[0001] 本申请要求于2014年9月9日提交的美国临时专利申请号62/048,037的权益，将其全部内容通过引用结合在此。
发明背景
1.发明领域

[0002] 本发明总体上涉及细胞生物学和肿瘤学领域。更具体地，它涉及结合AGR2和C4.4A的抗体以及它们在抗癌疗法中的使用方法。
2.相关技术说明

[0003] 前梯度蛋白2(AGR2[又称为hGA-2(汤普森(Thompson)和魏格尔(Weigel)，1998)或Gob-4(小宫(Komiya)等人，1999)])是非洲爪蟾XGA-2的人类直系同源物。XAG-2是分泌的并且通过与Ly6超家族的受体Prod-1相互作用而参与青蛙胚胎的外胚层形成和两栖动物肢体
再生(阿伯格(Aberger)等人，1998；库玛(Kumar)等人，2007；达席尔瓦(da Silva)等人，
2002)。然而，没有Prod-1的人类同系物。未知的是，AGR2在人类中是通过在细胞表面上的受体起作用还是在细胞内起作用。AGR2在健康成人中的组织分布指示它局限于具有粘蛋白生
成细胞的器官。AGR2的小鼠基因缺失模型在粘蛋白合成中示出了变化(帕克(Park)等人，
2009)。其他的研究支持AGR2与蛋白二硫化物异构酶(PDI)家族具有序列相似性这一概念
(赵(Zhao)等人，2010；阿特休尔(Altschul)等人，1997；佩尔松(Persson)等人，2005；古普塔(Gupta)等人，2012)。PDI蛋白家族的成员可以催化二硫键的形成、还原和异构化，因此在ER中在蛋白质成熟期间稳定中间体构象(佩尔松(Persson)等人，2005)。然而，在正常细胞中，AGR2在蛋白质合成中的作用不像其在两栖动物中的作用并且也没有解释它在癌症中观
察到的作用。

[0004] 基于酵母双杂交结果已经报道AGR2与肌营养不良蛋白聚糖-1(DAG-1)和C4.4A结合(弗莱彻(Fletcher)等人，2003)。然而，没有提供证据以支持这些分子在哺乳动物细胞中的相互作用或者证实这些相互作用的生物功能。AGR2表达于在具备不同遗传变化模式的不
同组织中形成的各种各样肿瘤中，包括胰腺导管腺癌(PDAC)(拉马钱德兰(Ramachandran)
等人，2008)和乳腺癌(汤普森(Thompson)和魏格尔(Weigel)，1998；弗莱彻(Fletcher)等
人，2003)、前列腺癌(张(Zhang)等人，2005)、肺癌(朱(Zhu)等人，2007)和结肠直肠癌(斯米尔诺夫(Smirnov)，2005)。AGR2支持侵袭性生长和各种癌细胞的转移(刘(Liu)等人，2005；
英尼斯(Innes)等人，2006；巴拉克拉夫(Barraclough)等人，2009)因此，AGR2和其受体可作为有用的治疗靶标。
发明概述

[0005] 在此，将C4.4A(LYPD3)鉴定为细胞外AGR2的功能性细胞表面受体。在此提供了针对AGR2和C4.4A两者的新型单克隆阻断性抗体及它们用于治疗癌症的方法。

[0006] 在一些实施例中，本发明针对特异性地结合至AGR2多肽的分离的或重组的单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些方面，抗体特异性地结合至相应于SEQ ID NO:26的氨基酸
25-125的AGR2多肽。在某些方面，抗体特异性地结合至根据SEQ ID NO:28的AGR2多肽。SEQ ID NO:28相应于人类AGR2(SEQ ID NO:26)的氨基酸残基75-103。诸位发明人已经发现与针
对AGR2的现有技术抗体，尤其是单克隆抗体Ab56703相比，对于如上定义的AGR2多肽具有特异性的单克隆抗体或其抗原结合片段在使用中提供了显著的优势。在一个另外的方面，对
于如上定义的AGR2多肽具有特异性的单克隆抗体或其抗原结合片段抑制肿瘤细胞胰腺导
管腺癌迁移和对吉西他滨诱导的细胞凋亡的抗性。在某些方面，抗体与163-28B-1单克隆抗体竞争结合AGR2多肽。在某些方面，该抗体可以包括163-28B-1单克隆抗体的重链可变区
和/或轻链可变区的全部或部分。在一个另外的方面，抗体可以包含相应于来自本发明实施例的163-28B-1单克隆抗体的轻可变/重可变链的第一、第二、和/或第三互补决定区(CDR)
的氨基酸序列。

