一种适用于3D生物打印的水凝胶墨水的制备方法
阅读：863发布：2023-02-03
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1.一种适用于3D生物打印的水凝胶墨水的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
步骤1、将壳聚糖衍生物溶于细胞培养基中，并在0℃～4℃的冰水浴条件下冷冻15min～30min，之后向细胞培养基中加入Pluronic F127衍生物，得到混合液，之后再将混合液采用离心处理，使固液分离，将得到的固体物质在4℃～8℃的条件下冷藏，备用；
壳聚糖衍生物、细胞培养基、Pluronic F127衍生物的质量比为2～15：100：20～40；
步骤2、制备多糖交联剂培养基溶液，具体为：
步骤2.1，将天然多糖溶于去离子水中，搅拌均匀，加入高碘酸钠，在避光条件下搅拌4h～6h，之后在加入乙二醇，在避光条件下继续搅拌2h～3h，得到混合液b；
步骤2.2，将经步骤1后得到的混合液b装入分子量为3000～8000的透析袋中透析3天～
5天，之后于-60℃～-70℃的条件下冷冻干燥48h～72h，得到多糖交联剂，最后，将多糖交联剂在-18℃～-25℃的条件下冷藏，备用；
步骤2.3，将经步骤2.2后得到的多糖交联剂溶于细胞培养基中，得到质量百分浓度为
1％～10％的多糖交联剂培养基溶液；
步骤3，制备水凝胶墨水；
具体为：将经步骤1后得到的固体物质于30℃～37℃的条件下放置1min～5min，得到水凝胶前驱体，之后将水凝胶前驱体浸入多糖交联剂培养基溶液中，稳定交联15min～30min，即可得到水凝胶墨水；
水凝胶前驱体与多糖交联剂培养基溶液的体积比为1～2：5～10。
2.根据权利要求1所述的一种适用于3D生物打印的水凝胶墨水的制备方法，其特征在于，所述步骤1和步骤2中，细胞培养基为均高糖DMEM细胞培养基、低糖DMEM细胞培养基或者DMEM/F12细胞培养基。
3.根据权利要求1所述的一种适用于3D生物打印的水凝胶墨水的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，壳聚糖衍生物为甲基丙酰化壳聚糖、羟乙基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、羟丁基壳聚糖中的任意一种。
4.根据权利要求3所述的一种适用于3D生物打印的水凝胶墨水的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酰化壳聚糖的制备方法，具体为：
将壳聚糖溶解于乙酸水溶液中，搅拌均匀，加入甲基丙烯酸酐，之后置于0～4℃的条件下反应4h～6h，得到甲基丙烯酰化的多糖溶液，之后将甲基丙烯酰化的多糖溶液装入分子量为3000～7000的透析袋中透析5～7天，之后在-55℃～-60℃的条件下冷冻干燥48～72h，最后在-18～-25℃的条件下冷藏，备用；
壳聚糖、乙酸水溶液和甲基丙烯酸酐的质量比为1：100：1～2；
乙酸水溶液中，乙酸与水的体积比为1：50～100。
5.根据权利要求3所述的一种适用于3D生物打印的水凝胶墨水的制备方法，其特征在于，所述羟丁基壳聚糖的制备方法，具体为：
将壳聚糖粉末分散于质量分数45～55％的NaOH水溶液中进行碱化处理，氮气保护下室温搅拌24～36h，过滤，加入异丙醇搅拌24～36h，以使碱化壳聚糖在异丙醇体系中完全分散开，之后向反应容器滴入1，2-环氧丁烷，室温反应5～7天，待反应结束后，采用丙酮沉淀反应物，过滤，将沉淀物洗涤至pH为中性，在40℃～50℃的条件下真空干燥12～24h；
壳聚糖粉末、NaOH水溶液、异丙醇、1,2-环氧丁烷、丙酮的质量比为1：6～8：20～30：20～30：500～800。
6.根据权利要求1所述的一种适用于3D生物打印的水凝胶墨水的制备方法，其特征在于，所述Pluronic F127衍生物为丙烯化F127或者氨基化F127。
7.根据权利要求6所述的一种适用于3D生物打印的水凝胶墨水的制备方法，其特征在于，所述丙烯化F127的制备方法，具体为：
将Pluronic F127溶解于无水二氯甲烷中，并置于0℃的冰水浴中，加入三乙胺，通入氮气保护15min，得到混合液a，按每秒1～2滴的速度向混合液a中滴加丙烯酰氯，之后置于冰水浴中反应36～48h，得到反应混合液，再将反应混合液进行过滤，除去滤渣，得到反应液，最后向反应液中加入石油醚，沉淀15～30min，将得到的固体物质置于25～35℃的真空干燥箱中干燥12～24h，得到丙烯化F127；
Pluronic F127、无水二氯甲烷和三乙胺的摩尔比为1：5～10：10；
