技术领域
[0001] 本
发明涉及生物技术、生物医用材料及组织工程技术领域，具体为一种基于聚天冬氨酸衍生物的可注射水凝胶的制备方法。
背景技术
[0002] 人的生命活动过程不可避免的会遭受
疾病困扰和意外创伤。对于各种原因导致的器官和组织的缺损，目前临床上主要常用的
治疗手段是组织和器官的移植和人工装置的代替，但是临床手术存在的不易塑性、易诱发
炎症和免疫反应等问题。用可注射型水凝胶负载抗生素或成骨细胞，用于病灶部位的填充或修复组织的连接，可以很好的避免临床手术存在的一系列问题，可以
加速骨组织重建速度和完善术后效果，具有很好的应用前景。
[0003] 化学交联的可注射性水凝胶因其具有较好的机械性能、组织相容性、
生物相容性等优点，已经广泛应用于药物缓释系统、细胞载体和组织工程
支架等。但是一般情况下，无论是热引发、光引发或化学反应引发的原位聚合反应或交联剂反应，通常都会用到有毒性的
有机溶剂、小分子交联剂或者催化剂，在支架
凝固成型的过程中，这些有毒物质可能给细胞及生物活性分子带来不利的影响。另一方面，目前大部分可注射水凝胶由天然高分子组成，此类高分子由于来源上的差异，
质量、分子量分布等指标缺乏
稳定性，并存在一定的免疫原性，在医学应用上有较多的局限性。
发明内容
[0004] 本发明的目的是针对上述存在的问题，提供一种基于聚天冬氨酸衍生物的可注射水凝胶的制备方法，该制备方法利用带有酰肼基和
醛基
侧链的聚（α,β-L-天冬氨酸），通过形成腙键进行化学交联，在生理条件下制备水凝胶，不需要加入任何小分子催化剂或交联剂，生物相容性好，体系具有pH敏感性，可广泛应用于生物医药领域。
[0005] 本发明的技术方案：
[0006] 一种基于聚天冬氨酸衍生物的可注射水凝胶的制备方法，步骤如下：
[0007] 1）利用热缩聚反应制成聚琥珀酰亚胺（PSI）：
[0008] 以L-天冬氨酸为原料，以
磷酸为催化剂，以环丁砜和1，3，5-三
甲苯的混合溶剂为反应溶剂，在氮气氛围和
温度为180-220℃条件下混合进行热缩聚反应，机械搅拌4.5小时，并在反应过程中用水分离器除去反应生成的水及挥发的溶剂，然后趁热用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解产物，搅拌条件下在40℃水浴中恒温2小时，使聚琥珀酰亚胺全部溶解于DMF中，将上清液倒入沉淀剂甲醇中沉淀、离心，将得到的离心产物再重复一次上述溶解、沉淀、离心的操作，将离心产物用丙
酮洗涤三次，再用蒸馏水洗涤至洗涤液pH值呈中性，4000rpm离心沉淀物，50℃
真空干燥24小时，得到浅粉色固体聚琥珀酰亚胺；
[0009] 2）以水合肼为亲核
试剂进攻聚琥珀酰亚胺进行开环反应得到聚天冬氨酸酰肼(PAHy)：
[0010] 将聚琥珀酰亚胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中，磁
力搅拌至完全溶解制得聚琥珀酰亚胺溶液，在氮气保护的氛围下，将水合肼溶液逐滴加入上述溶液中，滴加速度为2～5滴/分钟，滴加完成后在24-26℃温度下磁力搅拌反应4小时，将反应液倒入丙酮中沉淀，将抽滤得到的沉淀物溶于水中，得到棕色溶液，用
透析袋透析24h，经
冷冻干燥后得到的固体即为聚天冬氨酸酰肼；
[0011] 3）将3-氨基丙二醇和
乙醇胺依次进攻聚琥珀酰亚胺进行开环反应，得到聚3-氨基-1,2-丙二醇改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）(APDOL-PHEA)：
[0012] 将聚琥珀酰亚胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中，磁力搅拌至完全溶解制得聚琥珀酰亚胺溶液，在氮气的氛围下，将3-氨基丙二醇的N,N-二甲基甲酰胺溶液逐滴加入到聚琥珀酰亚胺的溶液中，滴加速度为2～5滴/分钟，滴加完成后，60℃回流反应8h，待体系冷却至室温后加入过量的乙醇胺，继续反应6h，反应结束后用旋蒸的方法除去70%的N,N-二甲基甲酰胺，将反应液用丙酮沉淀，抽滤并用丙酮洗涤沉淀物三次，真空干燥24h，得到的产物即为聚3-氨基-1,2-丙二醇改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）；
