传统的疫苗接种技术涉及到将能在动物体内诱导免疫应答的抗 原导入动物体，从而保护动物不受感染，已有多年历史。继90年代 初观察到DNA质粒能够直接转染体内动物细胞后，人们开始致力于 发展通过直接向动物体内导入编码抗原多肽的DNA来诱导免疫应答 的疫苗接种技术。这些被称为“DNA免疫”或“DNA疫苗接种”技 术已被广泛地应用于在病毒、细菌和寄生虫疾病的临床前模型中诱 导保护性抗体(体液)和细胞介导(细胞)的免疫应答。用DNA疫苗接 种技术来治疗和预防癌症、过敏和自身免疫性疾病的研究也在进行 中。
DNA疫苗通常由细菌质粒载体构成，包含插入的强启动子、编 码抗原肽的目的基因和多聚腺苷酸/转录终止序列。目的基因编码的 免疫原可以是完整蛋白或仅仅是与病原体、肿瘤或其他有意要预防 的因子有关的抗原性肽序列。质粒可以在细菌，例如大肠杆菌中扩 增，然后分离并根据拟定的用药途径，在给宿主用药前在适当的介 质中制备。
与DNA疫苗有关的有用的背景信息在″Donnelly，J等Annual Rev.Immunol.(1997)15：617-648；Ertl P.和Thomsen L.，Technical issues in construction of nucleic acid vaccines Methods.2003 Nov；31(3)： 199-206中有描述，其公开通过引用被整体结合到本文中。
与传统疫苗接种技术相比DNA疫苗接种技术有多种优点，首 先，推测由于DNA序列编码的蛋白质是在宿主体内合成，蛋白的结 构或构型应该与疾病的相关天然蛋白相似。DNA疫苗诱导识别保守 蛋白表位的细胞毒性T淋巴细胞反应，也有可能对同种病毒的不同 株产生预防作用；再者，由于质粒被直接导入宿主细胞，抗原蛋白 在宿主细胞内产生，所以可以诱导一个持续的免疫应答；该技术还 为将不同的免疫原构建入单一制剂以促进针对数种疾病的同步免疫 提供了可能。
尽管与传统疫苗接种疗法相比DNA疫苗接种有众多优点，仍然 希望开发出佐剂化合物以增强用于动物体的质粒DNA编码的蛋白质 所诱导的免疫反应。
DNA疫苗接种有时涉及到免疫反应从Th1到Th2反应的偏离， 尤其是当DNA表皮直接给药时(Fuller和Haynes，Hum.Retrovir.(1994) 10：1433-41)。已经认识到所需核酸疫苗产生什么样的免疫类型取决 于所要针对的疾病。一个倾向于引起Th1反应的刺激很可能提供针 对许多病毒性疾病和肿瘤的疫苗效应；Th2型为主的反应可能对抑制 一些自身免疫性疾病有关的过敏和炎症有效。因此，定量诱导免疫 反应或使免疫反应转换到对所针对疾病的最有效的类型的方法可能 会有用处。
树突状细胞在组织中以未成熟的形式存在，在组织受到感染或 其他组织损伤的情况下，作为反应，树突状细胞向受损组织迁移， 在那里它们吞噬、加工、提呈来自受损组织的肽并迁移至淋巴结。 树突状细胞将肽与协同刺激分子一起提呈到表面主要组织相容复合 物(MHC)分子中。提呈与协同刺激分子一起的MHC中的肽的树突状 细胞被定义为“成熟”树突状细胞。成熟树突状细胞能够与T细胞 相互作用，使能够识别所提呈的肽的T细胞被激活，从而激发起免 疫反应来消除损伤发生的原因(例如，入侵的细菌)。
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是能够诱导一系列具 有免疫功能的细胞的分化、增殖和激活的细胞因子。GM-CSF诱导 树突状细胞从骨髓前体细胞到未成熟树突状细胞状态，即表达低水 平协同刺激标记和高水平抗原摄取受体的细胞的增殖。
Toll样受体(TLRs)为I型跨膜受体，在昆虫与人之间存在进化保 守性。现在已发现10个TLRs(TLRs 1-10)(Sabroe等，JI 2003 p1630- 5。TLR家族成员有着相似的细胞外和细胞内功能域，其细胞外功 能域有着富含亮氨酸的重复序列，细胞内功能域与白介素1受体(IL- 1R)的细胞内功能域类似。TLR在免疫细胞和其他细胞(包括血管上 皮细胞、脂肪细胞、心肌细胞和肠道上皮细胞)上差异化表达。TLR 的细胞内功能域能与衔接子蛋白Myd88相互作用，引起细胞因子的 NF-KB激活，Myd88的胞质区也含有IL-1R功能域；该Myd88通 路是一条受TLR激活的影响的细胞因子释放通路。TLR主要表达在 抗原提呈细胞类细胞上(例如树突状细胞、巨噬细胞等)。
通过刺激TLRs激活树突状细胞引起树突状细胞的成熟，并且产 生炎性细胞因子如IL-12。迄今进行的研究发现TLRs识别不同类型 的激动剂，虽然一些激动剂为几个TLRs共有。TLRs激动剂主要来 自细菌或病毒，包括如鞭毛蛋白或细菌脂多糖(LPS)这样的分子。
咪唑并喹啉化合物咪喹莫特和瑞喹莫德为抗病毒小化合物。咪 喹莫特被用于人乳头状瘤病毒引起的尖锐湿疣(genital wart)的局部治 疗；瑞喹莫德也被试验性用于尖锐湿疣的治疗。咪喹莫特和瑞喹莫 德被认为是通过TLR-7和/或TLR-8信号传导通路并且激活Myd88 活化通路发挥作用的。
本发明已经确认了能够有效改善免疫反应，尤其是当用于DNA 疫苗接种的佐剂时改善细胞免疫反应的特定的佐剂联合。
发明概述
根据本发明的实施方案，提供一种佐剂组合物，包括：
(i)TLR激动剂，或编码TLR激动剂的核苷酸序列
(ii)编码GM-CSF的核苷酸序列
其中成份(i)和(ii)在功能上互相合作以强化哺乳动物对抗原的免 疫反应。
GM-CSF指GM-CSF全分子或其能够诱导骨髓前体细胞转变成 未成熟树突状细胞的任何片段。图2显示了小鼠GM-CSF的多核苷 酸基因序列。人GM-CSF的DNA序列从Genbank数据库获得(检索 号M11220-Ref.Lee，F.等PNAS 82(13)4360-4364(1985))。
在一个实施方案中，佐剂用于人用疫苗，该GM-CSF序列为人 序列(见图22)。
本发明的核苷酸序列，例如，编码GM-CSF的核苷酸序列可以 含于带有调节控制序列的质粒中。例如，核苷酸序列可以在疫苗载 体p7313中(具体描述见WO 02/08435)，受人巨细胞病毒(CMV)即早 期(IE)启动子的调节控制。
“TLR激动剂”指一种要么能够作为直接配体，要么能够间接 产生内源或外源配体而通过TLR信号通路引起信号反应的成分 (Sabroe等，JI 2003 p1630-5)。
在本发明的一个实施方案中，成分(i)是能够通过TLR-1引起信 号反应的TLR激动剂(Sabroe等，JI 2003 p1630-5)。在一个实施方案 中，能够通过TLR-1引起信号反应的TLR激动剂选自三酰化脂肽 (LPs)；酚溶性调节蛋白；结核分枝杆菌LP；S-(2，3-双(棕榈酰氧基)- (2-RS)-丙基)-N-棕榈酰-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH，三盐酸盐 (Pam3Cys)LP，其模拟细菌脂蛋白和来自布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorfei)的OspA LP的乙酰化氨基酸末端。
在一个可选性实施方案中，成分(i)为能够通过TLR-2引起信号 反应的TLR激动剂(Sabroe等，JI 2003 p1630-5)。在一个实施方案中， 能够通过TLR-2引起信号反应的TLR激动剂是来自结核分枝杆菌(M tuberculosis)、布氏疏螺旋体、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)的 一种或多种细菌脂肽；来自包括金黄色葡萄球菌(Staphylococci aureus) 菌种的肽聚糖；脂磷壁酸、甘露糖醛酸、奈瑟氏球菌孔蛋白(Neisseria porins)、细菌菌毛、耶尔森氏菌毒力因子、CMV病毒颗粒、麻疹凝 血素和来自酵母的酵母多糖。
在一个可选性实施方案中，成分(i)是能够通过TLR-3引起信号 反应的TLR激动剂(Sabroe等，JI 2003 p1630-5)。在一个实施方案中， 能够通过TLR-3引起信号反应的TLR激动剂是双链RNA或聚肌胞 苷酸(Poly IC)，一种与病毒感染有关的分子核酸模式。
在一个可选性实施方案中，成分(i)是能够通过TLR-4引起信号 反应的TLR激动剂(Sabroe等，JI 2003 p1630-5)。在一个实施方案中， 能够通过TLR-4引起信号反应的TLR激动剂是来自革兰氏阴性菌的 一种或多种脂多糖(LPS)或其片段；热休克蛋白(HSP)10、60、65、70、 75或90；表面活性蛋白A、类透明质酸寡糖、硫酸乙酰肝素片段、 纤连蛋白片段、纤维蛋白原肽和b-防御素-2。在一个实施方案中，TLR 激动剂是HSP 60、70或90。在一个可选性实施方案中，够通过TLR-4 引起信号反应的TLR激动剂是无毒性的LPS衍生物，单磷酰脂A(MPL) 就是这样的无毒性衍生物之一，由去除还原端葡萄糖胺的糖基团和 磷酸而得。Ribi等对MPL进行过描述(1986，Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins，Plenum Publ.Corp.，NY， p407-419)。可在本发明中被用作TLR激动剂的MPL有下述结构：

一个进一步去毒的MPL类型，由去除双糖骨架第3位上的酰基 链而得，被称为3-O-去酰基单磷酰脂A(3D-MPL)。3D-MPL是可以 被用于本发明的TLR激动剂。它可以根据GB 2122204B中提供的方 法进行纯化和制备，GB 2122204B的参考文献中也公开了制备二磷 酰脂A和其3-O-去酰基变异体的方法。一种形式的3D-MPL是含有 直径小于0.2μm的颗粒的乳剂，其制备方法公开在WO 94/21292中。 含有单磷酰脂A和表面活性物质的水性制剂在WO9843670A2中有 公开。其他纯化和合成无毒性LPS衍生物的方法见US 6,005,099和 EP 0 729 473 B1；Hilgers等.，1986，Int.Arch.Allergy.Immunol.，79 (4)：392-6；Hilgers等，1987，Immunology，60(1)：141-6；和EP 0 549 074 B1。
能够用于本发明TLR激动剂的无毒性LPS衍生物或细菌脂多糖 可以从细菌中纯化加工获得，或任选性地通过合成获得。例如，Ribi 等在1986年(supra)已公开纯化的单磷酰脂A的方法。提取自沙门氏 菌种(Lalmonella sp.)的3-O-去酰基单磷酰脂A或双磷酰脂A在GB 2220211和US 4912094上有描述。其他纯化和合成脂多糖的方法见 US 6,005,099和EP 0 729 473 B1；Hilgers等，1986，IntArch.Allergy. lmmunol.，79(4)：392-6；Hilgers等.，1987，Immunology，60(1)：141-6； 和EP 0 549 074 B1。细菌脂多糖佐剂可为3D-MPL和β(1-6)葡萄糖胺 二糖，见US6,005,009和EP 0 729 473 B1。
相应的，其他可用作本发明中的TLR激动剂的为那些在结构上 与LPS或MPL或3D-MPL类似的免疫刺激物。在本发明的另一个 方面中LPS衍生物可以是酰化单糖，其结构为以上MPL结构的一部 分。
双糖激动剂可以是具有下式的纯化的或合成的脂质A：

其中R2可以是H或PO3H2，R3可以是酰基链或β-羟十四酰基 或具有下列结构的3-酰氧基酰基残基：

其中
其中X和Y的值可以从0到20。
另外一个更加无毒的、与LPS结构几乎不同源的、纯粹合成的 LPS衍生物在WO 00/00462中有描述，其内容通过引用全部结合到 本文中。
在一个备选实施方案中，成分(i)是能够通过TLR-5引起信号反 应的TLR激动剂(Sabroe等，JI 2003 p1630-5)。在一个实施方案中， 能够通过TLR-5引起信号反应的TLR激动剂是细菌鞭毛蛋白。
在一个备选实施方案中，成分(i)是能够通过TLR-6引起信号反 应的TLR激动剂(Sabroe等，JI 2003 p1630-5)。在一个实施方案中， 能够通过TLR-6引起信号反应的TLR激动剂是分枝杆菌脂蛋白、双 酰基化LP和酚溶性调节蛋白。进一步的TLR6激动剂在 WO2003043572中有描述。
在一个备选实施方案中，成分(i)是能够通过TLR-7引起信号反 应的TLR激动剂(Sabroe等，JI 2003 p1630-5)。在一个实施方案中， 能够通过TLR-7引起信号反应的TLR激动剂是洛索立宾，N7和C8 位的鸟苷类似物或咪唑并喹啉化合物或其衍生物。在一个实施方案 中，TLR激动剂是咪喹莫特，进一步的TLR7激动剂在WO02085905 中有描述。
在一个备选方案中，成分(i)是能够通过TLR-8引起信号反应的 TLR激动剂(Sabroe等，JI 2003 p1630-5)。在一个实施方案中，能够通 过TLR-8引起信号反应的TLR激动剂是具有抗病毒活性的咪唑并喹 啉分子，例如瑞喹莫德(R848)，瑞喹莫德也能被TLR-7识别。其他 可用的TLR-8激动剂包括WO2004071459中描述的那些。
在一个备选实施方案中，TLR激动剂是咪喹莫特。在另一个实 施方案中TLR激动剂是瑞喹莫德。
一个备选方案中，成分(i)是能够通过TLR-9引起信号反应的TLR 激动剂(Sabroe等，JI 2003 p1630-5)。在一个实施方案中，能够通过 TLR-9引起信号反应的TLR激动剂是HSP90。任选性的，能够通过 TLR-9引起信号反应的TLR激动剂是含有未甲基化的CpG核苷酸的 DNA，特别是被称为CpG基序的序列。
含CpG的寡核苷酸诱导以Th1为主的反应。这样的寡核苷酸为 人们所熟知，其描述见，例如WO 96/02555，WO 99/33488和美国专 利号6,008,200和5,856,462。
在一个实施方案中，CpG核苷酸是CpG寡核苷酸。
在一个实施方案中，CpG核苷酸是其免疫刺激性寡核苷酸区含 有至少一个CG未甲基化的二核苷酸基序的寡核苷酸组合物。该免疫 刺激序列常为：嘌呤、嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶；其中该二核苷酸 CG基序是没有被甲基化的。
在一个实施方案中，CpG核苷酸含有两个或多个二核苷酸CpG 基序，中间有至少3个或至少6个或更多的核苷酸相隔。本发明中 的CpG核苷酸为典型的脱氧核糖核苷酸。
在一个实施方案中，寡核苷酸的核苷酸内键为二硫代磷酸酯键。 在一个进一步的实施方案中，寡核苷酸的核苷酸内键为硫代磷酸酯 键，尽管磷酸酯和其他核苷酸内键，包括带有混合核苷酸内键的寡 核苷酸也在本发明的范围内。生成硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯寡核 苷酸的方法在US5,666,153、US5,278,302和WO95/26204上有描述。
CpG核苷酸的例子有以下序列，这些序列可以含有修饰了的硫 代磷酸酯核苷酸内键。
OLIGO 1(SEQ ID NO：17)：TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)
OLIGO 2(SEQ ID NO：18)：TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)
OLIGO 3(SEQ ID NO：19)：ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
OLIGO 4(SEQ ID NO：20)：TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006)
OLIGO 5(SEQ ID NO：21)：TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)
任选性的，CpG寡核苷酸可以包括含有不重要部位的缺失和添 加的以上序列。
用于本发明中的CpG核苷酸可以用本领域所知的任何方法(例如 EP 468520)合成，常规情况下，这样的CpG核苷酸合成可以用自动 合成仪来完成。
本发明中所用的CpG核苷酸为典型的脱氧核糖核苷酸。在一个 实施方案中，寡核苷酸的核苷酸内键是二硫代磷酸酯键。在进一步 的实施方案中，寡核苷酸的核苷酸内键是硫代磷酸酯键，虽然磷酸 二酯键在本发明的范围之内。含有不同核苷酸内键也被认同，例如 硫代磷酸酯键和磷酸酯键的混合。其他能够稳定寡核苷酸的核苷酸 内键也可使用。
在一个备选实施方案中，成分(i)是能够通过TLR-10引起信号反 应的TLR激动剂。任选性的，该TLR激动剂能够通过以上任何两个 或更多的TLR的联合引起信号反应。
