发明的技术领域

本发明涉及改进的药物组合物，组合物包括肉毒杆菌毒素和螯合剂。发明进一 步提供治疗多种神经肌肉疾病的药物组合物和方法。

                             发明的背景

肉毒杆菌毒素是从肉毒梭菌(Clostridium botulinum)前株中分离的毒素， 在较高浓度和量是致死的毒素，它用作有价值的治疗剂以治疗许多神经肌肉疾病 (例如张力失常、偏侧面肌痉挛、磨牙症、痉挛状态、大脑性瘫痪、斜颈)以及 感觉障碍和皮肤病(肌筋膜痛、偏头痛、紧张性头痛、神经病、多汗症)。

在本发明之前，从未鉴定白蛋白体内结合肉毒杆菌毒素对基于肉毒杆菌毒素的 药物的临床效力是重要的。通过增强区域性鳌合神经毒素和促进神经组织上的神 经毒素受体的饱和，高浓度白蛋白制剂改善肉毒杆菌毒素的临床效力并减小副作 用如由肉毒杆菌毒素从施用部位扩散引起的副作用。先目前没有提示通过相对神 经毒素增加浓度来改变肉毒杆菌毒素的制剂能提高治疗人类疾病的效力。当前临 床实践可用的现有肉毒杆菌毒素制品是BOTOX、DYSPORT、MYOBLOC。本发明鉴定 机制且提供组合物，组合物含效力改善的基于肉毒杆菌毒素的药物，这是通过增 加螯合剂和其它粘性剂的浓度以增强鳌合并改善在其它可用肉毒杆菌毒素制品失 败处的效力。

近年来，Borodic等表征了肉毒杆菌毒素区域性效果，使用肌纤维形态计量法、 胆碱脂酶染色和来自面部肌紧张压抑的皮肤起皱(Borodic(1992))“用于额肌悬 带术后(表现性)睑下垂矫正过度的肉毒杆菌A毒素”(Botulinum A toxin for (expressionistic)ptosis overcorrection after frontalis sling).Ophthalmic Plastic and Reconstrctive Surg.8(2)：137-142；全部纳入本文供参考)。

由于作为治疗剂引入，肉毒杆菌毒素的去神经或生物活性的药物测量是LD50单 位，使用18-22克Swiss-Webster小鼠，通过从纯化的肉毒杆菌神经毒素蛋白和 其蛋白复合体的不同稀释度注射小鼠同龄组来统计上定量。此测量的优点是简单， 有清楚的终点确定(活或死小鼠)，然而，LD50单位不预测临床研究比较中不同肉 毒杆菌毒素制剂的临床特点。例如，一种b型肉毒杆菌毒素(MYOBLOC)的制品需 要5,000-15,000LD50单位以治疗斜颈，而另一种a型肉毒杆菌毒素(BOTOX)的 制品仅需要100-300LD50单位。类似地，LD50单位不能区分不同来源的相同肉毒杆 菌毒素免疫类型在治疗特点上的差异。例如，与另一种肉毒杆菌a型毒素制品 DYSPORT需要200-1200单位相比。需要约50-300单位的BOTOX来治疗睑痉挛和颈 张力失常，表1描述了用于不同疾病的可变剂量。

         表1：不同肉毒杆菌毒素的药物制剂间的剂量比较   制剂   自发性睑痉挛   斜颈   BOTOX   50U1   200U   DYSPORT   200U   600-1,200U   MYOBLOC   3,000-5,000U   10,000-15,000U

1单位(U)是用20-30g Swiss-Webster小鼠确定的LD50单位，如本文所述。

A.与常规肉毒杆菌毒素制剂相关的并发症

在有效剂量要求外，已在治疗量的不同肉毒杆菌制品中注意到并发症比例的显 著差异。副作用如由肉毒杆菌毒素从施用部位扩散引起的，似乎取决于肉毒杆菌 毒素制剂。例如，当用于治疗颈张力失常时，吞咽困难比例(困难吞咽)是熟知 的肉毒杆菌毒素施用的并发症(Borodic等，(1990)“用于治疗痉挛性斜颈的肉毒 杆菌A毒素”(Botulinum A toxin for treatment of spasmodic torticolis) Dysphagia and Regional Toxin Spread Head&Neck，12：392-398；全部纳入本文 供参考)。回顾1984-1995间的现有技术文献时，很好理解了制剂间此并发症比例 的差异。当比较不同免疫类型和相同免疫类型的不同制品时，报导了睑下垂症比 例的差异(见表1)。现在公认此并发症是肉毒杆菌毒素从注射部位扩散的结果， 该性质与对特定靶区域的去神经或生物效果的临床目标相冲突。

    表2：不同肉毒杆菌毒素的药物制剂间点扩散相关的并发症   并发症   BOTOX   DYSPORT2   MYOBLOC3   睑下垂症1   ＜2％   12-15％   30-40％   吞咽困难   ＜2％   14-21％   10-17％

1Nussgens等，(1997)“比较自发性睑痉挛治疗中的2种肉毒杆菌毒素制品” (Comparasion of two botulinum-toxin preparations in the treatment of essential blepharospasm)Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 235(4)：197-199.

