靶特异性双突变体融合蛋白质及其制备工艺
阅读：172发布：2023-01-30
专利汇可以提供靶特异性双突变体融合蛋白质及其制备工艺专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了具有靶细胞特异性细胞毒性的融合 蛋白质 及其制备方法，本发明涉及人体促性腺 激素 释放激素突变体(mGnRH)与重组绿脓杆菌外毒素A突变体(PE38m4a)融合蛋白质，以及所述的双突变体融合蛋白质作为抗 肿瘤 药物，在抑制肿瘤的发生和发育中的应用。，下面是靶特异性双突变体融合蛋白质及其制备工艺专利的具体信息内容。
1.靶特异性双突变体融合蛋白质，所述的融合蛋白质从N末端到C末端包括：首位氨基酸为谷氨酰胺(Glu)的、且第六位氨基酸被修饰的促性腺激素释放激素的氨基酸残基
1-10以及截短的绿脓杆菌外毒素A氨基酸残基，优选氨基酸序列为SEQ ID NO.3。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白质，所述的截短的绿脓杆菌外毒素A氨基酸残基为PE40、PE38、PE35、PE23或已知结构片段，也可以是突变其最后4个氨基酸为KDEL的PE40、PE38、PE35、PE23已知结构片段。
3.根据权利要求2的融合蛋白质，其中所说的蛋白质由Met+TrxA+His Tag+Sumo蛋白酶识别序列+mGnRH+突变的PE片段组成。
4.根据权利要求1的融合蛋白质，其中所述的促性腺激素释放激素的氨基酸残基第6位被修饰，包括促性腺激素释放激素的第6位Gly被D-Trp或其他氨基酸取代。
5.根据权利要求4的融合蛋白质，所述的氨基酸残基第10位Gly被乙酰化。
6.融合蛋白重组基因，它的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
7.根据权利要求1的融合蛋白质，其中所说的融合蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。
8.根据权利要求1-6所述的融合蛋白质，其中所说的嵌合毒素蛋白质是以DNA融合和重组技术制备的。
9.权利要求1-6所述的融合蛋白质在生产抗肿瘤药物中的应用。
10.权利要求6所述的融合蛋白质的制备方法，包括如下步骤：
(1)构建携带重组融合蛋白双链表达基因的可表达质粒载体，所述融合蛋白重组基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；
(2)融合蛋白质的表达：将携带重组基因质粒转化至大肠杆菌中表达；
(3)将菌体破碎，离心取上清即为融合蛋白粗提物；在咪唑存在下进行金属螯合介质纯化；
(4)用SUMO蛋白酶酶切，并利用金属螯合介质将标签部分与目的蛋白分离、纯化。
11.根据权利要求10所述的融合蛋白质的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的纯化为：粗提物经过缓冲液平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用含有0～0.5M NaCl的TE缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)连续梯度洗脱，并收集蛋白质各组分峰部分；
目的组分峰部分经中空纤维超滤器作用20-40分钟超滤浓缩换液后，使浓缩物通过用20mM Tris-HCl，pH8.0，0.15M NaCl，20mM咪唑缓冲液平衡过的XK1.6×10cm IMAC柱，并用含有
0.15M NaCl的缓冲液(20mM Tris·HCl，pH8.0，200mM咪唑)洗脱，收集目的蛋白峰部分。