可以用于本发明的特殊的TLR激动剂包括TLRs2、4、7或8的 激动剂。
在另一个备选实施方案中，可以使用一个以上的TLR激动剂的 联合。在本发明的一个实施方案中使用了TLR-4的激动剂和TLR-7 的激动剂。
在本发明的一个实施方案中，成分(i)不能通过TLR-9引起信号 反应。
本发明不限于这里列出的TLR激动剂；其他天然的配体或合成 的TLR激动剂也可被用于本发明。
在本发明的一个实施方案中，TLR激动剂能够通过TLR-7引起 信号反应。在本发明的一个实施方案中，TLR激动剂是一个咪唑并 喹啉化合物或其衍生物。在一个进一步的实施方案中，咪唑并喹啉 或其衍生物是一种由任何一个如这里所定义式I-VI定义的化合物。 在一个进一步的实施方案中，咪唑并喹啉或其衍生物由式VI所定义。 在一个方案中，咪唑并喹啉或其衍生物是式VI化合物，选自：
1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；
1-(2-羟基-2-甲基丙基)-2-甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；
1-(2-羟基-2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；
1-(2-羟基-2-甲基丙基)-2-乙氧基甲基-1-H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4- 胺。
在一个进一步的实施方案中，咪唑并喹啉或其衍生物是咪喹莫 特或瑞喹莫德。该咪唑并喹啉或其衍生物可以是咪喹莫特。在本发 明的一个实施方案中，当咪唑并喹啉或其衍生物是咪喹莫特时，该 咪喹莫特以膏状制剂的形式用于局部。可用的咪喹莫特膏状制剂的 实例是AldaraTM膏5％(3M)。在本发明的一个可选性方案中，当咪 唑并喹啉或其衍生物是瑞喹莫德时，该瑞喹莫德被制成口服或皮内 用药的制剂。在本发明的一个方案中，成分(ii)和(iii)是多核苷酸序列， 为伴随给药，成分(i)是咪唑并喹啉，例如咪喹莫特，为局部用药，例 如制成膏状制剂，在成分(ii)和(iii)被给予后的12和36小时之间，例 如在成分(ii)和(iii)被给予后的24小时或约24小时给药。
在本发明的一个实施方案中，编码本发明中的成分(i)、(ii)或(iii) 的核苷酸序列是DNA。在进一步的实施方案中，核苷酸序列或多核 苷酸分子在质粒DNA中编码。
在一个本发明的佐剂组合物的实施方案中，编码成分(i)和成分(ii) 的核苷酸序列在同一个质粒中共同编码。
在一个实施方案中，佐剂成分(i)是编码以下一种或多种能够用 作TLR激动剂或其能够用作TLR激动剂的部分的核苷酸序列：β-防 御素、HSP60、HSP70、HSP90或其他低分子的可用作TLR激动剂 的HSP、纤连蛋白和鞭毛蛋白。
在一个备选实施方案中，佐剂成分(i)的TLR激动剂是以下一种 或多种能够用作TLR激动剂的物质或其能够用作TLR激动剂的部 分：
TLR-1激动剂，如三酰化脂肽；酚溶性调节蛋白；结核分枝杆 菌LP；S-(2，3-双(棕榈酰氧基)-(2-RS)-丙基)-N-棕榈酰-(R)-Cys-(S)- Ser-(S)-Lys(4)-OH，三盐酸盐(Pam3Cys)LP；其模拟细菌脂蛋白和来 自布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorfei)的OspA LP的乙酰化氨基酸末 端；
TLR-2激动剂，如来自结核分枝杆菌、布氏疏螺旋体、苍白密 螺旋体的一种或多种细菌脂肽；来自包括金黄色葡萄球菌菌种的肽 聚糖、脂磷壁酸、甘露糖醛酸、奈瑟氏球菌孔蛋白、细菌菌毛、耶 尔森氏菌毒力因子、CMV病毒颗粒、麻疹凝血素和来自酵母的酵母 多糖；
TLR-3激动剂，如双链RNA或聚肌胞苷酸(Poly IC)，一种与病 毒感染有关的分子核酸模式；
TLR-4激动剂，如来自革兰氏阴性菌的一种或多种脂多糖(LPS) 或其片段；热休克蛋白(HSP)10、60、65、70、75或90；表面活性 蛋白A、类透明质酸寡糖、硫酸乙酰肝素片段、纤连蛋白片段、纤 维蛋白原肽和b-防御素-2、无毒性的LPS衍生物如单磷酰脂A(MPL)；
TLR-5激动剂，如细菌鞭毛蛋白；
TLR-6激动剂，如分枝杆菌脂蛋白、双酰基化LP和酚溶性调节 蛋白；
TLR-7激动剂，如洛索立宾，N7和C8位的鸟苷类似物或咪唑 并喹啉化合物或其衍生物，如咪喹莫特或瑞喹莫德。
TLR-8激动剂，如具有抗病毒作用的咪唑并喹啉分子，如瑞喹 莫德；
TLR-9激动剂，如HSP90或含有未甲基化的CpG核苷酸的 DNA，特别是被称为CpG基序的序列。
用于与成分(ii)伴随给药或依序给药。在一个方案中，成分(i)是 前述TLR激动剂之一。
本发明进一步提供包括这里描述的佐剂成分(i)、(ii)和含有编码 抗原性肽或蛋白的核苷酸序列的免疫原成分(iii)的一种或一类免疫原 性组合物。
在本发明的一个实施方案中，成分(i)由核苷酸序列编码，并且 编码成分(i)、(ii)和(iii)的核苷酸序列被包含在一个或同一多核苷酸分 子内。
在本发明的一个进一步的实施方案中，成分(i)由核苷酸序列编 码，并且编码成分(i)、(ii)和(iii)的核苷酸序列被包含在分开的多核苷 酸分子内，用于伴随给药或依序给药。
任选性的，编码(i)、(ii)和(iii)中任何两个的核苷酸序列可以包含 于一个或同一多核苷酸分子，余下的核苷酸序列可以由另外的多核 苷酸分子编码，用于伴随用药和依序给药。编码成分(ii)和(iii)的核苷 酸序列可以包含于一个或同一多核苷酸分子，编码成分(i)的核苷酸序 列可以由另外的多核苷酸分子编码，用于伴随用药和依序给药。
在本发明的一个方案中，其中成分(i)、(ii)和/或(iii)被包含在 分开的多核苷酸分子中，这些多核苷酸分子各自可以含于分开的质 粒中，用于伴随或依序导入。在一个方案中，伴随导入被使用。
在本发明的一个实施方案中，编码成分(i)的核苷酸序列和编码 成分(ii)的核苷酸序列被包含于一个或同一多核苷酸分子中。
在一个备选实施方案中，编码成分(i)的核苷酸序列和编码成分(ii) 的核苷酸序列由含于分开核苷酸分子上的核苷酸序列编码，用于伴 随给药或依序给药。
伴随给药指基本上同时地给药，即指药物成分在同一时间被给 予，或如果不是同一时间，也至少是相互间隔在几分钟之内。任选 性的，成分相互间在1、2、3、4、5或10分钟之内被给予。在一个 治疗方案中，佐剂成分(i)和(ii)几乎与编码免疫原(iii)的核苷酸序列同 时给药。显然，该方法可根据需要进行改变。
在本发明的一个实施方案中，成分(i)为咪唑并喹啉或其衍生物， 与成分(ii)和(iii)在分开的组合物中，用于伴随或依序给药。在一个实 施方案中，咪唑并喹啉化合物或其衍生物在分开的组合物中，在给 予成分(ii)和(iii)后依序给药。在另一个实施方案中，咪唑并喹啉化合 物或其衍生物在给予成分(ii)和(iii)的2、4、6、8、10、12或24小时 后被给予。在一个实施方案中，咪唑并喹啉化合物或其衍生物在给 予成分(ii)和(iii)的24小时时或约24小时时被给予。在一个进一步的 实施方案中，咪唑并喹啉化合物或其衍生物为膏状制剂用于局部， 该膏剂在给予成分(ii)和(iii)的24小时后使用。在本发明的一个可选 性方案中，咪唑并喹啉化合物或其衍生物以可溶性制剂给药，例如 但不限于皮下给药。咪唑并喹啉化合物或其衍生物可以在给予成分(ii) 和(iii)的6到24小时后被给予，或给予成分(ii)和(iii)后的下一个工作 日被给予。给予成分(ii)和(iii)可以被包装进金微珠内用颗粒介导的药 物导入法导入病人的皮肤，例如用EP0500799中描述的“基因枪”。
在本发明的进一步的实施方案中，也提供编码γ干扰素(IFN-γ) 的核苷酸序列。IFN-γ可以在与成分(i)、(ii)或(iii)中任一个分开的核 苷酸序列上提供。在本发明的一个实施方案中，成分(i)为编码TLR 激动剂的核苷酸序列，IFN-γ可以与编码一种或多种成分(i)、(ii)或(iii) 的核苷酸序列共编码。任何其余成分可以在分开的核苷酸序列中编 码，或在单一的另外的核苷酸序列中共编码。
在一个实施方案中，IFN-γ在编码成分(ii)或(iii)的核苷酸序列中 编码，或成分(ii)或(iii)和IFN-γ在同一或分开的质粒分子中编码，成 分(i)提供在分开的组合物中，用于伴随或依序给药。例如，成分(ii) 或(iii)和IFN-γ在分开的质粒分子中编码。在一个实施方案中，成分 (i)可以是咪唑并喹啉化合物或其衍生物，例如咪喹莫特。
在本发明的进一步方案中，也提供编码CD40配体(CD40L)的核 苷酸序列。CD40L可以由不同于任何成分(i)、(ii)或(iii)的核苷酸序列 提供。在本发明的一个实施方案中，成分(i)是编码TLR激动剂的核 苷酸序列，CD40L可以在编码一种或多种成分(i)、(ii)或(iii)的核苷酸 序列中编码。任何其余的成分可以在分开的核苷酸序列中编码，或 在另外的单一核苷酸序列中共同编码。
在一个实施方案中，CD40L在编码成分(ii)或(iii)的核苷酸序列 中编码，成分(ii)或(iii)和CD40L在同一或分开的质粒分子中编码， 成分(i)在分开的组合物中提供，用于伴随或依序给药。例如，成分(ii) 或(iii)和CD40L在分开的质粒分子中编码。在一个实施方案中，成 分(i)可以是咪唑并喹啉化合物或其衍生物，例如咪喹莫特。
这里提到的所有核苷酸序列可以是RNA或DNA序列。此外， 所有核苷酸序列可以包含在或构建于DNA质粒中。
在一个实施方案中，成分(ii)和(iii)被用于伴随用药，含有编码成 分(ii)和(iii)的核苷酸序列的质粒可以被导入同一细胞或相邻细胞。在 一个方案中，质粒被导入相邻细胞，经表达使表达成分释放到同一 微环境中。在一个实施方案中，成分(i)在分开的组合物中提供用于伴 随或依序导入。在一个进一步的实施方案中，为伴随导入。在一个 备选实施方案中，成分(i)提供在分开的组合物中，在成分(ii)和(iii) 导入后的12到24小时后导入。成分(i)可以在导入成分(ii)和(iii)的同 一部位导入。同一部位指成分(i)可以在成分(ii)和(iii)导入的15cm、 5cm、1cm内或同一注射位点导入。在本发明的一个可选实施方案中， 一种或多种成分可以在不同的注射部位给药。在一个实施方案中， 所有成分均在流注到同一淋巴结或淋巴结群的位点给药。
在本发明的一个实施方案中，编码(iii)的核苷酸序列编码能够引 起体内免疫反应的MUC-1蛋白或其衍生物，这种免疫反应能够识别 表达MUC-1的肿瘤细胞或肿瘤。
在本发明的一个进一步实施方案中，编码(iii)的核苷酸序列编码 能够引起免疫反应的P501S蛋白或其衍生物，这种免疫反应能够识 别表达P501S蛋白的肿瘤细胞或肿瘤。
本发明进一步提供包含本发明的一种或一类免疫原性组合物和 药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的疫苗组合物。
本发明进一步提供生产免疫原性组合物的方法，包括将本发明 的佐剂成分(i)和(ii)与含有编码抗原性肽或蛋白的核苷酸序列的免疫 原性成分(iii)混合。在一个实施方案中，该方法包括将编码佐剂(ii)和 编码免疫原性成分(iii)混合，佐剂成分(i)或编码佐剂成分(i)的核苷酸 序列提供在分开的组合物中，用于伴随或依序给药。任选性的，该 方法包括使编码佐剂成分(ii)的核苷酸分子和编码免疫原成分(iii)的核 苷酸在同一个多核苷酸分子上共同编码，佐剂分子(i)或编码佐剂分子 (i)的核苷酸序列在分开的组合物中提供，用于伴随或依序给药。
在一个任选实施方案中，提供的方法是使编码成分(i)、(ii)和(iii) 的核苷酸序列在分开的多核苷酸序列中编码，用于伴随或依序给药。 在另一个进一步的实施方案中，提供的方法是使编码成分(i)、(ii)和(iii) 的核苷酸序列中的任何两个共同编码形成一个单一的多核苷酸分 子，其余的核苷酸序列由另一个多核苷酸序列编码，用于伴随或依 序给药。任选性的，编码成分(i)、(ii)和(iii)的核苷酸序列共同编码形 成一个单一的多核苷酸分子。
在一个实施方案中，方法中所用的核苷酸序列是DNA，可能用 于方法中的核苷酸序列在质粒DNA中编码。在一个备选实施方案中， 使用的方法是将编码成分(ii)和(iii)的核苷酸序列构建入一个质粒中， 佐剂成分(i)在分开的组合物中提供，用于伴随或依序给药。
一个进一步的实施方案中的方法提供将这些成分加入到药学上 可接受的赋形剂、稀释剂或载体中。
本发明进一步提供一种或一类药用组合物，包括本发明的佐剂 成分(i)和(ii)；含编码抗原性肽或蛋白质的核苷酸序列的免疫原成分 (iii)；和一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
任选性的，本发明提供包含这里描述的一种或一类免疫原性组 合物和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体的一种或一类药用组 合物。
本发明进一步提供一个包含有药用组合物的试剂盒，包括有佐 剂成分(ii)；免疫原成分(iii)和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体 的药用组合物；和另一个含有佐剂成分(i)和药学上可接受的赋形剂、 稀释剂或载体的药用组合物，其中，佐剂成分(i)含有TLR激动剂， 或编码TLR激动剂的核苷酸；佐剂成分(ii)含有编码GM-CSF的核苷 酸；佐剂成分(iii)含有编码抗原性肽或蛋白的核苷酸序列。在一个实 施方案中，至少一种载体为金微珠，且至少一种药用组合物是由颗 粒介导的药物导入方式导入。在一个进一步的实施方案中，成分(ii) 和(iii)的载体为金微珠，佐剂成分(i)被制成伴随或依序给药的制剂。 本发明的一个方面是提供一个将一种或多种成分(ii)和(iii)的核苷酸序 列包装入一定数量金微珠的方法。在本发明的一个实施方案中，成 分被包装进分开的金微珠中，用药前再混合到一起。在一个备选实 施方案中，成分被包装进同样数量的金微珠中。在一个进一步的实 施方案中，成分(ii)和(iii)被包装入金微珠中，成分(i)在分开的组合物 中提供，以用于伴随或依序给药。
本发明进一步提供一种通过给予安全和有效剂量的这里描述的 免疫原性组合物、疫苗组合物或药用组合物来治疗患有肿瘤或易患 肿瘤的患者的方法。在一个实施方案中，被治疗的肿瘤为表达MUC- 1或P501S的肿瘤，被治疗的肿瘤可以是乳腺癌、肺癌，包括非小细 胞性肺癌，或前列腺、胃和其他胃肠道癌。
本发明进一步提供一个增强哺乳动物对抗原的免疫反应效果的 方法，该方法包括给予哺乳动物下列成分：
(i)TLR激动剂，或编码TLR激动剂的核苷酸
(ii)编码GM-CSF的核苷酸
(iii)含有编码抗原肽或蛋白的核苷酸序列的免疫原成分
在一个实施方案中，该方法包括用成分(i)、(ii)和(iii)中的任何两 种伴随给药，余下的成分依序给药。任选性的，该方法包括将成分(i)、 (ii)和(iii)依序给药。在一个进一步的实施方案中，伴随给药的成分被 配制成分开的组合物。在本发明的一个方法中，成分(ii)和(iii)伴随给 药，成分(i)在分开的组合物中提供，用于伴随或依序给药。在一个实 施方案中，成分(i)为咪唑并喹啉或其衍生物，成分(i)可以是咪喹莫特， 且可以是AldaraTM膏(3M)的形式用于成分(ii)和(iii)给药位点或附近区 域局部给药。
为生产治疗或预防表达MUC-1和P501S的肿瘤的药物，本发明 进一步提供含有下列成分的免疫原性组合物，
(i)TLR激动剂，或编码TLR激动剂的核苷酸
(ii)编码GM-CSF的核苷酸(iii)含有编码MUC-1和P501S抗原肽 或蛋白的核苷酸序列的免疫原成分
本发明进一步提供一种在哺乳动物体内诱导针对疾病状态的免 疫反应的方法，包括给予哺乳动物含于合适载体中的编码与疾病有 关的抗原性肽的核苷酸序列；另外给予哺乳动物含于合适载体中的 编码GM-CSF的核苷酸序列；并且进一步给予哺乳动物咪唑并喹啉 或其衍生物以诱导免疫反应。
本发明进一步提供增强哺乳动物针对免疫原的免疫反应的方 法，其步骤包括给予哺乳动物含于合适载体中的编码能够刺激起免 疫反应的有效量免疫原的核苷酸序列和编码GM-CSF的核苷酸序 列；并且进一步给予哺乳动物有效剂量的咪唑并喹啉或其衍生物以 增强免疫反应。
本发明进一步提供给予这里所描述的任何一种组合物的方法。
