一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中分离纯化α2-巨球蛋白的方法
阅读：831发布：2023-02-17
专利汇可以提供一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中分离纯化α2-巨球蛋白的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中分离纯化α2‑巨球蛋白的方法，将Cohn组分Ⅳ沉淀依次经过 硫酸 铵盐析、锌离子亲和层析、凝胶过滤和 超滤 浓缩，最终得到α2‑巨球蛋白。本发明以工业废料Cohn组分Ⅳ沉淀为原料，结合盐析、亲和层析及凝胶过滤的方法纯化出了具有临床应用价值的 血浆 蛋白α2‑巨球蛋白，将Cohn组分Ⅳ沉淀变废为宝，综合利用了血浆。同时该方法操作简便，易于放大，适合规模化分离纯化α2‑巨球蛋白。，下面是一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中分离纯化α2-巨球蛋白的方法专利的具体信息内容。
1.一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中分离纯化α2-巨球蛋白的方法，其特征在于，将Cohn组分Ⅳ沉淀依次经过硫酸铵盐析、超滤脱盐、锌离子亲和层析、凝胶过滤和超滤浓缩，最终得到α2-巨球蛋白；所述硫酸铵盐析中硫酸铵的饱和度为40-60％，所述超滤浓缩中选用的超滤膜的截留量在30-500kD之间；所述硫酸铵盐析为单次盐析；
所述锌离子亲和层析中纯化介质选用锌离子螯合高流速琼脂糖介质Zn-IDA QZT6FF。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述硫酸铵盐析中硫酸铵的饱和度为45％-
55％。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述硫酸铵盐析为加入硫酸铵后搅拌1小时，再离心15分钟。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述锌离子亲和层析中洗脱液选用pH为6.5-
7.0的0.1M Na2EDTA或pH为7.4的20mM Tris+0.1M NaCl+0.1-0.5M咪唑。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述凝胶过滤中过滤介质选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶-200HR(Sephacryl-200HR)、聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶-300HR(Sephacryl-300HR)、琼脂糖凝胶、或交联葡聚糖Sephadex G-200。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶选用Superose prep grade或Superose 12。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述超滤浓缩中选用的超滤膜的截留量在
50-100kD。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
a).硫酸铵盐析：将Cohn组分Ⅳ沉淀溶解于8-12倍体积的蒸馏水中，通过压滤获得压滤液，在压滤液中添加硫酸铵，使其饱和度达到40％-60％，离心得到沉淀与上清，弃上清；
b).超滤脱盐：将步骤a)得到的沉淀溶解于透析液中超滤进行脱盐，所述透析液为pH6.0-7.0的0.02M Tris+0.5M NaCl缓冲液；
c).锌离子亲和层析：脱盐后进行锌离子亲和层析，至蛋白峰降至基线时停止洗脱，收集亲和层析的洗脱液；纯化介质选用锌离子螯合高流速琼脂糖介质Zn-IDA QZT6FF；