2对吞咽困难和肉毒杆菌临床研究的Oculinum Meta-分析的3期研究1998-1989 (Phase 3 Studies1998-1989 for Oculinum Meta-analysis of clinical studies on Dysphagia and Botulinum 1995，攻NIH(Borodic))。

3Lew等，(1997)“肉毒杆菌毒素b型：颈张力失常中的双盲、安慰剂控制、安 全性和功效研究”(Botulinum toxin type B：a double-blind， placebo-controlled，safety and efficacy study in cervical dystonia) Neurology 49(3)：701-707。

在1991年，Borodic等论证了组织学模型，证明来自肉毒杆菌毒素点注射的 组织化学和形态学的扩散梯度。(Borodic等，(1991)“肉毒杆菌毒素：临床和科 学方面”(Botulinum toxin：Clinical and scientific aspects)Ophthalmology Clinics of North America 4：491-503；全部纳入本文供参考)。进一步证明此梯 度在单肌肉带中是剂量依赖性且能使筋膜平面交叉。在人前额的面部起皱模式中 更进一步证明扩散模型(Borodic等，(1992)“用于痉挛性斜颈的肉毒杆菌毒素， 多个相对单点注射每肌肉”(Botulinum toxin for spasmodic torticollis，multiple vs.single point injections per muscle)Head and Neck 14：33-37)。之后，扩散用于解释表面注射用于人颈的肉毒杆菌注射剂之后吞咽困 难的机制和眼周注射以治疗自发性睑痉挛后的睑下垂制(眼睑下垂并发症)。睑下 垂症是由于神经肌肉阻断活性从眼睑边缘扩散到位于上眼窝间隙的上眼睑缩肌的 肌肉部分。吞咽困难是由于神经肌肉削弱作用从靶向用于治疗斜颈的胸乳突肌扩 散到产生有效吞咽力的咽周肌肉系统。根据组织学模型和临床经验，扩散似乎与 以LD50单位给出的毒素量直接相关，即所用LD50单位越高，来自点注射的扩散越大。 根据80年代到90年代早期的文献概述，在有效剂量，用DYSPORT产生的吞咽困 难比BOTOX更普遍。最近，根据在欧洲中心完成的研究，确认了吞咽困难比例的 差异(Ranoux等，(2002)“DYSPORT和BOTOX的各自效力：颈张力失常中的双盲、 随机、交叉研究”(Respective potencies of DYSPORTand BOTOX：a double blind， randomized，crossover study in cervical dystonia)J.NeuroL Neurosurg.Psychia try 72：459-462)。比较BOTOqX与DYSPORT时也观察到治疗眼 睑痉挛的睑下垂症比例的差异，表明BOTOX发生此并发症不太普遍。(Nussgens 等，(1997)“比较自发性眼睑痉挛治疗中的2种肉毒杆菌毒素制品”(Comparison of two botulinum-toxin preparations in the treatment of essential Blepharospasm)Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 235(4)：197-199)。与肉毒 杆菌a型(BOTOX)相比较，当使用肉毒杆菌毒素b型治疗眉间和前额皱纹时报导 了睑下垂症并发症的主要差异，(Holck等“比较外眦皱纹治疗中的高剂量肉毒杆 菌毒素B型与肉毒杆菌A型”(Comparison of High Dose Botulinum Toxin Type B to Botulinum A in the Treatment of Lateral Canthal Rhytides)美国眼科 整形和整复外科医师学会年会，Anaheim，CA 11-14-03)。

B.鳌合

白蛋白起初用于制成以肉毒杆菌毒素为基础的药物，因为它在高稀释度对神经 毒素的生物活性有稳定作用(参见Schantz，《肉毒杆菌毒素治疗》(Botulinum Toxin Therapsy)，Marcel Dekker 1994)。用生理盐水或水稀释纯化的肉毒杆菌毒 素晶体在高稀释度会引起生物活性和药物性质丧失。另外，已报导白蛋白有助于 阻止神经毒素结合玻璃容器。在BOTOX和任何其它制备用于药物用途的肉毒杆菌 毒素的临床前开发期间，没有认识到白蛋白在不同于稀释稳定剂和赋形剂的制剂 中对于阻止神经毒素结合玻璃的重要性。

BOTOX和DYSPORT获得自梭菌种类的不同菌株。BOTOX获得自肉毒梭菌的Hall 菌株，该菌株最初由威斯康星大学保存，而DYSPORT获得自英国微生物保藏所。 产物间存在免疫交叉反应性，因为2种产物都获得自免疫类型A菌株。尽管有类 似的免疫类型，BOTOX和DYSPORT间的临床反应可通过各制剂中所用的赋形剂差异 解释。BOTOX与DYSPORT间的人血清白蛋白的浓度差异概括于表3。

表3.不同肉毒杆菌毒素的药物制剂的人血清白蛋白含量   制剂   白蛋白1   LD50/μg白蛋白   BOTOX   500μg   0.2   DYSPORT   125μg   5.0