12.根据权利要求11所述的融合蛋白质的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的纯化为：将收集目的蛋白峰部分并稀释10倍，利用SUMO酶切目的蛋白，30℃，4hr，并再次进行IMAC液相色谱，收集蛋白质流川峰部分并在30mM PBS中彻底透析，透析后于-20℃下储存备用，得到纯化的融合蛋白质。
13.根据权利要求9所述的融合蛋白质的制备方法，其特征在于所述的携带重组融合蛋白双链表达基因的可表达质粒载体的结构如图1所示。
靶特异性双突变体融合蛋白质及其制备工艺
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学领域，本发明总地涉及具有靶细胞特异性细胞毒性的融合蛋白质的新型制备工艺。更具体地说，本发明涉及肿瘤特异性治疗药物人体促性腺激素释放激素突变体(mGnRH)与重组绿脓杆菌外毒素A截短片段或其突变体(PE38m4a)融合蛋白质的基因重新构建和纯化的制备工艺。
背景技术
[0002] 为了提高抗肿瘤药物对肿瘤细胞的选择性杀伤作用，在中国专利CN200810051112.4中构建并表达了以突变的GnRH为导向，以截短并在C端进行突变的绿脓杆菌外毒素A为细胞毒性剂的双突变体融合蛋白质，其基本原理是在肿瘤的发生和发育过程中，许多肿瘤细胞都在其表面上过量表达促性腺激素释放激素受体蛋白质(GnRHR)，因此，可将某些细胞毒性剂(如绿脓杆菌外毒素(PE)、白喉毒素、霍乱毒素、葡萄球菌内毒素及蓖麻毒素等)连接到作为导向剂的GnRH分子上，以产生兼有肿瘤细胞导向功能和细胞毒活性的杂交分子。这些杂交分子借助其对靶肿瘤细胞导向能力将整个分子引向靶细胞并通过其毒素部分杀伤靶细胞。
[0003] 作为细胞毒性剂的绿脓杆菌外毒素A(PEA)(参见美国专利US4,545,985和中国专利申请CN200810051112.4)是由613个氨基酸组成的单链多肽。对PEA分子的X射线晶体学研究和突变分析显示，PEA分子包括三个与产生细胞毒性相关的结构区域：负责与敏感细胞结合的氨基末端细胞受体结合区(I区)；负责毒素分子向细胞溶胶内转位的中间转位区(II区)；以及负责失活蛋白质并最终导致细胞死亡的羧基末端酶促活性区(III区)。其中I区包括介导细胞结合的Ia区(氨基酸1-252)和目前尚未明确其功能的Ib区(氨基酸365-399)。可以使用生物化学或重组DNA技术修饰PEA分子，以制备PEA分子中有一个或多个氨基酸缺失或取代的各种修饰的PEA片段，例如，一般将删去了PE分子中Ia区，只含有酶促和转位区，分子量约为40KDa的PE-A蛋白质称为PE40。现已发现删除PE的Ia和大部分Ib区(氨基酸365-380)后，即PE38毒素分子，该分子仍保留其特异性细胞毒性，但降低了非特异性毒性(例如参见Hwang et al.，Cell48：129-136,1987；美国专利4,892,827和欧洲专利0261671)。同时，如果将PE38分子中C末端氨基酸RKEDL进行突变为与内质网、高尔基体结合密切的KDEL则细胞活性能够提高10倍以上。
[0004] 许多现有技术文献已描述了PEA与各种生长因子、抗体、激素或CD4融合，以产生可选择性地导向并杀伤具有不同细胞膜蛋白(受体或抗原)之靶细胞的杂交蛋白质的方法。美国专利5,428,143公开了用于选择性杀伤HIV感染之细胞的杂交蛋白质及编码该杂交蛋白质的嵌合基因的构建。其中所说的杂交蛋白质由含有HIV结合位点的人CD4和可杀死HIV感染之细胞毒性蛋白质(PE40)组成。
[0005] 作为与本发明更为相关的现有技术，PCT国际专利申请WO93/15751公开了将促性腺激素释放激素(GnRH)肽直接偶联到绿脓杆菌外毒素分子上制成的嵌合蛋白质分子。据称，投用这样的嵌合分子可导致脑垂体中携带GnRH受体的细胞的破坏，并伴有性激素分泌的降低，因而可望将其用于动物不育化及抑制类固醇激素相关肿瘤的增殖。