丙烯酰氯与混合液a的质量比为1～2：10；
反应液与石油醚的体积比为1：10～15。
8.根据权利要求6所述的一种适用于3D生物打印的水凝胶墨水的制备方法，其特征在于，所述氨基化F127的制备方法，具体为：
将F127、N'N-羰基二咪唑(CDI)和二氯甲烷溶液混合，室温搅拌8～12h，之后向溶液中缓慢的加入乙醚，搅拌10～20min，以稀释二氯甲烷溶液并移除过量的N'N-羰基二咪唑，静置10～20min后得到沉淀物，抽滤沉淀物并用氮气流干燥，得到CDI活化的F127；在氮气保护的条件下，将CDI活化的F127溶解于二氯甲烷中，以每秒钟1～2滴的速度缓慢滴加氯仿混合溶液，室温搅拌8h，再将溶液缓慢加入到乙醚溶液中，经过两次沉淀后，在40℃～50℃的条件下真空干燥12～24h，得到氨基化F127；得到氨基化F127；
F127、N'N-羰基二咪唑(CDI)、二氯甲烷、乙醚的质量比为1：1～3：10～15：100～200；
CDI活化的F127、二氯甲烷、氯仿混合液、乙醚的质量比为1：10～15：10～15：100～200；
氯仿混合液由质量比为1：10～15的1，6-己二胺与氯仿混合而成。
9.根据权利要求1所述的一种适用于3D生物打印的水凝胶墨水的制备方法，其特征在于，所述步骤2.1中，天然多糖、去离子水和高碘酸钠的质量比为0.5～2：100：1～2；天然多糖为硫酸软骨素、透明质酸、透明质酸钠、葡聚糖、果胶中的任意一种。
一种适用于3D生物打印的水凝胶墨水的制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于水凝胶墨水材料制备技术领域，具体涉及一种适用于3D生物打印的水凝胶墨水的制备方法。
背景技术
[0002] 3D生物打印是利用增材制造原理定位组装生物材料、细胞单元，制造组织工程支架和组织器官等制品的重要技术手段。3D生物打印的关键核心在于打印墨水材料，“水凝胶”支架类似于生物体细胞外基质结构，可原位负载细胞，是理想的3D打印生物墨水。3D打印水凝胶生物墨水具备四个基本特征：(1)可调节的粘度；粘度是阻碍水凝胶前驱体溶胶流动的阻力，可调的粘度对设计适合的打印方式，打印参数区间以及延缓结构形变具有重要意义；(2)优异的剪切变稀性能；剪切变稀是高分子水凝胶体系的粘度随剪切应力的增大而降低，而当应力卸载后，粘度可缓慢恢复的现象，剪切变稀有利于水凝胶墨水从喷头中挤出；(3)快速的自愈合能力；快速自愈合要求打印过程中被破坏的水凝胶能够通过物理或化学作用自我修复，有利于提高结构保真度；(4)保证结构稳定的力学强度；适宜的力学强度一方面能阻止打印结构的塌缩，维持结构稳定性；此外，在适当打印条件下，打印墨水以塞流形式挤出，保护细胞，免受剪切力损伤，并能防止细胞在打印期间沉降，保证分散均匀性。然而，由于快速凝胶化过程涉及物理化学强作用，且光交联存在引发剂或UV光等有害因素，不利于细胞的负载和生长，成为广泛应用的矛盾所在。
[0003] 水凝胶生物墨水可由合成高分子、天然高分子以及生物蛋白分子等制备，如Pluronic F127，聚乙二醇，聚甲基丙烯酸羟乙酯，聚乙烯醇，壳聚糖，海藻酸钠，透明质酸钠，蛛丝蛋白，胶原，明胶等。PluronicF127是聚氧乙烯-聚氧丙烯醚-聚氧乙烯组成的三嵌段共聚物，无生理活性，无溶血性，对皮肤无刺激性，毒性小，是FDA批准的体内应用生物材料。当高于临界胶束浓度和临界胶束温度时，Pluronic F127在水溶液中自组装形成胶束，质量浓度升高10％，可聚集形成温敏型凝胶，20％～35％的Pluronic F127可用于注射型3D生物打印。然而，温敏可逆Pluronic F127水凝胶在体外只能存在数小时，即可被细胞培养液稀释溶解，无法保持长期稳定结构，严重限制了作为3D生物打印墨水的应用。
[0004] 为了发挥Pluronic F127的温敏性溶胶-凝胶转变优势，解决其生理环境稳定性成为关键问题。目前的解决方案主要是利用化学反应或超分子作用将其绑定于三维网络中，例如，中国专利《一种高强度可生物降解超分子水凝胶的制备方法》(申请号：200810048066.2)公开了一种利用Pluronic嵌段共聚物与辛酸亚锡为作为共化学引发剂制备可光聚合的大分子单体的方法，以紫外光触发大分子单体凝胶前驱体制备了高强度、可降解、温度响应的超分子水凝胶。中国专利《一种两亲性多糖衍生物/泊洛沙姆温敏型原位水凝胶及其制备方法》(申请号)公开了一种由两亲性多糖衍生物和Pluronic系列聚合物，以及疏水性药物发生相互作用形成了稳定的原位水凝胶，其凝胶化温度为34～37℃，凝胶化时间1～3分钟。与普通的多糖/Pluronic F127原位水凝胶相比，该方法制备的原位水凝胶稳定性更高、药物缓释时间更长。上述化学引发聚合和超分子作用凝胶化技术在一定程度上实现了Pluronic F127的结构稳定性，但这些技术中均没有考虑到体外细胞培养、体内生理环境的温度(37℃)、pH(7.2～7.4)以及存在的多种氨基酸、蛋白质等营养物质之间的相互作用。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种适用于3D生物打印的水凝胶墨水的制备方法，解决了现有水凝胶墨水结构稳定性差的问题。