本发明进一步提供在药物生产中使用咪唑并喹啉或其衍生物和 GM-CSF来增强由抗原性肽或蛋白诱导的免疫反应的方法，该抗原 性肽或蛋白的表达由给予哺乳动物编码该肽的核苷酸序列所引起。
本发明进一步提供在药物生产中使用下列(i)到(iii)成分来加强对 由核苷酸序列编码的抗原的免疫反应的方法：
(i)TLR激动剂，或编码TLR激动剂的核苷酸
(ii)编码GM-CSF的核苷酸
(iii)含有编码抗原性肽或蛋白的核苷酸序列的免疫原成分
本发明进一步提供在生产两种或多种用于哺乳动物伴随或依序 用药的药物中使用下列(i)到(iii)成分来加强对由核苷酸序列编码的抗 原的免疫反应的方法：
(i)TLR激动剂，或编码TLR激动剂的核苷酸
(ii)编码GM-CSF的核苷酸
(iii)含有编码抗原性肽或蛋白的核苷酸序列的免疫原成分
本发明进一步提供在生产哺乳动物伴随或依序用药的药物中使 用下列(i)到(iii)成分来加强对由核苷酸序列编码的抗原的免疫反应的 方法，其中各成分被制成分开的药物。
(i)TLR激动剂，或编码TLR激动剂的核苷酸
(ii)编码GM-CSF的核苷酸
(iii)含有编码抗原性肽或蛋白的核苷酸序列的免疫原成分
这里描述的一种或一类佐剂组合物可以被用于一个“仅仅初敏” 方案或“初敏-加强”方法的“初敏”和/或“加强”阶段中，所用“初 敏-加强”方法可以包含两种核酸疫苗，或可以包含两种不同的疫苗 制剂(一种为核酸，一种为蛋白)。“初敏-加强”方法的例子Barnett 等在Vaccine 15：869-873(1997)中有描述，他们制备两种不同的疫苗 制剂(一种为DNA，一种为蛋白质)，在不同的时间，以特定的顺序 分开给药。
在一个实施方案中，这里描述的组合物用于疫苗接种策略的“初 敏”阶段。
发明详述
在整个的说明书和附加的权利要求中，除非内容中另有要求，   “包含”和“包括”等被解释为包含，这些单词的使用暗示可能包 含没有特别提到的数字或元素。此外“包含”在各种情况下可以任 选被“由...组成”取代。
此外，整个说明书和附加权利要求中，除了关系到实验数据、 实施例和图，术语“GM-CSF”在各种情况下可任选被术语“IFNγ” 取代，反之亦然。在本发明的一个实施方案中，成分(ii)是编码IFN- γ的核苷酸序列，成分(i)可为TLR-2、4、7或8的TLR激动剂。
正如以上所描述，本发明涉及到免疫原性组合物、疫苗组合物 和疫苗接种方法，并且涉及到疫苗接种方法的改良，所述方法包括 将编码作为免疫原的抗原性蛋白或肽的核苷酸序列导入哺乳动物， 这样蛋白或肽将在哺乳动物体内表达从而在哺乳动物体内诱导出抗 该抗原性蛋白或肽的免疫反应。这种疫苗接种的方法已为人们所熟 知，并在以上引用的Donnelly等和Ertl等的参考文献中有系统描述。
正如这里所用，术语免疫原性组合物指
(i)TLR激动剂，或编码TLR激动剂的核苷酸序列
(ii)编码GM-CSF的核苷酸序列
(iii)含有编码抗原性肽或蛋白的核苷酸序列的免疫原成分
的联合。其中成分(i)和成分(ii)在功能上相互协同以增强哺乳动 物体针对免疫原成分(iii)的免疫反应。
这里的联合指，例如，三种成分被混合在一起形成一个药学上 可接受的单一制剂形式，或分开的单独成分形式，例如包括有佐剂 成分(i)和(ii)和免疫原成分(iii)的试剂盒形式，其中三种成分分开给 药、依序给药或同时给药。在一个实施方案中，三种成分用伴随给 药的形式给药。在本发明的一个进一步的实施方案中，成分(ii)和(iii) 伴随给药，成分(i)在成分(ii)和(iii)用药前单独给药。在本发明的一个 进一步方案中，成分(ii)和(iii)伴随给药，成分(i)在成分(ii)和(iii)用药 后单独给药。
整个说明书和附加权利要求中提到的咪唑并喹啉或其衍生物可 以是以下式I-VI中的一个所定义的化合物：

其中，
R11选自直链或支链烷基、羟基烷基、酰基氧基烷基、苯甲基、(苯 基)乙基和苯基，所述苯甲基、(苯基)乙基或苯基取代基任选在苯环 上被一个或两个独立地选自1到约4个碳原子的烷基、1到约4个碳 原子的烷氧基和卤素的部分取代，前提条件是如果苯环被两个所述 部分取代，这两个部分所含的碳原子加起来不超过6个。R21选自氢、 1到约8个碳原子的烷基、苯甲基、(苯基)乙基和苯基，所述苯甲基、 (苯基)乙基或苯基取代基在苯环上任选被一个或两个独立地选自1到 约4个碳原子的烷基、1到约4个碳原子的烷氧基和卤素的部分取代， 前提条件是如果苯环被两个部分取代，这两个部分所含的碳原子加 起来不超过6个。各R1独立地选自氢、1到约4个碳原子的烷氧基、 卤素和含1到约4个碳原子的烷基，其中n为0-2的整数，前提条件 是如果n为2，R11所含碳原子数加起来不得超过6个。

其中
R12选自含有2到约10个碳原子的直链或支链烯基，且取代的 直链或支链烯基含有2到约10个碳原子，其中取代基选自1到约4 个碳原子的直链或支链烷基和含3到约6个碳原子的环烷基；含3 到约6个碳原子的环烷基被含1到约4个碳原子的直链或支链烷基 取代。R22选自氢、含1到约8个碳原子的直链或支链烷基、苯甲基、 (苯基)乙基和苯基的化合物，所述苯甲基、(苯基)乙基或苯基取代基 在苯环上任选被一个或两个独立地选自1到约4个碳原子的直链或 支链烷基、1到约4个碳原子的直链或支链烷氧基和卤素取代，前提 条件是如果苯环被两个这样的部分取代，这两个部分所含的碳原子 不超过6个。各R2独立地选自1到约4个碳原子的直链或支链烷氧 基、卤素和含1到约4个碳原子的直链或支链烷基，其中n为0-2的 整数，前提条件是如果n为2，R2所含碳原子数一共不得超过6个。

其中
R23选自氢、含1到约8个碳原子的直链或支链烷基、苯甲基、(苯 基)乙基和苯基，所述苯甲基、(苯基)乙基或苯基取代基在苯环上任 选被一个或两个独立地选自1到约4个碳原子的直链或支链烷基、1 到约4个碳原子的直链或支链烷氧基和卤素取代，前提条件是如果 苯环被两个部分取代，这两个部分所含的碳原子一共不超过6个。 各R5独立地选自1到约4个碳原子的直链或支链烷氧基、卤素和30 个1到约4个碳原子的直链或支链烷基，其中n为0-2的整数，前提 条件是如果n为2，R3所含碳原子数一共不得超过6个。

其中
R14是-CHRARB，其中RB是氢或碳-碳键，前提条件是当RB是氢 时，RA为1到约4个碳原子的烷氧基、含1到约4个碳原子的羟基 烷氧基、2到约10个碳原子的1-炔基、四氢吡喃基、烷氧基烷基(其 中烷氧基部分含1到约4个碳原子，烷基部分含1到约4个碳原子)、 2-、3-、或4-吡啶基，进一步的前提条件是当RB为碳-碳键时，RB 和RA一起形成四氢呋喃基，其任选被一种或多种独立地选自1到约 4个碳原子的羟基、羟基烷基的取代基取代。R24选自氢、1到约4个 碳原子的烷基、苯基和取代苯基，其中所述取代基选自1到约4个 碳原子的烷基、1到约4个碳原子烷氧基和卤素。R4选自氢、含1到 约4个碳原子的直链或支链烷氧基、卤素和含1到约4个碳原子的 直链或支链烷基。

其中
R15选自：氢、含1到约10个的碳原子的直链或支链烷基和被 取代的含1到约10个碳原子的直链或支链烷基，其中取代基选自含 有3到约6个碳原子的环烷基和被含1到约4个碳原子的直链或支 链烷基取代的含有3到约6个碳原子的环烷基；含有2到约10个碳 原子的直链或支链烯基和被取代的含有2到约10个碳原子的直链或 支链烯基，其中取代基选自含有3到约6个碳原子的环烷基和被含1 到约4个碳原子的直链或支链烷基取代的含有3到约6个碳原子的 环烷基；含有1到约6个碳原子的羟基烷基；烷氧基烷基，其中烷 氧基部分含1到约4个碳原子，烷基部分含1到约4个碳原子；酰 氧基烷基，其中酰氧基部分为含2到约4个碳原子的烷酰氧基或苯 甲酰氧基，烷基部分含1到约6个碳原子；苯甲基、(苯基)乙基和苯 基，所述苯甲基、(苯基)乙基和/或苯基取代基在苯环上任选被一个或 两个独立地选自1到约4个碳原子的烷基、1到约4个碳原子的烷氧 基和卤素的部分取代，前提条件是如果苯环被两个部分取代，这两 个部分所含的碳原子一共不超过6个。
R25为：

其中
Rx和Ry独立地选自氢、1到约4个碳原子的烷基、苯基和取代 苯基，其中取代基选自含1到约4个碳原子的烷基、含1到约4个 碳原子的烷氧基和卤素。X选自含1到约4个碳原子的烷氧基；烷 氧基烷基，其中烷氧基部分含1到约4个碳原子，烷基部分含1到 约4个碳原子；含有1到约4个碳原子的卤代烷基；烷基酰氨基， 其中烷基含有1到约4个碳原子；氨基；取代氨基，其中取代基为 含1到约4个碳原子的烷基和羟基烷基；叠氮基；1到约4个碳原子 的烷硫基；R5选自氢、含1到约4个碳原子的直链或支链烷氧基、 卤素和含1到约4个碳原子的直链或分自链的烷基；或任何前述的 药学上可接受的盐。
烷基可以是C1-C4烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-甲基丙基和 丁基。烷基可以是甲基、乙基和2-甲基丙基。烷氧基可以是甲氧基、 乙氧基和乙氧基甲基。
以上提到的化合物和它们的制备方法在PCT专利申请公开号 WO 94/17043中有公开。
在n可以是0、1或2的情况下，n可以是0或1。
以上提到的取代基R1-R5这里通常被指定为“苯取代基(benzo substitute)”，该苯取代基可以是氢。
以上提到的取代基R11-R15这里通常被指定为“1-取代基”，该1- 取代基可以是2-甲基丙基或2-羟基-2-甲基丙基。
以上提到的取代基R21-R25这里通常被指定为“2-取代基”，该 2-取代基可以是氢；含1到约6个碳原子的烷基；烷氧基烷基，其中 烷氧基部分含1到约4个碳原子，烷基部分含1到约6个碳原子。 该2-取代基可以是氢、甲基或乙氧基甲基。
1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺可以是以下式VI所定义的化合物

其中
Rt选自氢、含1到约4个碳原子的直链或支链烷氧基、卤素、 和含1到约4个碳原子的直链或支链烷基。
Ru为2-甲基丙基或2-羟基-2-甲基丙基；
Rv为氢；含1到约6个碳原子的烷基；或烷氧基烷基，其中烷 氧基部分含1到约4个碳原子，烷基部分含1到约4个碳原子；或 以上提到的任何的生理上可以接受的盐。
在式VI中，Rt可以是氢，Ru可以是2-甲基丙基或2-羟基-2-甲 基丙基，Rv可以是氢、甲基或乙氧甲基。
1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺可以包括以下化合物：
1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(式VI的化合物，其 中Rt是氢，Ru是2-甲基丙基，Rv是氢)
1-(2-羟基-2-甲基丙基)-2-甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(式VI 的化合物，其中Rt是氢，Ru是2-羟基-2-甲基丙基，Rv是甲基)
1-(2-羟基-2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(式VI的化合 物，其中Rt是氢，Ru是2-羟基-2-甲基丙基，Rv是氢)
1-(2-羟基-2-甲基丙基)-2-乙氧基甲基-1-H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺 (式VI的化合物，其中Rt是氢，Ru是2-羟基-2-甲基丙基，Rv是乙氧 基甲基)；
或这些化合物的生理上可接受的盐。
疾病状态
本申请的疫苗接种方法和组合物可能被用来预防或治疗各种哺 乳动物疾病状态例如病毒、细菌或寄生虫感染，癌症、过敏和自身 免疫性疾病。本发明的方法或组合物能够预防或治疗的疾病和紊乱 的具体例子如下：
病毒感染
肝炎病毒A、B、C、D和E、HIV、疱疹病毒1、2、6和7、巨 细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、乳头瘤病毒、EB病毒、流感病毒、 付流感病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、微小核糖核酸病毒、轮状病毒、 呼吸道合胞病毒、痘病毒、鼻病毒、风疹病毒、乳多空病毒(paponirus)、 腮腺炎病毒及麻疹病毒。
细菌感染
引起结核和麻风的分枝杆菌、肺炎球菌(pneumocci)、需氧革兰 氏阴性杆菌、支原体、葡萄球菌感染、链球菌感染、沙门氏菌和衣 原体感染。
寄生虫
疟疾、利什曼、非洲锥虫、弓形体、血吸虫和丝虫感染。
癌症
乳腺癌、结肠癌、直肠癌、头颈部癌、肾癌、恶性黑色素瘤、 喉癌、卵巢癌、子宫颈癌和前列腺癌。
过敏
尘螨、花粉和其他环境过敏原引起的引起的鼻炎。
自身免疫性疾病
系统性红斑狼疮
在一个实施方案中，本发明的方法或组合物被用于预防或治疗 病毒性疾病乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳头状瘤病毒、人免 疫缺陷病毒、或单纯疱疹病毒感染；细菌性疾病结核；乳腺癌、结 肠癌、卵巢癌、宫颈癌和前列腺癌；或自身免疫性疾病哮喘、风湿 性关节炎和阿尔茨海默病。
应该知道这些疾病状态只是作为例子被提出来，不是用来限制 本发明的范围。
抗原或免疫原
本申请中提到的成分(iii)的核苷酸序列，编码在哺乳动物体内表 达的抗原或免疫原，为了诱导出抗原性反应，可以编码整个蛋白或 只是能够引起抗原性反应的短肽。在整个说明书和附加的权利要求 中，短语“抗原性肽”或“免疫原”有意包括能够在目标动物体诱 导出免疫反应的所有肽或蛋白序列。在一个实施方案中，核苷酸序 将编码与疾病状态有关的整个蛋白质，因为完整蛋白质在哺乳动物 体内的表达更能够模拟天然抗原的提呈，所以能够激起全方位的免 疫反应。一些非限制性的与特殊疾病有关的已知的抗原性肽包括如 下：
能够诱导出抗人体病原的免疫反应的抗原，其抗原或抗原性组 合物来自HIV-1，(如tat，nef，gp120 or gp160，gp40，p24，gag，env，vif， vpr，vpu，rev)；人疱疹病毒，如gH，gL gM gB gC gK gE or gD或其衍 生物或即早蛋白，如HSV1或HSV2的ICP27，ICP 47，IC P4，ICP36； 巨细胞病毒，尤其是人巨细胞病毒(如gB或其衍生物)，EB病毒(如 gp350或其衍生物)，水痘-带状疱疹病毒(如gpI、II、III核IE63)，或 肝炎病毒，如乙型肝炎病毒(例如乙型肝炎病毒表面抗原或核心抗原 或Pol)，丙型肝炎病毒抗原和丁型肝炎病毒抗原；或其他病毒致病原， 如副粘病毒：呼吸道合胞病毒(如F和G蛋白或其衍生物)，或来自 付流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒的抗原；人乳头状病毒(例如 HPV6，11，16，18，eg L1，L2，E1，E2，E3，E4，E5，E6，E7)；黄病毒(如黄热 病病毒，登革热病毒、森林脑炎病毒、日本脑炎病毒)或流感病毒抗 原(如HA、NP、NA或M蛋白或其联合)；或来自细菌致病原的抗 原，如奈瑟菌属某些种，包括淋球菌(N.Gonorrhoeae)、脑膜炎双球 菌(N.meningitidis)，例如转铁蛋白结合蛋白，乳铁蛋白结合蛋白、PiIC 和粘附素)；化脓性链球菌(S.pyogenes)(例如M蛋白或其片段、C5A 蛋白酶、无乳链球菌(S.agalactiae)、变形链球菌(S.Mutans)；杜克雷嗜 血杆菌(H.ducreyi)；莫拉菌属(Moraxella)某些种，包括卡他莫拉菌(M catarrhalis)，也称卡他布兰汉菌(Branhamella catarhalis)(例如高分子和 低分子重量的粘附素和侵袭素)；博德特菌属某些种(Bordetella ssp)， 包括百日咳鲍特氏菌(B.pertussis)(例如百日咳外膜蛋白、百日咳毒素 或其衍生物、丝状凝血素、腺苷酸环化酶、菌毛)、副百日咳鲍特氏 菌(B.parapeltussis)、支气管腐败杆菌(B.bronchiseptica)；分枝杆菌属 某些种(Mycobacterium spp)，包括结核杆菌(M.tuberculosis)(例如 ESAT6，抗原85A，-B or-C，MPT 44，MPT59，MPT45，HSP10，HSP65， HSP70，HSP 75，HSP90，PPD 19kDa[Rv3763]，PPD 38kDa[Rv0934])， 牛分枝杆菌(M.bovis)、麻风分枝杆菌(M，leprae)、鸟型结核分支杆菌 (M.avium)、副结核杆菌(M.paratuberculosis)、耻垢分支杆菌(M. smegmatis)；军团杆菌属(Legionella