[0013] 4）将高碘酸钠水溶液与聚3-氨基-1,2-丙二醇改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）水溶液进行
氧化反应制备醛基改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）(ALD-PHEA)：
[0014] 将聚3-氨基-1,2-丙二醇改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）水溶液和高碘酸钠水溶液分别置于0℃的
冰盐水浴中，预冷30min后，将高碘酸钠水溶液加入到聚（2-羟乙基天冬酰胺）水溶液中，避光反应30min，然后加入过量的乙二醇，继续搅拌30min，所得溶液直接透析24h，冷冻干燥后得到的产物即为醛基改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）；
[0015] 5）水凝胶的形成反应：
[0016] 将聚天冬氨酸酰肼和醛基改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）分别溶于磷酸缓冲溶液(PBS溶液)中，置于37℃水浴下恒温30min，将等质量浓度的两种溶液等体积混合，体系的流动性很快变差，形成目标物水凝胶。
[0017] 所述热缩聚反应中，磷酸的重量百分比浓度为85%，磷酸的的用量为每100g的L-天冬氨酸加7.5mL；反应溶剂中环丁砜与1，3，5-三甲苯的体积比为3:7，反应溶剂的用量为每100g的L-天冬氨酸为225mL；溶解产物的N,N-二甲基甲酰胺的用量为每克产物加入4mL；上清液与沉淀剂甲醇的体积比为1:10。
[0018] 所述水合肼的开环反应中，N,N-二甲基甲酰胺的用量为每克聚琥珀酰亚胺加入10mL；水合肼溶液的重量百分比浓度为85%，聚琥珀酰亚胺与水合肼的摩尔比为1:12.5；反应液与丙酮的体积比为1:10，透析袋的截留分子量为7000道尔顿。
[0019] 所述3-氨基丙二醇和乙醇胺与聚琥珀酰亚胺的开环反应中，N,N-二甲基甲酰胺的用量为每克聚琥珀酰亚胺加入10mL；3-氨基丙二醇的N,N-二甲基甲酰胺溶液中每克3-氨基丙二醇加入5mL；3-氨基丙二醇与聚琥珀酰亚胺的摩尔比为0.4-0.6:1；乙醇胺与聚琥珀酰亚胺的摩尔比为1.5-1:1；反应液与丙酮的体积比为1:10。
[0020] 所述氧化反应中，高碘酸钠水溶液的浓度为0.3M，聚3-氨基-1,2-丙二醇改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）水溶液的浓度为0.3g/mL，高碘酸钠与聚3-氨基-1,2-丙二醇改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）中邻二羟基的摩尔比为2.5:1。
[0021] 所述水凝胶的形成反应中，聚天冬氨酸酰肼和醛基改性的聚（2-羟乙基天冬溶液的重量百分比浓度为5-10%，PBS溶液为pH7.4，PBS溶液的盐浓度组成：PBS溶液的盐浓度组成：NaCl为7.99g/L、KCl为0.22g/L、KH2PO4为0.26g/L、Na2HPO4为1.15g/L。
[0022] 本发明的优点是：该制备方法合成简便、易于实施、制造成本低；以天冬氨酸作为主链，通过调节醛化度和
聚合物溶液的初始浓度可以很好地实现对凝胶的性能如说成胶时间、溶胀性能以及表观机械强度的控制；形成凝胶时间短，可作为注射型水凝胶广泛用于药物载体和组织工程支架材料。
附图说明
[0023] 图1为本