d).凝胶过滤：将步骤c)得到的亲和层析的洗脱液进行凝胶过滤，收集第一蛋白峰的凝胶过滤的洗脱液；
e).超滤浓缩：将步骤d)得到的凝胶过滤的洗脱液中蛋白浓度浓缩至4.5-5.5％，再使用0.22μm滤器过滤除菌，即得到目标蛋白。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，步骤c)中的洗脱选用pH6.5-7.0的0.1M Na2EDTA。
10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，步骤d)的凝胶过滤主要包括以下几个步骤：
ⅰ)装柱：将过滤介质填装在层析柱内；ⅱ)缓冲过滤介质：使用平衡缓冲液平衡缓冲过滤介质；ⅲ)上样：将步骤c)得到的亲和层析的洗脱液泵入层析柱内；ⅳ)淋洗：使用平衡缓冲液将目标蛋白α2-巨球蛋白淋洗下来。
11.根据权利要求8或9或10所述方法，其特征在于，所述超滤脱盐中选用的超滤膜的截留量在30-500kD之间。
12.根据权利要求11所述方法，其特征在于，所述超滤脱盐中选用50-100kD孔径的超滤膜。
一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中分离纯化α2-巨球蛋白的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及血液制品分离纯化技术领域，特别是涉及一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中分离纯化α2-巨球蛋白的方法。
背景技术
[0002] Cohn组分Ⅳ沉淀是血浆蛋白生产中的废弃物，也可简称为CohnⅣ沉淀。CohnⅣ沉淀中主要是蛋白，其中包括很多有潜在价值的蛋白质，但现在通常作为废弃物丢掉，这些蛋白无论作为临床使用还是作为生化诊断试剂都有着非常广阔的前景。比如α1-抗胰蛋白酶：可以治疗α1-抗胰蛋白酶先天性缺乏伴肺气肿患者，是美国FDA批准的药品；α2-巨球蛋白：
用于放射损伤的治疗以及眼角膜损伤和角膜炎的治疗；补体1酯酶抑制剂：用于治疗遗传性血管神经性水肿；结合珠蛋白：静脉输注结合珠蛋白或用固相化结合珠蛋白体外循环去除血液中的游离血红蛋白，防止和治疗溶血性肾衰竭；运铁蛋白：治疗先天性无运铁蛋白血症，用脱铁的运铁蛋白治疗铁血黄素沉着症；铜蓝蛋白：促进红细胞生成，治疗贫血。
用于放射损伤的治疗以及眼角膜损伤和角膜炎的治疗；补体1酯酶抑制剂：用于治疗遗传性血管神经性水肿；结合珠蛋白：静脉输注结合珠蛋白或用固相化结合珠蛋白体外循环去除血液中的游离血红蛋白，防止和治疗溶血性肾衰竭；运铁蛋白：治疗先天性无运铁蛋白血症，用脱铁的运铁蛋白治疗铁血黄素沉着症；铜蓝蛋白：促进红细胞生成，治疗贫血。
[0003] 其中，α2-巨球蛋白(α2-M)是体内重要的蛋白酶抑制剂，分子量为720kD(千道尔顿)。它是由四个相同亚基组成的四聚体，每个亚基由1451个氨基酸组成，含糖量为8-11％。α2-M主要由肝细胞合成，在正常人血浆中的含量为2-4g/L。在人体内α2-M能够清除多余的内源性及外源性蛋白酶而发挥蛋白酶抑制剂的作用。除此之外α2-M还具有抗辐射、抗肿瘤、抑制氧自由基、参与凝血平衡及与调节细胞因子活性等作用。
[0004] α2-M曾收录在1990年版生物制品规程试行规程上，其临床适应症主要是针对放射性皮肤和粘膜局部溃疡、损伤，放疗部位手术创口崩裂、溃疡、组织坏死以及角膜炎等。但是目前国内外尚无α2-M相关产品上市。近年来随着世界核安全形势的紧张以及肿瘤患者放疗致皮肤黏膜损伤的普遍，研发α2-M相关产品无论从国家及军队战略储备角度考虑还是从日常临床需求考虑都显得十分必要。要想得到α2-M相关产品，首先要有纯度高的α2-M。