[0006] 本发明所采用的技术方案是，一种适用于3D生物打印的水凝胶墨水的制备方法，具体按照以下步骤实施：
[0007] 步骤1、将壳聚糖衍生物溶于细胞培养基中，并在0℃～4℃的冰水浴条件下冷冻15min～30min，之后向细胞培养基中加入PluronicF127衍生物，得到混合液，之后再将混合液采用离心处理，使固液分离，将得到的固体物质在4℃～8℃的条件下冷藏，备用；
[0008] 壳聚糖衍生物、细胞培养基、Pluronic F127衍生物的质量比为2～15：100：20～40；
[0009] 步骤2、制备多糖交联剂培养基溶液，具体为：
[0010] 步骤2.1，将天然多糖溶于去离子水中，搅拌均匀，加入高碘酸钠，在避光条件下搅拌4h～6h，之后在加入乙二醇，在避光条件下继续搅拌2h～3h，得到混合液b；
[0011] 步骤2.2，将经步骤1后得到的混合液b装入分子量为3000～8000的透析袋中透析3天～5天，之后于-60℃～-70℃的条件下冷冻干燥48h～72h，得到多糖交联剂，最后，将多糖交联剂在-18℃～-25℃的条件下冷藏，备用；
[0012] 步骤2.3，将经步骤2.2后得到的多糖交联剂溶于细胞培养基中，得到质量百分浓度为1％～10％的多糖交联剂培养基溶液；
[0013] 步骤3，制备水凝胶墨水；
[0014] 具体为：将经步骤1后得到的固体物质于30℃～37℃的条件下放置1min～5min，得到水凝胶前驱体，之后将水凝胶前驱体浸入多糖交联剂培养基溶液中，稳定交联15min～30min，即可得到水凝胶墨水；
[0015] 水凝胶前驱体与多糖交联剂培养基溶液的体积比为1～2：5～10。
[0016] 本发明的特点还在于：
[0017] 步骤1和步骤2中，细胞培养基为均高糖DMEM细胞培养基、低糖DMEM细胞培养基或者DMEM/F12细胞培养基。
[0018] 步骤1中，壳聚糖衍生物为甲基丙酰化壳聚糖、羟乙基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、羟丁基壳聚糖中的任意一种。
[0019] 甲基丙烯酰化壳聚糖的制备方法，具体为：
[0020] 将壳聚糖溶解于乙酸水溶液中，搅拌均匀，加入甲基丙烯酸酐，之后置于0～4℃的条件下反应4h～6h，得到甲基丙烯酰化的多糖溶液，之后将甲基丙烯酰化的多糖溶液装入分子量为3000～7000的透析袋中透析5～7天，之后在-55℃～-60℃的条件下冷冻干燥48～72h，最后在-18～-25℃的条件下冷藏，备用；
[0021] 壳聚糖、乙酸水溶液和甲基丙烯酸酐的质量比为1：100：1～2；
[0022] 乙酸水溶液中，乙酸与水的体积比为1：50～100。
[0023] 羟丁基壳聚糖的制备方法，具体为：
[0024] 将壳聚糖粉末分散于质量分数45～55％的NaOH水溶液中进行碱化处理，氮气保护下室温搅拌24～36h，过滤，加入异丙醇搅拌24～36h，以使碱化壳聚糖在异丙醇体系中完全分散开，之后向反应容器滴入1，2-环氧丁烷，室温反应5～7天，待反应结束后，采用丙酮沉淀反应物，过滤，将沉淀物洗涤至pH为中性，在40℃～50℃的条件下真空干燥12～24h；
[0025] 壳聚糖粉末、NaOH水溶液、异丙醇、1,2-环氧丁烷、丙酮的质量比为1：6～8：20～30：20～30：500～800。
[0026] Pluronic F127衍生物为丙烯化F127或者氨基化F127。
[0027] 丙烯化F127的制备方法，具体为：
[0028] 将Pluronic F127溶解于无水二氯甲烷中，并置于0℃的冰水浴中，加入三乙胺，通入氮气保护15min，得到混合液a，按每秒1～2滴的速度向混合液a中滴加丙烯酰氯，之后置于冰水浴中反应36～48h，得到反应混合液，再将反应混合液进行过滤，除去滤渣，得到反应液，最后向反应液中加入石油醚，沉淀15～30min，将得到的固体物质置于25～35℃的真空干燥箱中干燥12～24h，得到丙烯化F127；
[0029] Pluronic F127、无水二氯甲烷和三乙胺的摩尔比为1：5～10：10；
[0030] 丙烯酰氯与混合液a的质量比为1～2：10；