1白蛋白以mg每100LD50单位的肉毒杆菌毒素表示。存在其它差异，包括存在 稳定糖，乳糖用于DYSPORT，而不用于BOTOX。

BOTOX与DYSPORT间的白蛋白差异与多项临床研究中观察到的BOTOX与 DYSPORT间在剂量要求上的差异几乎相同。白蛋白比例/临床效力比例间的相关性 通过白蛋白加入小瓶时DYSPORT的药理学性质变化来进一步加强，使用小鼠偏侧 膈动物模型。Wohlfahrt等注意到，使用此加入白蛋白到1个DYSPORT小瓶的模型 产生的生物活性高于用小鼠偏侧膈模型所得生物活性。(Biglalke等，(2001)“肉 毒杆菌A毒素：DYSPORT改善生物利用度”(Botulinum A toxin：DYSPORT improvement of biological availability).Exp.Neurol.168(1)：162-170)。作 者提示生物活性增加归因于稳定性增加，如用白蛋白浓度增加提供的小鼠LD50生 物测定所测量(Biglalke等，(2001)“肉毒杆菌A毒素：DYSPORT改善生物利用 度”，Exp.Neurol.168(1)：162-170)。作者解释LD50生物测定中的白蛋白差异没有 涉及在组织中的作用机制或药理-药物动力学的重要性即体内白蛋白结合，可增强 鳌合并改善治疗效果。相同作者进一步在大鼠隔膜制品中观察到加入白蛋白到 BOTOX制品不能显著增加区域性去神经作用且不提倡制剂的任何变化。这些研究者 的发现断定白蛋白浓度对LD50测量有效果，然而，工作没有证明BOTOX对区域性 去神经的效力有任何增加或能提高DYSPORT以产生任何大于BOTOX的去神经效力。 工作受其实验的体外性质限制，即使用非血液灌注的动物运动神经(膈神经)和 隔膜肌肉解剖不能说明稀释液和组织液流动能在神经轴末端受体结合前从靶组织 冲走注射的毒素。实时应用需要体内分析白蛋白对区域性去神经的效果，如下列 实验所概括。他们的工作未确定造成小鼠致死测定所测量的LD50差异的原因。结 论是不能超出现有BOTOX制品改善效能或效力，与本文所得结论直接相反(德国 汉诺威国际肉毒杆菌毒素2002年会议)。

效能差异涉及生物效果的扩散和保持在基于肉毒杆菌的药物的药理学中是重 要的。本文描述改变基于肉毒杆菌的药物组成的方法，以提高潜能、增加肉毒杆 菌毒素鳌合和限制基于肉毒杆菌的药物的副作用。

                             发明的概述

本发明提供包含肉毒杆菌毒素和螯合剂的组合物，用于治疗多种神经肌肉疾病 和局限性去神经。在一个实施方案中，螯合剂以每100LD50单位肉毒杆菌毒素550 到550,000μg螯合剂的量存在。在另一个实施方案中，螯合剂以每100LD50单位 肉毒杆菌毒素550到5,500μg螯合剂的量存在。在进一步的一个实施方案中，螯 合剂以每100LD50单位肉毒杆菌毒素5,500到13,000μg螯合剂的量存在。在一 个较佳实施方案中，螯合剂以每100LD50单位肉毒杆菌毒素13,000到50,500μg 螯合剂的量存在。在一个更佳实施方案中，螯合剂以每100LD50单位肉毒杆菌毒 素50,500到505,000μg螯合剂的量存在。在一个最佳实施方案中，螯合剂配制 成包囊的微球体，其含量在每100LD50单位肉毒杆菌毒素50,500到90,500μg螯 合剂之间。

在另一个实施方案中，本发明提供包含肉毒杆菌毒素和螯合剂的组合物，其中 螯合剂以每100LD50单位肉毒杆菌毒素550到900,500μg螯合剂的量存在，其中 白蛋白可配制成固体白蛋白颗粒。

本组合物的肉毒杆菌毒素可选自多种肉毒梭菌菌株。在一个较佳实施方案中， 本发明的组合物包含选自肉毒杆菌毒素类型A、B、C、D、E、F和G的肉毒杆菌毒 素。在一个较佳实施方案中，肉毒杆菌毒素是肉毒杆菌毒素a型。在一个更佳实 施方案中，肉毒杆菌毒素是来自肉毒梭菌的Hall菌株的肉毒杆菌毒素a型。

在另一个实施方案中，本发明的组合物包含肉毒杆菌毒素，基本由分级分离的 轻链(fractionated-light-chain)肉毒杆菌毒素组成。在又另外一个实施方案 中，肉毒杆菌毒素基本由肉毒杆菌毒素的杂合体与链易位形式的混合物组成。在 进一步的一个实施方案中，肉毒杆菌毒素基本由肉毒杆菌毒素的嵌合形式组成。 尽管本发明可使用任何肉毒杆菌毒素，保留神经毒性的肉毒杆菌毒素片段、肉毒 杆菌毒素嵌合体和杂合体、化学修饰的肉毒杆菌毒素和本领域普通技术人员熟知 的特定活性，在一个实施方案中，肉毒杆菌毒素纯化到比活大于或等于约20LD50 单位每纳克肉毒杆菌毒素。

本发明提供肉毒杆菌毒素和螯合剂的组合物，其中肉毒杆菌毒素的LD50单位与 μg螯合剂的比例对于肉毒杆菌毒素A型是小于或等于约0.2，对于肉毒杆菌毒素 B型是小于或等于约10。

