生物抗菌肽及其制备方法
专利汇可以提供生物抗菌肽及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种 生物 抗菌肽及其制备方法,本发明的抗菌肽以林蛙蛙皮为原料,经除脂除肌肉前处理、溶胀、匀浆、抽提、离心、沉淀、 透析 除盐、浓缩、洗脱、收集活 力 峰等步骤,最后制得。本抗菌肽具有制备工艺简单、产率高、抗菌谱广、杀菌效力高等优点,可广泛地应用于食品、 水 果及蔬菜保鲜及护肤品等领域。，下面是生物抗菌肽及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种用林蛙蛙皮制备生物抗菌肽的方法，其步骤如下：(1)取林蛙干皮或鲜皮，进行除脂，除肌肉的前处理；(2)加少量的缓冲液，于4℃～80℃溶胀1～24小时；(3)鲜皮或溶胀后干皮于组织匀浆器中匀浆；(4)加缓冲液，10～100ml/g蛙皮，于4℃～80℃抽提2～72小时；(5)3000～10000r.p.m,5～30min离心，收集上清，沉淀。可重复操作4,5步骤2～3次；(6)上清液加(NH4)2SO4沉淀，(NH4)2SO4终浓度为20～80％；或沸水浴5～10min；(7)4000～20000r.p.m,10～30min离心，收集上清液；(8)合并上清透析24～72小时除盐；(9)透析后上清液超滤浓缩，超滤膜分子量截留值为1000Da，或冻干浓缩；(10)浓缩液上CM-纤维柱，平衡液为pH4.0～5.0,0.01～0.1mol/LNaAc-HAc缓冲液，洗脱液为pH5.0～5.5,0.1～0.5mol/LNaAc-HAc缓冲液梯度洗脱，收集活力峰；(11)活力峰超滤浓缩，超滤膜分子量截留值为1000Da，或冻干浓缩；(12)浓缩液上Sephadex G-25/G-50柱，洗脱条件为pH6.0～7.0,0.01～0.1mol/L磷酸缓冲液，收集活力峰；(13)活力峰超滤浓缩，超滤膜分子量截留值为1000Da，或冻干浓缩；(14)浓缩液上制备型HPLC,10～80％乙腈(0.01％TFA)洗脱，或梯度洗脱，收集活力峰；(15)活力峰冻干，于零下20℃保存，得从林蛙蛙皮制备的抗菌肽。
2.如权利要求1所述的制备生物抗菌肽的方法，其特征在于：所说的缓冲液为0.01～0.5mol/L,pH2.5～7.0的溶液。
3.权利要求1所述方法制备的生物抗菌肽，其具有如下特征：(1)热稳定性本抗菌肽80℃5小时不失活，100℃10min仍有活力；(2)pH值稳定性在pH2～13范围内活力稳定，最适pH值为pH6.4；(3)非极性体系稳定性本抗菌肽在15％六氟异丙醇中呈稳定的α-螺旋构象，在磷脂脂质体中也呈稳定α-螺旋构象；(4)等电点采用pH值调节测吸光度法测定蛙皮抗菌肽pI值；pI值为8.0～10.5的碱性多肽；(5)分子量采用凝胶过滤层析法、聚丙烯酰氨垂直板电泳法及激光解吸电离飞行时间质谱法，测得本抗菌肽的分子量为4～6KD；(6)氨基酸组成：本抗菌肽含有氨基酸种类为：天门冬氨酸(Aspartic acid)苏氨酸(Threonine)；丝氨酸(Serine)谷氨酸(Glutamicacid)；甘氨酸(Glycine)；丙氨酸(Alanine)；半胱氨酸(Cystine)；缬氨酸(Valine)；甲硫氨酸(Methionine)；异亮氨酸(Isoleucine)；亮氨酸(Leucine)；酪氨酸(Tyrosine)；苯丙氨酸(Phenylalanine)；赖氨酸(Lysine)；组氨酸(Histidine)；精氨酸(Arginine)；脯氨酸(Proline)。
4.如权利要求3所述的生物抗菌肽，可用作食品、水果及蔬菜保鲜剂使用。
5.如权利要求3所述的生物抗菌肽，可用作护肤品及皮肤外用药使用。
生物抗菌肽及其制备方法
本发明涉及一种生物抗菌肽及其制备方法，特别是涉及一种从林蛙蛙皮提取的抗菌肽及其制备方法。
七十年代末期，瑞典科学家Boman首先从惜古比天蚕(HyalopHoracecropia)蛹中经诱导分离纯化了天蚕素(cecropins)，引起了人们的广泛重视，特别是80年代后期以来对抗菌肽的筛选、纯化、结构测定、机理研究、基因克隆和应用研究等方面都取得了显著的进展。1989年Lee等人从猪小肠中发现并纯化了抗菌肽，又有人从牛气管和两栖类中发现并纯化了抗菌肽，说明抗菌肽类化合物是广泛存在的。目前已确定一级结构的抗菌肽有二十几种，可分为有二硫键抗菌肽和不含二硫键的抗菌肽，这些抗菌肽的残基数一般在20-40之间，具有广谱抗细菌、抗病毒和抗癌等重要功能，具有重要的应用价值。