[0031] 反应液与石油醚的体积比为1：10～15。
[0032] 氨基化F127的制备方法，具体为：
[0033] 将F127、N'N-羰基二咪唑(CDI)和二氯甲烷溶液混合，室温搅拌8～12h，之后向溶液中缓慢的加入乙醚，搅拌10～20min，以稀释二氯甲烷溶液并移除过量的N'N-羰基二咪唑，静置10～20min后得到沉淀物，抽滤沉淀物并用氮气流干燥，得到CDI活化的F127；在氮气保护的条件下，将CDI活化的F127溶解于二氯甲烷中，以每秒钟1～2滴的速度缓慢滴加氯仿混合溶液，室温搅拌8h，再将溶液缓慢加入到乙醚溶液中，经过两次沉淀后，在40℃～50℃的条件下真空干燥12～24h，得到氨基化F127；得到氨基化F127；
[0034] F127、N'N-羰基二咪唑(CDI)、二氯甲烷、乙醚的质量比为1：1～3：10～15：100～200；
[0035] CDI活化的F127、二氯甲烷、氯仿混合液、乙醚的质量比为1：10～15：10～15：100～200；
[0036] 氯仿混合液由质量比为1：10～15的1，6-己二胺与氯仿混合而成。
[0037] 步骤2.1中，天然多糖、去离子水和高碘酸钠的质量比为0.5～2：100：1～2；天然多糖为硫酸软骨素、透明质酸、透明质酸钠、葡聚糖、果胶中的任意一种。
[0038] 本发明的有益效果在于：
[0039] 该方法利用壳聚糖或其衍生物与天然多糖交联剂反应，既提高了水凝胶墨水的结构稳定性，又实现了多糖分子的功能化修饰，丰富了该墨水的生物学用途。
具体实施方式
[0040] 下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
[0041] 一种适用于3D生物打印的水凝胶墨水的制备方法，具体按照以下步骤实施：
[0042] 步骤1、将壳聚糖衍生物溶于细胞培养基中，并在0℃～4℃的冰水浴条件下冷冻15min～30min，之后向细胞培养基中加入PluronicF127衍生物，得到混合液，之后再将混合液采用离心处理，使固液分离，将得到的固体物质在4℃～8℃的条件下冷藏，备用；
[0043] 细胞培养基为高糖DMEM细胞培养基、低糖DMEM细胞培养基或者DMEM/F12细胞培养基；
[0044] 壳聚糖衍生物、细胞培养基、Pluronic F127衍生物的质量比为2～15：100：20～40；
[0045] 离心速率为500rpm～1000rpm，离心时间为3min～5min；
[0046] 壳聚糖衍生物为甲基丙酰化壳聚糖、羟乙基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、羟丁基壳聚糖中的任意一种；
[0047] 其中，羟乙基壳聚糖的生产厂家为武汉远成共创科技有限公司，羟乙基取代度为85％，粘度为400mPa·s；
[0048] 羟丙基壳聚糖的生产厂家为武汉市恒沃科技有限公司，羟丙基取代度大于70％，粘度小于200mPa·s；
[0049] 甲基丙烯酰化壳聚糖的制备方法，具体为：
[0050] 将壳聚糖溶解于乙酸水溶液中，搅拌均匀，加入甲基丙烯酸酐，之后置于0～4℃的条件下反应4h～6h，得到甲基丙烯酰化的多糖溶液，之后将甲基丙烯酰化的多糖溶液装入分子量为3000～7000的透析袋中透析5～7天，之后在-55℃～-60℃的条件下冷冻干燥48～72h，最后在-18～-25℃的条件下冷藏，备用；
[0051] 壳聚糖、乙酸水溶液和甲基丙烯酸酐的质量比为1：100：1～2；
[0052] 乙酸水溶液中，乙酸与水的体积比为1：50～100；
[0053] 羟丁基壳聚糖的制备方法，具体为：
[0054] 将壳聚糖粉末分散于质量分数45～55％的NaOH水溶液中进行碱化处理，氮气保护下室温搅拌24～36h，过滤，加入异丙醇搅拌24～36h，以使碱化壳聚糖在异丙醇体系中完全分散开，之后向反应容器滴入1，2-环氧丁烷，室温反应5～7天，待反应结束后，采用丙酮沉淀反应物，过滤，将沉淀物洗涤至pH为中性，在40℃～50℃的条件下真空干燥12～24h；
[0055] 壳聚糖粉末、NaOH水溶液、异丙醇、1,2-环氧丁烷、丙酮的质量比为1：6～8：20～30：20～30：500～800；
[0056] Pluronic F127衍生物为丙烯化F127或者氨基化F127；
[0057] 其中，丙烯化F127的制备方法，具体为：
[0058] 将Pluronic F127溶解于无水二氯甲烷中，并置于0℃的冰水浴中，加入三乙胺，通入氮气保护15min，得到混合液a，按每秒1～2滴的速度向混合液a中滴加丙烯酰氯，之后置于冰水浴中反应36～48h，得到反应混合液，再将反应混合液进行过滤，除去滤渣，得到反应液，最后向反应液中加入石油醚，沉淀15～30min，将得到的固体物质置于25～35℃的真空干燥箱中干燥12～24h，得到丙烯化F127；