[0005] 最早1955年Schultze从人血清中首次分离出α2-M，随着对α2-M生物学特性研究的深入及其临床应用的开展，对α2-M纯化制备工艺的研究也越加广泛。早在1975年SONG等人(M.K.SONG,et al,Large Scale Purification of α2-Macroglobulin from Human Plasma,Biochemical Medicine,1975,14:162-169)报道通过利凡诺分级沉淀结合PEG沉淀、凝胶过滤的方法制备出了纯度较高的α2-M，该工艺的回收率达60％。国内学者刘文方等(刘文方等，利凡诺法分离人血浆α2-M的研究，中华血液学杂志1984,5(5)：323)同样使用利凡诺分级沉淀的方法制备出纯度80％以上的α2-M，但20世纪90年代中国禁止使用利凡诺法生产人血液制品，因此该工艺被废除。
[0006] 1978年Virca等(G.D.Virca,et al,Purification of human α2-macrolobulin by chromatography on cibacron blue sepharose,Analytical Biochemistry,1978,89:274-278)使用cibacron蓝色染料亲和层析的方法制备α2-M，其活性回收率高达75％，但该方法的局限性在于起始纯化血浆中结合珠蛋白的类型需为1-1型，而1-1型结合珠蛋白献浆者只占总献浆者的10％，这限制了α2-M纯化制备时的原料来源。
[0007] 1978年JOHN等(JOHN E.McENTIRE,Purification of alpha-2Macroglobulin By Immunoadsorbent Chromatography,Journal of Immunological Methods,1978,24:39-45)将兔抗人α2-M抗血清螯合在琼脂糖介质上，采用免疫亲和层析的方法制备出高纯的α2-M。1981年Barrett(Alan J.Barrett,α2-macrolobulin,Methods in Enzymology,1981,80:
737-754)同样使用免疫亲和层析并结合PEG沉淀及凝胶过滤的方法制备α2-M。免疫亲和层析虽然能够制备出高纯的α2-M，但其纯化效率很低，因此不适合规模化生产制备。1986年国内学者彭启明等(彭启明等，人血浆α2-巨球蛋白的分离纯化，生物化学与生物物理进展，
1986,3:69-72)结合PEG沉淀法、cibacron蓝色染料亲和层析以及两步锌离子亲和层析的方法纯化α2-M，其纯化倍数达72.2倍，但活性回收率仅为31.1％。1990年版中国生物制品规程试行规程中介绍了低温乙醇法分离组分Ⅳ，再结合硫酸铵盐析法制备α2-M，但该方法制备的α2-M纯度在40％左右。
737-754)同样使用免疫亲和层析并结合PEG沉淀及凝胶过滤的方法制备α2-M。免疫亲和层析虽然能够制备出高纯的α2-M，但其纯化效率很低，因此不适合规模化生产制备。1986年国内学者彭启明等(彭启明等，人血浆α2-巨球蛋白的分离纯化，生物化学与生物物理进展，
1986,3:69-72)结合PEG沉淀法、cibacron蓝色染料亲和层析以及两步锌离子亲和层析的方法纯化α2-M，其纯化倍数达72.2倍，但活性回收率仅为31.1％。1990年版中国生物制品规程试行规程中介绍了低温乙醇法分离组分Ⅳ，再结合硫酸铵盐析法制备α2-M，但该方法制备的α2-M纯度在40％左右。
[0008] 现有的纯化制备工艺存在的上述问题均制约了α2-M纯化工艺应用于生产。适于规模化制备的利凡诺法被禁止用于生产人血液制品；cibacron蓝色染料亲和层析对起始血浆来源有限制；免疫亲和层析效率较低，仅适用于实验室规模制备；单纯的硫酸铵沉淀法制备出的α2-M纯度较低，无法满足对血液制品的质量要求；等等。同时，几乎所有的纯化工艺均是以血浆为起始材料，但目前工业生产时血浆主要用于生产白蛋白、静脉注射用丙种球蛋白、凝血因子等制品，若以血浆为原料制备α2-M则会影响到血浆的综合利用，极大降低经济效益。因此有必要建立一种适于规模化制备且能够综合利用血浆，从血浆蛋白生产过程产生的废弃物中分离纯化α2-M的工艺。
发明内容
[0009] 本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，提供一种适合规模化生产的从Cohn组分Ⅳ沉淀中分离纯化α2-巨球蛋白的方法，将Cohn组分Ⅳ沉淀依次经过硫酸铵盐析、锌离子亲和层析、凝胶过滤和超滤浓缩，最终得到α2-巨球蛋白。