[0007] 在某些方面，该分离的抗体包含与163-28B-1重链和轻链氨基酸序列的CDR区至少80％、90％或95％一致的CDR序列。在另外方面，抗体包含与163-28B-1一致的CDR区，除了在一个或多个CDR中一个或两个氨基酸取代、缺失或插入。例如，抗体可以包括CDR，其中CDR序列包括相对于163-28B-1单克隆抗体的CDR而言，在VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VLCDR3中的1个或2个氨基酸取代。因此，在一些特定方面，实施例的抗体包含(a)与163-28B-1的VH CDR1(SEQ ID NO:20)至少80％一致的第一VH CDR；(b)与163-28B-1的VH CDR2(SEQ ID NO:21)至少80％一致的第二VH CDR；(c)与163-28B-1的VH CDR3(SEQ ID NO:
22)至少80％一致的第三VH CDR；(d)与163-28B-1的VL CDR1(SEQ ID NO:23)至少80％一致
的第一VL CDR；(e)与163-28B-1的VL CDR2(SEQ ID NO:24)至少80％一致的第二VL CDR；以及(f)与163-28B-1的VL CDR3(SEQ ID NO:25)至少80％一致的第三VL CDR。

[0008] 在另一些方面，该分离的抗体包含与单克隆抗体163-28B-1的相应CDR序列(分别由SEQ ID NO:20、21、22、23、24和25代表)至少80％一致的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL、和第三VL CDR序列。在一个方面，该分离的抗体包含与单克隆抗体163-28B-1的CDR序列一致的CDR序列。

[0009] 在另一个方面，该分离的抗体包含与163-28B-1的VH结构域(SEQ ID NO:18)至少约80％一致的VH结构域以及与163-28B-1的VL结构域(SEQ ID NO:19)至少约80％一致的VL
结构域。在一个方面，该分离的抗体包含与单克隆抗体163-28B-1的那些VH和VL结构域一致的VH和VL结构域。在一个另外的方面，该分离的抗体是163-28B-1抗体。

[0010] 在一些实施例中，本发明针对特异性地结合至C4.4A多肽的分离的或重组的单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些方面，抗体特异性地结合至相应于SEQ ID NO:27的氨基
酸240-340的C4.4A多肽。在某些方面，抗体特异性地结合至根据SEQ ID NO:29的C4.4A多肽中的C4.4A表位。SEQ ID NO:29相应于人类C4.4A(SEQ ID NO:28)的氨基酸残基262-296。诸位发明人已经发现与针对C4.4A的现有技术抗体，尤其是单克隆抗体AF5428相比，具有如上定义的特异性的单克隆抗体或其抗原结合片段在使用中提供了显著的优势。在一个另外的
方面，对于如上定义的C4.4A多肽具有特异性的单克隆抗体或其抗原结合片段抑制肿瘤细
胞胰腺导管腺癌迁移和对吉西他滨诱导的细胞凋亡的抗性。在某些方面，抗体与162-1A-1
单克隆抗体竞争结合C4.4A多肽。在某些方面，该抗体可以包括162-1A-1单克隆抗体的重链可变区和/或轻链可变区的全部或部分。在一个另外的方面，抗体可以包含相应于来自本发明实施例的162-1A-1单克隆抗体的轻可变/重可变链的第一、第二、和/或第三互补决定区
(CDR)的氨基酸序列。

[0011] 在某些方面，该分离的抗体包含与162-1A-1重链和轻链氨基酸序列的CDR区至少80％、90％或95％一致的CDR序列。在另外方面，抗体包含与162-1A-1一致的CDR区，除了在一个或多个CDR中一个或两个氨基酸取代、缺失或插入。例如，抗体可以包括CDR，其中CDR序列包括相对于162-1A-1单克隆抗体的CDR而言，在VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VLCDR3中的1个或2个氨基酸取代。因此，在一些特定方面，实施例的抗体包含(a)与162-1A-1的VH CDR1(SEQ ID NO:12)至少80％一致的第一VH CDR；(b)与162-1A-1的VH 
CDR2(SEQ ID NO:13)至少80％一致的第二VH CDR；(c)与162-1A-1的VH CDR3(SEQ ID NO:
14)至少80％一致的第三VH CDR；(d)与162-1A-1的VL CDR1(SEQ ID NO:15)至少80％一致
的第一VL CDR；(e)与162-1A-1的VL CDR2(SEQ ID NO:16)至少80％一致的第二VL CDR；以
及(f)与162-1A-1的VL CDR3(SEQ ID NO:17)至少80％一致的第三VL CDR。