[0006] 与本发明直接相关的是本申请人持有的中国专利CN200810051112.4提供了一种由突变的人促性腺激素与重组绿脓杆菌外毒素A突变体融合而成的嵌合毒素，特征在于其中所说的突变的人促性腺激素部分作为导向剂，可与表面上具有相应激素受体的外周性腺激素反应性或非反应性肿瘤细胞特异结合，并且当内化到这些肿瘤细胞中之后，所说的绿脓杆菌外毒素部分作为细胞毒性剂可有效地杀伤这些肿瘤靶细胞。其中所说的作为导向的激素是突变的促性腺激素释放激素(mGnRH)，其中所说的重组绿脓杆菌外毒素是PE38KDEL(PE38m4a)。
发明内容
[0007] 根据本申请人持有的中国专利CN200810051112.4，本发明在具体基因工程操作和产物纯化方面进行了进一步发明改造，使之结构更忠实于GnRH天然结构，纯化工艺更简单且经济实用，收率显著提高。
[0008] 根据这一发明的一个优选实施方案，其中所说的mGnRH是以人工体外基因合成的形式连接到PE分子中相当于Ia区基因的位置。
[0009] 根据这一发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的mGnRH基因是以大肠杆菌偏性密码子为主体的基因形式合成的。
[0010] 这一发明的另一个目的是提供含有细胞毒性有效量的上述mGnRH-PE38m4a嵌合毒素，以及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
[0011] 这一发明的再一个目的涉及上述药物组合物在治疗多种与促性腺激素受体有关的肿瘤中的应用。
[0012] 本发明的一个优选方案是将有利于二硫键形成的转硫酶A和SUMO蛋白酶识别底物序列与中国专利CN200810051112.4中mGnRH-PE38m4a基因依次拼接形成融合表达，并去除了mGnRH-PE38m4a原来N端作为酶切连接序列的Met-Gly氨基酸。
[0013] 本发明的另一个优选方案是SUMO蛋白酶识别底物序列N端增加了具有金属螯合介质亲和特性的组氨酸标签His6。
[0014] 本发明的另一个优选方案是利用20mM咪唑存在下进行金属螯合介质纯化，一步获得90％纯度的融合蛋白。
[0015] 本发明的另一个优选方案是利用高特异性和高活性SUMO蛋白酶对纯化的融合蛋白进行酶切，使标签部分与mGnRH-PE38m4a目的蛋白分离，在20mM咪唑存在下进行金属螯合介质纯化以流川形式获得95％纯度的mGnRH-PE38m4a目的蛋白。
[0016] 本发明的另一个优选方案是高度纯化的目的蛋白质在多种保护剂存在下，制备成具有抗肿瘤能力的药物组合物。
[0017] 本文中所使用术语“导向剂”，是指能够只与待杀伤的靶细胞表面上的受体或抗原特异结合的分子或配体。“导向剂”有时也称为“识别分子”或“配体结合剂”。这样的识别分子的例子是可识别靶细胞的抗体或其片段，可与靶细胞上的分子特异结合的生长因子、淋巴因子、细胞因子、抗原及激素等。根据本发明的优选实施方案，所说的导向剂是小分子突变的性腺类激素(mGnRH)。
[0018] GnRH是由Schally等于1971年从动物体内分离纯化，阐明其结构后又人工合成的，并以此获得了1976年的Nobel奖。GnRH为一个不含游离氨基酸与羧基的十肽，其分子结构为：P-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2，其中第4-6位氨基酸可能形成β转折，呈发夹形，适合与受体结合，第2和3位对生物活性很重要，第6位对维持发夹构象起重要作用，第1位与第4-10位氨基酸均参与受体结合，若置换以上氨基酸残基可导致活力丧失或呈几何级增强。