[0059] Pluronic F127、无水二氯甲烷和三乙胺的摩尔比为1：5～10：10；
[0060] 丙烯酰氯与混合液a的质量比为1～2：10；
[0061] 反应液与石油醚的体积比为1：10～15；
[0062] 氨基化F127的制备方法，具体为：
[0063] 将F127、N'N-羰基二咪唑(CDI)和二氯甲烷溶液混合，室温搅拌8～12h，之后向溶液中缓慢的加入乙醚，搅拌10～20min，以稀释二氯甲烷溶液并移除过量的N'N-羰基二咪唑，静置10～20min后得到沉淀物，抽滤沉淀物并用氮气流干燥，得到CDI活化的F127；在氮气保护的条件下，将CDI活化的F127溶解于二氯甲烷中，以每秒钟1～2滴的速度缓慢滴加氯仿混合溶液，室温搅拌8h，再将溶液缓慢加入到乙醚溶液中，经过两次沉淀后，在40℃～50℃的条件下真空干燥12～24h，得到氨基化F127；得到氨基化F127；
[0064] F127、N'N-羰基二咪唑(CDI)、二氯甲烷、乙醚的质量比为1：1～3：10～15：100～200；
[0065] CDI活化的F127、二氯甲烷、氯仿混合液、乙醚的质量比为1：10～15：10～15：100～200；
[0066] 氯仿混合液由质量比为1：10～15的1，6-己二胺与氯仿混合而成；
[0067] 步骤2、制备多糖交联剂培养基溶液，具体为：
[0068] 步骤2.1，将天然多糖溶于去离子水中，搅拌均匀，加入高碘酸钠，在避光条件下搅拌4h～6h，之后在加入乙二醇，在避光条件下继续搅拌2h～3h，得到混合液b；
[0069] 天然多糖、去离子水和高碘酸钠的质量比为0.5～2：100：1～2；
[0070] 天然多糖为硫酸软骨素、透明质酸、透明质酸钠、葡聚糖、果胶中的任意一种；
[0071] 步骤2.2，将经步骤1后得到的混合液b装入分子量为3000～8000的透析袋中透析3天～5天，之后于-60℃～-70℃的条件下冷冻干燥48h～72h，得到多糖交联剂，最后，将多糖交联剂在-18℃～-25℃的条件下冷藏，备用；
[0072] 步骤2.3，将经步骤2.2后得到的多糖交联剂溶于细胞培养基中，得到质量百分浓度为1％～10％的多糖交联剂培养基溶液；
[0073] 细胞培养基为高糖DMEM细胞培养基、低糖DMEM细胞培养基或者DMEM/F12细胞培养基；
[0074] 步骤3，制备水凝胶墨水；
[0075] 具体为：将经步骤1后得到的固体物质于30℃～37℃的条件下放置1min～5min，得到水凝胶前驱体，之后将水凝胶前驱体浸入多糖交联剂培养基溶液中，稳定交联15min～30min，即可得到水凝胶墨水；
[0076] 水凝胶前驱体与多糖交联剂培养基溶液的体积比为1～2：5～10。
[0077] 实施例1
[0078] 一种适用于3D生物打印的水凝胶墨水的制备方法，具体按照以下步骤实施：
[0079] 步骤1、将甲基丙酰化壳聚糖溶于高糖DMEM细胞培养基中，并在0℃的冰水浴条件下冷冻15min，之后向细胞培养基中加入丙烯化F127，得到混合液，之后再将混合液采用离心处理，使固液分离，将得到的固体物质在4℃的条件下冷藏，备用；
[0080] 甲基丙酰化壳聚糖、高糖DMEM细胞培养基、丙烯化F127的质量比为2：100：20；
[0081] 离心速率为500rpm，离心时间为3min；
[0082] 甲基丙烯酰化壳聚糖的制备方法，具体为：
[0083] 将壳聚糖溶解于乙酸水溶液中，搅拌均匀，加入甲基丙烯酸酐，之后置于0℃的条件下反应4h，得到甲基丙烯酰化的多糖溶液，之后将甲基丙烯酰化的多糖溶液装入分子量为3000的透析袋中透析5天，之后在-55℃的条件下冷冻干燥48h，最后在-18℃的条件下冷藏，备用；
[0084] 壳聚糖、乙酸水溶液和甲基丙烯酸酐的质量比为1：100：1；
[0085] 乙酸水溶液中，乙酸与水的体积比为1：50；
[0086] 其中，丙烯化F127的制备方法，具体为：
[0087] 将Pluronic F127溶解于无水二氯甲烷中，并置于0℃的冰水浴中，加入三乙胺，通入氮气保护15min，得到混合液a，按每秒1滴的速度向混合液a中滴加丙烯酰氯，之后置于冰水浴中反应36h，得到反应混合液，再将反应混合液进行过滤，除去滤渣，得到反应液，最后向反应液中加入石油醚，沉淀15min，将得到的固体物质置于25℃的真空干燥箱中干燥12h，得到丙烯化F127；
[0088] Pluronic F127、无水二氯甲烷和三乙胺的摩尔比为1：5：10；
[0089] 丙烯酰氯与混合液a的质量比为1：10；
[0090] 反应液与石油醚的体积比为1：10；