[0010] 所述硫酸铵盐析中硫酸铵的饱和度为40-60％，优选45％-55％。
[0011] 所述硫酸铵盐析为单次盐析，即加入硫酸铵后搅拌1小时，再离心15分钟。
[0012] 所述锌离子亲和层析中纯化介质选用锌离子螯合高流速琼脂糖介质(Zn-IDA QZT6FF)。
[0013] 所述锌离子亲和层析中洗脱液可选用pH为6.5-7.0的0.1M Na2EDTA、pH为7.4的20mM Tris+0.1M NaCl+0.1-0.5M咪唑、pH为4.5-5.0的0.02M Tris+0.5M NaCl或pH为7.4的
20mM Tris+0.1M NaCl+0.01-0.05M组氨酸中的一种。
20mM Tris+0.1M NaCl+0.01-0.05M组氨酸中的一种。
[0014] 所述凝胶过滤中过滤介质可选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶-200HR(Sephacryl-200HR)、聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶-300HR(Sephacryl-300HR)、琼脂糖凝胶(Superose prep grade或Superose 12)、或交联葡聚糖(G-200Sephadex G-200)。
[0015] 所述超滤浓缩中选用的超滤膜的截留量在30-500kD之间，优选50-100kD孔径的超滤膜。
[0016] 具体包括以下步骤：
[0017] a).硫酸铵盐析：将Cohn组分Ⅳ沉淀溶解于8-12倍体积的蒸馏水中，通过压滤获得压滤液，在压滤液中添加硫酸铵，使其饱和度达到40％-60％，离心得到沉淀与上清，弃上清；
[0018] b).锌离子亲和层析：将步骤a)得到的沉淀用平衡缓冲液溶解成沉淀溶解液后进行锌离子亲和层析，至蛋白峰降至基线时停止洗脱，收集亲和层析的洗脱液；纯化介质选用锌离子螯合高流速琼脂糖介质(Zn-IDA QZT 6FF)，优选用来溶解沉淀的平衡缓冲液的体积为步骤a)中压滤液体积的1/2；
[0019] c).凝胶过滤：将步骤b)得到的亲和层析的洗脱液进行凝胶过滤，收集第一蛋白峰的凝胶过滤的洗脱液；
[0020] d).超滤浓缩：将步骤c)得到的凝胶过滤的洗脱液中蛋白浓度浓缩至4.5-5.5％，再使用0.22μm滤器过滤除菌，即得到目标蛋白；
[0021] 优选的是，步骤b)中用来溶解沉淀的平衡缓冲液所使用的是pH6.0-7.0的0.02M Tris+0.5M NaCl缓冲液；步骤b)中的洗脱液选用pH6.5-7.0的0.1M Na2EDTA。
[0022] 步骤b)的锌离子亲和层析主要包括以下几个步骤：ⅰ)装柱：将纯化介质填装在层析柱内；ⅱ)缓冲纯化介质：使用平衡缓冲液平衡缓冲纯化介质；ⅲ)上样：将沉淀溶解液泵入层析柱内；ⅳ)淋洗：使用平衡缓冲液将未能与纯化介质结合的蛋白淋洗下来；ⅴ)洗脱：使用洗脱液将结合在纯化介质上的蛋白洗脱下来；
[0023] 步骤c)的凝胶过滤主要包括以下几个步骤：ⅰ)装柱：将过滤介质填装在层析柱内；ⅱ)缓冲过滤介质：使用平衡缓冲液平衡缓冲过滤介质；ⅲ)上样：将步骤b)得到的亲和层析的洗脱液泵入层析柱内；ⅳ)淋洗：使用平衡缓冲液将目标蛋白α2-巨球蛋白淋洗下来；
[0024] 优选的，步骤b)中缓冲纯化介质、淋洗，及步骤c)中缓冲过滤介质和淋洗所使用的平衡缓冲液均是pH6.0-7.0的0.02M Tris+0.5M NaCl缓冲液。
[0025] 在进行步骤b)之前将步骤a)得到的沉淀溶解于透析液中进行超滤脱盐，所述透析液为pH6.0-7.0的0.02M Tris+0.5M NaCl缓冲液；优选的，所述超滤脱盐中选用的超滤膜的截留量在30-500kD之间，优选50-100kD孔径的超滤膜。