除了包含肉毒杆菌毒素和螯合剂外，本发明的各组合物可进一步包含药学上可 接受的载体和/或锌和/或锌盐。在一个实施方案中，肉毒杆菌毒素非共价结合螯 合剂。在另一个实施方案中，肉毒杆菌毒素共价结合螯合剂。

本发明提供肉毒杆菌毒素和螯合剂的组合物，其中螯合剂选自蛋白、脂类和碳 水化合物。在一个较佳实施方案中，螯合剂是白蛋白、胶原、肾上腺素或透明质 酸盐。在一个更佳实施方案中，螯合剂是透明质酸盐。在一个最佳实施方案中， 螯合剂是白蛋白。

本发明进一步提供包含肉毒杆菌毒素和螯合剂的组合物，其中螯合剂是白蛋 白，优选人血清白蛋白。此外，在一个实施方案中，本组合物的白蛋白是重组产 生的。在一个实施方案中，白蛋白以每100LD50单位肉毒杆菌毒素550到5,500 μg白蛋白的量存在。在进一步的一个实施方案中，白蛋白以每100LD50单位肉毒 杆菌毒素5,500到13,000μg白蛋白的量存在。在一个较佳实施方案中，白蛋白 以每100LD50单位肉毒杆菌毒素13,000到50,500μg白蛋白的量存在。在一个更 佳实施方案中，白蛋白以每100LD50单位肉毒杆菌毒素50,500到505,000μg白 蛋白的量存在。在一个最佳实施方案中，白蛋白配制成包囊的微球体，其含量在 每100LD50单位肉毒杆菌毒素50,500到90,500μg白蛋白之间。

在本发明的一个实施方案中，组合物包含肉毒杆菌毒素和至少1种螯合剂。在 一个较佳实施方案中，本发明组合物包含肉毒杆菌毒素和白蛋白且进一步包含1 种或多种另外的螯合剂。

本发明也提供在有此需要的受试者中产生局限性去神经的方法，包括施用有效 量的本文所述任何本发明组合物。在一个实施方案中，本发明方法用于在患神经 肌肉疾病的受试者中产生去神经，此疾病与有不随意运动的肌紧张增加相关。在 另一个实施方案中，本发明方法用于在患神经肌肉疾病的受试者中产生去神经。 神经肌肉疾病的特征优选是肌紧张增加和/或不随意运动，包括但不限于肌张力失 常、脊髓损伤或疾病、多发性硬化、痉挛状态、大脑性瘫痪、中风等。与肌紧张 增加和/或不随意运动相关的神经肌肉疾病优选是眼睑痉挛或斜颈。与有不随意运 动的肌紧张增加相关的神经肌肉疾病更优选是眼睑痉挛。

在一个实施方案中，本发明提供在患眼睑痉挛的受试者中产生去神经的方法， 包括施用10-200LD50单位的本发明组合物，如本文所述。在另一个实施方案中， 本发明提供在患斜颈的受试者中产生去神经的方法。本发明组合物的有效量优选 在10和3000LD50单位间。

在另一个实施方案中，本发明提供在有此需要的受试者中治疗失调的方法，失 调选自面部皱纹、皱纹(rhytides)和整容改变(cosmetic alteration)唇和眉 毛，包括施用有效量的本发明组合物，如本文所示。有效量优选在2.5和400LD50 单位间。

在又另外一个实施方案中，本发明提供在有此需要的受试者中治疗人头痛病的 方法，包括施用有效量的本发明组合物，如本文所示。有效量优选在5和1000LD50 单位间。

在进一步的一个实施方案中，本发明提供在有此需要的受试者中治疗人偏头痛 病的方法，包括施用有效量的本发明组合物，如本文所示。有效量优选在5和1,000 LD50单位间。

本发明也提供在有此需要的受试者中治疗人炎性疾病的方法，包括施用有效量 的本发明组合物，如本文所示。有效量优选在5和4,000LD50单位间。

本发明同样提供在有此需要的受试者中治疗肌病性或神经病性疼痛的方法，包 括施用有效量的本发明组合物，如本文所示。有效量优选在5和4,000LD50单位 间。

本发明也提供在有此需要的受试者中治疗背痛或关节痛的方法，包括施用有效 量的本发明组合物，如本文所示。有效量优选在5和4,000LD50单位间。

在又另一个实施方案中，本发明提供在有此需要的受试者中治疗胃肠痉挛和狭 窄的方法，包括施用有效量的本发明组合物，如本文所示。有效量优选在5和4,000 LD50单位间。

本发明提供在有此需要的受试者中治疗多汗综合征的方法，包括施用有效量的 本发明组合物，如本文所示。有效量优选在5和4,000LD50单位间。

本发明也提供产生本文所述组合物的方法。在一个实施方案中，方法包括混合 螯合剂与肉毒杆菌毒素。在另一个实施方案中，方法包括冷冻干燥或急骤干燥螯 合剂和肉毒杆菌毒素。肉毒杆菌毒素和螯合剂的重量对重量比例优选超过100μg 螯合剂对1mg肉毒杆菌毒素。

