禽白细胞干扰素的制备方法
专利汇可以提供禽白细胞干扰素的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种禽白细胞干扰素的制备方法，使用鸡新城疫病毒(NDV)作为诱生剂诱导健康禽白细胞，经培养、灭活病毒、除菌、分离、纯化等工艺，制成禽白细胞干扰素冻干粉针剂。本发明成功利用了禽新鲜 全血 作为原料，制备工艺简便及经冻干后易运送和保藏，产品 质量 可靠。禽白细胞干扰素注射禽 机体 后，具有疗效好、安全可靠和无毒 副作用 等特点。可用于 治疗 禽流感、新城疫、禽传染性支气管炎、小鹅瘟、鸭瘟等病毒性 疾病 。，下面是禽白细胞干扰素的制备方法专利的具体信息内容。
1、禽白细胞干扰素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、无菌采集禽的新鲜抗凝血、分离收集白细胞悬液；
(2)、禽白细胞悬液中加入启动用粗纯制禽白细胞干扰素进行短时启动 超诱导培养；
(3)、加入诱导剂——鸡新城疫病毒(NDV)及含有禽血清或血浆的营 养液进行诱生培养18-24小时；
(4)、收集上清液，灭活鸡新城疫病毒等，滤过除菌；
(5)分装好的禽白细胞干扰素粗制品，冷冻保存。
2、据权利要求1所述的禽白细胞干扰素的制备方法，其特征在于：
(1)、以800rpm～2500rpm离心装有新鲜抗凝血瓶30min，收集血灰黄 层，得到富含禽全血白细胞悬液，用已预温的培养液将细胞悬液浓度稀释成1×107 /ml细胞悬液；
(2)、在已稀释好的细胞悬液中加入少量粗纯制禽白细胞干扰素，使其 最终浓度为100单位/ml，置于37℃水浴摇床搅拌培养2小时；
(3)、在启动后的禽白细胞悬液中加入NDV，使其最终浓度为100～150 血凝单位/ml，并同时在白细胞悬液中加入原全血1～1.5倍体积量的含10％禽血清或 禽血浆的RPMI 1640营养液，加入终浓度为10μg/ml的卡那霉素，调悬液酸碱度至 pH7.4，37℃摇床搅拌培养18～24小时；
(4)、经2000rpm～3000rpm离心30min，取上清液，加入6N HCl调 至pH2.0，置4℃4～5天，每日振摇2～3次。再用6N NaOH调至pH7.2，即得到 禽白细胞干扰素粗制品。
3、根据权利要求1所述的禽白细胞干扰素的制备方法，其特征在于：对禽白细 胞干扰素粗制品依下列步骤精制：
(1)、在粗制干扰素中加1/10量4℃预冷的5M KCNS，慢加搅拌，加完 后用4℃预冷2N HCl调pH至3.5(慢加3ml/min)4℃过夜；
(2)、弃去上清，取沉淀，4℃2000rpm 20min；
(3)、弃上清，沉淀中加1/15量-20℃预冷95％酒精。先加少量酒精， 组织匀浆器快档研磨3min，再加至足量酒精，用2N HCl调至pH4.0；
(4)、4℃2500rpm 20min，弃沉淀；
(5)、上清用1N NaOH调至pH5.0～5.5；
(6)、4℃2000rpm 20min，弃沉淀；
(7)、上清用0.1N NaOH调至pH5.6；
(8)、4℃2000rpm 20min离心，弃沉淀；
(9)、上清用1N NaOH调至pH8.0；
(10)、4℃2000rpm 20min离心，弃上清；
(11)、沉淀物中加入原体积1/10～1/15量pH8.00.1M PB(含0.5M KCNS)；
(12)、电磁搅拌过夜，使之充分溶解；
(13)、4℃2000rpm 20min离心，弃沉淀；
(14)、上清用2N HCl调至pH3.0；
(15)、4℃2000rpm 20min离心，弃上清；
(16)、沉淀物中加入1/100量pH8.00.1M PB溶解用pH7.6PB透析， 除去CNS-；
(17)、用HNO3、0.1N AgNO3检测CNS-，直至透析除尽为止；
(18)、3万g离心1h，弃沉淀；