[0019] 在体内很容易被蛋白水解酶降解，故其半衰期仅4-8min。其水解酶肽酶的主要作用部位是Gly6-Leu7和Pro9-Gly10-NH2。为寻求高效且持久的LHRH类似物，通过对其肽链结构中氨基酸的拾取或替换，已合成3000多种LHRH类似物。由于合成的LHRH半衰期长，作用更强，所以比天然的LHRH更适于病人的治疗。合成长效的LHRH激动剂的要求是稳定分子结构，使之不易被酶水解，增加与循环中的蛋白和胞膜的结合及提高对LHRH受体的亲和力。如6位为D-氨基酸的类似物和取代Gly10酰胺基。这种LHRH激动剂不仅耐蛋白酶水解作用较大，而且对受体有较高的亲和力。若在第6位引入庞大的疏水基团可进一步增加与受体的亲和力。这样的置换稳定了释放激素类似物的“活性”构型，提高了与循环中蛋白的结合，从而延长半衰期。早期开发的LHRH拮抗剂的理论基础与LHRH激动剂相似，可改善与受体结合，却产生不易接受的组胺释放副作用。因此，开发下一代的LHRH拮抗剂的焦点集中到既提高效能又减少组胺释放这一方面。
[0020] 越来越多的研究发现，某些激素和细胞因子的受体在肿瘤和癌细胞上有异常高的表达，如EGFR、LHRHR等。而且，激素和细胞因子的分子相对较小，结构简单，基因操作方便，因此，作为免疫毒素的载体有很大的可行性。目前有很多的细胞因子和激素被利用来做免疫毒素的载体，如IL-2、IL-4、EGF、LHRH等，并且表达的重组免疫毒素蛋白均具有特异性细胞毒效应。GnRH受体最早发现于垂体，随着近年来对GnRH及其受体研究的进一步深入，越来越多的临床和实验表明，垂体外组织也有GnRH及其受体的分布，并且垂体外正常组织及其相应部位癌组织GnRH受体性质有许多不同。有文献报道，它们所介导的信号传导通路不同，也有报道，癌细胞表面的GnRH受体可能介导细胞调亡。另外，癌细胞膜表面受体的亲和力通常大于相应正常组织细胞膜表面受体亲和力。据报导，在脊椎动物牛蛙脑垂体和后脑的细胞上已经发现了3种LHRH受体的亚型，人体中目前发现两种亚型，但其分布和功能各不相同，I型受体与I型GnRH结合，II型受体与II型GnRH结合，二者之间交叉反应极低。已经有大量的实验证明：(1)人类正常性腺组织(包括子宫内膜、子宫肌层、卵巢和睾丸)，胎盘等细胞膜上有低亲和力GnRH受体的分布。(2)其他正常组织心、肝、脾、肺、肾、肌肉等细胞膜上无GnRH受体存在。(3)GnRH受体主要分布在肝癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫肌瘤、乳腺癌和前列腺癌细胞膜上。
[0021] 本文所使用的术语“mGnRH”是指能够与表面存在GnRH受体的细胞结合，并引导蛋白质分子作用在靶细胞上，引起细胞病变或死亡，其作用机理等同于或高于天然GnRH或其类似物。
[0022] 天然GnRH也称为促黄体激素释放激素(LHRH或LRH)，其为具有如下所示的氨基酸序列的十肽分子：
[0023] pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly
[0024] 由于GnRH为导向的蛋白质在基因工程表达必须添加启动子和基因酶切位点进行连接，故中国专利CN200810051112.4中的mGnRH-PE38m4a融合蛋白的mGnRH氨基酸序列的增加了启动密码子ATG和调整正确开放阅读框架添加了GGC密码子，所以其表达产物为十二肽分子：
[0025] Met-Gly-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly
[0026] 本发明所涉及的融合毒素中设计的导向部分为突变的GnRH氨基酸序列为：Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly
[0027] 式中所用的氨基酸符号为本领域通用的三字母缩写符号，其中为了基因连接方便在基因合成时于N末端去除了Met-Gly的密码子，并且将新序列中第六位氨基酸于基因水平上仍保留突变的Trp，以使表达产物与相应受体结合能力的增强；同时将大肠杆菌偏性密码子引入到其中，以使表达产物适合在大肠杆菌中表达。