本发明也提供使用本文所述任何组合物治疗神经肌肉疾病、疼痛、炎性疾病、 面部皱纹、皱纹、整容改变唇和眉毛等。本发明同样提供使用本文所述任何组合 物制备药物以治疗神经肌肉疾病、疼痛、炎性疾病、面部皱纹、皱纹、整容改变 唇和眉毛等。

                           发明的详细描述

本发明描述提高临床使用的肉毒杆菌毒素制品的临床效力的方法和组合物，通 过增加靶向治疗的人或哺乳动物身体区域中肉毒杆菌神经毒素分子鳌合的方法， 使用螯合剂或“分子锚”。用较高浓度的大分子如蛋白(例如白蛋白、胶原等)和 /或脂类和/或多糖(例如透明质酸盐等)的增强鳌合可用于提供分子锚给神经毒 素分子，防止从注射点扩散出去，引起肉毒杆菌神经毒素受体的最大饱和，从而 用获得所需临床效果的神经毒素量达到较高功效。螯合剂提高区域性去神经的保 持，增强临床结果。鳌合增加允许更好地传递到神经末梢，吸收提高并增加去神 经和其它生物作用。发明需要加入神经毒素制剂并结合神经毒素的螯合剂，防止 神经毒素散布且证明在病人中的临床反应改善，病人先前没有用优选浓度的载体 分子治疗。螯合剂可以是浓度显著高于以前所用(如人血清白蛋白)的现有赋形 剂，或以前未用于稳定肉毒杆菌毒素的物质(如透明质酸钠)。螯合剂必须结合肉 毒杆菌毒素分子且防止它扩散，从而神经毒素可与神经末梢或任何神经结构反应， 使治疗效果改善。

A.定义

如本文所用，“肉毒杆菌毒素”指从肉毒梭菌菌株分离的蛋白毒素和其复合体， 包括多种免疫类型如A、B、C1、C2、C3、D、E、F和G。

如本文所用，“有效量”是足以产生治疗反应的量。有效量可用开放性标记的 临床试验中的剂量提高研究或盲法试验的两项研究来确定。

如本文所用，术语“神经肌肉疾病”指不利影响神经元件(脑、脊髓、外周神 经)或肌肉(横纹肌或平滑肌)的任何疾病，包括但不限于不随意运动障碍、张 力失常、脊髓损伤或疾病、多发性硬化、痉挛状态、大脑性瘫痪和中风。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指化学组合物、化合物或溶剂，它 们可结合活性成分且结合后能用于施用活性成分给受试者。如本文所用，“药学上 可接受的载体”包括但不限于1种或多种下列：赋形剂；表面活性剂；分散剂； 惰性稀释剂；粒化剂和分解剂；结合剂；润滑剂；防腐剂；生理上可降解组合物 如明胶；水载体和溶剂；油载体和溶剂；悬浮剂；分散剂或润湿剂；乳化剂；缓 和剂；缓冲液；盐；增稠剂；填充剂；抗氧化剂；稳定剂、药学上可接受的聚合 或疏水物质和其它本领域已知成分，它们描述于例如Genaro编辑，1985，《雷明 顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，Mack Publishing Co.， Easton，Pa.，纳入本文供参考。

如本文所用，“螯合剂”指增强肉毒杆菌毒素局部化和/或保持于施用部位的试 剂。

如本文所用，“受试者”指哺乳动物。

B.白蛋白

内源人血清白蛋白结合天然循环分子，如游离脂肪酸、胆红素、激素和锌。另 外，循环的人白蛋白能结合许多药剂，可影响这些试剂的效力、并发症比例、清 除率和其它药效性质。例子包括水杨酸盐、磺胺二甲异噁唑、华法林、苯丁唑酮、 泽地黄毒苷、苯妥英、苯唑西林、苄青霉素、速尿、吲哚美辛、安定和奎尼丁。 也已知肽和蛋白结合人血清白蛋白。也已知肽激素如胃泌素、促肾上腺皮质素、 褪黑素结合人血清白蛋白。

鉴定了一些结合位点且认为结合是非共价的。另外，白蛋白能非共价结合阳离 子，阳离子用作肉毒杆菌毒素多肽复合体部分的酶反应性的辅因子。锌特定是肉 毒杆菌毒素轻链的内肽酶活性的辅因子，它在重链结合细胞表面蛋白受体后进入 靶细胞。较高的结合白蛋白的锌量可提高内肽酶活性。锌结合白蛋白是剂量依赖 性。白蛋白上的锌结合饱和可增强肉毒杆菌毒素的去神经效果。

由于原子质量较大和其它蛋白性质，白蛋白通过淋巴管吸收(而不是血管吸收) 从注射区生理上清除，此过程比去除较小的分子种类慢许多。与肉毒杆菌毒素药 物的关联性涉及通过促进神经接触来维持生物活性和防止从注射点的游离神经毒 素释放中冲走。有较低白蛋白浓度的DYSPORT提供更少的鳌合给神经毒素复合体， 随后，结果是在注射后从靶解剖区扩散出去。临床效果是化学去神经的区域性扩 散更大，导致并发症(睑下垂症、吞咽困难，见表2)增加。为补偿此生物行为， 临床医生在实践或研究中不得不用4到5倍神经毒素以达到与较高白蛋白浓度相 同程度的生物活性。用不太有效的免疫类型如肉毒杆菌毒素B型(MYOBLOC)，需 要较大剂量以获得相同区域性生物效果，因而发生进一步扩散，并发症比例增加 (见表2)。施用更多肉毒杆菌毒素(较高蛋白负荷)导致重复注射后免疫速度较 高(Borodic等，(1996)“肉毒杆菌毒素、免疫学和用现有材料的问题”(Botulinum Toxin，Immunology and Problems with Available Materials).Neurology 46：26-29)。