专利所设计到的聚合物和水凝胶的FT-IR谱图。
[0024] 图2为醛基改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）的1H NMR谱图。
[0025] 图3为
实施例1制备的水凝胶冻干样品的SEM图。
[0026] 图4为实施例2制备的水凝胶冻干样品的SEM图。
具体实施方式
[0027] 实施例1：
[0028] 一种基于聚天冬氨酸衍生物的可注射水凝胶的制备方法，步骤如下：
[0029] 1）利用热缩聚反应制成聚琥珀酰亚胺：
[0030] 称取13.3g L-天冬氨酸粉末，1mL重量百分比浓度为85%的磷酸加入100mL的三口瓶中，按体积比为3:7的比例加入环丁砜与1，3，5-三甲苯作为混合反应溶剂，共30mL；氮气氛围下控制温度180-220℃，机械搅拌4.5小时，用水分离器除去反应过程中生成的水及挥发的溶剂；反应开始时，L-Asp为白色晶体分散在溶剂中，随着反应温度的升高，有大量的浅黄色黏稠
块状物生成，即为中间体聚琥珀酰亚胺；反应结束后，趁热用DMF溶解产物，每克混合物加入4mL的DMF；搅拌条件下在40℃水浴中恒温2h，此时混合物中的聚琥珀酰亚胺全部溶解于DMF中，将上清液倒入10倍体积的甲醇中沉淀，离心，得到的离心产物重复上述溶解、沉淀、离心操作，即再用DMF溶解，每克混合物加入4mL的DMF，10倍体积的甲醇中沉，离心；离心产物用丙酮洗涤三次，再用蒸馏水洗涤至洗涤液pH值呈中性，4000rpm离心沉淀物，50℃真空干燥24小时，得到浅粉色固体聚琥珀酰亚胺9.1g，产率94%。用极限
粘度法测得聚琥珀酰亚胺的聚合度为306。
[0031] 2）以水合肼为亲核试剂，进攻聚琥珀酰亚胺进行开环反应得到聚天冬酰肼。
[0032] 称取真空干燥的聚琥珀酰亚胺0.97g，溶于10mL的DMF中，磁力搅拌至形成澄清液；将14.7g质量分数为85%的水合肼溶液逐滴加入上述溶液中，滴加速度2-5滴/分钟；中间出现粉红色沉淀，继续滴加沉淀消失，溶液变澄清；将反应液倒入10倍体积的丙酮中沉淀，抽滤，得到沉淀物溶于水中，得到棕色溶液，用截留分子量为7000道尔顿的透析袋透析24h；冷冻干燥后得到的固体产物聚天冬氨酸酰肼，得到产物0.87g，产率67.44%。
[0033] 3）以3-氨基丙二醇和乙醇胺为亲核试剂，依次进攻聚琥珀酰亚胺进行开环反应，得到聚3-氨基-1,2-丙二醇改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）(APDOL-PHEA)：
[0034] 称取真空干燥的聚琥珀酰亚胺0.97g，溶于10mL N,N-二甲基甲酰胺中，磁力搅拌至完全溶解制得聚琥珀酰亚胺溶液；称取0.364g3-氨基丙二醇溶到1.82mL DMF中，在氮气的氛围下，将3-氨基丙二醇的DMF溶液，逐滴加入到聚琥珀酰亚胺的溶液中，滴加速度2-5滴/分钟；60℃回流反应8h，待体系冷却至室温后加入0.915g的乙醇胺，继续反应6h；反应结束后用旋蒸的方法除去70%的DMF，将得到的产物浓缩溶液3-5mL，倒入10倍体积的丙酮中沉淀，抽滤，并丙酮洗涤三次，产物真空干燥24h，得到聚3-氨基-1,2-丙二醇改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）。
[0035] 4）以0.3M的高碘酸钠为
氧化剂将聚3-氨基-1,2-丙二醇改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）氧化为醛基改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）(APDOL-PHEA)：