spp)，包括嗜肺性退伍军人杆菌(L. pneumophila)；大肠杆菌属的某些种(Escherichia spp)，包括肠毒性大 肠杆菌(E.coli)(例如集落因子、不耐热肠毒素、耐热肠毒素或其衍生 物)、肠出血性大肠杆菌(enterohemorragic E.coli)、病原性大肠杆菌 (enteropathogenic E.coli)(例如shiga毒素样毒素或其衍生物)；弧菌属 细菌的某些种(Vibrio spp)，包括霍乱弧菌(V.cholera)(例如霍乱毒素 或其衍生物)；志贺氏菌属的某些种(Shigella spp)，包括宋内氏志贺杆 菌(S.sonnei)、痢疾志贺菌(S.dysenteriae)、弗氏志贺杆菌(S.flexnerii)； 耶尔森菌属某些种(Yersinia spp)，包括小肠结肠炎耶尔森菌(Y. enterocolitica)(例如Yop蛋白)、鼠疫杆菌(Y.pestis)、假结核耶尔森氏 菌(Y.pseudotuberculosis)；肠弯曲杆菌属的某些种(Campylobacter spp)，包括空肠弯曲菌(C.jejuni)(例如毒素、粘附素和侵袭素)、大肠 弯曲菌(C.coli)；沙门氏菌属的某些种(Salmonella spp)，包括伤寒沙 门菌(S.typhi)、付伤寒沙门菌(S.paratyphi)、霍乱沙门氏菌(S. choleraesuis)、沙门氏肠炎杆菌(S.enteritidis)；李斯特菌属的某些种 (Listeria spp)，包括单核细胞增多李斯特菌(L.monocytogenes)；螺旋 杆菌属的某些种(Helicobacter spp)，包括人幽门螺杆菌(H.pylori)(例 如尿素酶、过氧化氢酶、空泡毒素)；假单胞菌属某些种(Pseudomonas spp)，包括绿脓杆菌(P.aeruginosa)；葡萄球菌属某些种(Staphylococcus spp)，包括金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)； 肠球菌的某些种(Enterococcus spp)，包括粪肠球菌(E faecalis)、屎肠 球菌(E.faecium)；梭菌属某些种(Clostridium spp)，包括破伤风梭菌(C. tetani)(如破伤风毒素或其衍生物)肉毒梭菌(C.botulinum)(如肉毒或 其衍生物)，艰难梭菌(C.difficile)(如梭菌毒素A或B和其衍生物)； 杆菌属的某些种(Bacillus spp)，包括炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)(如肉 毒杆菌毒素和其衍生物)；棒状杆菌属某些种(Corynebacterium spp)， 包括白喉杆菌(C.diphtheriae)(如白喉毒素和其衍生物)；疏螺旋体的 某些种(Borrelia spp)，包括布氏疏螺旋体(B.burgdorferi)(如OspA， OspC，DbpA，DbpB)，加里螺旋体(B，garinii)(如OspA，OspC，DbpA， DbpB)，阿氏疏螺旋体(B.afzelii)(如OspA，OspC，DbpA，DbpB)、 andersonii螺旋体(B.andersonii)(如OspA，OspC，DbpA，DbpB)、赫氏 疏螺旋体(B.hermsii)；埃利希体的某些种(Ehrlichia spp)，包括马埃利 希体(E.equi)和人粒细胞艾利希体因子(Human Granulocytic Ehrlichiosis)；立克次体的某些种(Rickettsia spp)，包括立氏立克次氏 体(R.rickettsii)；衣原体的某些种(Chlamydia spp)，包括沙眼衣原体(C. trachomatis)(如MOMP，肝素结合蛋白)、肺炎衣原体(C.pneumoniae)(如 MOMP，肝素结合蛋白)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)；钩端螺旋体某 些种(Leptospira ssp)，包括问号状钩端螺旋体(L.interrogans)；密螺旋体 某些种(Treponema spp)，包括苍白密螺旋体(T.pallidum)(如罕见外膜 蛋白)、齿垢密螺旋体(T.denticola)、痢疾螺旋体(T hyodysenteriae)； 或来自寄生虫，如疟原虫的某些种(Plasmodium spp)，包括恶性疟原 虫(P.falciparum)；弓形虫的某些种(Toxoplasma spp)，包括刚地弓形 虫(Toxoplasma.gondii)(例如SAG2，SAG3，Tg34)；内阿米巴虫属的 某些种(Entamoeba spp)，包括溶组织阿米巴虫(E.histolytica)；巴贝虫 某些种(Babesia spp)，包括微毛巴贝虫(B.microti)；锥形虫的某些种 (Trypanosoma spp)，包括枯氏锥虫(T.cruzi)；贾第虫某些种(Giardia spp)，包括蓝氏贾第虫鞭毛虫(G.lamblia)；利什曼原虫的某些种 (leishmania spp)，包括硕大利什曼原虫(L.major)；肺囊原虫的某些种 (Pneumocystis spp)，包括卡氏肺囊原虫(P.carinii)；毛滴虫的某些种 (Trichomonas spp)，包括阴道毛滴虫(T.vaginalis)；血吸虫的某些种 (Schisostoma spp)，包括曼氏血吸虫(S.mansoni)；或来自真菌，如假 丝酵母菌属的某些种(Candida spp)，包括白色念珠菌(C.albicans)；隐 球菌属的某种(Cryptococcus spp)，包括新生隐球菌(C.neoformans)。
其他结核杆菌的特异性抗原包括，例如Rv2557，Rv2558，RPFs： Rv0837c，Rv1884c，Rv2389c，Rv2450，Rv1009，aceA(Rv0467)，PstS1， (Rv0932)，SodA(Rv3846)，Rv2031c 16kDal.，Tb Ra12，Tb H9，Tb Ra35， Tb38-1，Erd 14，DPV，MTI，MSL，mTTC2和hTCC1(WO 99/51748)， 结核杆菌的蛋白包括融合蛋白和其变异体，其中至少2或3个结核 杆菌多肽融合成一个较大的蛋白，融合包括Ra12-TbH9-Ra35，Erd14- DPV-MTI，DPV-MTI-MSL，Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2，Erd14- DPV-MTI-MSL，DPV-MTI-MSL-mTCC2，TbH9-DPV-MTI(WO 99/51748)。
在一个实施方案中，衣原体抗原包括，如高分子量蛋白(HWMP) (WO 99/17741)、ORF3(EP 366412)和推定的膜蛋白(Pmps)。疫苗制 剂中的其他衣原体抗原可以选自WO 99/28475中描述的一组蛋白。
在一个实施方案中，细菌疫苗来自链球菌属(Streptococcus)的某 种，包括肺炎双球菌(Streptococcus pneumoniae)(PsaA，PspA，链球菌 溶血素，胆碱结合蛋白)和蛋白抗原肺炎链球菌溶血素(Biochem Biophys Acta，1989，67，1007；Rubins等，Microbial Pathogenesis，25，337- 342)和其突变的去毒衍生物(WO 90/06951；WO 99/03884)。其他细菌 疫苗抗原来自嗜血杆菌的某种(hemophilus spp)，包括B型流感嗜血 杆菌(H influenzae type B)(例如PRP和其结合物)，非分型流感嗜血杆菌 (non typeeble H influenzae)，例如OMP26、高分子量粘附素、P5、P6、 蛋白D和脂蛋白D、丝束蛋白和衍生自丝束蛋白的肽(US 5,843,464) 或其多拷贝变异体或融合蛋白。
可以用于本发明的抗原进一步包括来自引起疟疾的寄生虫，如 来自恶性疟原虫，包括RTS，S和TRAP.RTS为恶性疟原虫环子孢子 (CS)蛋白的几乎整个C-末端通过乙型肝炎病毒表面抗原的前S2区的 4个氨基酸与乙型肝炎表面抗原(S)相连，其完整结构公开在其在WO 93/10152名下发表的国际专利申请PCT/EP92/02591中，WO 93/10152 要求对英国专利申请No.9124390.7.的优先权。当在真菌中表达时， RTS产物为脂蛋白颗粒，当与HBV的S抗原共表达时，形成RTS 和S的混合颗粒。TRAP抗原在发表在WO 90/01496名下的国际专 利申请PCT/GB89/00895中有描述。本发明的一个实施方案是疟疾疫 苗，其中抗原制剂包括RTS、S和TRAP抗原的联合。其他可能作为 多阶段疟疾疫苗成分的候选疟原虫抗原有恶性疟原虫MSP1、 AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、Sequestrin、 PfEMP1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、 Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230和它们在其 他疟原虫中的类似物。
本发明有意将抗肿瘤抗原用于肿瘤的免疫治疗。例如那些针对 前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、肾癌或黑色素瘤 的肿瘤排斥抗原。示例性的抗原包括MAGE 1、3和MAGE 4或其 他MAGE抗原，如WO99/40188中公开的PRAME，BAGE，Lage(也 被称为NY Eos 1)SAGE和HAGE(WO 99/53061)或GAGE(Robbins 和Kawakami，1996，Current Opinions in Immunology 8，pps 628-636； Van den Eynde等，International Journal of Clinical & Laboratory Research(submitted 1997)；Correale等(1997)，Journal of the National Cancer Institute 89，p293。的确，这些抗原在许多不同类型的肿瘤， 如黑色素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌上都有表达。
用于本发明的MAGE抗原可以与表达增强子或免疫性融合配偶 体一起表达为融合蛋白，特别是Mage蛋白可以与来自流感嗜血杆菌 B的蛋白D形成融合蛋白。特别是该融合配偶体可以含有蛋白质D 的前1/3，这样的结构在WO99/40188中有公开。其他含有癌特异性 表位的融合蛋白的例子包括bcr/abl融合蛋白。
在一个实施方案中，前列腺抗原被使用，如前列腺特异抗原 (PSA)、PAP、PSCA(PNAS 95(4)1735-17401998)、PSMA或称为 前列酶(Prostase)的抗原。
前列酶是前列腺特异的丝氨酸蛋白酶(胰蛋白样)，长度为254个 氨基酸，含一个保守的丝氨酸蛋白酶催化三联体H-D-S和一个氨基 端的前原肽(pre-propeptide)序列，提示一种潜在的分泌功能(P.Nelson， Lu Gan，C.Ferguson，P.Moss，R.Gelinas，L.Hood & K. Wand，″Molecular cloning and characterisation of prostase，an androgen- regulated serine protease with prostate restricted expression，In Proc.Natl. Acad.Sci.USA(1999)96，3114-3119)。另有一个推定的糖基化位点。 预测的结构与其他已知的丝氨酸蛋白酶很相似，显示其成熟多肽折 叠成一个单一功能域。该成熟蛋白有224个氨基酸，带有一个自然 加工形成的A2表位。
前列酶核苷酸序列和推论的多肽序列和同源物在Ferguson等 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96，3114-3119上和国际专利申请号 WO 98/12302(也见相应授权专利US 5,955,306)、WO 98/20117(也 见相应授权专利US 5,840,871和US 5,786,148)(前列腺特异性激肽 释放酶)和WO 00/04149(P703P)中有公开。
本发明提供包括基于前列酶蛋白、片段和其同源物(衍生物)的前 列酶蛋白融合物的抗原。这样的衍生物适用于治疗前列腺肿瘤的治 疗性疫苗制剂。典型的片段将含有至少20、50或100连续的氨基酸， 正如以上参考专利和专利申请中公开的那样。
另外一个前列腺抗原被称为P501S，为WO98/37814中的ID 号113的序列，通过引用结合到本文中。P501S是与细胞表面受体相 互作用的膜蛋白。推测它是IIIa型胞质膜蛋白，带有9-11个跨膜区 散布在整个蛋白长度上。P501S与菠菜蔗糖结合蛋白享有同源性 (Riesmeier JW，Willmitzer L，Frommer WB，1992，EMBO J 11，4705- 13)。
也有关于连续且部分重叠的P501S cDNA片段及其编码的多肽 的描述(WO 98/50567)，更具体的是C末端255个氨基酸长度的片段。 在WO 99/67384上描述的一个231个氨基酸长度的多肽被报告含有 一个潜在的跨膜区、两个潜在的酪蛋白激酶II的磷酸化位点、一个 潜在的蛋白激酶C磷酸化位点和一个潜在的细胞附着序列。
US 6,329,505(通过引用结合到本文中)中也对P501S和其构建体 进行了描述。其基因编码的免疫原性片段和部分含有至少20、50或 100个连续氨基酸，正如以上参考专利所公开的那样。一个具体片段 是PS108(WO 98/50567，通过引用结合到本文中)。
其他已知的前列腺特异性抗原来自WO98/37418和WO/004149， 另一个是STEAP PNAS 96 14523 14528 7-12 1999。
其他在本发明内容中有用的肿瘤相关抗原包括Plu-1(J Biol. Chem 274(22)15633-15645，1999)、HASH-1、HasH-2、Cripto(Salomon 等Bioessays 199，2161-70，US patent 5654140)Criptin美国专利5 981 215。另外，与肿瘤治疗方面的疫苗特别有关的抗原还包含酪氨酸酶 和存活蛋白。
本发明也可与乳腺癌抗原，如Muc-1，Muc-2，EpCAM，her 2/Neu， mammaglobin(US5,668,267)或那些在WO00/52165，WO99/33869， WO99/19479，WO98/45328中公开的抗原联合使用。
上皮细胞粘蛋白MUC-1(又被称为上皮唾蛋白或多形性上皮粘蛋 白)是表达在很多上皮细胞上的大分子糖蛋白，WO01/46228和 WO03/100060中对其有描述。
在一个实施方案中，成分(iii)编码缺乏任何重复单位的(完全的 或不完全的)MUC-1蛋白或衍生物。在一个进一步的实施方案中， MUC-1蛋白或衍生物仅缺乏完全重复单位。在另一个实施方案中， MUC-1蛋白或衍生物含有1-15个的重复单位；7个完全重复单位。
在本发明的一个实施方案中，MUC-1衍生物可以从野生型 MUC-1经密码子修饰而来。具体是非完全重复区可以有至少0.6或 0.65的同义密码子使用率(RSCU)。编码MUC-1蛋白或衍生物的非完 全重复单位的核苷酸序列可以与野生型的MUC-1DNA的相应非重 复区的相同程度小于85％或小于80％。DNA密码有4个字母(A、G、 T和C)，用这些字母拼出三个字母的“密码子”，代表生物体的基 因编码的蛋白质上的氨基酸。DNA分子上的线状密码子序列被翻译 成这些基因编码的蛋白质上线状的氨基酸。密码具有高度简并性，61 种密码子编码20种天然氨基酸，3个密码子代表终止信号。这样， 大多数氨基酸有一个以上的密码子，事实上，有几个氨基酸由4个 或更多的不同的密码子编码。