本发明的目的是提供一种制备工艺简单、原料来源广泛、成本低廉、抗菌谱广的生物抗菌肽及其制备方法。
本发明所涉及的生物抗菌肽以林蛙蛙皮为原料，其制备工艺路线如下：1、取林蛙干皮或鲜皮，进行除脂，除肌肉的前处理；2、加少量(1～2ml/g干皮)的缓冲液(0.01～0.5mol/L,pH2.5～7.0的酸性或中性缓冲溶液)，于4℃～80℃溶胀1～24小时；(鲜皮材料无需此步操作)3、鲜皮或溶胀后干皮于组织匀浆器中匀浆；4、加上述缓冲液(10～100ml/g蛙皮)4℃～80℃抽提2～72小时；5、3000～10000r.p.m,5～30min离心，收集上清，对沉淀物可重复操作4,5步骤2～3次；6、合并上清液，加(NH4)2SO4沉淀，(NH4)2SO4终浓度为20～80％；或沸水浴5～10min；7、4000～20000r.p.m,10～30min离心，收集上清液；8、对上清液透析24～72小时除盐；9、透析后上清液超滤浓缩(超滤膜分子量截留值为1000Da)或冻干浓缩；10、浓缩液上CM-纤维素柱，平衡液为pH4.0～5.0,0.01～0.1mol/L NaAc-HAc缓冲液，洗脱液为pH5.0～5.5,0.1～0.5mol/LNaAc～HAc缓冲液，进行梯度洗脱，收集活力峰；11、活力峰超滤浓缩(超滤膜分子量截留值为1000Da)或冻干浓缩；12、浓缩液上Sephadex G-25/G-50柱，洗脱条件为pH6.0～7.0,0.01～0.1mol/L磷酸缓冲液，收集活力峰；13、活力峰超滤浓缩(超滤膜分子量截留值为1000Da)或冻干浓缩；14、浓缩液上制备型HPLC,10～80％乙腈(0.01％TFA)洗脱，或梯度洗脱，收集活力峰；15、活力峰冻干，于零下20℃保存，得本发明所说的从林蛙蛙皮制备的抗菌肽。
本抗菌肽具有如下性能：(一)生化特性：1、热稳定性林蛙皮抗菌肽80℃ 5小时不失活，100℃ 10min仍有活力；2、pH值稳定性在pH2～13范围内活力稳定，最适pH值为pH6.4；3、非极性体系稳定性抗菌肽在15％六氟异丙醇中呈稳定的α-螺旋构象，在磷脂脂质体中也呈稳定α-螺旋构象；4、等电点采用pH值调节测吸光度法测定蛙皮抗菌肽的pI值：pI值为8.0～10.5的碱性多肽；5、分子量采用凝胶过滤层析法、聚丙烯酰氨垂直板电泳法及激光解吸电离飞行时间质谱法，测得本抗菌肽的分子量为4～6KD；6、氨基酸组成：用6N HCl于100～120℃下在真空安瓿瓶内水解10～24小时，水解后除去过量盐酸，于HITACHI 835-50氨基酸自动分析仪上测定抗菌肽含有氨基酸种类为：天门冬氨酸(Aspartic acid)；苏氨酸(Threonine)；丝氨酸(Serine)；谷氨酸(Glutamic acid)；甘氨酸(Glycine)；丙氨酸(Alanine)；半胱氨酸(Cystine)；缬氨酸(Valine)；甲硫氨酸(Methionine)；异亮氨酸(Isoleucine)；亮氨酸(Leucine)；酪氨酸(Tyrosine)；苯丙氨酸(Phenylalanine)；赖氨酸(Lysine)；组氨酸(Histidine)；精氨酸(Arginine)；脯氨酸(Proline)。
(二)生理活性采用两种方法测定抗菌肽的生理活性
1、液体比浊法将处于对数生长期的菌液预冷后，3000r.p.m离心10分钟得菌体，用pH7.0、0.2M磷酸缓冲液洗去残余培养基后，将菌体悬浮于pH7.0、0.2M磷酸缓冲液中，使OD值为0.3～0.4，按2ml/管加入菌液，并加入适量的待测样，设立阳性、阴性对照，混匀后，37℃摇床培养45分钟，冰浴10分钟。
λ600nm处测OD值根据μ2=(A0-A)/A计算抑菌活力μ：活力单位；A0：阴性对照OD值；A：样品管OD值。
2、抑菌圈法用相同大小滤纸片分别加入不等量抗菌肽，晾干后，置于涂菌液的培养皿内，24小时后观察结果，以抑菌圈大小来测定抑菌活力。
3、实验结果经测定，林蛙皮抗菌肽可广泛抑制多种革兰氏阳性、阴性细菌及真菌，下表给出了几种细菌的最低抑菌浓度。
最小抑菌浓度(μg/ml)
(三)水果保鲜试验A组：选取草莓6枚，水洗后室温放置(标记为A1～A6)；B组：选取草莓4枚，水洗后喷抗菌肽蛙皮初提液(相当于步骤5得到的抗菌肽)(标记为B1～B4)；C组：选取草莓4枚，水洗后喷步骤15后得到的抗菌肽(标记为C1～C4)。
试验结果如下(单位：小时)：
生理活性试验及水果保鲜试验表明：本发明的生物抗菌肽可广泛地用于食品、水果保鲜，护肤品等领域。