(19)、测定干扰素效价及比活性，比活性≥1×105国际单位/mg蛋白为 合格；
(20)、无菌分装，-70℃保存，此即为禽白细胞干扰素实验室参比标准 品。
技术领域
本发明涉及一种生物制剂，具体是用于紧急预防和治疗家禽病毒性传染病如禽 流感、新城疫、禽传染性支气管炎、小鹅瘟、鸭瘟等病的禽白细胞干扰素。
背景技术
至今市场上未见有一种价格合理，疗效显著的禽白细胞干扰素制剂。
发明内容
本发明技术方案如下：
禽白细胞干扰素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、无菌采集禽的新鲜抗凝血、分离收集白细胞悬液；
(2)、禽白细胞悬液中加入启动用粗纯制禽白细胞干扰素进行短时启动 超诱导培养；
(3)、加入诱导剂——鸡新城疫病毒(NDV)及含有禽血清或血浆的营 养液进行诱生培养18-24小时；
(4)、收集上清液，灭活鸡新城疫病毒等，滤过除菌；
(5)分装好的禽白细胞干扰素粗制品，冷冻保存。
上述的禽白细胞干扰素的制备方法，其特征在于：
(1)、以800rpm～2500rpm离心装有新鲜抗凝血瓶30min，收集血灰黄 层，得到富含禽全血白细胞悬液，用已预温的培养液将细胞悬液浓度稀释成1×107 /ml细胞悬液；
(2)、在已稀释好的细胞悬液中加入少量粗纯制禽白细胞干扰素，使其 最终浓度为100单位/ml，置于37℃水浴摇床搅拌培养2小时；
(3)、在启动后的禽白细胞悬液中加入NDV，使其最终浓度为100～150 血凝单位/ml，并同时在白细胞悬液中加入原全血1～1.5倍体积量的含10％禽血清或 禽血浆的RPMI 1640营养液，加入终浓度为10μg/ml的卡那霉素，调悬液酸碱度至 pH7.4，37℃摇床搅拌培养18～24小时；
(4)、经2000rpm～3000rpm离心30min，取上清液，加入6N HCl调 至pH 2.0，置4℃4～5天，每日振摇2～3次。再用6N NaOH调至pH7.2，即得到 禽白细胞干扰素粗制品。
本发明中：“预温的培养液”是指：把保存在4℃ RPMI 1640等置室温或水浴锅中 加热到接近37℃；“过夜”在本技术领域内通常指在4℃或37℃放置12小时～18小 时；PB是含0.5M KCNS溶液；本发明所称的“禽”包括鸡、鹅、鸭等。
本发明制备的禽白细胞干扰素，经分离纯化后，制成冻干粉针剂，规格为：干 扰素效价≥2万单位/瓶；2～8℃或室温≤25℃保存。使用时，加2ml无菌双蒸水后， 能迅速溶解为均匀悬浊液，轻轻摇匀后可进行肌肉注射。幼禽500～1000单位/只/ 天；成年禽10000～20000单位/只/天。每日注射1次，一个疗程3～5次。
本发明成功地解决了禽新鲜血源来源及污染等问题，经过严格田间实验和区域 实验证实，无可见不良反应。禽白细胞干扰素注入动物机体后，治疗禽流感、新城 疫、禽传染性支气管炎、小鹅瘟、鸭瘟等病毒性疾病，具有疗效好、安全可靠、无 毒副作用和不污染环境等特点。
在治疗已发病禽的同时，应及时隔离未发病禽，并给予等量药物预防注射。使 用本发明制备的禽白细胞干扰素时，应同时实施环境的消毒等综合预防办法，防止 再感染或疫病的复发。
具体实施方式
一、配制抗凝剂(每支12500单位的肝素钠加Hank's液10ml，每毫升为1250单位) 及抗生素(卡那霉素，使用时终浓度为100μg/ml)。
二、在事先已加有抗凝剂和抗生素的无菌容器中，无菌采集禽全血，摇匀，在4℃ 冰箱放置备用。
三、制备鸡新城疫病毒(F系)，并滴定其效价。
四、按产品说明书规定溶解RPMI 1640粉剂，经蔡氏滤器加压过滤，无菌检测后在 4℃冰箱放置备用。
五、粗制品干扰素制备
(1)、以800rpm～2500rpm离心装有新鲜抗凝血瓶30min，收集灰黄层， 得到富含白细胞的悬液，用已预温的培养液稀释成1×107/ml细胞悬液；
