M.tuberculosis)
4.来源：天然序列
5.名称/要素：mmaA 1
6.SEQ ID No.1
SEQ ID No.2的信息
1.序列特征：
1.长度：864bp.
2.类型：DNA
5’CTACTTCGCCAGCGTGAACTGGTTGACGTCGATGTAGCCGACCCGGAACAGCTTGGCG
CAGCCGGTCAGGTATTTCATGTACCGCTCGTAGACCTCTTCGGACTGGATCGCGATGGC
CTCGCTTTTGTGTTCCTGCAGCGCCTCGGCCCACAGGTCGAGGGTCCTGGCGTAATGCG
GCTGCAGCGACTGGCGGCGAGTCAGCGTGAAACCCGTCTTCGCCGACTGTTCCTCAACC
ATTTCAATCGTCGGAGGTTGGCCCCCCGGGAAGATTTCGGTCGCGATGAACTTGAGAAA
GCGGGCCAGCCACAACGTGAGCGGCAAGCCGTGGTCGACCATCTGCTGCCTGGTCAGG
CCGGTGATCGTGTGCAGCAGCAACACGCCATCGGGCGGCAGGATTTTGTGGGCCCGGGC
GAAGAAGTCGGCGTGACGATCGTGGCCGAAGTGCTCGAACGCGCCGATCGACACGATG
CGGTCGACGGGCTCGTTGAACTGCTCCCATCCCGCCAGCAACACTCGCCTGTCGCGCGG
GGTGTCCATCTCGTCGAACGACTTCTGCACATGGGCGGCCTGGTTCTTCGACAATGTCA
GGCCGACGACGTTGACGTCATACTGCGCGATCGCGCGCCGCATGGTGGCGCCCCAGCCG
CAACCGATATCGAGCAGCGTCATGCCGGGCTGCAGACCTAGCTTGCCCAGCGCCAGGTC
GATCTTGGCGATCTGGGCCTCTTCCAGCGTCATGTCCTCGCGTTCGAAATGCGCGCAGCT
GTAGGTCTGGGTCGGATCCAGGAACAGCCGGAAGAAGTCGTCGGACAGGTCGTAGTGT
GCCTGCACGTCCTCGAAGTGCGGCGTTAGGTCGTTGACCAT 3’
3.生物体：结核分支杆菌(M.tuberculosis)
4.来源：天然序列
5.名称/要素：mmaA 2
6.SEQ ID#2
SEQ ID No.3的信息
1.序列特征：
1.长度：166bp.
2.类型：DNA
5’GAGGTGTAATGCCTTTCCGGACCCTAGGTGGCCTTTCGGTGCTTGCACGGAACGCACC
GATGCTTCCCCCTCCCCGCATGCTCGAGGCATGCTATCCGATACAGGGCCGCCGCACTA
AACCGCGATCGAATTTGCCCAGGTCAGGGAACGGATATGAGCGGACGAG 3’
3.生物体：结核分支杆菌(M.tuberculosis)
4.来源：天然序列
5.名称/要素：mmaA 1和mmaA 2间的基因间区域
6.SEQ ID#3
SEQ ID No.4的信息
1.序列特征：
1.长度：363bp.
2.类型：DNA
5’TGGATCCGTTGACCATGAGGTTGTAATGCCTTTCCGGACCCTAGGTGGCCTTTCGGTGCTT
GCACGGAACGCACCGATGCTTCCCCCTCCCCGCATGCTCGAGGCATGCTATCCGATACA
GGGCCGCCGCACTAAACCGCGATCGAATTTGCCCAGGTCAGGGAACGGATATGAGCGG
ACGAGCTACTTGGTCATGGTGAACTGGGCGACGTTTGATTAGGCCTCTGCGGAAGCGCTC
CGCGCATCCGGTCAGATAGTGCATGAAGTTGTTGTTAGACCTCTTCGGACTGTACGGCGA
TGGCGCGTTCGCGGGCAGCCTGTAGGTTGGCGGCCCATGCATCGAGAGTCCGTGCGTAGT
GGGAATTC3’
3.生物体：结核分支杆菌(M.tuberculosis)
4.来源：天然序列和人工序列
5.名称/要素：正向引物(SEQ.ID 5和反向引物(SEQ.ID 6)间的区域
SEQ ID#4
SEQ ID No.5的信息
1.序列特征：
1.长度：27bp.
2.类型：DNA
5’TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG3’
3.生物体：人工序列
4.来源：人工合成的寡核苷酸
5.名称/要素：正向引物
6.SEQ ID#5
SEQ ID No.6的信息
1.序列特征：
1.长度：25bp.
2.类型：DNA
5’GGAATTCCACTACGCACGGACTCTC3’
3.生物体：人工序列
4.来源：人工合成的寡核苷酸
5.名称/要素：反向引物
6.SEQ ID#6
参考文献：
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Zambardi等，Annales de Biologie Clinique 50：893-897，1993.
权利要求书
(按照条约第19条的修改)
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于检测临床样品中病原 分枝杆菌的寡核苷酸引物，其能扩增SEQ ID No.4的基因间区域，其选自以 下组：
a.5′TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG 3′(SEQ ID No.5)，其是正 向引物。
b.5′GGAATTCCACTACGACGGACTCTC 3′(SEQ ID No.6)，其是反向引 物。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，寡核苷酸引物的长度在5 至100个碱基间。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，改进的裂解缓冲液提供更 净化的DNA制品。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用含4M异硫氰酸胍的改 进的裂解缓冲液处理使活分枝杆菌失活，从而使过程对操作者更安全。
17.用于检测临床样品中病原分枝杆菌的诊断试剂盒，其包含选自由以 下引物组成的组中的引物：
a.5′TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG 3′(SEQ ID No.5)，其是 正向引物，和
b.5′GGAATTCCACTACGCACGGACTCTC 3′(SEQ ID No.6)，其是反 向引物。
18.具有seq.ID No.5和Seq.ID No.6的引物用于检测病原分枝杆菌的应 用，所述方法包括以下步骤：
a.利用改进的方法从处理过的临床样品中提取基因组DNA以提高DNA 的产量和质量，
b.设计来自步骤(a)所得DNA的用于特异检测病原分枝杆菌的序列SEQ ID No.4，所述设计的序列包括步骤(a)所得DNA所选出的SEQ ID No.3的基 因间区域、含SEQ ID No.1的mmaA1基因部分的侧翼区域和SEQ ID No.2的 mmaA2基因部分，
c.开发用于特异性扩增步骤(b)的SEQ ID No.4的PCR扩增过程，和
d.通过限制酶片断长度多态性(RFLP)分析PCR扩增产物，用于区分病原
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