[0012] 在另一些方面，该分离的抗体包含与单克隆抗体162-1A-1的相应CDR序列(分别由SEQ ID NO:12、13、14、15、16和17代表)至少80％一致的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL、和第三VL CDR序列。在一个方面，该分离的抗体包含与单克隆抗体162-1A-1的CDR序列一致的CDR序列。

[0013] 在另一个方面，该分离的抗体包含与162-1A-1的VH结构域(SEQ ID NO:10)至少约80％一致的VH结构域以及与162-1A-1的VL结构域(SEQ ID NO:11)至少约80％一致的VL结构
域。在一个方面，该分离的抗体包含与单克隆抗体162-1A-1的那些VH和VL结构域一致的VH和VL结构域。在一个另外的方面，该分离的抗体是162-1A-1抗体。

[0014] 在一些方面，实施例的抗体可以是IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgM、IgA或其抗原结合片段。抗体可以是Fab'、F(ab')2、F(ab')3、单价scFv、二价scFv、或单结构域抗体。抗体可以是人类抗体、人源化抗体或去免疫化抗体。在一些方面，抗体可以与成像剂、化学治疗剂、毒素或放射性核素缀合。

[0015] 在一个实施例中，提供了包含抗体VH结构域的重组多肽，该抗体VH结构域包含163-28B-1的VH结构域的CDR1-3(SEQ ID NO:20、21、和22)或162-1A-1的VH结构域的CDR1-3(SEQ ID NO:12、13、和14)。在另一个实施例中，提供了包含抗体VL结构域的重组多肽，该抗体VL结构域包含163-28B-1的VL结构域的CDR1-3(SEQ ID NO:23、24、和25)或162-1A-1的VL结构域的CDR1-3(SEQ ID NO:15、16、和17)。

[0016] 在一些实施例中，提供了分离的多核苷酸分子，该多核苷酸分子包含编码包括在此披露的抗体VH或VL结构域的抗体或多肽的核酸序列。

[0017] 在另外的实施例中，提供了产生实施例的单克隆抗体或重组多肽的宿主细胞。在一些方面，该宿主细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、纤毛虫细胞或昆虫细胞。在某些方面，宿主细胞是杂交瘤细胞。

[0018] 在再另外的实施例中，提供了制造本发明的抗体的方法，该方法包括在细胞中表达编码在此披露的抗体的VL或VH链的一个或多个多核苷酸分子并且从细胞中纯化抗体。

[0019] 在另外的实施例中，存在包括如在此披露的抗体或抗体片段的药物组合物。这种组合物进一步包括药学上可接受的载体并且可以包含或可以不包含另外的活性成分。

[0020] 在本发明的实施例中，提供了用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括将有效量的抑制AGR2/C4.4A自分泌信号传导环路的药剂给予受试者。在一个方面，该药剂可
以是破坏AGR2/C4.4A相互作用的药剂。

[0021] 在本发明的实施例中，提供了用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括给予有效量的在此披露的抗体。在某些方面，抗体是本发明的单克隆抗体如162-1A-1或163-
28B-1，或包括源自抗体中的抗体区段的重组多肽。

[0022] 在某些方面，癌症可以是乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食管癌、气管癌、皮肤癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。在一个方面，癌症可以是胰腺导管腺癌。

[0023] 在一个方面，抗体可以是全身给予的。在另外的方面中，该抗体可以是静脉、真皮内、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、或局部给予的。该方法可以进一步包括向该受试者给予至少一种第二抗癌疗法。第二抗癌疗法的实例包括但不限于外科疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。在一个方面，受试者可以是人类受试者。

[0024] 在另外的方面中，该方法可以进一步包括向受试者给予本发明的组合物多于一次，如，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多次。