MYOBLOC在＜6.0的酸性pH配制，提供稳定性增加和液体制剂在室温的稳定性。 不幸的是，酸性pH对结构和携带此生物药物制剂中人血清白蛋白性质的可能组织 有不利的副作用。在不同的pH，白蛋白异构化是可观的，像白蛋白四级构象和物 理性质一样(参见Peters(1996)《关于白蛋白的一切》(All about Albumin) Academic Press，New York；全部纳入本文供参考)。物理性质改变(通过肉毒杆 菌毒素结合和组织中肉毒杆菌毒素分子释放动力学的变化)可用于解释临床实践 中比较BOTOX和DYSPORT的剂量需求的一些相当大差异。有较高pH、B型制剂， 用相等LD50单位可观察到类似的组织学效果(参见Borodic等，(1993)“肉毒杆 菌B毒素作为肉毒杆菌A毒素的选择对象，一个组织学研究”(Botulinum B Toxin as an Alternative to Botulinum A Toxin，A Histological study)Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery 9(3)：182-190)。

尽管其它蛋白(例如明胶、乳白蛋白、溶菌酶)、脂类和碳水化合物可用作有 效的螯合剂，包括包囊的白蛋白和固体微球体的白蛋白是优选的蛋白螯合剂，部 分是因为它的免疫原性低。

C.鳌合

发明者使用鳌合概念来解释在缺乏玻璃酸酶给予眼周注射时利多卡因的毒性 改变(Troll等，(1999)“缺乏玻璃酸酶TM时用4％利多卡因白内障手术之后复视” (Diplopia after cataract surgery using 4％ lidocaine in the absense of WydaseTM).Clin Anesth.11(7)：615-6)。缺乏透明质酸酶时，可注射利多卡因在 此情况中的鳌合引起具有收缩瘢痕的眼外肌的肌原纤维的毒性，且损害眼外运动。 利多卡因例子表明来自可注射药物的动力学扩散的鳌合如何能对药物的基础药理 学重要。

然而，从未有提示或建议白蛋白能改变区域性去神经效力或提高临床效果或用 于治疗不响应BOTOX、DYSPORT或MYOBLOC的病人。本发明提供增强肉毒杆菌毒素 药物的临床效力的组合物和方法。

如上面的效力部分所指出，鳌合-区域性保持化学去神经-是本发明制剂最重要 的性质之一。此性质对提高效力、减小来自扩散的并发症比例、降低肉毒杆菌毒 素抗原性是重要的。需要较高剂量即施用蛋白负荷增加的制品与较高的免疫速度 相关(比较79-11原始Oculinum批与当前的BOTOX批，MYOBLOC与BOTOX比较)。 鳌合提高允许蛋白负荷更低、扩散更少、靶向治疗区内的生物效果增强。此改进 组合物的效用通过它在目前所用常规制剂(如BOTOX、MYOBLOC)失败或产生亚最 佳结果时具有的治疗效果来证明。

D.肉毒杆菌毒素的高白蛋白制剂的剂量

希望产生治疗特定疾病所需有效量较低的肉毒杆菌毒素组合物，因为施用肉毒 杆菌毒素与发展免疫学抗性相关。因此，此复杂性需要增加剂量(LD50单位较高) 以获得治疗有效量的肉毒杆菌毒素。

Hall菌株衍生的肉毒杆菌毒素组合物用20LD50单位/ng毒素和900μg人血清 白蛋白对100LD50单位肉毒杆菌毒素(0.11LD50单位/μg白蛋白)的比活配制(US FDA IND 4891)。此新制剂的治疗指示是面神经再生异常，有不随意的联带运动性 眼睑痉挛。研究用5到15LD50单位间的肉毒杆菌A型毒素进行，毒素用对LD50含 量增加的白蛋白量配制。

         表5：使用高白蛋白肉毒杆菌毒素组合物肉毒杆菌毒素有效量的减少   开放性标记试验   15个病人   各接受5-15LD50单位   100％证明不随意运动减少   没有睑下   垂症并发   双盲   安慰剂控制试验   30个病人(治疗/对照比例   1∶1)各接受5-15LD50单位   1.不随意运动程度显著好于对照。   2.主观参数显著好于对照。   无睑下垂   症并发