本抗菌肽来源于生物，是一种小肽分子，属天然物质，且水溶性极好，用于水果保鲜，抗菌肽会形成一层无色保护膜，隔绝空气的接触并能杀死水果表面的细菌，从而达到水果保鲜保水的目的，对水果的色香味影响不明显。
抗菌肽对于皮肤上存在的各种细菌具有高效杀伤作用，如铜绿假单孢菌，其活性比溶菌酶还高，抗菌肽制剂应用于皮肤消毒，具有对皮肤无损害，杀菌效果好的优点。应用于护肤品中，由于其特有的杀菌性及高稳定性，可以在护肤同时得到杀菌的效果，对于常见的皮肤病如青春痘、粉刺等有一定的疗效。
可以看出，本发明的生物抗菌肽具有制备工艺简单，抗菌谱广，抗菌效果好，稳定性高等优点。
下面举例说明本发明生物抗菌肽的制备：实施例1：1、取林蛙干皮1g，除脂除肌肉；2、加2ml 0.01mol/L、pH2.5柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液，于4℃溶胀24小时；3、溶胀蛙皮匀浆；4、加10ml步骤2所述的缓冲液，进行抽提，于4℃抽提72小时；5、3000r.p.m,30min离心，收集上清；沉淀重抽提两次；
6、上清液加(NH4)2SO4沉淀，至终浓度为20％；7、4000r.p.m,30min离心，收集上清液；8、上清液透析24小时；9、上清液超滤浓缩；10、浓缩液上CM-纤维素柱，pH4.0、0.01mol/L NaAc-HAc缓冲液平衡，以pH5.0、0.1～0.5mol/L NaAc-HAc缓冲液梯度洗脱，收集活力峰；11、活力峰冻干浓缩；12、浓缩液上Sephadex G25柱，pH6.0、0.01mol/L NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液洗脱，收集活力峰；13、活力峰冻干浓缩；14、浓缩液上半制备型HPLC(Sepherisorb C1810μ),10％乙腈(0.01％TFA)洗脱，收集活力峰；15、活力峰冻干于零下20℃保存。
产率：2.7mg/g干皮。
实施例2：取林蛙干皮1g，前处理后加入2ml、0.5mol/L、pH7.0 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，80℃溶胀1小时，匀浆后加入100ml上面所述的缓冲液进行抽提，于80℃抽提2小时，10000r.p.m、10min离心，收集上清液，上清液加入(NH4)2SO4沉淀，(NH4)2SO4终浓度为80％，20000r.p.m、离心10min，收集上清液，透析72小时除盐，上清液冻干浓缩；浓缩液上CM-纤维素柱，以pH5.0、0.1mol/L NaAc-HAc缓冲液平衡，以pH5.5、0.1～0.5mol/L NaAc-HAc缓冲液梯度洗脱，收集活力峰，活力峰冻干浓缩；浓缩液上Sephadex G50柱，洗脱条件为pH7.0、0.1mol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液，收集活力峰冻干浓缩；浓缩液上半制备HPLC(Sepherisorb C1810μ)，80％乙腈(0.01％TFA)洗脱，收集活力峰；冻干于零下20℃保存。
产率：1.9mg/g干皮。
实施例3：1、取林蛙干皮1g，除脂除肌肉前处理；2、加2ml、0.2mol/L、pH5.0 NaAc-HAc缓冲液，于40℃溶胀4小时；3、匀浆；4、加50ml步骤2所述的缓冲液进行抽提，70℃抽提4小时；5、6000r.p.m,15min离心，沉淀反复抽提两次；6、沸水浴10min；
7、18000r.p.m,15min离心，收集上清液；8、上清液透析36小时除盐；9、上清液超滤浓缩；10、浓缩液上CM-纤维素柱，平衡液为pH4.0、0.05mol/LNaAc-HAc缓冲液，以pH5.1、0.2～0.5mol/L NaAc-HAc缓冲液梯度洗脱，收集活力峰；11、活力峰超滤浓缩；12、浓缩液上Sephadex G25柱，pH6.4、0.05mol/L NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液洗脱，收集活力峰；13、活力峰超滤浓缩；14、浓缩液上半制备型HPLC(Sepherisorb C1810μ),20～80％乙腈(0.01％TFA)梯度洗脱，收集活力峰；15、冻干于零下20℃保存。
产率：3.5mg/g干皮
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