[0036] 将聚3-氨基-1,2-丙二醇改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）1.7g溶于5.7mL的蒸馏水中，将聚合物的水溶液和0.3M的高碘酸钠水溶液分别置于0℃的冰盐水浴中，预冷30min；然后将33.3mL的高碘酸钠水溶液加入到聚（2-羟乙基天冬酰胺）的水溶液中，避光反应30min，然后加入5mL的乙二醇，继续搅拌30min，中止反应，所得溶液直接透析24h，冷冻干燥，得到的产物即为醛基改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）。
[0037] 5）将50mg聚天冬氨酸酰肼和50mg醛基取代的聚（2-羟乙基天冬酰胺）分别溶于溶于1mL的pH=7.4的磷酸缓冲溶液，PBS溶液的盐浓度组成为：NaCl7.99g/L、KCl0.22g/L、K2HPO4·3H2O0.23g/L和Na2HPO41.15g/L中，置于37℃水浴下恒温30min，将两种溶液均匀混合，即可形成水凝胶。
[0038] 在扫描电镜下观察水凝胶冷冻干燥样品的微观形貌。具体说明如下：水凝胶在-40℃中预冻24h，-80℃冷冻干燥24h。将冷冻干燥样品，切成1cm×1cm小块，
镀金，用扫描电镜对样品内部剖面结构进行观测。由扫描电镜结果可以看出该水凝胶具有很好的多孔性网络结构。扫描电镜图片如图3所示。
[0039] 该实施例中，采用红外谱图来判断聚琥珀酰亚胺是否开环完全，具体说明如下：采用FTS6000(BIO-RAD,USA)型红外谱仪进行测定。如图1所示，聚琥珀酰亚胺的红外
光谱图-1上在1717和1796cm 处有两个特征吸收峰，是由于两个相邻羰基偶合作用产生的，说明了聚琥珀酰亚胺的酰亚胺环状结构。开环反应以后，PAHY、APDOL-PHEA和ALD-PHEA的红外谱-1
图中1717和1796cm 处的吸收峰消失，证明PSI开环完全。
[0040] 采用
核磁共振氢谱来计算ALD-PHEA中醛基的取代度，具体说明如下：采用Varian1
UNITY plus-400型核磁共振波谱仪进行测定，TMS为内标，氘代D2O为溶剂。H NMR的质子
1
共振
频率为400.07MHz，
采样时间为1.997s，偏转
角为45°。如图2所示，通过 H NMR谱图中d和b的质子
信号峰面积可以计算出共聚物中醛基的取代度。计算结果显示：产物中醛基的取代度为29%。
[0041] 实施例2：
[0042] 一种基于聚天冬氨酸衍生物的可注射水凝胶的制备方法，步骤如下：
[0043] 1）聚琥珀酰亚胺的制备同实施例1。
[0044] 2）聚天冬氨酸酰肼的制备同实施例1。
[0045] 3）以3-氨基丙二醇和乙醇胺为亲核试剂，依次进攻聚琥珀酰亚胺进行开环反应，得到聚3-氨基-1,2-丙二醇改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）(APDOL-PHEA)：
[0046] 称取真空干燥的聚琥珀酰亚胺0.97g，溶于10mL DMF中，磁力搅拌至完全溶解制得聚琥珀酰亚胺溶液；称取3-氨基丙二醇0.455g加到2.3mL DMF中，在氮气的氛围下，将3-氨基丙二醇的N,N-二甲基甲酰胺溶液逐滴加入到聚琥珀酰亚胺的溶液中，滴加速度2-5滴/分钟；60℃回流反应8h，待体系冷却至室温后加入0.762g的乙醇胺，继续反应6h；反应结束后，用旋蒸的方法除去70%的DMF，将得到的产物浓缩溶液3-5mL，倒入10倍体积的丙酮中沉淀，抽滤，并丙酮洗涤三次，产物真空干燥24h，得到聚3-氨基-1,2-丙二醇改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）。
[0047] 4）以0.3M的高碘酸钠为氧化剂将聚3-氨基-1,2-丙二醇改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）氧化为醛基改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）(ALD-PHEA)：