[0028] 我们对按中国专利CN200810051112.4发明方法制备的mGnRH-PE38m4a融合蛋白质的生物学活性分析已清楚地证明，mGnRH-PE38m4a具有与包括Hela细胞在内多种器官来源的肿瘤细胞具有杀伤活性，而对多种组织来源的正常细胞则没有这种特异杀伤活性(参见中国专利200810051112.4实施例2)。同时利用本发明方法制备的mGnRH-PE38m4a与原产物进行了活性对比，结果发现本发明专利制备的样品活性优于原工艺产品。
[0029] 本文中所使用术语“IC50”是指抑制靶细胞蛋白质合成达到对照组的50％所需的融合蛋白的浓度。本发明中使用MTT标准方法测定蛋白质对体外培养细胞的半数抑制浓度。
[0030] 本发明进一步涉及以重组DNA技术生产多种类蛋白质串联融合表达的靶特异性、细胞毒性重组PE融合蛋白质的方法，该方法包括：(1)提供携带PE38KDEL基因的表达载体；(2)人工合成分子串联连接的编码转硫酶A和SUMO酶切底物的核苷酸序列，并将其克隆到线性化的步骤(1)的表达载体中；(3)用步骤(2)的表达载体转化适当的宿主细胞；(4)在适于表达所说的由转硫酶A和SUMO酶切底物和mGnRH-PE38m4a组成的融合蛋白质的条件下培养所说的被转化的宿主细胞；(5)从细胞培养物中回收并纯化所说的融合蛋白质。
[0031] 用于构建本发明的融合蛋白质的PE分子可以是缺失了Ia区和大部分Ib区的天然PE分子，但也可以并且较好是经过修饰的PE38m4a分子。例如，这样经过修饰的PE38KDEL265 287 372 379
分子可以是其中1～4个半胱氨酸(Cys 、Cys 、Cys 和Cys )被删除或被其他氨基酸如Lys-Asp-Glu-Leu取代的PE38m4a。
分子可以是其中1～4个半胱氨酸(Cys 、Cys 、Cys 和Cys )被删除或被其他氨基酸如Lys-Asp-Glu-Leu取代的PE38m4a。
[0032] 由于作为本发明抗肿瘤嵌合毒素中导向剂或称识别分子的小分子激素的分子量均相对较小(10肽)，所以可使用通用的DNA合成仪在1000A固相载体上合成编码这些激素或其变异体的核苷酸序列。为了便于与游离的或携带于特定重组载体上的PE编码序列连接，可在合成的融合蛋白基因序列的5’和/或3’端引入适当的核酸内切酶(如NcoI)酶切位点，并造成适于连接的粘性末端。可按照本领域技术人员已知的重组技术，克隆编码这些合成的阅读框架通畅的基因(或以其cDNA或基因组DNA形式)，DNA重组操作中，一般使用标准的PCR扩增技术扩增所需的基因片段并造成适当的酶切位点。使用限制性酶切法鉴定序列连接方向的正确性和可能的突变，最后以DNA测序进行序列确认。
[0033] 这里应特别指出的是，由于相对于细胞毒性部分PE38m4a来说，导向部分mGnRH的分子量小得多，所以由两者产生的融合蛋白质中的PE38m4a部分很可能形成新的二级空间构象，导致PE38m4a部分对mGnRH的卷曲，影响融合蛋白质的受体结合的程度。然而通过技术人员计算机分析PE38m4a部分的卷曲并不能影响mGnRH的分子暴露和与受体结合。
[0034] 重组蛋白质基因将被可操纵地连接到适当的表达控制序列上，如连接到适于在大肠杆菌中使用的T7、trp或λ启动子、核糖体结合位点及转录终止信号上。可使用已知的转化方法，如适于原核细胞的氯化钙处理法或适于哺乳动物细胞的电穿孔法将本发明的重组质粒转化到选择的宿主细胞中。可基于质粒上所含抗生素抗性基因所赋予的抗生素抗性来选择被转化的阳性细胞。一旦表达了所需的融合蛋白质，即可按照本领域已知的方法分离并纯化该融合蛋白质。例如，可从发酵培养物中离心收集菌体细胞并用溶菌酶和超声波裂解之，然后超速离心并在低浓度磷酸盐(约20mM)溶液中加入饱和硫酸铵进行分步沉淀。依次经离子交换层析(IEC)和IMAC层析纯化所需的mGnRH-PE38KDEL重组蛋白质。
[0035] 一般说来，使用聚丙烯酰胺凝胶以SDS-PAGE电泳法分析各柱层析洗脱部分，并使用多克隆抗PE抗血清和以免疫印迹法监测之。对重组融合蛋白质纯化产物进行肿瘤细胞抑制试验以检测融合蛋白质的细胞毒性(IC50)。