[0026] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0027] 本发明所选的用于分离纯化α2-M的起始原料为Cohn组分Ⅳ沉淀，是工业上利用低温乙醇分离法制备白蛋白过程中产生的，目前Cohn组分Ⅳ沉淀多作为工业废弃物处理，因此原料价格低廉。本发明采用废弃物制备出具有治疗价值的α2-M，降低了生产成本，提高了血浆综合利用率及经济效益。在此基础上，本发明的分离纯化过程中综合运用了盐析、亲和层析、分子筛的方法制备出高纯的α2-M，其中硫酸铵盐析这一步是对Cohn组分Ⅳ沉淀的粗分离，该步骤去除近一半的杂蛋白，锌离子亲和层析能够相对特异性地富集α2-M，最后一步凝胶过滤是利用分子筛，将α2-M与小分子杂蛋白分离。亲和层析中采用金属螯合高流速琼脂糖(Zn-IDA QZT 6FF)作基质，该基质耐碱能力较好，线性流速较高，适于工业化生产。用本发明方法分离纯化得到的α2-M纯度能够达到90％以上，纯度满足血液制品的质量要求，且操作简单；该方法对α2-M的活性回收率基本超过50％，适合规模化生产。附图说明
[0028] 图1为锌离子亲和层析分离纯化α2-M的色谱图；
[0029] 图2为凝胶过滤分离纯化α2-M的色谱图；
[0030] 图3为SDS-PAGE鉴定α2-M非还原性电泳图谱；
[0031] 图4为对图3条带4中蛋白的质谱鉴定结果。
具体实施方式
[0032] 本发明提供的从Cohn组分Ⅳ沉淀中分离纯化α2-巨球蛋白的方法，是将Cohn组分Ⅳ沉淀依次经过硫酸铵盐析、锌离子亲和层析、凝胶过滤和超滤浓缩，最终得到α2-巨球蛋白的过程。
[0033] 具体包括以下步骤：
[0034] a).硫酸铵盐析：将Cohn组分Ⅳ沉淀溶解于蒸馏水中(Cohn组分Ⅳ沉淀与蒸馏水的质量体积比(g：mL)为1：(8-12))，通过压滤获得压滤液，在压滤液中缓慢添加硫酸铵(添加过程大约持续1小时)，使其饱和度达到40％-60％，优选45％-55％，8000g/分钟离心15min得到沉淀与上清，弃上清。
[0035] b).锌离子亲和层析：将步骤a)得到的沉淀用平衡缓冲液(pH6.0-7.0的0.02M Tris+0.5M NaCl)溶解得到沉淀溶解液(沉淀加入平衡缓冲液搅拌得到)，所用平衡缓冲液的体积为步骤a)得到的压滤液体积的1/2；再进行锌离子亲和层析，至蛋白峰降至基线时停止洗脱，收集亲和层析的洗脱液。
[0036] 锌离子亲和层析是用GE公司的蛋白纯化仪AKTA purifier进行的，主要包括以下几个步骤：ⅰ)装柱：将纯化介质填装在层析柱内，整个纯化介质的体积为1个柱体积(1CV)，并将该层析柱与蛋白纯化仪连接；ⅱ)缓冲纯化介质：使用约5CV的平衡缓冲液平衡缓冲纯化介质；ⅲ)上样：将沉淀溶解液泵入层析柱内，使目标蛋白α2-M能够与纯化介质充分结合；ⅳ)淋洗：使用平衡缓冲液将未能与纯化介质结合的蛋白淋洗下来，淋洗至基线时纯化介质中只剩下与纯化介质结合的蛋白，一般淋洗需要约8-10CV；ⅴ)洗脱：此时使用洗脱液将结合在纯化介质上的蛋白洗脱下来，一般需要1CV洗脱液。
[0037] 纯化介质选用锌离子螯合高流速琼脂糖介质(Zn-IDA QZT 6FF)，纯化介质与沉淀溶解液的加入比是根据沉淀溶解液中蛋白浓度的大小而定的，本发明中纯化介质与沉淀溶解液体积比约为1：5。该过程中缓冲纯化介质和淋洗过程均使用平衡缓冲液(pH6.0-7.0的0.02M Tris+0.5M NaCl)，洗脱液选用pH6.5-7.0的0.1M Na2EDTA。
[0038] c).凝胶过滤：将步骤b)得到的亲和层析的洗脱液进行凝胶过滤。凝胶过滤是利用分子量不同的蛋白质在过滤介质中滞留时间不同的原理实现蛋白的分离提纯，蛋白分子越大滞留时间越短，越早被淋洗下来。由于α2-M分子量最大，因此只需要收集第一个蛋白峰即可。该过程与锌离子亲和层析相似，包括装柱、缓冲过滤介质、上样和淋洗这几个步骤，用GE公司的蛋白纯化仪AKTA purifier进行，该仪器可以检测淋洗液中的蛋白浓度，并根据浓度高低自动绘制蛋白峰图，操作中，目标蛋白α2-M会最先被淋洗下来，因此根据仪器中蛋白出峰情况收集第一蛋白峰的淋洗液，当第二峰出现时即停止收集。