[0025] 根据本发明的某些方面，提供了治疗癌症的方法，该方法包括给予对于治疗患者癌症有效的一个量的AGR2结合蛋白和/或C4.4结合蛋白。在一些方面，方法包括对之前已经被确定为患有癌症或被确定为患有癌症如胰腺导管腺癌的患者进行治疗。

[0026] 在某些实施例中，AGR2结合蛋白和/或C4.4A结合蛋白可以是一种抗体，该抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、亲和性成熟抗体、人源化抗体、人类抗体、或抗原结合抗体片段。优选地，该抗体是单克隆抗体或人源化抗体。在该抗体是抗体片段的实施例中，优选的片段包括Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、或scFv分子。

[0027] 对于某些医学或临床应用，该抗体可以与有待靶向C4.4A表达细胞的药剂附接。该药剂可以是细胞毒剂、细胞因子、抗血管生成剂、化学治疗剂、诊断剂、成像剂、放射性同位素、促凋亡剂、酶、激素、生长因子、肽、蛋白质、抗生素、抗体、抗体的Fab片段、抗原、存活因子、抗凋亡剂、激素拮抗剂、病毒、噬菌体、细菌、脂质体、微粒子、纳米粒子、磁珠、微装置、细胞、核酸、或表达载体。如果被靶向的分子是蛋白，各自蛋白分子和抗体的编码区域可以是框内对齐的以允许所期望的“融合”分子的生产。然而，在其他实施例中，该抗体可以通过使用常规的缀合技术与分子缀合。

[0028] 某些实施例针对抗体或重组多肽组合物，该抗体或重组多肽组合物包括特异性地结合至AGR2或C4.4A的分离的和/或重组的抗体或多肽。在某些方面，该抗体或多肽具有与
在此提供的任何单克隆抗体的全部或部分至少或至多80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％、99％、或100％(或其中可衍生的任何范围)一致的序列。在再另外的方面，该分离的和/或重组的抗体或多肽具有至少或具有至多10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、
22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、
47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、
72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、
97、98、99、100个或更多个来自于在此提供的任何序列或这些序列组合的连续氨基酸。

[0029] 在再另外的方面，实施例的抗体或多肽包括在此披露的任何氨基酸序列的一个或多个氨基酸区段。例如，抗体或多肽可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸区段，所述氨基酸区段的长度为包括约至少或至多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、21、22、23、24、25至25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、
42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、
67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、
92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、
113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、
132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、
151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、
170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、
189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200个氨基酸，包括所有的值和其间的范围，且所述氨基酸片段与在此披露的任何氨基酸序列是至少80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％、或100％一致的。在一些方面，一个或多个氨基酸区段选自如表1中提供的AGR2结合抗体或C4.4A结合抗体的氨基酸序列中的一个。

[0030] 在再另外的方面，实施例的抗体或多肽包括在此披露的任何氨基酸序列的氨基酸区段，其中该区段起始于在此提供的任何序列中的氨基酸位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25至25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、
36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、
61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、
86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、
108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、
127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、
146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、
165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、
184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、或200处，并且终止于在提供的相同序列中的氨基酸位置4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、23、24、25至25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、
43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、
68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、
93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、
114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、
133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、
152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、
171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、
190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、或200处。在某些方面，一个或多个氨基酸区段或其部分选自如表1中提供的AGR2结合抗体或C4.4A结合抗体的氨基酸序列中的一个。

[0031] 在又另外的方面中，实施例中的抗体或多肽包括与AGR2结合抗体或C4.4结合抗体(如在表1中提供)的V、VJ、VDJ、D、DJ、J或CDR结构域至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％、99％、或100％(或其中可衍生的任何范围)一致的氨基酸区段。例如，多肽可以包括与在表1中提供的AGR2结合抗体或C4.4A结合抗体的CDR1、2、和/或3至少80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％、99％、或100％(或其中可衍生的任何范围)一致的1个、2个或3个氨基酸区段。

[0032] 在一个实施例中，提供了包括AGR2结合抗体和/或C4.4A结合抗体的组合物以用于在患者中治疗癌症。在另一个实施例中，提供了AGR2结合抗体和/或C4.4A结合抗体在制造
用于治疗癌症的药剂中的用途。所述AGR2结合抗体和/或C4.4结合抗体可以是实施例的任
何AGR2结合抗体和/或C4.4A结合抗体。