有观察发现，当有一个以上的密码子可以用于编码一个给定的 氨基酸时，生物体内的密码子使用模式是高度非随机的。不同的种 系在它们对密码子的选择上有明显的偏性，而且，在同一种系中， 高水平表达和低水平表达的不同基因之间，密码子的使用也有明显 不同。这种偏性在病毒、植物、细菌和哺乳动物间有不同，一些种 系较另一些种系有更强的非随机选择偏性。例如，人和其他哺乳动 物的偏性较某些的细菌或病毒小。由于这个原因，当哺乳动物的基 因在大肠杆菌中表达，或病毒基因在哺乳动物细胞中表达时很可能 有不适合有效表达的密码子分布。如果异源DNA序列上有一连串表 达宿主体内罕见的密码子时，可以预见在该宿主体内的异源表达水 平是不会高的。
因而，被特殊的原核(如大肠杆菌或酵母)或真核宿主偏爱的密码 子可经过修饰用以表达同样的MUC1蛋白，但序列上有别于野生型。 密码子修饰的方法包括任何序列，通过手工或计算机软件产生，其 中MUC1天然序列的密码子的一些或全部被修饰。几种已发表的方 法见Nakamura等，Nucleic Acids Research 1996，24：214-215； WO98/34640。一种方法是Syngene方法，是Calcgene方法的改进(R.S. Hale和G Thompson(Protein Expression and Purification Vol.12 pp. 185-188(1998))。
MUC1密码子修饰的方法可以具有以下某些或所有益处：1)用 高频率使用的秘密子取代罕见和低频率密码子以改善该基因产物的 表达；2)去除或增添限制性酶切位点以方便下游克隆操作；3)降低DNA 载体中的插入序列与染色体序列同源重组的潜在可能；4)改良在人体 引起的免疫反应。该MUC1序列发生同源重组的潜在可能被有利地 降低，但其表达水平至少与野生型序列相同。由于SynGene程序使 用的运算程序的性质，将可能产生非常大量的具有相似功能的不同 密码子修饰序列。简短地讲，用统计程序指定的密码子得到一个与 天然高表达人体基因如β-Actin中发现的密码子频率近似的合成基 因。
在一个编码用于本发明中的免疫原的实施方案中，其中免疫原 是MUC-1，其密码子使用模式从典型的MUC-1被改变为更接近目 标高表达人体基因的密码子偏性。“密码子使用系数”是用于测量 一个已知的多核苷酸序列的密码子模式与目标种系的模式相似程度 的。密码子频率可以来自很多种系的高表达基因的文献(见，例如， Nakamura等Nucleic Acids Research 1996，24：214-215)。编码20个天 然氨基酸的61个密码子的密码子频率(表达为所选的一组基因每1000 个密码子中所发生的次数)被标化，将各个氨基酸的使用最频繁的密 码子的值指定为1，较不常见的密码子被按比例分级后其频率分布在 0到1之间。目标种系的高表达基因的61个密码子的每一个都被指 定了一个等于1或低于1的值。为了计算一个特异性多核苷酸相对 于该种系的高表达基因的密码子使用系数，记下该特异性多肽的各 密码子的分级值，取其几何均数(这些数值的自然对数之和除以密码 子总数，取其反对数)，将得到一个0到1之间的系数，系数越高， 该多核苷酸的密码子越是经常使用的密码子。假如该多核苷酸序列 的密码子使用系数为1，则所有的密码子都是目标种系高表达基因中 “最经常使用”的密码子。
在一个用于本发明的免疫原的例子中，多核苷酸的密码子使用 模式将那些在一个特殊氨基酸中密码子使用频率＜10％的密码子排除 在外。相对同义密码子使用(RSCU)值为观察到的密码子数除以期待 数，条件是所有编码那个氨基酸的密码子的使用频率是相同的。本 发明的多核苷酸可以将相对目标生物体内高表达基因RSCU值小于 0.2的密码子排除在外。总的来说，本发明的多核苷酸的高表达人基 因密码子使用系数高于0.6、高于0.65或高于0.7。人密码子使用表 在Genbank里也能找到。
作为对比，高表达的β-Actin基因的RSCU值为0.747。
人类密码子使用表列于下：
人基因(高表达)密码子使用1/24/91(human-high.cod)
氨基    酸密码子    数    /1000    比值
Gly    GGG    905.00     18.76    0.24
Gly    GGA    525.00     10.88    0.14
Gly    GGT    441.00     9.14     0.12
Gly    GGC    1867.00    38.70    0.50
Glu    GAG    2420.00    50.16    0.75
Glu    GAA    792.00    16.42    0.25
Asp    GAT    592.00    12.27    0.25
Asp    GAC    1821.00   37.75    0.75
Val    GTG    1866.00   38.68    0.64
Val    GTA    134.00    2.78     0.05
Val    GTT    198.00    4.10     0.07
Val    GTC    728.00    15.09    0.25
Ala    GCG    652.00    13.51    0.17
Ala    GCA    488.00    10.12    0.13
Ala    GCT    654.00    13.56    0.17
Ala    GCC    2057.00   42.64    0.53
Arg    AGG    512.00    10.61    0.18
Arg    AGA    298.00    6.18     0.10
Ser    AGT    354.00    7.34     0.10
Ser    AGC    1171.00   24.27    0.34
Lys    AAG    2117.00   43.88    0.82
Lys    AAA    471.00    9.76     0.18
Asn    AAT    314.00    6.51     0.22
Asn    AAC    1120.00   23.22    0.78
Met    ATG    1077.00   22.32    1.00
Ile    ATA    88.00     1.82     0.05
IIe    ATT    315.00    6.53     0.18
Ile    ATC    1369.00   28.38    0.77
Thr    ACG    405.00    8.40     0.15
Thr    ACA    373.00    7.73     0.14
Thr    ACT    358.00    7.42     0.14
Thr    ACC    1502.00   31.13    0.57
Trp    TGG    652.00    13.51    1.00
End    TGA    109.00    2.26     0.55
Cys    TGT    325.00   6.74     0.32
Cys    TGC    706.00   14.63    0.68
End    TAG    42.00    0.87     0.21
End    TAA    46.00    0.95     0.23
Tyr    TAT    360.00   7.46     0.26
Tyr    TAC    1042.00  21.60    0.74
Leu    TTG    313.00   6.49     0.06
Leu    TTA    76.00    1.58     0.02
Phe    TTT    336.00   6.96     0.20
Phe    TTC    1377.00  28.54    0.80
Ser    TCG    325.00   6.74     0.09
Ser    TCA    165.00   3.42     0.05
Ser    TCT    450.00   9.33     0.13
Ser    TCC    958.00   19.86    0.28
Arg    CGG    611.00   12.67    0.21
Arg    CGA    183.00   3.79     0.06
Arg    CGT    210.00   4.35     0.07
Arg    CGC    1086.00  22.51    0.37
Gln    CAG    2020.00  41.87    0.88
Gln    CAA    283.00   5.87     0.12
His    CAT    234.00   4.85     0.21
Hls    CAC    870.00   18.03    0.79
Leu    CTG    2884.00  59.78    0.58
Leu    CTA    166.00   3.44     0.03
Leu    CTT    238.00   4.93     0.05
Leu    CTC    1276.00  26.45    0.26
Pro    CCG    482.00   9.99     0.17
Pro    CCA    456.00   9.45     0.16
Pro    CCC    1410.00  29.23    0.48
于是在本发明的一个编码免疫原成分的核苷酸分子编码MUC-1 免疫原的实施方案中，对核苷酸序列进行了修饰使其密码子使用与 高表达的人体基因，如β-肌动蛋白更接近。
可以对任何可能使用的MUC-1免疫原成分的非VNTR单位进 行密码子修饰。当有VNTR单位呈现时，可以是也可以不是经过修 饰的。在一个实施方案中，经过密码子修饰的序列与相应的MUC-1 的非VNTR单位的同一性小于80％。
对比多核苷酸序列时，当对序列进行列队比较以获得最大相似 时，如果两个序列的核苷酸序列一样，两个序列被称为“相同的”， 正如以下所描述的那样。
两个序列的对比典型的是通过一个比对窗口去鉴别和对比序列 局部区域的相似性。这里所用的“比对窗口”，指一个至少20个连 续位置，通常30个到约75个，40个到约50个连续位置，在其内， 在对两个序列进行最佳列队排列后，一个序列与同样数量的连续位 置的参考序列进行比对。
于是对于一个用于本发明的免疫原，密码子修饰后的非重复区 域和非重复区域的序列最佳列对比较可以通过Smith和Waterman的 局部鉴别演算((1981)Add.APL.Math 2：482)、Needleman和Wunsch 的鉴别排列演算((1970)J.Mol.Biol.48：443)、Pearson和Lipman的 相似性搜寻方法((1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444)和通过这 些方法的计算机化的方法(GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA，和 TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI)或目测来完成。
适用于确定序列的同一性或序列的相似性的例子有BLAST和 BLAST 2.0演算法，Altschul和Altschul等分别在(1977)Nucl.Acids Res.25：3389-3402和(1990)J.Mol.上对其进行了描述。BLAST和 BLAST 2.0与这里描述的各种参数一起能被用于，例如，确定本发明 的多核苷酸序列同一性的百分比，操作BLAST分析的软件可通过国 家生物信息中心免费获得。
这样的构建体能够引起识别表达MUC-1的肿瘤细胞的细胞和抗 体反应，根据本发明，加入佐剂组合物将可以改善针对MUC-1的免 疫反应的动力学和功能。
构建体也可含有经改变的重复单位(VNTR单位)，如 WO01/46228中描述的降低了糖基化的突变体。
进一步的MUC-1构建体可以包括WO03/100060中描述的下述 构建体和变异体：
1)7VNTR MUC-1(仅带有7个完全重复的全长Muc-1)
2)7VNTR MUC-1 Ass(同1，但无信号序列)
3)7VNTR MUC-1ΔTMΔCYT(同1，但无跨膜区和胞质区)
4)7VNTR MUC-1ΔssΔTMΔCYT(同3，但无信号序列)
5)截断-MUC-1(即没有完全重复的全长MUC-1)
6)截断-MUC-1Δss(同5，但无信号序列)
7)截断-MUC-1ΔTMΔCYT(同5，但无跨膜区和胞质区)
8)截断-MUC-1ΔssΔTMΔCYT(同7，但无信号序列)
在一个实施方案中，通过改变糖基化位点，对一种或多种非完 全VNTR单位进行了突变以降低糖基化的可能。突变可以是取代， 或插入或删除。典型情况下，至少一个苏氨酸或丝氨酸被颉氨酸、 异亮氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸或色氨酸取代。
在一个进一步的实施方案中，被修饰的(gutted)MUC-1核酸在前 导肽和胞外区之间提供了一个限制性位点，通常该限制性位点是Nhel 酶切位点。
除了其他之外，Her 2neu抗原在美国专利5,801,005上有公开， Her 2neu可能含有完整的胞外区(含约1-645个氨基酸)或其片段， 和C末端约580个氨基酸的完整胞内段或至少其免疫原性部分。特 别是胞内段应含有磷酸化区域或其片段。这种构建体在WO00/44899 上有公开。一个构建体已知是ECD PD，另一个为ECD ΔPD(参见 WO/00/44899)。
这里所用的Her 2neu可以来自大鼠、小鼠和人。
疫苗也可含有与肿瘤支持机理(例如血管增生、肿瘤浸润)有关的 抗原，例如tie2、VEGF。
本发明中的疫苗也可用于预防和治疗除过敏、肿瘤和感染性疾 病以外的慢性病，这些慢性病如哮喘、动脉粥样硬化、Alzheimer病 和其他自身免疫性疾病。也可考虑用疫苗来进行避孕。
与预防和治疗易患或患有Alzheimer神经退化性疾病的病人相关 的抗原具体是淀粉样前体蛋白和较小片段N端39-43个氨基酸片段。 该抗原在国际专利申请号WO 99/27944-(Athena Neurosciences)上有 公开。
可以被包括进自身免疫性疾病疫苗或避孕疫苗的的潜在的自身 抗原包括：细胞因子、激素、生长因子或细胞外蛋白、或4螺旋细 胞因子，如IL13。细胞因子包括，如IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、 IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、 IL18、IL20、IL21、TNF、TGF、GMCSF、MCSF和OSM；4-螺 旋细胞因子包括IL2、IL3、IL4、IL5、IL13、GMCSF和MCSF；激 素包括，如黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、绒毛膜促性腺激素 (CG)、VGF、Grelin、agouti、agouti相关蛋白和神经原肽；生长因子 包括如VEGF。
本发明中的疫苗特别适合疾病的免疫治疗，如慢性疾病和癌症， 同时也适用于持续性感染。因此本发明中的疫苗特别适合于感染性 疾病的免疫治疗，如结核(TB)、HIV感染如爱滋和乙型肝炎病毒(HepB) 感染。
在一个实施方案中，核酸编码一种或多种以下抗原：
乙型肝炎病毒-前S1、前S2和表面env蛋白、core和pol
丙型肝炎病毒-E1、E2、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和B
人获得性免疫缺陷病毒-gp120、gp40、gp160、p24、gag、pol、 env、vif、vpr、vpu、tat、rev、nef
乳头状瘤病毒-E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、L1、 L2
疱疹病毒-gL、gH、gM、gB、gC、gK、gE、gD、ICP47、ICP36、 ICP4
流感病毒-凝血素、核蛋白
结核-分枝杆菌过氧化物歧化酶、85A、85B、MPT44、MPT59、 MPT45、HSP10、HSP65、HSP70、HSP90、PPD 19kDa Ag、PPD 38kDa 抗原。
预计本发明对于打破对自身抗原的耐受将特别有效，例如对肿 瘤抗原例如P501S或MUC-1，这些自身抗原可以在本发明中应用。