先有文献表明现有的BOTOX制品需要20LD50单位以达到此适应征的有利结果 (Borodic等，(1993)“用于异常面神经再生的肉毒杆菌毒素.剂量反应关系” (Botulinum Toxin for aberrant facial nerve regeneration.Dose response relationships).Plastic and Reconstructive Surgery，(91)6：1042-1045，1993)。 此外，在BOTOX用于治疗眼睑痉挛的100名患者研究的基础上并使用可比较的LD50 剂量(参见来自Allergan Pharmaceuticals，1998的新分批核准研究；全部纳入 本文供参考)，有20％的睑下垂症发生率(扩散并发症)，与使用肉毒杆菌毒素用于 不随意眼睑痉挛相关。比较上面所示高白蛋白研究中此并发症的发生率与BOTOX 等价研究(19/00，与0/30比较，P＜0.01，卡方)，似乎高白蛋白A型肉毒杆菌毒 素组合物需要更少LD50单位来获得可接受的治疗结果(毒素有效量减少)且与有 限的扩散入眼眶中相关，此扩散常导致睑下垂症。此并发症发生率降低表明，肉 毒杆菌毒素的鳌合效果通过较高的白蛋白含量增强。

                             实施例

下列实施例用于进一步阐述本发明且不以任何方式限制其范围。

实施例1：治疗眼睑痉挛

受试者是52岁女性，有严重的双侧不随意眼睑痉挛。不随意运动使她不能胜 任和保持有收益的工作。BOTOX通过在5个不同场合注射来施用，没有产生任何显 著的临床改善。进行手术以去除眼睑闭合的牵引肌部分(眼轮匝肌)。没有观察到 持久的改善。

BOTOX的白蛋白含量通过加入5,000μg人血清白蛋白到BOTOX小瓶(100LD50 单位)来改变。所得组合物的白蛋白浓度为2,750μg/cc(0.018LD50/μg白蛋白)。 施用60LD50单位的高白蛋白制品产生几乎完全的症状消退。即使用于超过2年的 后续施用(4个注射循环)时，高白蛋白浓度在临床上有效。

实施例2：治疗偏侧面肌痉挛

受试者是62岁男性，有双侧偏侧面肌痉挛史。用BOTOX的肉毒杆菌毒素治疗 无效。痉挛损害他天天发挥作用的能力。尝试在2个不同场合手术减压面神经。 手术都证明对获得可接受的不随意面痉挛缓解无效且导致1只耳聋。

BOTOX的白蛋白含量通过加入人血清白蛋白来增加，加入的人血清白蛋白足以 达到5,250μg/cc(0.00952LD50/μg白蛋白)的浓度。施用30LD50单位的高白 蛋白制品证明高度有效并显著缓解临床症状。

实施例3：治疗偏侧面肌痉挛

受试者是66岁男性，有右侧偏侧面肌痉挛。尽管他用BOTOX成功治疗11年， 却产生了抗性，使进一步的注射无效。用远点注射的抗性-抗性测试证明缺乏循环 抗体。另一种肉毒杆菌毒素制剂MYOBLOC的试验也对缓解征兆和症状无效。

BOTOX的白蛋白含量通过加入人血清白蛋白来增加，加入的人血清白蛋白足以 达到5,250μg/cc(0.00952LD50/μg白蛋白)的浓度。施用40LD50单位的高白 蛋白制品证明高度有效并显著缓解临床症状。

实施例4：治疗良性自发性眼睑痉挛

受试者是72岁大学校长，诊断患良性自发性眼睑痉挛。先前4次注射标准 BOTOX制品未获得任何显著改善。受试者寻求可能的手术去除肌肉和神经以削弱眼 睑闭合必需的肌肉。而肉毒杆菌毒素的高白蛋白制品施用给对良性自发性眼睑痉 挛特异的常用注射部位。高白蛋白制品通过加入12,250μg/cc(0.004LD50/μg 白蛋白)来产生。当施用常规BOTOX制剂失败时，施用60LD50单位的高白蛋白制 品获得极好结果。初始施用高白蛋白肉毒杆菌毒素制品3个月后，施用每100LD50 单位含25,000μg白蛋白(0.002LD50/μg白蛋白)的40LD50单位高白蛋白制品， 产生大于80％的眼睑痉挛临床症状缓解。

实施例5：治疗眼睑痉挛

受试者是67岁女性，有对BOTOX注射不响应的眼睑痉挛。手术去除神经和肌 肉不能产生任何对不随意眼睑闭合的缓解。

白蛋白加入常规BOTOX制品以产生肉毒杆菌毒素的高白蛋白制品，浓度为 50,250μg/cc(0.001LD50/μg白蛋白)。注射50单位的高白蛋白制品产生大于 50％的症状减少。

实施例6：治疗眼睑痉挛

受试者是77岁男性，他在重复注射肉毒杆菌毒素后发现快速免疫。注射肉毒 杆菌毒素B型的常规制剂没有减轻眼睑痉挛。

人血清白蛋白和0.5cc Healon(透明质酸盐)都加入100LD50单位的肉毒杆 菌毒素A型(BOTOX)。产生的高白蛋白制品每100LD50单位包含25,500μg白蛋 白(0.005LD50/μg白蛋白)。施用60LD50单位减少临床观察到的不随意眼睑收缩。

实施例7：治疗自发性眼睑痉挛

受试者是66岁女性，有自发性眼睑痉挛。用40到300LD50单位范围的BOTOX (A型)重复治疗没有产生治疗益处。肉毒杆菌毒素B型(MYOBLOC)以10,000LD50 单位的剂量在眼周区内施用且也不产生任何缓解。双侧面部神经切除也不产生任 何显著的症状缓解。去除眼睑闭合所需肌肉的另外手术程序也同样无效。