[0039] 其中，过滤介质选用Sephacryl-200HR(聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶-200HR)、Sephacryl-300HR(聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶-300HR)、Superose 12(琼脂糖凝胶)、Superose prep grade(琼脂糖凝胶)或Sephadex G-200(交联葡聚糖G-200)中一种，亲和层析的洗脱液的体积一般是过滤介质体积的1-3％，缓冲过滤介质和淋洗均使用平衡缓冲液(pH6.0-7.0的0.02M Tris+0.5M NaCl)。
[0040] d).超滤浓缩：将步骤c)得到的凝胶过滤的淋洗液进行超滤浓缩，浓缩至蛋白浓度为4.5-5.5％；再使用0.22μm滤器过滤除菌，即可得到目标蛋白α2-M产品，产品为液体。
[0041] 选用的超滤膜的截留量在30-500kD之间，优选50-100kD孔径的超滤膜。
[0042] 以上方法中，进一步地，在进行步骤b)之前最好用超滤的方法对步骤a)得到的沉淀进行脱盐，即将沉淀加入透析液中超滤脱盐，选用的超滤膜的截留量在30-500kD之间，所用的透析液为pH6.0-7.0的0.02M Tris+0.5M NaCl缓冲液。
[0043] 实施例
[0044] 按上述方法对Cohn组分Ⅳ沉淀中的α2-M进行分离纯化，并对方法中的一些参数做了调整(见表1)，然后用质谱验证所得产品(见图4)并翻译图4得到表2，进而检测所得α2-M的纯度和活性回收率，结果见表3。
[0045] 表1 用不同参数的方法分离纯化Cohn组分Ⅳ沉淀中的α2-M的结果[0046]
[0047]
[0048] 以例1为例，图1-图4为按照例1方法分离纯化α2-M得到的色谱图和质谱鉴定结果，其中图3为SDS-PAGE鉴定α2-M非还原性图谱，M为分子量Marker，条带1-3分别为步骤a)中的压滤液、步骤b)中的沉淀溶解液、步骤b)得到的亲和层析的洗脱液，条带4为步骤c)得到的淋洗液，即Sephacryl-200HR第一峰。
[0049] 质谱的目的是对制备的蛋白进行鉴定，鉴定其是否为目标蛋白。图4为质谱鉴定结果，即通过对图3中条带4中的蛋白进行分析，与数据库中肽段进行比对，并根据匹配度的高低进行排序，匹配度越高证明纯化得到的蛋白是与其匹配蛋白的可能性就越大。左侧的数字是右侧相应肽段的gi号，在pubmed上可搜索该gi号查询相应肽段的具体信息。对图4的翻译如表1，从图4可以看出，匹配度最高的三个肽段均是人源α2-巨球蛋白(第2和第3个gi号通过pubmed查询获得相关信息)，第7和第8个gi号鉴定的角蛋白为操作时手指皮肤上粘上去的蛋白，为实验误差，并非实验制备的蛋白。而其余鉴定的蛋白也基本为其他属性的α2-巨球蛋白，因此通过该实验可基本确定，通过上述方法纯化得到的蛋白就是α2-巨球蛋白。
[0050] 表2 对图4中gi号的翻译结果
[0051]1 gi︳177870 α2-巨球蛋白前体(人源)
2 gi︳377656551 链A，α2-巨球蛋白
3 gi︳224053 α2-巨球蛋白
4 gi︳426371570 α2-巨球蛋白类似物(大猩猩)
5 gi︳332232615 α2-巨球蛋白(黑长臂猿)
6 gi︳28317 未命名蛋白(人源)
7 gi︳11935049 角蛋白(人源)
8 gi︳375314779 角蛋白(人源)
9 gi︳403269387 α2-巨球蛋白类似物(松鼠猴属)
10 gi︳390467482 α2-巨球蛋白(狨猴属)
2 gi︳377656551 链A，α2-巨球蛋白
3 gi︳224053 α2-巨球蛋白
4 gi︳426371570 α2-巨球蛋白类似物(大猩猩)
5 gi︳332232615 α2-巨球蛋白(黑长臂猿)
6 gi︳28317 未命名蛋白(人源)
7 gi︳11935049 角蛋白(人源)
8 gi︳375314779 角蛋白(人源)
9 gi︳403269387 α2-巨球蛋白类似物(松鼠猴属)
10 gi︳390467482 α2-巨球蛋白(狨猴属)