[0048] 将聚3-氨基-1,2-丙二醇改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）1.73g溶于5.8mL的水中，将聚合物的水溶液和0.3M的高碘酸钠水溶液分别置于0℃的冰盐水浴中，预冷30min；然后，将41.7mL的高碘酸钠水溶液加入到聚（2-羟乙基天冬酰胺）的水溶液中，避光反应
30min，再加入5mL的乙二醇，继续搅拌30min，中止反应，所得溶液直接透析24h，冷冻干燥，得到的产物即为醛基改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）。
[0049] 5）将50mg聚天冬氨酸酰肼和50mg醛基取代度聚（2-羟乙基天冬酰胺）分别溶于溶于1mL的pH=7.4的磷酸缓冲溶液，PBS溶液的盐浓度组成与实施例1相同，置于37℃水浴下恒温30min，将两种溶液均匀混合，即可形成水凝胶。
[0050] 在扫描电镜下观察水凝胶冷冻干燥样品的微观形貌。具体说明如下：水凝胶在-40℃中预冻24小时，-80℃冷冻干燥24小时。将冷冻干燥样品，切成1cm×1cm小块，镀金，用扫描电镜对样品内部剖面结构进行观测。由扫描电镜结果可以看出该水凝胶具有很好的多孔性网络结构。扫描电镜图片如图4所示。
[0051] 聚合物中醛基取代度的测定方法同实施例1，如图2所示，计算结果显示：产物中醛基的取代度为35%。
[0052] 实施例3：
[0053] 1）聚琥珀酰亚胺的制备同实施例1。
[0054] 2）聚天冬氨酸酰肼的制备同实施例1。
[0055] 3）以3-氨基丙二醇和乙醇胺为亲核试剂，依次进攻聚琥珀酰亚胺进行开环反应，得到聚3-氨基-1,2-丙二醇改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）(APDOL-PHEA)：
[0056] 称取真空干燥的聚琥珀酰亚胺0.97g，溶于10mL N,N-二甲基甲酰胺中，磁力搅拌至完全溶解制得聚琥珀酰亚胺溶液；称取3-氨基丙二醇0.546g溶于2.73mL DMF中，在氮气的氛围下，将3-氨基丙二醇的DMF溶液逐滴加入到聚琥珀酰亚胺的溶液中，滴加速度2-5滴/分钟；60℃回流反应8h，待体系冷却至室温后加入0.610g的乙醇胺，继续反应6h；反应结束后，用旋蒸的方法除去70%的DMF，将得到的产物浓缩溶液3-5mL，倒入10倍体积的丙酮中沉淀，抽滤，并丙酮洗涤三次，产物真空干燥24h，得到聚3-氨基-1,2-丙二醇改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）。
[0057] 4）以0.3M的高碘酸钠为氧化剂将聚3-氨基-1,2-丙二醇改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）氧化为醛基改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）(APDOL-PHEA)：
[0058] 将聚3-氨基-1,2-丙二醇改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）1.76g溶于5.9mL的水中，将聚合物的水溶液和0.3M的高碘酸钠水溶液分别置于0℃的冰盐水浴中，预冷30min然后将50mL的高碘酸钠水溶液加入到聚（2-羟乙基天冬酰胺）的水溶液中，避光反应30min，再加入5mL的乙二醇，继续搅拌30min，中止反应，所得溶液直接透析24h，冷冻干燥，得到的产物即为醛基改性的聚（2-羟乙基天冬酰胺）。
[0059] 5）将50mg聚天冬氨酸酰肼和50mg醛基取代度聚（2-羟乙基天冬酰胺）分别溶于溶于1mL的pH=7.4的磷酸缓冲溶液，PBS溶液的盐浓度组成与实施例1相同，置于37℃水浴下恒温30min，将两种溶液均匀混合形成水凝胶。
[0060] 聚合物中醛基取代度的测定方法同实施例1，如图2所示，计算结果显示：产物中醛基的取代度为50%。