[0036] 可将本发明的mGnRH-PE38m4a融合蛋白质作为基本活性成分，并加入一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂，制成适于临床应用的药物组合物。所说的载体或赋形剂包括但不只限于磷酸盐缓冲盐水、生理盐水、等渗葡萄糖溶液、葡聚糖、右旋糖苷等。根据所治疗的疾病的不同，可在本发明的药物组合物中加入一种或多种与本发明的融合蛋白质有辅助或协同作用的其他天然的、合成的或重组的活性化合物。另外，可在本发明的药物组合物2+ 2+ 2+ 2+
中加入低分子量肽、甘氨酸或赖氨酸及金属阳离子(如Zn 、Mn 、Mg 和Ca )的蛋白质保护剂，以及聚乙二醇、羧甲基纤维素、多聚甘氨酸、谷胱甘肽的稳定剂。
中加入低分子量肽、甘氨酸或赖氨酸及金属阳离子(如Zn 、Mn 、Mg 和Ca )的蛋白质保护剂，以及聚乙二醇、羧甲基纤维素、多聚甘氨酸、谷胱甘肽的稳定剂。
[0037] 可以通过常规给药途径，特别是胃肠道外途径投用本发明的药物组合物，例如通过静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下或粘膜内途径给药。本发明药物组合物的有效剂量范围可从几毫微克至几十毫克/公斤体重/天，但针对每个特定病人的具体用药剂量将根据待治疗疾病或病理状态的性质及严重程度、病人的年龄、体重、对药物的反应能力及给药方式等因素而定。
[0038] 应特别指出的是，尽管更深入的作用机理尚不明确，但我们的实验室已证明本发明的mGnRH-PE38m4a蛋白质对包括结肠癌HT-29细胞、卵巢癌OVCAR3细胞、子宫颈腺癌HeLa细胞及肝癌HepG-2细胞等肿瘤细胞系均有明显的特异结合活性和细胞毒性。附图说明
[0039] 图1显示用于表达mGnRH-PE38m4a的重组质粒结构示意图。
具体实施方式
[0041] 实施例1：mGnRH-PE38m4a融合蛋白质的制备
[0042] (1)重组表达质粒的构建与鉴定
[0043] a.基因合成：在中国专利200810051112.4实施例1中构建了表达载体PET-11a-mGnRH-PE38m4a，其中mGnRH和PE38m4a基因之间利用NdeI内切酶进行连接，本发明中参考已经公开认知的转硫酶A和SUMO酶识别底物序列，人工体外合成如下序列：
[0044] NcoI内切酶+转硫酶A+HIS6+SUMO酶识别底物序列+mGnRH+NdeI内切酶基因序列SEQ ID NO：1，本合成序列经NcoI、NdeI双酶切形成粘性末端，以正确的阅读框架在T4连接酶(Promega)存在下插入到同样酶切的PET-11a-mGnRH-PE38m4a载体中，构建转硫酶A+HIS6+SUMO酶识别底物序列+mGnRH+PE38m4a融合蛋白双链表达基因，所述融合蛋白重组基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2
[0045] b.构建的载体转化感受态大肠杆菌JM105细胞，并将被转化的细胞培养于含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养基中，以扩增质粒DNA。培养完成后，破碎细胞，离心收集质粒并纯化质粒DNA测序，测序正确的质粒将被转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，用酶切鉴定法和琼脂糖凝胶(2％)电泳法进行鉴定，然后阳性重组质粒进行DNA序列分析。图1显示了重组质粒PET-11a-TRXA-SUMO-mGnRH-PE38m4a的构建。
[0046] (2)TRXA-SUMO-mGnRH-PE38m4a融合蛋白质的表达及产物的纯化：