[0052] 图4的质谱鉴定结果表明条带4即为通过本发明方法纯化出的α2-M。按照例2-例5方法分离纯化α2-M得到的色谱图和质谱鉴定结果与图1-图4无异，不再赘述。
[0053] 对比例1
[0054] 对比例1即为例6，具体操作为：将1000g Cohn组分Ⅳ沉淀溶解于10000ml蒸馏水中，搅拌1小时后压滤，得到滤液9500ml。在滤液中添加等体积100％饱和度的硫酸铵溶液，搅拌1小时后4℃放置过夜。离心分离沉淀A与上清A，用5000ml 50％饱和度的硫酸铵溶液溶解沉淀A，搅拌一小时离心，获得沉淀B、上清B。将沉淀B溶解于4000ml 50％饱和度的硫酸铵溶液中，离心得到沉淀C、上清C，将沉淀C溶解于3000ml蒸馏水中，按照243g/L添加固体硫酸铵，使其饱和度达到40％，离心分离沉淀D、上清D。在上清D中按照97g/L添加固体硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到55％，溶液搅拌1小时后离心，将获得的沉淀E溶解于1000ml缓冲液中(0.02M Tris、0.15M NaCl、pH6.0)，使用500kDa超滤膜进行超滤以脱盐，将600ml截留液进行锌离子亲和层析，上样完成后继续用缓冲液淋洗，淋洗至蛋白峰趋于基线时换洗脱液(0.1M Na2EDTA、pH6.8)洗脱，洗脱至蛋白峰降至基线时停止洗脱。收集富含α2-M的洗脱液约150ml。
[0055] 对比例2
[0056] 对比例2是参照彭启明等人方法(人血浆α2-巨球蛋白的分离纯化，生物化学与生物物理进展，1986,3:69-72)，以人血浆为原料，先通过4％-12％聚乙二醇沉淀的方法处理血浆，再依次采用锌离子亲和层析、蓝色琼脂糖亲和层析、第二次锌离子亲和层析的方法纯化制备α2-巨球蛋白。
[0057] 对比例3
[0058] 对比例3是参照G.D.Virca等人的方法(Purification of human α2-macrolobulin by chromatography on cibacron blue sepharose,Analytical Biochemistry,1978,89:274-278)，以1-1型结合珠蛋白血浆为原料，依次通过蓝色琼脂糖亲和层析及凝胶过滤。
[0059] 对比例4
[0060] 对比例4是参考1990年中国生物制品规程试行规程中制备α2-巨球蛋白的方法，通过硫酸铵分级沉淀，制备α2-巨球蛋白。
[0061] 测定本发明的例1-例9的蛋白浓度、比活、回收率及纯度，并将检测结果记录在表3中。α2-M活性测定以单位体积的样品能够抑制胰蛋白酶的量(μg/ml)作为标准；比活(μg/mg)等于活性值除以蛋白含量值，表示每毫克蛋白能够抑制的胰蛋白酶的量；纯度测定通过纯度分析软件Band Scan5.0测得。
[0062] 表3 纯化检测结果汇总
[0063] 蛋白浓度(％) 比活(μg/mg) 回收率(％) 纯度(％)例1 4.5 14.4 55.3 95.1
例2 5.5 13.3 48.5 94.4
例3 5.0 14.6 53.2 96.4
例4 4.8 14.2 55.6 95.2
例5 5.5 13.7 58.8 94.8
例6/对比例1 5.2 14.1 23.4 96.5
例7 5.3 10.3 39.4 70.5
例8 5.1 14.4 30.3 95.9
例9 5.0 11.7 65.5 80.5
对比例2 4.8 12.9 24.5 93.9
对比例3 4.8 9.8 70.0 67.8
对比例4 5.0 5.5 75.2 35.6
例2 5.5 13.3 48.5 94.4
例3 5.0 14.6 53.2 96.4
例4 4.8 14.2 55.6 95.2
例5 5.5 13.7 58.8 94.8
例6/对比例1 5.2 14.1 23.4 96.5
例7 5.3 10.3 39.4 70.5
例8 5.1 14.4 30.3 95.9
例9 5.0 11.7 65.5 80.5
对比例2 4.8 12.9 24.5 93.9