人血清白蛋白加入100LD50单位的肉毒杆菌毒素A型(BOTOX)。产生的高白蛋 白制品每100LD50单位包含12,750μg白蛋白(0.00196LD50/μg白蛋白)。当其 它制剂和手术方法失败时，施用50LD50单位产生3到4个月的症状显著缓解。

实施例8：治疗严重慢性眼睑痉挛

受试者是83岁男性，有严重慢性眼睑痉挛。用治疗剂量的常规肉毒杆菌毒素 制剂重复治疗后，受试者产生睑下垂症，这是一种扩散副作用。睑下垂症的出现 需要较低剂量的肉毒杆菌毒素，使此受试者的治疗复杂化。较低剂量证实效果更 小。

病人接受肉毒杆菌毒素的高白蛋白制剂，此制剂通过混合25,000μg人血清白 蛋白与100LD50单位的BOTOX来产生。高白蛋白制品每cc包含12,750μg白蛋白 (0.004LD50/μg白蛋白)。使用高白蛋白制品，施用60-70LD50单位，获得极好 的临床结果且治疗后没有睑下垂症迹象。增加鳌合浓度高许多的肉毒杆菌毒素减 少神经毒素扩散到眼窝内的肌肉中。

实施例9：治疗自发性眼睑痉挛

受试者是67岁的女性，有自发性眼睑痉挛。受试者用常规肉毒杆菌毒素制剂 治疗，没有减轻。此外，这些治疗产生睑下垂症。

高白蛋白肉毒杆菌毒素组合物(20,000μg白蛋白每cc；0.0025LD50BOTOX/ μg白蛋白)施用给受试者，获得眼睑痉挛的临床改善且没有扩散相关的副作用(睑 下垂症)。

                表4：实施例1-9所用白蛋白浓度与其它制剂的比较   实施例   白蛋白浓度   (μg/cc)   高白蛋白制品   (LD50/μg白蛋   白/cc)   BOTOX   (LD50/μg白   蛋白/cc)   DYSPORT   (LD50/μg白   蛋白/cc)   MYOBLOC   (LD50/μg白   蛋白/cc)   1   2,750   0.0180   0.2   5   10   2   5,250   0.0095   0.2   5   10   3   5,250   0.0095   0.2   5   10   4   12,500   0.0040   0.2   5   10   25,000   0.0020   5   50,250   0.0001   0.2   5   10   6*   10,200   0.0050   0.2   5   10   7   25,000   0.0020   0.2   5   10   8   12,500   0.0040   0.2   5   10   9   20,000   0.0025   0.2   5   10

给出LD50/mcg白蛋白/cc用于BOTOX、DYSPORT、MYOBLOC用于直接比较

实施例10：制备肉毒杆菌毒素的高白蛋白组合物

通过稀释纯化的肉毒杆菌毒素定量生物效果后，加到冻干物质的白蛋白量足以 超过500mg每100LD50。增加的白蛋白结合肉毒杆菌毒素并增强注射的神经毒素的 螯合，提供更佳的神经毒素受体的饱和改善的临床效果。

实施例11：制备进一步包含透明质酸盐的肉毒杆菌毒素的高白蛋白组合物

通过稀释纯化的肉毒杆菌毒素定量生物效果后，加到冻干物质的白蛋白量足以 超过500μg每100LD50单位。此外，加入进一步增强鳌合的另外螯合剂以防止肉 毒杆菌神经毒素从注射部位置扩散出来。这种螯合剂包括但不限于稀释的透明质 酸钠溶液。增加的白蛋白非共价结合肉毒杆菌毒素并增强鳌合神经毒素的螯合， 提供更佳的神经毒素受体的饱和，因而改善临床效果。

实施例12：制备进一步包含胶原的肉毒杆菌毒素的高白蛋白组合物

通过稀释纯化的肉毒杆菌毒素定量肉毒杆菌神经毒素的去神经效果后，白蛋白 与冻干的肉毒杆菌神经毒素混合，量足以超过每100LD50单位500μg白蛋白。此 外，加入进一步增强鳌合的另外螯合剂以防止肉毒杆菌神经毒素从注射区扩散出 去。这种试剂可能是动物或人胶原的稀释混合物。增加的白蛋白非共价结合肉毒 杆菌毒素并增强神经毒素的鳌合，提供更佳的神经毒素受体的饱和改善的临床效 果。

实施例13：制备包含重组产生的肉毒杆菌毒素-白蛋白融合蛋白的肉毒杆菌毒 素的高白蛋白组合物

产生肉毒杆菌毒素作为具有白蛋白的融合蛋白，从而产生共价连接肉毒杆菌毒 素的白蛋白分子。融合蛋白用小鼠LD50生物测定测试以确定有效量。区域性去神 经大鼠睑下垂症生物测定和小鼠后肢生物测定可用于确定包含融合蛋白的组合物 的有效量。临床剂量提高研究可能进一步用于确认和改进有效量。

本专利申请要求2002年12月20日提交的美国临时专利申请序列号 60/435,901的权利。