[0047] 将携带重组基因质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)(含有T7RNA聚合酶基因)培养在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂平皿上。培养后挑选氨苄青霉素抗性菌落，于含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养基中37℃培养，当A600达到约0.4～0.6时加入1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)(终浓度1mM)，37℃继续培养3小时，以诱导目的产物的表达。然后离心分离细胞和培养基，并将含有目的蛋白质的菌体中加入缓冲液成分，终浓度达50mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，超生破碎，4℃离心(20，000g，30分钟)，取上清(可溶性部分)即为融合蛋白粗提物。
[0048] 粗提物经过缓冲液平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow柱(Pharmacia)，用含有0～0.5M NaCl的TE缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)连续梯度洗脱，并收集蛋白质各组分峰部分。目的组分峰部分经小型中空纤维超滤器(Milipore)作用30分钟超滤浓缩换液后，使浓缩物通过用20mM Tris-HCl，pH8.0，0.15M NaCl，20mM咪唑缓冲液平衡过的XK1.6×10cm IMAC柱(Pharmacia)，并用含有0.15M NaCl的缓冲液(20mM Tris·HCl，pH8.0，200mM咪唑)洗脱。收集目的蛋白峰部分并进行10倍稀释，利用SUMO酶切目的蛋白，30℃，4hr，并再次以相同条件进行IMAC液相色谱柱，收集流川峰部分并在30mM PBS中彻底透析，透析后于-20℃下储存备用，如此纯化的蛋白质SEQ ID NO.3，纯度＞97％。
[0049] 实施例2：利用MTT法测定两种工艺制备的mGnRH-PE38m4a对Hela细胞活性作用。
[0050] 细胞毒性试验：
[0051] 将培养的Hela单层细胞经胰蛋白酶消化，吹打收集细胞悬液，利用细胞计数板记数后，调整细胞数量为60000个/ml，按照80μl/孔加入到96孔培养板中(每孔5000细胞)，5％CO2，37℃条件下培养4h。调整两种工艺制备的mGnRH-PE38m4a蛋白质样品浓度为1mg/ml，定量的样品经过滤除菌，按等倍稀释法将不同量的样品加入各细胞孔中，然后补足培养基，使之总体积为100ul，5％CO2，37℃条件下培养12h，培养板各孔中分别加入100μl的MTT染色试剂，5％CO2，37℃条件下继续培养4h，于490nm波长下测定吸光值，计算融合蛋白对Hela肿瘤细胞的50％蛋白质合成抑制的浓度(IC50)结果见表1。
[0052] 表1：两种工艺产物对比
[0053]样品类型 200810051112.4工艺 本发明工艺
Hela细胞IC50 0.245μg/ml 0.213μg/ml
产量(1gram bacteria) 1.15mg 2.58mg
纯化步骤 5 3
每mg费用 3.40元 1.05元
Hela细胞IC50 0.245μg/ml 0.213μg/ml
产量(1gram bacteria) 1.15mg 2.58mg
纯化步骤 5 3
每mg费用 3.40元 1.05元
[0054] 由于本发明的工艺样品纯化简单，操作时间短，样品活性保持好，本发明的工艺所生产的样品活性超过原工艺样品活性的15％。
[0055] 以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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