[0033] 在本发明的方法和/或组合物的背景中所讨论的实施例可以相对于在此描述的任何其他的方法或组合物使用。因此，有关一个方法或组合物的实施例也可以适用于本发明
的其他方法和组合物。

[0034] 如在此所用的，使用关于核酸的术语“编码”或“编码”以使得本发明可被技术人员容易地理解；然而，这些术语可以分别与“包括”(“comprise”或“comprising”)互换使用。

[0035] 如在说明书中使用的，“一种/一个(“a”或“an”)”可以意指一种/一个或多于一种/一个。如在权利要求中使用的，当与词“包括(comprising)”结合使用时，这些词“一种/一个(“a”或“an”)”可以意指一种/一个或多于一种/一个。

[0036] 在权利要求书中，术语“或”的使用被用于指“和/或”，除非明确指明是指仅替代方案或替代方案是互相排斥的，虽然本披露支持是指仅替代方案以及“和/或”的定义。如在此所使用的，“另一个”可以意指至少第二个或更多个。

[0037] 贯穿本申请，术语“约(about)”用于指示数值包括对于装置、被用于确定数值的方法、或在研究对象中存在的变化而言固有的误差变化。

[0038] 本发明的其他目的、特征和优点将从以下详细说明中变得清楚。然而，应当理解，详细说明和具体实例，在指示本发明的优选实施例的同时，仅以说明的方式给出，因为根据本详细说明，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员而言将变得清楚。
附图简要说明

[0039] 下列附图形成了本说明书的一部分并且被包括以进一步证实本发明的某些方面。本发明可以通过结合在此呈现的具体实施例的详细描述，参考这些附图中的一个或多个而
被更好的理解。

[0040] 图1A-D.细胞外AGR2刺激PDCA细胞侵袭性。细胞外添加rAGR2(0-500nM)至AsPC-1细胞导致(A)细胞增殖，(B)迁移，和(C)侵袭的剂量依赖型增加。(D)吉西他滨(Gem)添加导致增加的细胞凋亡。增殖由活细胞相对对照的百分比示出。然而，细胞外AGR2显著降低了
Gem诱导的细胞凋亡的水平。示出的数据是3次实验的平均值±SEM(*p<0.05)。

[0041] 图2A-C.C4.4A和其他LY6家族受体和AGR2相互作用。(A)几种候选受体(uPAR、C4.4A、和CD59)与AGR2免疫共沉淀，然而DAG-1不能免疫共沉淀。(B)纯化的重组AGR2和
C4.4A从它们的悬浮液中也可以免疫共沉淀，支持AGR2和C4.4A的直接相互作用。(C)使用
siRNA在两个不同浓度下实现C4.4A、CD59、和uPAR的沉默。显著的沉默通过蛋白质印迹利用各自的抗体示出，并且将相同的膜针对作为加载对照的β-肌动蛋白进行印迹。siRNA的两个浓度示出显著沉默。示出的显微照片代表三次独立的实验。

[0042] 图3A-E.C4.4A对于rAGR2介导的功能来说是需要的。将AsPC-1细胞用siRNA转染以沉默C4.4A、CD59、或uPAR，并且然后每天不用(基底，左列)和用AGR2(100nM，右列)处理。只有C4.4A沉默降低了基底和rAGR2两者刺激的(A)增殖、(B)迁移、和(C)侵袭。增殖由活细胞相对Si对照(基底)和Si对照+AGR2(处理的)的百分比示出。(D)在Si对照细胞中，Gem添加刺激细胞凋亡并且该作用由AGR2改善。C4.4A本身的沉默诱导细胞凋亡，提升了Gem介导的细
胞凋亡，并且消除了AGR2的存活效应，示出了显著的细胞凋亡增加。示出的数据是3次实验的平均值±SEM(*p<0.05)。(E)为了测定特异性C4.4A siRNA的作用，使用四种siRNA
(SiC4.4A 1–4)用于细胞凋亡研究并且具有可比较的结果。