在本发明的一个进一步实施方案中，本发明的免疫原构建体含 编码至少一个异源T细胞表位的核酸序列。这些T细胞表位可以被 构建于免疫原中间或在免疫原两端的任一端。T细胞表位可以是T 辅助细胞表位，T细胞表位包括PADRE，T细胞表位来自细菌蛋白 和毒素，如破伤风和白喉毒素。例如，可使用来自破伤风毒素的P2 和P30表位。这样的表位可以是较长序列的一部分。表位可以被构 建于本发明的核酸分子之中或在序列的3′或5′端。
其他如来自乙型肝炎病毒的核心抗原或结核杆菌的融合配偶体 可被考虑使用。在一个实施方案中，融合配偶体来自结核分枝杆菌， RA12，为MTB32A的一个亚序列(192到323位氨基酸)(Skeiky等 Infection and Immunity(1999)67：3998-4007)。
在本发明的一个实施方案中，免疫原为这里定义的任何一种 MUC-1构建体，与广泛(promiscuous)T细胞表位PADRE融合。
还有其他免疫性融合配偶体，包括例如，来自嗜血流感病毒B 的蛋白D(WO91/18926)，或来自肺炎葡萄球菌的LytA的一部分(典 型的是C末端部分)(CLytA；Biotechnology 10：795-798，1992)，它可以 与另外一个配偶体如P2融合，即ClytA-P2-CLytA(CPC)，正如 WO03/104272中所描述的那样。WO99/40188描述了除其他以外含有 组氨酸尾和分子N端C-LytA蛋白的MAGE抗原的融合蛋白；编码 这样的融合蛋白的核酸序列可以包含本发明中的成分(iii)。
由组成本发明的成分(iii)的核苷酸编码的其他免疫原构建体可以 包括：
-免疫原-C-LytA重复区1-4-P2表位(插入或取代C-LytA重复 区5)-C-LytA重复区6
-C-LytA重复区1-4-P2表位(插入或取代C-LytA重复区5)- C-LytA重复区6-免疫原
-免疫原-C-LytA重复区2-5-P2表位(插入或取代C-LytA重复 区6)
-C-LytA2-5-P2表位(插入或取代C-LytA重复区6)-免疫原
-免疫原C-LytA重复区1-5-P2表位-插入C-LytA重复区6
-C-LytA重复区1-5-P2表位-插入C-LytA重复区6-免疫原
-免疫原-P2表位插入C-LytA重复区1-C-LytA重复区2-5
-P2表位插入C-LytA重复区1-C-LytA重复区2-5-免疫原
-免疫原-P2表位插入C-LytA重复区1-C-LytA重复区2-6
-P2表位插入C-LytA重复区1-C-LytA重复区2-6-免疫原
-免疫原-C-LytA重复区1-P2表位插入C-LytA重复区2-C-LytA 重复区3-6
-C-LytA重复区1-P2表位插入C-LytA重复区2-C-LytA重复 区3-6-免疫原
这里“插入”指在重复区的任何位置插入，例如在1和2残基 之间、或2和3残基之间等。
广泛T辅助细胞表位可以插入一个重复区内，例如C-LytA重 复区2-5_-C-LytA重复区6a-P2表位-C-LytA重复区6b，其中P2表 位被插入到第6个重复区内(见WO03/104272的图20)。
在其他实施方案中，CPL1的C末端(C-CPL1)可以用于替代C- LytA。
任选性的，以上构建体的P2表位可以由其他广泛T表位取代， 如P30。
特别阐明的免疫原包含有与融合配偶体融合的肿瘤相关蛋白或 组织特异性蛋白的至少10个连续氨基酸、20、30、40、50、60、70、 80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180个氨基酸 的序列。
本发明的另一个方面是提供含有本发明的各种多核苷酸序列并 能指导其表达的表达载体。该载体可能适合于驱动异源性DNA在细 菌、昆虫或哺乳动物细胞，尤其是人体细胞中的表达。
同时提供的还有本发明的疫苗或免疫原性组合物，或本发明的 载体在治疗或预防表达MUC-1或P501S的肿瘤或肿瘤转移中的用 途。
本发明也提供包括给予有效剂量的本发明的疫苗或免疫原性组 合物以治疗或预防表达MUC-1或P501S的肿瘤和包括转移的与其有 关的任何症状或疾病的方法。
本发明不限于含有编码MUC-1的核酸的疫苗。
核苷酸序列可以是RNA或包括染色体DNA、合成DNA或cDNA 的DNA。在一个实施方案中，核苷酸序列是DNA或cDNA序列。 为了使抗原性肽在哺乳动物细胞中表达，有必要将编码抗原性肽的 多核苷酸序列构建入一个合适的载体系统中。这里所用的“合适载 体”指能够使抗原性肽在哺乳动物体内足量表达、诱导出免疫反应 的任何载体。
例如，选择的载体可以包含以正确顺序排列的质粒、启动子、 多腺苷酸化/转录终止序列，以使抗原性肽得到表达。构建包括这些 成分和其他可选成分如增强子、限制性酶切位点和筛选基因，如抗 生素耐药基因的载体的技术为本领域技术人员所熟知，在″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″，Cold Spring Harbour Laboratory，Cold Spring Harbour Press，Vols 1-3，2nd Edition，1989中Maniatis等对该技 术有详细描述。
为了避免质粒在哺乳动物宿主中复制和整合到动物染色体DNA 中，可以构建一个没有能够在真核细胞中行使功能的复制起始区的 质粒。
本发明的方法和组合物可用于所有哺乳动物，包括如家养动物、 实验动物、农场动物、捕获的野生动物，或在一个方案中，人的有 关预防或治疗程序中。
正如以上所讨论，本发明包括了编码本发明的佐剂成分(i)和/或 (ii)、或抗原或免疫原(iii)的表达载体的使用。这样的表达载体的构建 在分子生物学领域属常规操作，可涉及到质粒DNA和合适的起始子、 启动子、增强子和其他元件的使用，例如多聚腺苷酸化信号的使用， 为使蛋白得到表达，多聚腺苷酸化信号可能是必需的并且其排列的 方向必须是正确的。其他合适的载体对本领域的技术人员来说应该 是显而易见的。关于这方面的进一步的例子我们推荐Sambrook等所 编的Molecular Cloning：a Laboratory Manual.2nd Edition.CSH Laboratory Press.(1989)。
用于本发明中的载体的多核苷酸可以被操作性地连接到控制序 列，该控制序列能够使被编码序列被宿主细胞表达，即载体为表达 载体。术语“操作性地连接”指一种并列结构，在该并列结构中， 所述成分处于一种能允许它们以其应有的方式发挥其功能的关系 中。调节序列如启动子“操作性地连接”到编码序列即被置于这样 的位置以使被编码序列能在与调节序列兼容的条件下被表达出来。
载体可以是，例如，带有一个复制起始区、任选的用于表达多 核苷酸的启动子和任选的启动子调节序列的质粒、人工染色体(即 BAC，PAC，YAC)、病毒或噬菌体载体。载体可以包含一种或多种可 选的标记基因，例如氨苄青霉素或卡那霉素抗性基因用于细菌质粒 或抗性基因用于真菌载体。载体可以用于体外，例如用于生产DNA 或RNA或用于转染或转化宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞，即用 于产生该载体编码的蛋白。载体也可被改变后用于体内，如用于DNA 疫苗接种或基因治疗的方法中。
可以选择与设计用于表达的宿主细胞兼容的启动子和其他表达 调节信号，例如，哺乳动物启动子，包括巨细胞病毒(CMV)即早(IE) 启动子、劳斯肉瘤病毒LTR启动子、腺病毒启动子、或HPV启动子， 尤其是HPV上游调节区(URR)可以被使用。所有这些启动子在本领 域都已有详细描述而且很易得到。
一个启动子元件是不内含子A但有外显子1的CMV即早启动 子(WO02/36792)。这里提供含有在HCMV IE即早启动子控制下的本 发明的多核苷酸的载体。
合适的病毒载体的例子包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒、α-病毒、 逆转录病毒含慢病毒、腺病毒和腺相关病毒。用这些病毒进行的基 因转移技术为本领域的技术人原员所熟知。例如逆转录病毒载体可 被用于稳定地将本发明的多核苷酸序列整合到宿主染色体中，虽然 这种重组不是理想选择。相比之下，复制缺陷型腺病毒载体保持游 离体形式允许暂时性表达。能够驱动在昆虫细胞(例如杆状病毒)、人 体细胞或细菌细胞中表达的载体可以用来大量生产由本发明中的多 核苷酸编码的HIV蛋白，用作亚单位疫苗或用于免疫检测。本发明 的核苷酸在病毒性疫苗中特别有用，因为以前为了制备全长痘苗构 建体的努力一直未能成功。
在本发明的一个方案中，含有选自C1、Pan 5、Pan 6，、Pan 7C68 (Pan 9)、SV1、SV25和SV 39的腺病毒核酸序列的病毒载体可以被 使用，正如已发表的PCT申请WO 03/046124中所述，该早期发表 物的全文通过引用被结合到本文中。
细菌载体，如减毒沙门氏菌和李斯特菌可以被有选择地使用。 本发明中的多核苷酸序列可以通过表达用于其所编码的蛋白的生 产，这种表达可以在体外(in vitro)、体内(in vivo)和先体外后体内(ex vivo)进行。核苷酸因此涉及到重组蛋白的合成，例如增加产量，或 其本身作为治疗因子使用，例如用于DNA接种技术。当本发明的多 核苷酸被用于体外(in vitro)或先体外后体内(ex vivo)产生所编码的蛋 白时，将对细胞，例如细胞培养物中的细胞进行加工改造以使其含 有需要被表达的多核苷酸，这些细胞包括暂时性的或永久性的哺乳 动物细胞系。可以通过插入含编码本发明的多核苷酸的载体进行改 造的细胞的例子包括哺乳动物细胞HEK293T、CHO、HeLa、293和 COS细胞，选择出的细胞系不仅要稳定，还要能够使多肽充分糖基 化且表达在细胞表面。可以在卵母细胞中进行表达。本发明的多核 苷酸的多肽的表达可以在转基因非人动物细胞中进行，如小鼠。用 转基因非人动物表达本发明的多核苷酸的多肽也包含在本发明的范 围之内。
本发明也提供一种接种哺乳动物体的方法，包括给予其有效剂 量的这样的疫苗或疫苗组合物。用于DNA疫苗、疫苗组合物和免疫 治疗剂的表达载体可以是质粒载体。
含有编码抗原性肽的核苷酸序列的载体的免疫原成分可以以多 种方式给药。有可能将裸质粒(为裸核苷酸序列，不与脂质配方、病 毒载体和促转染蛋白结合)悬浮于合适介质，如缓冲盐溶液PBS中， 通过肌肉注射、皮下注射、腹膜内和静脉内注射，虽然早期资料建 议用肌肉或皮下注射(Brohm等Vaccine 16 No.9/10 pp 949-954 (1998)，其公开的全文通过引用被结合到本文中)。还有可能是将该载 体用脂质体包裹或包裹在聚交酯共乙交酯(polylactide co-glycolide) (PLG)颗粒(25)内，除通过以上所述途径给药外，还通过口、鼻或肺 部给药。
根据本发明的一个实施方案，也有可能通过例如基因枪(尤其是 粒子轰击)给药技术，用免疫原成分皮内给药。这种技术涉及到将免 疫原成分包被到金微珠上，在高压条件下注入表皮，例如Haynes等 在J.Biotechnology 44：37-42(1996)中所描述的那样。
在一个说明性例子中，可以通过如那些由Powderject Pharmaceuticals PLC(Oxford，UK)和Powderject Vaccines Inc.(Madison， WI)生产的仪器来获得气体驱动的颗粒加速，其例子在美国专利Nos. 5,846,796；6,010,478；5,865,796；5,584,807；和欧洲专利0500 799中有描述。该方法提供了一个无针头的导入途径，其中显微粒子， 如多核苷酸的干粉制剂在一个手握式仪器的氦气喷嘴中被高度加 速，并冲击进入目标组织，通常为皮肤组织。颗粒可以是直径0.4-4.0μM 或0.6-2.0μM的金微珠，DNA缀合物包被在这些金微珠上面，然后 置入药筒或药盒里放入“基因枪”中。
在一个相关的实施方案中，其他可以用于本发明的组合物的气 体驱动无针头注射的仪器和方法包括由Bioject，Inc.(Portland，OR)提 供，其例子有美国专利4,790,824；5,064,413；5,312,335；5,383,851； 5,399,163；5,520,639和5,993,412上所描述的那些。
也可通过显微针来导入核酸疫苗，可以用本发明的组合物包被 显微针或从一个储库中通过显微针来导入。
含有编码抗原性肽的核苷酸序列的载体的给药量应能起到有效 的预防或治疗作用，给药量一般来说在1pg到1mg之间，或1pg到 10μg用于颗粒介导的导入，10μg到1mg/剂量用于其他途径核酸给 药。根据被免疫的哺乳动物的种类和重量、给药的途径、佐剂成分 的强度和剂量、待治疗或预防的疾病的性质、被给药者的免疫系统 产生免疫反应的能力和想要达到的预防和治疗的有效程度，具体的 用药量可以有很大的变化。根据这些变量，一个医疗或兽医工作者 应该能够很容易地决定适当的剂量水平。
含有编码抗原性肽的免疫原成分(iii)和佐剂成分(i)和(ii)可以以一 次性的方式给药和反复给药，例如给药1到7次、或给药1到4次， 间隔时间约4周-或约18个月。然而治疗方案同样将根据病人的体重、 被治疗/预防的疾病种类、给予的核苷酸序列量、给药途径和其他对 于熟练的医疗工作人员来说显而易见的因素而有明显变化。作为完 整治疗方案的一部分，病人可以接受一种或多种其他抗肿瘤药物。
同样，根据以上列出的各类变量，TLR激动剂的给药量也将变 化，例如可能在0.1mg/kg到约100mg/kg的范围内。这里“/kg”指涉 及到的哺乳动物的体重。TLR激动剂的胺衍生物可以随着每次核苷 酸序列的继后或加强给药而反复给药。给药剂量可以在0.5mg/kg到 约5mg/kg，或约1mg/kg或1mg/kg之间。当TLR激动剂是瑞喹莫 德或咪喹莫特，剂量可以是1mg/kg。当TLR激动剂是咪喹莫特，可 以使用AldaraTM膏(5％咪喹莫特；3M)，涂于给药处或给药的附近。在 本发明的一个实施方案中，可以用一个12.5mg包装的(3M)5％ AldaraTM膏，可选性的，多于一个包装的AldaraTM膏可被使用。在本 发明的另一个实施方案中，可只使用一个包装的一部分：例如取一 个包装的约20％、25％、33％或50％用于各位点或位点的附近。
当含有咪唑并喹啉分子或其衍生物的TLR激动剂成分以原始化 学状态给药时，可以制备成药学制剂的形式给药，即指将含有咪唑 并喹啉分子或其衍生物的TLR激动剂成分与一种或多种药学或兽医 学上可接受的载体和可选性的其他治疗性成分结合。载体必须是“可 接受的”意思是能与制剂中的其他成分兼容且对受者无害。制剂的 性质将根据拟定的给药途径的不同而变化，可以通过制药领域熟知 的方法来制备制剂。所有制备制剂的方法包括将咪唑并喹啉分子或 其衍生物与一种或多种合适的载体结合的步骤。载体包括膏状配方、 或任选的PBS或水。一般来说，制备制剂时使衍生物与液体载体或 细碎的固体载体或液体和固体载体两者均匀地、充分地结合，然后， 如果需要，将产品做成想要的剂型。适合于口服给药的本发明的制 剂可以是不连续的单位，如含有拟定量的活性成分的胶囊、扁囊和 片剂；粉剂和颗粒；水性液体或非水性液体中的溶液或混悬液；或 水包油液体乳剂或油包水乳剂。活性成分也可以是丸、干药糖剂或 贴剂。
片剂可以任选与一种或多种辅助成分通过压制或模制制备，压 制片剂可以通过在一个合适的机器中，将任选性地与结合剂、润滑 剂、惰性稀释剂、润滑、表面活性或分散因子混合的自由流动形式 的活性成分如粉或颗粒进行压制而成；模制片剂可以在一个合适的 机器中通过模具将润湿的粉状成分与惰性液体稀释剂的混合物制成 片剂。
可以对片剂选择性地进行包衣或划痕，并且可以将片剂制成活 性成分能够缓慢释放或控制释放的制剂。
通过肌肉、腹膜内或皮下注射途径给药的制剂包括含有抗氧化 剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂具有与受者的血液等渗的溶液的水性 和非水性灭菌注射溶液，及含悬浮剂和增稠剂的水性和非水性灭菌 混悬液。制剂可以装在单剂量或多剂量容器内，例如，密封的安瓿 或小管中，制剂可以是冻干状态，只需在临使用前加入灭菌的液体 载体，例如水用于注射。临配的注射溶液或混悬液可以从灭菌的粉、 颗粒或前面描述的片剂制得。适合于通过口腔或鼻腔肺部给药的制 剂可以是理想的直径为0.5到7微米的含活性成分的颗粒，通过受 者的支气管导入。这类制剂的可能性在于它们是非常细小的颗粒， 被常规地制成要么可刺穿的胶囊，例如，明胶胶囊，用于吸入仪器； 或可选性地制成含有活性成分、合适的液体推进剂和任选的其他成 分如表面活性剂和/或固体稀释剂的自我推进制剂，活性成分为溶液 或混悬液微滴的自我推进制剂也可使用。这种自我退进剂与本领域 所知的那些类似，可以用已有的方法制备。它们适合于与一个手工 操作的或机器控制的具有喷雾功能的阀门一起使用，最好该阀门是 有刻度的，每次操作可用来导入固定的量，如50到100μl。