对比例3 4.8 9.8 70.0 67.8
对比例4 5.0 5.5 75.2 35.6
[0064] 分析表3的数据可知，例1-例5中比活、回收率、纯度均比较稳定，如蛋白浓度均在5.0％左右，比活、回收率和纯度分别均在14.0μg/mg、54％、95％左右。
[0065] 而将例6(即对比例1)的洗脱液超滤至20ml，得到的α2-M蛋白浓度为5.2％，比活为14.1μg/mg，回收率为23.4％。对比例1是参考一篇英文文献(Purification of Human Plasma α2Macroglobulin andαl Proteinase Inhibitor Using Zinc Chelate Chromatography，ANALYTICAL BIOCHEMISTRY，1979，99：415—420)中制备α2-M的方法进行的，不同的是该篇英文文献中起始材料使用的是血浆，而对比例1中使用的是组分Ⅳ沉淀。
对比例1方法与本发明方法主要的区别在于：①本发明使用单次硫酸铵盐析，并且该硫酸铵盐析步骤反应时间较短(搅拌1小时后离心15分钟即可)，而对比例1中使用硫酸铵分级盐析，即多次使用硫酸铵沉淀的方法，且反应时间较长(需过夜)，由于硫酸铵可破坏α2-M活性，因此对比例1中回收率较低；②本发明方法比对比例1方法中多了一步凝胶过滤，但凝胶过滤反应条件温和，不会使蛋白失活。总结来讲，对比例1方法中纯化初始便多次使用硫酸铵盐析的方法纯化α2-M，使得在进行锌离子亲和层前便达到较高的纯度，但缺点是α2-M活性损失较多，反应时间较长。而本发明仅用一步硫酸铵盐析，且反应时间较短，虽然在锌离子亲和层析后面加了一步凝胶过滤以提高纯度，多了一步反应，但整个纯化时间是短的，且回收率是高于对比例1的。
对比例1方法与本发明方法主要的区别在于：①本发明使用单次硫酸铵盐析，并且该硫酸铵盐析步骤反应时间较短(搅拌1小时后离心15分钟即可)，而对比例1中使用硫酸铵分级盐析，即多次使用硫酸铵沉淀的方法，且反应时间较长(需过夜)，由于硫酸铵可破坏α2-M活性，因此对比例1中回收率较低；②本发明方法比对比例1方法中多了一步凝胶过滤，但凝胶过滤反应条件温和，不会使蛋白失活。总结来讲，对比例1方法中纯化初始便多次使用硫酸铵盐析的方法纯化α2-M，使得在进行锌离子亲和层前便达到较高的纯度，但缺点是α2-M活性损失较多，反应时间较长。而本发明仅用一步硫酸铵盐析，且反应时间较短，虽然在锌离子亲和层析后面加了一步凝胶过滤以提高纯度，多了一步反应，但整个纯化时间是短的，且回收率是高于对比例1的。
[0066] 可见，例6中虽然比活及纯度能够达到例1-例5的水平(分别为14.1μg/mg和96.5％)，但回收率太低(只有23.4％)，不适合规模化制备。例7相对于例6，简化了硫酸铵盐析的步骤，这使得活性回收率有所提高(提高至39.4％)，但纯度偏低(只有70.5％)。例8和例9基本参照本发明的实验步骤，但选择的硫酸铵饱和度要不太高、要不太低，这使得产品无法在纯度、回收率两方面均获得满意的结果，如例8的纯度能够与例1-例5相当，但回收率太低；例9虽回收率较高，但纯度太低，仅有80.5％。对比例2-4也存在无法在纯度、回收率两方面均获得满意的结果的缺陷，对比例2的纯度能够与例1-例5相当，但回收率太低；对比例
3虽回收率较高，但纯度又太低；对比例4的纯度更是低。
3虽回收率较高，但纯度又太低；对比例4的纯度更是低。
[0067] 因此，本发明以工业废料Cohn组分Ⅳ沉淀为原料，结合盐析、亲和层析及凝胶过滤的方法纯化出了具有临床应用价值的血浆蛋白α2-M，将Cohn组分Ⅳ沉淀变废为宝，综合利用了血浆。同时该方法操作简便，易于放大，适合规模化分离纯化α2-M。本发明方法分离纯化的回收率在50％左右，纯度在95％左右。而其他文献报道的工艺则无法在回收率及纯度同时兼顾。因此本发明具有良好的应用前景。
[0068] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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