[0091] 步骤2、制备多糖交联剂培养基溶液，具体为：
[0092] 步骤2.1，将硫酸软骨素溶于去离子水中，搅拌均匀，加入高碘酸钠，在避光条件下搅拌4h，之后在加入乙二醇，在避光条件下继续搅拌2h，得到混合液b；
[0093] 硫酸软骨素、去离子水和高碘酸钠的质量比为0.5：100：1；
[0094] 步骤2.2，将经步骤1后得到的混合液b装入分子量为3000的透析袋中透析3天，之后于-60℃的条件下冷冻干燥48h，得到多糖交联剂，最后，将多糖交联剂在-18℃的条件下冷藏，备用；
[0095] 步骤2.3，将经步骤2.2后得到的多糖交联剂溶于高糖DMEM细胞培养基中，得到质量百分浓度为1％的多糖交联剂培养基溶液；
[0096] 步骤3，制备水凝胶墨水；
[0097] 具体为：将经步骤1后得到的固体物质于30℃的条件下放置1min，得到水凝胶前驱体，之后将水凝胶前驱体浸入多糖交联剂培养基溶液中，稳定交联15min，即可得到水凝胶墨水；
[0098] 水凝胶前驱体与多糖交联剂培养基溶液的体积比为1：5。
[0099] 实施例2
[0100] 一种适用于3D生物打印的水凝胶墨水的制备方法，具体按照以下步骤实施：
[0101] 步骤1、将羟乙基壳聚糖溶于低糖DMEM细胞培养基中，并在1℃的冰水浴条件下冷冻20min，之后向细胞培养基中加入氨基化F127，得到混合液，之后再将混合液采用离心处理，使固液分离，将得到的固体物质在4℃的条件下冷藏，备用；
[0102] 羟乙基壳聚糖、细胞培养基、氨基化F127的质量比为5：100：25；
[0103] 离心速率为800rpm，离心时间为3min；
[0104] 其中，羟乙基壳聚糖的生产厂家为武汉远成共创科技有限公司，羟乙基取代度为85％，粘度为400mPa·s；
[0105] 氨基化F127的制备方法，具体为：
[0106] 将F127、N'N-羰基二咪唑(CDI)和二氯甲烷溶液混合，室温搅拌8h，之后向溶液中缓慢的加入乙醚，搅拌10min，以稀释二氯甲烷溶液并移除过量的N'N-羰基二咪唑，静置10min后得到沉淀物，抽滤沉淀物并用氮气流干燥，得到CDI活化的F127；在氮气保护的条件下，将CDI活化的F127溶解于二氯甲烷中，以每秒钟1滴的速度缓慢滴加氯仿混合溶液，室温搅拌8h，再将溶液缓慢加入到乙醚溶液中，经过两次沉淀后，在40℃的条件下真空干燥12h，得到氨基化F127；得到氨基化F127；
[0107] F127、N'N-羰基二咪唑(CDI)、二氯甲烷、乙醚的质量比为1：1：10：100；
[0108] CDI活化的F127、二氯甲烷、氯仿混合液、乙醚的质量比为1：10：10：100；
[0109] 氯仿混合液由质量比为1：10的1，6-己二胺与氯仿混合而成；
[0110] 步骤2、制备多糖交联剂培养基溶液，具体为：
[0111] 步骤2.1，将透明质酸溶于去离子水中，搅拌均匀，加入高碘酸钠，在避光条件下搅拌5h，之后在加入乙二醇，在避光条件下继续搅拌3h，得到混合液b；
[0112] 透明质酸、去离子水和高碘酸钠的质量比为0.5：100：2；
[0113] 步骤2.2，将经步骤1后得到的混合液b装入分子量为4000的透析袋中透析3天，之后于-60℃的条件下冷冻干燥48h，得到多糖交联剂，最后，将多糖交联剂在-18℃的条件下冷藏，备用；
[0114] 步骤2.3，将经步骤2.2后得到的多糖交联剂溶于低糖DMEM细胞培养基中，得到质量百分浓度为5％的多糖交联剂培养基溶液；
[0115] 步骤3，制备水凝胶墨水；
[0116] 具体为：将经步骤1后得到的固体物质于35℃的条件下放置3min，得到水凝胶前驱体，之后将水凝胶前驱体浸入多糖交联剂培养基溶液中，稳定交联20min，即可得到水凝胶墨水；
[0117] 水凝胶前驱体与多糖交联剂培养基溶液的体积比为2：5。
[0118] 实施例3
[0119] 一种适用于3D生物打印的水凝胶墨水的制备方法，具体按照以下步骤实施：
[0120] 步骤1、将羟丙基壳聚糖溶于DMEM/F12细胞培养基中，并在2℃的冰水浴条件下冷冻20min，之后向细胞培养基中加入丙烯化F127，得到混合液a，之后再将混合液采用离心处理，使固液分离，将得到的固体物质在5℃的条件下冷藏，备用；
[0121] 羟丙基壳聚糖、细胞培养基、丙烯化F127的质量比为15：100：30；
[0122] 离心速率为1000rpm，离心时间为5min；
[0123] 羟丙基壳聚糖的生产厂家为武汉市恒沃科技有限公司，羟丙基取代度大于70％，粘度小于200mPa·s；
[0124] 其中，丙烯化F127的制备方法，具体为：