另一种可能性是，佐剂成分为溶液，用于有加速气流或超声振 荡器的喷雾器和雾化器，以产生可吸入的细小的雾状微滴。
适合于鼻内给药的制剂一般来说包括与以上描述的肺部给药的 制剂类似的制剂，但这类制剂的颗粒直径在约10到约200微米之间， 以使其能够在鼻腔内存留。这一目的可以通过使用合适大小的颗粒 或选择一个合适的阀门来达到。其他合适的制剂包括从一个靠近鼻 部的容器中经鼻道快速吸入给药的颗粒直径在约20到约500微米的 粗粉；和含0.2到5％(w/w)的水性或油性溶液中的活性成分的鼻腔滴 液。在本发明的一个实施方案中，含有编码抗原性肽的核苷酸序列 的载体可以与1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物在同一制剂中给药， 这样在该实施方案中，同一制剂中可有免疫原性成分和佐剂成分。
在一个实施方案中，佐剂成分(ii)和免疫原成分(iii)被制成适合于 基因枪给药的形式，通过该途径与编码免疫原的核苷酸序列伴随给 药。对于制备适合于这种应用的制剂，可能有必要将佐剂成分(ii)和 免疫原成分(iii)进行冷冻干燥后附着到，例如适合于基因枪给药的金 微珠上。在这一方案中，佐剂成分(i)可以在一个分开的组合物中依序 给药。
在一个可选实施方案中，佐剂成分(i)或(ii)、或二者可以用干粉 的形式通过高压气体推进给药。至少一个佐剂成分可以和编码免疫 原的核苷酸序列伴随给药；佐剂成分(ii)可以和免疫原成分伴随给药。
即使没有被配制在一起，佐剂成分(i)和(ii)可适于在核苷酸序列 给药的同一部位或附近给药。
其他药物制剂方面的详细内容在Remington′s Pharmaceutical Sciences Mack Publishing Company，Easton，Pennysylvania(1985)上可 以找到，其公开通过引用被全文结合到本文中。
这里提到的佐剂成分同样也可通过不同的给药途径给药，例如 通过口、鼻、肺、肌肉、皮下、皮内或局部给药。成分可以通过皮 内、皮下或局部给药。
佐剂给药可以在核苷酸序列给药前的约14天或给药后的约14 天进行，或在核苷酸序列给药前的约1天或给药后的约3天进行。 编码GM-CSF的核苷酸序列可以与编码免疫原的核苷酸序列伴随给 药，TLR激动剂成分依序提供。可以在抗原成分给药前的约或正好7、 6、5、4、3、2或1天或给药前的约或正好24、22、20、18、16、14、 12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1小时给予TLR激动剂成分。 可以在抗原成分给药后的约或正好7、6、5、4、3、2或1天或给药 后的约或正好24、22、20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、 4、3、2或1小时给予TLR激动剂成分。
TLR激动剂成分可以在其他成分给药后的24小时或约24小时 给药。在成分(ii)和(iii)给药后给予TLR激动剂成分的优势在于导入 成分(ii)和(iii)可能会导致导入局部产生IFNγ，这会引起TLRs上调， 如上调TLRs 7和/或8，从而增强对TLR激动剂的反应性。
在本发明的一个实施方案中，成分(ii)和(iii)被制成适合于通过基 因枪同时给药的制剂，佐剂成分(i)提供为不同的膏状制剂，用于依序 局部给药。
适合于将裸多核苷酸或载体导入病人的技术还包括与适当的介 质一起局部用药。核酸可以例如通过鼻内、口腔、阴道内或直肠内 局部皮肤或粘膜给药。裸多核苷酸或载体可以与药学上可以接受的 赋形剂例如磷酸缓冲盐制备在一起。可以通过使用促进剂如布比卡 因来促进DNA的摄取，促进剂可以单独使用或包含在DNA制剂中。 其他将核酸直接用于受者的方法包括超声、电刺激、电穿孔和US- 5,697,901上描述的微接种。
可以通过已知的几种方法来加强核酸构建体的摄取，例如那些 使用转染剂的方法，这些剂包括阳离子剂，例如磷酸钙、DEAE-葡 聚糖和脂转染剂(lipofectants)，如lipofectam和transfectam。核酸的 给药量可以改变。
本发明的核苷酸序列也可通过转化细胞给药。这些细胞包括从 受试者体内收集的细胞。本发明的裸多核苷酸或载体可以在体外被 导入这些细胞，然后再将被转化的细胞注回到受试者体内。本发明 的多核苷酸可以通过同源重组整合入细胞内已有的核酸中。如果需 要，被转化的细胞可以在体外生长，一种或多种被转化的细胞可用 于本发明。细胞可以通过已知的外科或显微外科技术(即移植或显微 注射)导入病人合适的部位。
本发明者证明，用TLR激动剂和GM-CSF联用作为DNA疫苗 接种的佐剂能够增强细胞介导的免疫反应，特别是在初敏注射后。 这里所用的术语佐剂或佐剂成分的意思是指含有能够以期望的方式 强化和/或改变机体对免疫原的反应的衍生物的衍生物或成分。所以， 佐剂可被用于将免疫反应转变为以Th1为主的免疫反应，或用于增 强两种类型的免疫反应。
Th1类型的免疫反应的诱导剂诱导细胞介导的免疫反应的产生， 高水平的Th1型细胞因子倾向于诱导对已知抗原的细胞介导的免疫 反应，而高水平的Th2型细胞因子倾向于诱导对已知抗原的体液免 疫反应。
重要的是要记住Th1和Th2型免疫反应的区分不是绝对的，现 实是它们各自将代表一个被描述为以Th1为主的或以Th2为主的免 疫反应。然而，从Mosmann和Coffman在小鼠CD4+ve T细胞克隆 里所描述的角度考虑细胞因子家族(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L. (1989)TH1 and TH2 cells：different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties.Annual Review of Immunology，7， p145-173)通常是方便的。传统上，Th1类型反应与T细胞产生的IFN- γ和IL-2细胞因子有关，其他与Th1型免疫反应的诱导直接有关的 细胞因子不由T细胞所产生，如IL-12。相反，Th2型反应与IL-4，IL-5， IL-6，IL-10的分泌有关。
现在将以下述非限制性实施例为参考对本发明进行进一步描 述：
实施例
简介
实验证明使用编码GM-CSF和TLR激动剂的核苷酸分子能强化 对抗原性肽的细胞免疫反应。观察到明显不同的免疫原性；含有编 码GM-CSF连同TLR激动剂的核苷酸的佐剂的使用可以改善针对抗 原的免疫反应的动力学和功能，正如在以下实验可以看到的那样， 这一点能被下面给出的方法和本领域熟知的方法进一步证明。
材料和方法
表达载体的构建：OVAcyt、7VNTRMuc1、HIV RNG和GM-CSF 质粒
OVAcyt质粒的构建
通过删除野生型鸡卵白蛋白基因的分泌信号(氨基酸20-145)构 建编码非分泌型鸡卵白蛋白的基因。该截断的基因被命名为OVAcyt 以表示其为非分泌的胞质型的卵白蛋白。用带有限制性位点的引物 对该基因进行PCR扩增，以使其能够与DNA疫苗载体p7313(WO 02/08435中有详细描述，其提早发表的全文通过引用被结合到本文 中)连接。
图1显示的是含有OvaCyt基因的表达盒的序列。限制性酶Not1 和BamH1的酶切位点带有下划线，起始和终止密码子为黑体，Kozak 序列为斜体。
GM-CSF质粒的构建
小鼠GM-CSF从一个cDNA文库被克隆出来，然后克隆进表达 载体pVACss2。这一cDNA克隆被用作模板，通过PCR扩增mGM- CSF的开放性阅读框，所用引物含有Kozac序列、起始密码子和限 制性酶切位点，以使其能被克隆进DNA疫苗载体p7313(WO 02/08435 如上述)。图2显示的使该mGM-CS的表达盒。
图2，限制性酶Nhe1和Asc1的酶切位点标有下划线，起始密 码子和终止密码子为黑体，Kozak序列为斜体。
RNG质粒的构建
来自HIV-1分化单位B株HXB2的经失活的密码子优化的RT、 截断的Nef和密码子优化的gag基因的p17/p24部分位于Iowa长度 HCMV启动子和外显子1的下游和兔β-球蛋白多聚腺苷酸信号的上 游。
这些基因在构建子中的排列通过以下步骤实现：从p73i-Tgrn上 PCR扩增RT-trNef和p17p24，两个DNA片段经PCR法进行连接， 得到的3kb的产物经过胶纯化后，经Not1/BamH1酶切，再连接到经 Not1/BamH1消化后的p7313ie上。该序列在图4中显示。
MUC-1构建体的获得
含有7个VNTR单位的MUC-1表达载体的构建
该载体的构建在专利申请WO03/100060中有详细描述，其公开 通过引用结合到本文中，其序列在图3A中显示。
带有插入MUC1 C末端的HepB辅助表位的MUC1表达盒的构 建
一个两步法被用于将HepB辅助表位插入MUC1的C末端。通 过退火连接两个寡核苷酸FORA和REVA，获得编码该表位的短 DNA接头。上游引物10pmol，下游引物10pmol，1X T4 DNA连接 酶缓冲液和10U T4多核苷酸激酶相互混合，总体积20μl，37℃孵育 2小时，然后通过95℃加热2分钟，再以0.1℃/秒的速度冷却退火， 并将温度维持在4℃。得到的接头被连接到pVAC的Nhe1/Xho1位点， 获得JNW729(C-末端)载体。从载体JNW656的Xba1盒切下MUC1 表达盒并将其克隆进JNW729载体的Nhe1位点，获得载体JNW737(C- 末端)。所有载体均经过序列鉴定。JNW737的序列在图3B中显示， 其中加框的为辅助表位。
带有插入MUC1 C末端的PADRE辅助表位的MUC1表达盒的 构建
首先通过插入一个短接头到pVAC1产生一个C末端融合。该接 头通过退火连接两个引物PADREFOR和PADREREV获得，然后通 过Nhe1和Xho1位点将接头克隆到pVAC1，得到载体JNW800。用 Xba1切下JNW656(7x VNTR MUC1)和JNW758(密码子优化的7x VNTR MUC1，见专利申请VB60033)的7X VNTR MUC1表达盒片段， 再克隆进Xba1位点，产生两个载体：
7x VNTR MUC1 C-端PADRE：JNW810
7x VNTR MUC1(密码子优化的)C-端PADRE：JNW812
JNW810和JNW812MUC1表达盒和PADRE表位的测序结果在 图3C中有显示。
2.构建体检测-材料
动物
CBAB6.F1为C57BI6小鼠和CBA小鼠的杂交子。它们被用作 MUC1转基因小鼠的野生型背景。MUC1转基因小鼠从帝国癌症研 究基金会(Imperial Cancer Research Fund)获得，它们在人MUC1启动 子的控制下表达人MUC1(Peat等，1992)。MUC1在这些小鼠中的表 达模式与在人体组织中看到的非常类似。C57/b16或Balb/C从Charles River获得，用于有关p73130Vacyt和p7313RNG的研究。RIP-OVAlo 小鼠为GSK自己繁殖。
2.1两个质粒共导入：p7313 OVAcyt(编码抗原的质粒)、 p7313RNG(编码抗原的质粒)、或pVAC 7VNTR Muc1(编码抗原的 质粒)和p7313 GMCSF质粒(编码GM-CSF的质粒)
用氯化钙和亚精胺将质粒DNA沉淀到2μm直径的金微珠上面。 同样量的编码抗原的质粒(p73130VAcyt，p7313RNG， pVAC7VNTRMuc1，pVAC7VNTRMuc1-PADRE或 pVAC7VNTRMuc1-HepB)和p7313GMCSF质粒被混合在一起进行共 沉淀，以使所有微珠被两个质粒的混合物包被，保证两个质粒被导 入同一细胞。除非特别指出，抗原和GMCSF两者的装量均为0.5μg/ 药筒。当抗原用量较低，GMCSF量保持在0.5μg，则用p7313empty 或pVACempty将药筒中的DNA总量调节到1μg。加入的微珠被包 被到Tefzel管上，正如Eidenbraum等在1993.DNA Cell Biol.12： 791-797；Pertmer等在1996 J.Virol.70：6119-6125上所描述的那样。 粒子轰击(particle bombardment)用Accell gene delivery(PCT WO 95/19799；通过引用结合到本文)进行。如结果部分所详述，雌性 C56BI/6小鼠在各时间点两次给予质粒免疫，刮毛后在其腹部的两侧 一边一次。每个时间点给予的DNA总量为2μg。当使用咪喹莫特时， 在免疫24小时后，用膏状制剂局部涂于免疫位点。20μl 5％ AldaraTM cream(3M)用于免疫的各部位。对于小型猪(minipig)，每只腹部(刮毛 后)1μg 4次免疫。
CpG寡核苷酸共包被
CpG寡核苷酸用共包被质粒同样的方法共包被到金微珠上。寡 核苷酸与DNA以10∶1寡核苷酸∶质粒的比例混合。我们看到质粒没 有被寡核苷酸取代，大约10％的寡核苷酸被沉淀到微珠上，使药筒 中的比例为1∶1。与1∶1的比例相比，用10∶1的寡核苷酸比质粒的比 例时导致寡核苷酸在药筒的结合更高。本研究所用的ODNs被列在 表1中。PTO ODNs CpG1826(刺激CpG)和GpC1745(非刺激寡核 苷酸)和DNA ODNs由MWG-Biotech AG合成。
表1.本研究所用寡核苷酸列表。   寡核苷酸   描述   序列   CpG1826   GpC1745   20氨基酸100％PTO   20氨基酸100％PTO   5′-tccatgacgttcctgacgtt-3′     5′-tccatgagcttcctgagtct-3′
PTO(硫代磷酸酯)残基为斜体字；CpG/GpC基序为黑体字
2.2测试T细胞反应的ELISPOT试验
制备小鼠脾细胞
在免疫后7天或图上给出的时间点取小鼠脾。在玻璃片之间研 磨脾脏获得细胞悬液。用氯化氨处理裂解红细胞，去除碎片后获得 很好的脾细胞悬液。在RPMI完全培养基中重悬细胞，使浓度为 4×106/ml，用于ELISPOT检测。
用于鼠研究的多肽
对OVA检测，OVA的优势CD8肽SIINFEKL用于测定CD8反 应，终浓度为50nM，肽TEWTSSNVMEERKIKV用于测定CD4反 应，终浓度为10μM。对ICS检测卵白蛋白也用于CD4反应的测定， 浓度为1mg/ml。对检测对p7313RNG肽的反应ELISPOT试验，CD8 肽AMQMLKETI被用于刺激。对于检测对Muc1的反应，使用的CD4 肽是GGSSLSYTNPAVAATSANL和GEKETSATQRSSVPS，浓度 为10μM，使用的CD8肽是SAPDNRPAL，浓度为10nM。用于监测 小鼠体内对Gag和RT的CD8反应所用的9个氨基酸的多肽分别是 AMQMLKETI(Gag CD8)和YYPDSKDLI(RT CD8)，监测对Gag和 RT的CD4反应所用的肽分别为IYKRWIILGLNKIVR(Gag CD4)和 QWPLTEEKIKALVEI(RT CD4)。肽EREVLEWRFD SRLAF(Nef 218) 也被用于检测。这些肽用于检测时的终浓度为10μM。肽从Genemed Synthesis，South San Francisco获得。
小鼠IFNg和IL-2ELISPOT试验
用15μg/ml(于PBS中)的大鼠抗小鼠IFNγ或大鼠抗小鼠IL-2 (Pharmingen)包被板，将包被好的板放入+4℃过夜。在用板之前用PBS 洗板3次。加脾细胞于板中，4×105细胞/孔。各孔中的总液量为200μl。 含有肽刺激细胞的板被放入饱和湿度的37℃培养箱中孵育16小时。
ELISPOT试验板显色
用水洗板1次(浸泡一分钟确保细胞被裂解)，PBS洗板3次去除 细胞，加入生物素标记的大鼠抗小鼠IFNγ或IL-2(Phamingen)，至 浓度1μg/ml PBS。室温下振摇孵育2小时。在加入1∶1000稀释的链 霉亲和素碱性磷酸酶(Caltag)之前用PBS洗板3次。再经PBS洗板3 次后，用BCICP底物(Biorad)对斑点进行15-45分钟显色。用水洗去 底物将板晾干，用Brian Hayes，Asthma Cell Biology unit GSK制造的 影像分析系统，或AID Elispot reader(Cadama Biomedical，UK)计数斑 点数。
2.3流式细胞仪检测鼠T细胞对肽或蛋白刺激的反应中产生的 IFNγ和IL-2