(2)、在已稀释好的细胞悬液中加入少量粗纯禽白细胞干扰素，使其最 终浓度为100单位/ml，置于37℃水浴摇床搅拌培养2小时；
(3)、在启动后的禽白细胞悬液中加入NDV，使其最终浓度为100～150 血凝单位/ml，并同时在白细胞悬液中加入原全血1～1.5倍体积量的含10％禽血清或 禽血浆的RPMI 1640营养液，加入终浓度为10μg/ml的卡那霉素，调整该悬液酸碱 度至pH7.4，37摇床搅拌培养18～24小时；
(4)、经2000rpm～3000rpm离心30min，取上清液，加入6N HCl调 至pH2.0，4℃放置4～5天，每日振摇2～3次。再用6N NaOH调至pH7.2，即得到 禽白细胞干扰素粗制品。留取样品进行无菌检验、余毒检验等。
将上述粗制白细胞干扰素在4℃下经2000rpm～3000rpm离心30min， 取上清液用蔡氏滤器加压过滤，无菌收集滤液，再取样进行无菌检验、余毒检验、 安全检验、外源病毒检验和效价测定等均合格后，加入终浓度含5％无菌脱脂牛奶、 5％GS和10％禽血清(或血浆)作为冻干保护剂混匀后，置入冻干机保存。
干扰素粗制品依下列步骤精制(硫氰酸钾盐析纯化)：
(1)、在粗制干扰素中加1/10量4℃预冷的5M KCNS，慢加搅拌，加完 后用4℃预冷2N HCl调pH至3.5(慢加3ml/min)4℃过夜。
(2)、弃去上清，取沉淀，4℃ 2000rpm 20min。
(3)、弃上清，沉淀中加1/15量-20℃预冷95％酒精。先加少量酒精， 组织匀浆器快档研磨3min，再加至足量酒精，用2N HCl调至pH4.0。
(4)、4℃2500rpm 20min，弃沉淀。
(5)、上清用1N NaOH调至pH5.0～5.5。
(6)、4℃2000rpm 20min，弃沉淀。
(7)、上清用0.1N NaOH调至pH5.6。
(8)、4℃ 2000rpm 20min离心，弃沉淀。
(9)、上清用1N NaOH调至pH8.0。
(10)、4℃ 2000rpm 20min离心，弃上清。
(11)、沉淀物中加入原体积1/10～1/15量pH8.00.1M PB(含0.5M KCNS)。
(12)、电磁搅拌过夜，使之充分溶解。
(13)、4℃ 2000rpm 20min离心，弃沉淀。
(14)、上清用2N HCl调至pH3.0。
(15)、4℃ 2000rpm 20min离心，弃上清。
(16)、沉淀物中加入1/100量pH8.0 0.1M PB溶解用pH7.6 PB透析， 除去CNS-。
(17)、用HNO3、0.1N AgNO3检测CNS-，直至透析除尽为止。
(18)、30000×g离心1h，弃沉淀。
(19)、测定干扰素效价及比活性，比活性≥1×105国际单位/mg蛋白为 合格。
(20)、无菌分装，-70℃保存。此即为禽白细胞干扰素实验室参比标准 品。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种血液透析器及血液透析装置 | 2020-05-13 | 587 |
| 透析器称重装置 | 2020-05-12 | 419 |
| 新型纤维透析器 | 2020-05-12 | 20 |
| 聚砜血液透析器 | 2020-05-12 | 858 |
| 透析器复用装置 | 2020-05-12 | 686 |
| 透析器称重装置 | 2020-05-12 | 269 |
| 聚砜血液透析器 | 2020-05-13 | 263 |
| 具有整合透析器耦接件的透析机 | 2020-05-13 | 448 |
| 一种血液透析器 | 2020-05-11 | 718 |
| 便携式透析机器 | 2020-05-11 | 348 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