[0125] 将Pluronic F127溶解于无水二氯甲烷中，并置于0℃的冰水浴中，加入三乙胺，通入氮气保护15min，得到混合液a，按每秒2滴的速度向混合液a中滴加丙烯酰氯，之后置于冰水浴中反应40h，得到反应混合液，再将反应混合液进行过滤，除去滤渣，得到反应液，最后向反应液中加入石油醚，沉淀25min，将得到的固体物质置于30℃的真空干燥箱中干燥20h，得到丙烯化F127；
[0126] Pluronic F127、无水二氯甲烷和三乙胺的摩尔比为1：8：10；
[0127] 丙烯酰氯与混合液a的质量比为2：10；
[0128] 反应液与石油醚的体积比为1：15；
[0129] 步骤2、制备多糖交联剂培养基溶液，具体为：
[0130] 步骤2.1，将透明质酸钠溶于去离子水中，搅拌均匀，加入高碘酸钠，在避光条件下搅拌6h，之后在加入乙二醇，在避光条件下继续搅拌3h，得到混合液b；
[0131] 透明质酸钠、去离子水和高碘酸钠的质量比为2：100：1；
[0132] 步骤2.2，将经步骤1后得到的混合液b装入分子量为5000的透析袋中透析4天，之后于-60℃的条件下冷冻干燥48h，得到多糖交联剂，最后，将多糖交联剂在-18℃的条件下冷藏，备用；
[0133] 步骤2.3，将经步骤2.2后得到的多糖交联剂溶于DMEM/F12细胞培养基中，得到质量百分浓度为8％的多糖交联剂培养基溶液；
[0134] 步骤3，制备水凝胶墨水；
[0135] 具体为：将经步骤1后得到的固体物质于37℃的条件下放置5min，得到水凝胶前驱体，之后将水凝胶前驱体浸入多糖交联剂培养基溶液中，稳定交联30min，即可得到水凝胶墨水；
[0136] 水凝胶前驱体与多糖交联剂培养基溶液的体积比为1：8。
[0137] 实施例4
[0138] 一种适用于3D生物打印的水凝胶墨水的制备方法，具体按照以下步骤实施：
[0139] 步骤1、将羟丁基壳聚糖溶于高糖DMEM细胞培养基中，并在4℃的冰水浴条件下冷冻30min，之后向细胞培养基中加入氨基化F127，得到混合液，之后再将混合液采用离心处理，使固液分离，将得到的固体物质在8℃的条件下冷藏，备用；
[0140] 羟丁基壳聚糖、细胞培养基、氨基化F127的质量比为15：100：35；
[0141] 离心速率为8000rpm，离心时间为5min；
[0142] 羟丁基壳聚糖的制备方法，具体为：
[0143] 将壳聚糖粉末分散于质量分数45％的NaOH水溶液中进行碱化处理，氮气保护下室温搅拌24h，过滤，加入异丙醇搅拌24h，以使碱化壳聚糖在异丙醇体系中完全分散开，之后向反应容器滴入1，2-环氧丁烷，室温反应5天，待反应结束后，采用丙酮沉淀反应物，过滤，将沉淀物洗涤至pH为中性，在40℃的条件下真空干燥24h；
[0144] 壳聚糖粉末、NaOH水溶液、异丙醇、1,2-环氧丁烷、丙酮的质量比为1：6：20：20：500；
[0145] 氨基化F127的制备方法，具体为：
[0146] 将F127、N'N-羰基二咪唑(CDI)和二氯甲烷溶液混合，室温搅拌10h，之后向溶液中缓慢的加入乙醚，搅拌15min，以稀释二氯甲烷溶液并移除过量的N'N-羰基二咪唑，静置15min后得到沉淀物，抽滤沉淀物并用氮气流干燥，得到CDI活化的F127；在氮气保护的条件下，将CDI活化的F127溶解于二氯甲烷中，以每秒钟12滴的速度缓慢滴加氯仿混合溶液，室温搅拌8h，再将溶液缓慢加入到乙醚溶液中，经过两次沉淀后，在50℃的条件下真空干燥
24h，得到氨基化F127；得到氨基化F127；
24h，得到氨基化F127；得到氨基化F127；
[0147] F127、N'N-羰基二咪唑(CDI)、二氯甲烷、乙醚的质量比为1：1：10：100；
[0148] CDI活化的F127、二氯甲烷、氯仿混合液、乙醚的质量比为1：10：15：200；
[0149] 氯仿混合液由质量比为1：15的1，6-己二胺与氯仿混合而成；
[0150] 步骤2、制备多糖交联剂培养基溶液，具体为：
[0151] 步骤2.1，将葡聚糖溶于去离子水中，搅拌均匀，加入高碘酸钠，在避光条件下搅拌6h，之后在加入乙二醇，在避光条件下继续搅拌2h，得到混合液b；
[0152] 葡聚糖、去离子水和高碘酸钠的质量比为2：100：1；
[0153] 步骤2.2，将经步骤1后得到的混合液b装入分子量为8000的透析袋中透析3天，之后于-70℃的条件下冷冻干燥72h，得到多糖交联剂，最后，将多糖交联剂在-25℃的条件下冷藏，备用；
[0154] 步骤2.3，将经步骤2.2后得到的多糖交联剂溶于高糖DMEM细胞培养基中，得到质量百分浓度为10％的多糖交联剂培养基溶液；
[0155] 步骤3，制备水凝胶墨水；
[0156] 具体为：将经步骤1后得到的固体物质于37℃的条件下放5min，得到水凝胶前驱体，之后将水凝胶前驱体浸入多糖交联剂培养基溶液中，稳定交联30min，即可得到水凝胶墨水；