4×106的脾细胞被分装到各试管中，离心收集细胞沉淀，倒掉上 清，振荡打散细胞沉淀物。将0.5μg抗-CD28+0.5μg抗-CD49d (Pharmingen)加入各试管中，室温孵育10分钟。向合适的试管中加 入1ml培养基，或含适当浓度的肽或蛋白的培养基，然后在37℃水 浴中孵育1小时。加入10μg/ml Brefeldin A到各试管中，继续在37℃ 孵育5小时之后，设定好程序的水浴将降回到6℃并保持在此温度 过夜。
然后用抗小鼠CD4-PerCP(Pharmingen)和抗小鼠CD8APC对样 品进行染色。在p7313 RNG实例中，用CD4 CyChrome和CD8生 物素，洗涤样品，用链霉亲和素-ECD染色。洗涤样品，加100μl ″Intraprep Permeabilization Reagent″试剂盒(Immunotech)的固定液 (Fixative)室温孵育15分钟。洗涤样品后，加100μl Intraprep试剂盒 的透化剂到各样品中同时加入抗-IFNγ-PE+抗-IL-2-FITC (Immunotech)。样品在室温孵育15分钟后洗涤。将样品重悬于0.5ml 缓冲液中，在流式细胞仪上进行分析。
各样品收集总数为500,000的细胞，继之对CD4和CD8细胞进 行门控以确定受刺激起而分泌IFNγ和/或IL-2的细胞数。
2.4四聚体染色和分析
100μl全血或脾细胞悬液被加入到各试管中，加入5μl Phycoeritherin(PE)标记的H2-Kb SIINFEKL四聚体(Immunomics) 于各管中室温孵育20分钟。加入抗小鼠CD8-CyChrome或APC，继 续孵育10分钟。如果分析全血，根据说明书用″全血裂解溶液″ (Immunotech)裂解血红细胞，洗涤后，样品被重悬于缓冲液中并用流 式细胞仪分析。各样品收集400,000事例。
3.小型猪数据
免疫小型猪
通过导入4药筒的疫苗到小型猪的腹部进行免疫。14天后采集 外周血制备外周血单核细胞(BMC)。
纯化猪PBMC
采集猪血时用肝素抗凝，用PBS 2∶1稀释血样，将血样加入50ml Falcon管中的Histopaque(Sigma)的上层，1200g离心30分钟后，从 离心管的中间层收集猪淋巴细胞。残余的红细胞用氯化铵裂解缓冲 液裂解。计数细胞后将细胞重悬于完全RPMI培养基，制成浓度为2x 106/ml的细胞悬液。
猪IFNg ELISPOT试验
用8μg/ml(于PBS)(纯化的小鼠抗猪IFN-□，Biosource ASC4934) 包被板，放入+4℃过夜。使用前用PBS洗板3次并用完全RPMI培 养基封闭2小时。PBMC被加入板中，浓度2×105细胞/孔，液量为 200μl/孔。将重组的Gag，Nef或RT蛋白(自己制备)加入孔中，使终 浓度为5μg/ml。将板放入饱和湿度的37℃培养箱中孵育16小时。
ELISPOT试验板的显色
用水洗板1次(浸泡一分钟确保细胞被裂解)，PBS洗板3次去除 细胞，用PBS稀释的生物素标记的浓度0.5μg/ml抗猪IFNγ加入板 中，室温下振摇孵育2小时。在加入1∶1000稀释的链霉亲和素碱性 磷酸霉(Caltag)之前用PBS洗板3次。再经PBS洗板3次后，用BCICP 底物(Biorad)对斑点进行15-45分钟显色。用水洗去底物将板晾干， 用AID Elispot reader(Cadama Biomedical，UK)计数斑点数。
3.结果
咪喹莫特增强免疫反应
小鼠经PMID用2×0.5μg p731-RNG(GW825780X)或对照空载体 免疫。相关的组用20μl 5％ AldaraTM膏(3M)涂于免疫部位。AldaraTM 膏在免疫后的24小时使用。免疫后的14天取脾，用IFNγElispot 试验分析经GAG balb/c CD89氨基酸肽AMQMLKETI刺激后的细胞 反应。结果见图5。咪喹莫特在0小时或24小时免疫后给药的数据 对比显示，佐剂在免疫后24小时给药的效果更好。
体外数据证明在对炎性刺激的反应中会上调TLRs。
IFNγ处理过的DC上TLR表达的Taqman分析
从3个健康供者的PBMC中分离出单核细胞，在有IL-4和GM- CSF存在的条件下培养7天，以诱导其分化为成熟的DC。然后用IFN γ处理这些DC24小时。通过Taqman测定TLRs 1-9的mRNA表达。 结果见图6。与已发表的报道相反，我们的数据表明在单核细胞来源 的DC上TLR7呈低水平结构性表达。继IFNγ处理后，TLR8的表 达和增强了的TLR7的表达在3个供者中均可看到。TLR2也出现上 调但上调的幅度不大。体外刺激后24小时TLR7表达的增高解释了 图5中咪喹莫特在免疫后24小时使用效果较好的结果。
IFNγ增强DC对瑞喹莫德的反应
我们同时观察了这些供者的细胞对瑞喹莫德的反应。DC的分离 和用GMCSF的培养同前。用瑞喹莫德进行处理前，用IFNγ处理DC24 小时或不用IFNγ进行处理。然后测定细胞因子和表面标记的表达。 结果如图7所示，显示用IFNγ预处理增强了DC对瑞喹莫德的反应， 成熟过程也被加强，导致DC细胞表面标记的表达、细胞因子的分泌 和功能的加强。这些结果表明TLR7和TLR8涉及到人单核细胞来源 的DC对瑞喹莫德的反应，再一次支持了免疫后24小时使用咪喹莫 特。
GMCSF的共导入和咪喹莫特的使用加强了初次免疫后对 p73130Vacyt的细胞免疫反应
通过ELISPOT试验测定继0天经PMID用OVAcyt和联合使用 p7313GMCSF和咪喹莫特初次免疫后的细胞反应。药筒内装载0.5μg p73130Vacyt和0.5μg p7313GMCSF或空载体对照。注射2次，每只 小鼠的总DNA量共2μg。试验条件为：用CD8高亲和肽SIINFEKL 刺激或用含有CD4表位的TEWTSSNVMEERKIKV刺激。Elispot结 果见图8，显示了GMCSF或咪喹莫特与p7313 OVAcyt一起用药的 佐剂效果。试验在免疫后的7天进行。在OVA+GMCSF+咪喹莫特组， CD8 IFNy Elispot试验的孔中的斑点多到无法计数，表明由GMCSF 或咪喹莫特本身引起的大量增加。另一个与单用p73130Vacyt免疫相 比被大大改善的参数是CD4的数量和分泌IFNγ的CD4细胞的比 率。
在根据同样的免疫方案进行的进一步实验中，继用OVAcyt免 疫和联合使用p7313GMCSF和咪喹莫特后用流式细胞仪测定细胞反 应，该方法能够测定更大范围的反应。实验用免疫后第7、14、21 天的脾细胞进行。实验条件是用高亲和力的CD8肽SIINFEKL肽或 能够刺激CD4和CD8的卵白蛋白作为刺激物。进行的实验为细胞内 细胞因子染色以确定分泌IFNγ和IL-2的CD8和CD4细胞的频率及 SIINFEKL Kb肽四聚体染色以确定反应的CD8细胞的总频率。图9所 示为初次免疫后7、14、21天通过肽四聚体染色测得的反应结果。 与前面的实验吻合，实验发现GMCSF和咪喹莫特的联合比其任何一 个单独使用诱导出的SIINFEKL特异的CD8细胞更多。图10显示了 分泌IFNγ和/或IL-2的CD4和CD8细胞的比率。与Elispot的结果 相同，GMCSF和咪喹莫特的联合使用诱导出最强的反应，CD8细 胞和CD4细胞分泌细胞因子是这样的情况，特别是分泌IFNγ和IL- 2两者的CD4细胞得到了很大的加强。
咪喹莫特在有GMCSF或无GMCSF共使用的条件下增强初次 免疫和加强免疫后对p73130Vacyt的细胞反应
小鼠在0天和28天用p73130Vacyt免疫，单独给药或与 p7313GMCSF同时给药，某些实验组在免疫后24小时给予咪喹莫特。 对于初次免疫和加强免疫的方案，p73130Vacyt的剂量降低到0. 005μg/药筒，当需用p7313GMCSF时，其给药量为0.5μg/药筒。在 加强免疫后的第7天收集脾细胞，用卵白蛋白CD4和CD8肽刺激过 夜后用Elispot试验进行分析。结果发现，对比单独使用Ova，与GMCSF 共给药并在24小时后联合使用咪喹莫特增强细胞反应，特别是增强 CD4和CD8细胞产生IFNγ。
GMCSF和咪喹莫特对Muc1引起的细胞反应的效果
进行该实验是要确定GMCSF和咪喹莫特处理对pVAC7VNTR Muc1引起的反应的效果，小鼠在0天和21天用pVAC7VNTR muc1 免疫，免疫或单独进行，或与p7313GMCSF共同给药，或与 p7313GMCSF共同给药后24小时加用咪喹莫特。加强免疫后的第7 天收集脾细胞，用Muc1 CD4肽刺激过夜后用Elispot试验进行分析。 结果发现，对比单独使用pVAC 7VNTRMuc1，与p7313 GMCSF共 用药或使用咪喹莫特能改善CD4反应，与GMCSF共用药加上24小 时后使用咪喹莫特能进一步加强反应(图12)。
为了进一步研究GMCSF和咪喹莫特对Muc1反应的效果，进 行了进一步的实验。对于打破耐受实验，使用了人Muc1转基因小鼠 Muc1 Sacll小鼠，这些小鼠有CBA/C57/b16背景，所以有同样背景的 小鼠被用作对照。CBA/C57/b16 F1小鼠或Sacll小鼠用pVac空载 体、pVac7VNTRMuc1或PVAC7VNTR-PADRE免疫，并与GMCSF 共给药或不与GMCSF共给药，GMCSF组24小时后加用咪喹莫特。 小鼠在0天、28天、42天免疫，49天处死。继用CD4肽 GGSSLSYTNPAVAATSANL(298)和GEKETSATQRSSVPS(192)或 PADRE肽AKFVAAWTLKAAA刺激后，通过IFNg和IL-2Elispot 试验测定CD4细胞的IFNg和IL-2分泌。同时用ICS法测定经同样 的刺激后的IFNg和IL-2的分泌。接受p7313 GMCSF和咪喹莫特的 野生型小鼠组的CD4反应最强，对PADRE肽或Muc1肽都是如此。 用7VNTRMuc1+GMCSF/咪喹莫特免疫的Sacll小鼠对 GGSSLSYTNPAVAATSANL(298)肽有Muc1CD4反应，因此这些小 鼠体内的免疫耐受被打破。用pVac7VNTR PADRE+GMCSF咪喹莫 特免疫的Sacll小鼠有针对PADRE(24％的CD4细胞)的高反应，但 没有打破对Muc1的耐受。这可能是因为相对针对Muc1的反应来讲 针对PADRE的反应有明显的免疫优势的缘故(图13)。在使用同样方 法的一个进一步实验中(图14)，用pVac空载体，pVac7VNTRMuc1， pVac 7VNTR-PADRE或pVac 7VNTR HepB免疫Sacll小鼠，同时， 与GMCSF共给药或不与GMCSF共给药。在这一实验中，在有GMCSF 和咪喹莫特存在的情况下，针对HepB和PADRE的CD4反应得到 了增强，并且对Muc1 CD4肽298的CD4耐受被7VNTR构建体和 7VNTRHepB构建体打破。
GMCSF和咪喹莫特增强对p7313RNG质粒编码的HIV抗原的 反应
雌性Balb/c(K2d)小鼠用Powderject研究仪器经PMID途径导入 两药筒免疫，两个剂量的抗原为0.5和0.05μg/药筒。免疫后24小时 使用咪喹莫特。免疫后第7天，每组3只小鼠被处死，取脾用于 ELISPOT试验分析细胞反应。用于监测针对Gag和RT的CD8反应 的9个氨基酸的肽分别为AMQLKETI(Gag CD8)和YYPDSKDLI(RT CD8)；监测对Gag和RT的CD4反应的肽分别是 IYKRWIILGLNKIVR(Gag CD4)和QWPLTEEKIKALVEI(RT CD4)。 肽EREVLEWRFDSRLAF(Nef 218)也被用于试验。与其任何一个单 独使用时相比，针对Gag和RT的CD4和CD8肽的反应在有GMCSF 和咪喹莫特联合使用的情况下被强化到了最大程度，这一结果与卵 白蛋白和Muc1数据相吻合，卵白蛋白和Muc1数据显示GMCSF和 咪喹莫特联合使用对CD4细胞有很强的效果。
GMCSF和CpG寡核苷酸增强初次免疫后对p73130VA的反应。
C57/b16小鼠经PMID途径用包被有OVAcyt和CpG 1826、 CpG1745和GMCSF的药筒免疫，如图X轴所标示。药筒的制备在 材料和方法中有描述。其中指定的小鼠免疫24小时后局部使用咪喹 莫特。小鼠在免疫后7天被处死进行脾细胞分析。肽SIINFEKL(10nM) 用于测定CD8反应，肽TEWTSSNVMEERIKV(10μM)用于测定CD4 反应(图16)。在用肽SIINFEKL测定时CpG寡核苷酸1826与 p73130Vacyt共包被显示对CD8反应有正面效果，阴性对照寡核苷 酸CpG1745有非特异性的佐剂效应，但与1826的相比非常低下。TLR 配体CpG1826与GMCSF的协同作用同其与咪喹莫特的协同作用类 似。
GMCSF和咪喹莫特增强初次免疫后对p7313OVA的细胞毒性 反应。
C57/b16小鼠用OVAcyt或OVAcyt+GMCSF经PMID进行免疫。 24小时后咪喹莫特用于免疫部位。免疫后第7天来自每组的3只小 鼠的脾细胞被合并在一起，用材料方法中描述的体外细胞毒性试验 测定细胞毒性。试验有直接进行的体外试验和在体外经过7天扩增 后在进行的两种，在两种试验条件下，都发现GMCSF+咪喹莫特组 的细胞毒性反应最强，其反应性T细胞数量的增加是功能相关的(图 17)。初次免疫后GMCSF和咪喹莫特对细胞毒性反应的效果也用体 内细胞毒性试验进行了测定(图18)。C57/b16小鼠用OVAcyt或 OVAcyt+GMCSF经PMID免疫24小时后在进行免疫的部位使用咪 喹莫特。在免疫后的第7天、14天、21天和42天，向小鼠静脉注 射CSFE标记的用肽SIINFEKL脉冲过或未脉冲过的同样数量(umbers) 的脾细胞。两小时后用流式细胞仪分析血液，计算残留的脉冲过的 细胞与未脉冲过的细胞的比率，得到数量化的细胞毒性值。虽然加 用咪喹莫特和GMCSF/咪喹莫特与单用OVA相比有明显的优势，但 当每组3只小鼠时，各组的区别不明显，因此，又进行了一个每组6 只或7只小鼠进行比较的实验，在这个实验中，各组间特异性裂解 的百分比的差异清晰可见。所有GMCSF+咪喹莫特组与单一咪喹莫 特组相比显示较高的特异性裂解(图19b)。
用GM-CSF+咪喹莫特在RIP OVAlo小鼠中打破耐受
RIP OVAlo小鼠被用于测试GMCSF+咪喹莫特联合使用打破耐 受的潜能(图20)。RIP OVAlo小鼠的胰腺胰岛素产生β细胞上表达卵 白蛋白(OVA)，因此对该分子耐受。对这一耐受的打破将引起β细胞 的自身免疫性破坏，从而导致糖尿病的发生，这可以很容易地通过 测定尿糖和血糖水平来进行监测。RIPPova Io和C57/BL6小鼠(野生 型对照)用空载体或OVAcyt(经PMID)、±GM-CSF(经PMID)和± 咪喹莫特进行4次免疫，每次免疫间隔3周。咪喹莫特在经PMID 免疫后的24小时局部使用。最后一次免疫后7天取脾和血清样品。 用细胞内细胞因子染色法染色经肽TEWTSSNVMEERIKV再刺激的 脾细胞来监测CD4+T细胞的IFNγ和IL2产生情况，CD8+T细胞 的IFNγ和IL2产生情况用细胞内细胞因子染色法染色经肽 SIINFEKL再刺激的脾细胞来监测。脾细胞的H-2Kb SIINFEKL肽四 聚体CD8+T细胞分析也同时进行。结果显示，要打破CD4耐受， GMCSF+咪喹莫特是必须的(图20A)。就CD8细胞来看，GMCSF自 身和咪喹莫特自身都有反应，但GMCSF+咪喹莫特组的反应最强。 用肽四聚体测得的结果与此吻合(Figure 20C)。在这一模型中，打破 耐受的功能性测试是糖尿病的出现，可以用测定尿糖水平来监测。 在这一测试中，GMCSF和咪喹莫特联用明显具有优势(图20E)。这 一实验显示了在以打破耐受包括产生功能性反应为目的多次加强免 疫的方案中加入GMCSF的重要性。
GM-CSF和咪喹莫特在微型猪体内增强对p7313RNG (GW825780X)的初次反应
Gottingen微型猪腹部给药4次(即4药筒)进行免疫，各药筒包 括0.5μg p7313RNG和0.5μg p7313空载体或p7313GMCSF(图21的 说明中有详述)。初次免疫后的14天采集血样，纯化PBMC，用 ELISPOT试验确定抗原特异性IFNγ分泌细胞数(图21)。结果显示 GMCSF+咪喹莫特的介导的佐剂效应较单一GMCSF或单一咪喹莫特 介导的要大。
本发明者确认编码GM-CSF的核苷酸与TLR激动剂一起组成的 本发明的佐剂系统的优势在于导致树突状细胞的全面激活和成熟， 这一激活和成熟继而引起明显改善的针对核苷酸序列编码的抗原的 初次免疫反应，这一改善可以通过特异性细胞数量和细胞毒活性来 测定。另外，免疫系统对抗原发生耐受或导致不反应的危险被大大 降低。进一步，当系列免疫给药时，该佐剂系统能够克服对核苷酸 序列编码的自身抗原的耐受。