[0157] 水凝胶前驱体与多糖交联剂培养基溶液的体积比为1：5。
[0158] 实施例5
[0159] 一种适用于3D生物打印的水凝胶墨水的制备方法，具体按照以下步骤实施：
[0160] 步骤1、将羟乙基壳聚糖溶于低糖DMEM细胞培养基中，并在4℃的冰水浴条件下冷冻30min，之后向细胞培养基中加入丙烯化F127，得到混合液，之后再将混合液采用离心处理，使固液分离，将得到的固体物质在8℃的条件下冷藏，备用；
[0161] 羟乙基壳聚糖、细胞培养基、氨基化F127的质量比为15：100：40；
[0162] 离心速率为1000rpm，离心时间为5min；
[0163] 其中，羟乙基壳聚糖的生产厂家为武汉远成共创科技有限公司，羟乙基取代度为85％，粘度为400mPa·s；
[0164] 其中，丙烯化F127的制备方法，具体为：
[0165] 将Pluronic F127溶解于无水二氯甲烷中，并置于0℃的冰水浴中，加入三乙胺，通入氮气保护15min，得到混合液a，按每秒2滴的速度向混合液a中滴加丙烯酰氯，之后置于冰水浴中反应48h，得到反应混合液，再将反应混合液进行过滤，除去滤渣，得到反应液，最后向反应液中加入石油醚，沉淀30min，将得到的固体物质置于35℃的真空干燥箱中干燥24h，得到丙烯化F127；
[0166] Pluronic F127、无水二氯甲烷和三乙胺的摩尔比为1：10：10；
[0167] 丙烯酰氯与混合液a的质量比为2：10；
[0168] 反应液与石油醚的体积比为1：15；
[0169] 步骤2、制备多糖交联剂培养基溶液，具体为：
[0170] 步骤2.1，将果胶溶于去离子水中，搅拌均匀，加入高碘酸钠，在避光条件下搅拌6h，之后在加入乙二醇，在避光条件下继续搅拌2h，得到混合液b；
[0171] 果胶、去离子水和高碘酸钠的质量比为2：100：2；
[0172] 步骤2.2，将经步骤1后得到的混合液b装入分子量为8000的透析袋中透析5天，之后于-70℃的条件下冷冻干燥72h，得到多糖交联剂，最后，将多糖交联剂在-25℃的条件下冷藏，备用；
[0173] 步骤2.3，将经步骤2.2后得到的多糖交联剂溶于低糖DMEM细胞培养基中，得到质量百分浓度为10％的多糖交联剂培养基溶液；
[0174] 步骤3，制备水凝胶墨水；
[0175] 具体为：将经步骤1后得到的固体物质于37℃的条件下放置5min，得到水凝胶前驱体，之后将水凝胶前驱体浸入多糖交联剂培养基溶液中，稳定交联30min，即可得到水凝胶墨水；
[0176] 水凝胶前驱体与多糖交联剂培养基溶液的体积比为2：8。
[0177] 本发明方法利用壳聚糖或其衍生物与天然多糖交联剂反应，既提高了水凝胶的结构稳定性，又实现了多糖分子的功能化修饰，丰富了该墨水的生物学用途；该体系在低温下为粘性液体，细胞培养环境为凝胶态，具有剪切变稀和自修复性能，可作为3D打印生物墨水负载细胞三维培养，细胞存活率高达95％～98％。
[0178] 本发明方法制备的水凝胶墨水负载骨髓间充质干细胞(BMSCs)三维培养：其中所使用的细胞模型为第三代SD鼠骨髓间充质干细胞；具体过程为：将贴壁生长的第三代干细胞胰酶消化后，分散于8～10mL细胞培养液中，800～1000rpm离心3～4min收集细胞；然后将5
所收集的BMSCs分散到无菌的水凝胶墨水溶液中，接种到24孔板，保持初始包载密度为10～106/mL；最后将24孔培养板至于37℃，保持1～5min形成凝胶后，每孔添加1mL含0.5～
1.0％多糖交联剂的细胞培养液，培养20～30min后移除。最后每孔添加1mL细胞培养液，在
37℃，5％CO2环境下连续培养24h。三维培养的细胞通过活-死细胞染色鉴定细胞的存活性，其操作步骤按照活-死细胞染色试剂盒说明执行。所有接触水凝胶墨水的器械均需提前冰浴20～30min。
所收集的BMSCs分散到无菌的水凝胶墨水溶液中，接种到24孔板，保持初始包载密度为10～106/mL；最后将24孔培养板至于37℃，保持1～5min形成凝胶后，每孔添加1mL含0.5～
1.0％多糖交联剂的细胞培养液，培养20～30min后移除。最后每孔添加1mL细胞培养液，在
37℃，5％CO2环境下连续培养24h。三维培养的细胞通过活-死细胞染色鉴定细胞的存活性，其操作步骤按照活-死细胞染色试剂盒说明执行。所有接触水凝胶墨水的器械均需提前冰浴20～30min。
[0179] 该实验测试得到了体外负载细胞培养存活率高达98％，表明上述涉及的材料具备优异的细胞相容性。
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