[0043] 图4A-C.AGR2的作用是通过C4.4A与整合素β1和层粘连蛋白1或层粘连蛋白5相互作用来介导的。(A)在Si对照AsPC-1细胞中，Gem添加刺激了细胞凋亡并且rAGR2的添加抑制了这一作用。还将AsPC-1细胞用针对ITG-β1、ITG-β2、ITG-β4、ITG-α6、层粘连蛋白1和层粘连蛋白5的siRNA转染。只有层粘连蛋白1和5以及整合素β1的沉默增加了Gem诱导的细胞凋
亡并且消除了AGR2的存活效应。(B)层粘连蛋白1和5以及整合素β1通过siRNA的沉默显著消除了AGR2介导的AsPC-1细胞的增殖。(C)针对ITG-β1、ITG-β2、ITG-β4、ITG-α6、层粘连蛋白
1、和层粘连蛋白5的可商购阻断性抗体示出与siRNA处理相似的结果，其中只有针对层粘连蛋白1和5以及整合素β1的抗体阻断了AGR2介导的存活效应。示出的数据是3次实验的平均
值±SEM(*p<0.05)。

[0044] 图5A-D.开发出阻断AGR2/C4.4A结合及生物效应的具有高度特异性的单克隆抗体。(A)从内源性PDAC细胞裂解物(SU86.86)中，AGR2(18kD)和C4.4A(50kD)是通过它们各自新开发的mAb来鉴定。用内源性蛋白鉴定出的额外的条带也在用重组蛋白的情况下观察到，并且可能代表裂解产物。可商购的抗体也识别这些分子。然而，可商购的Ab示出了几条非特异性条带。阻断性mAb(B)降低了AGR2刺激的PDAC细胞迁移并且(C)阻断了AGR2的存活效应，然而商业Ab不可以。(D)在TMA上使用开发的mAb的免疫组织化学分析示出PDAC的强标记(用
箭头指示)，但是正常的胰腺没有被标记。

[0045] 图6A-I.使用AGR2/C4.4A抗体的体内处理降低肿瘤生长和转移并且改善存活。在注射荧光素底物(精诺真(Xenogen)，阿拉米达，加利福尼亚州)后，利用用于活体动物生物发光成像的 成像系统每周测量肿瘤生长和转移。将小鼠存活直到实验结束的数量标
记出(存活百分比)。(A、B、G、H)模型1-AsPC-1-侵袭性模型。在注射侵袭性AsPC-1细胞两周后，当肿瘤重量少于0.5g(如从平行的未处理组中手术证实的)时，将小鼠(n＝6)用对照IgG或mAb(组合AGR2/C4.4A mAb(每种5mg)/kg/体重/一周两次/i.p)并且用或者不用Gem
(100mg/kg体重/每周一次/i.p)处理直到7周。(A)所有用组合的mAb处理的小鼠存活至少6
周，然而所有的对照小鼠在6周内死亡。(B)每周通过成像估算肿瘤体积。与对照IgG有或没有Gem相比，有或没有Gem的情况下，组合IgG均示出肿瘤体积的下降。在实验结束时，离体比较对照组和处理组之间的肿瘤重量以及到肝脏和肺的转移。用mAb处理的小鼠示出了大大
降低的肿瘤生长(G)以及转移发生率(H)。吉西他滨(Gem)单独或与mAb组合时没有显著的作
用。(C、D)模型2-Capan2-基质模型。注射基质形成性Capan-2细胞后的两周，将小鼠(n＝7)用15mg AGR2或C4.4A mAb/kg/体重/一周两次/i.p处理。在15周之后停止处理(13周的处
理)，并且通过生物发光监测在存活的动物中的肿瘤大小直到63周。(C)与9周死亡的对照小鼠相比，使用任何一个mAb的处理单独示出了24周的存活改善。在没有处理48周后，小鼠没有示出肿瘤再生。(D)肿瘤体积改变均值指示用任何一个mAb处理的小鼠示出更慢的生长。
在几只小鼠中，观察到肿瘤消失了。(E、F)模型3-Capan-2-回归研究。在注射Capan-2细胞之后四周，当肿瘤重量超过1g(如从平行的未处理组中手术证实的)，将小鼠(n＝5)用AGR2或
C4.4A mAb以15mg/kg/体重/一周两次/i.p处理或用两种mAb组合处理(每种7.5mg)。12周之
后停止处理。在存活动物中监测生物发光直到18周。(E)与在处理的4周内死亡的对照小鼠
相比，用mAb对具有大于1g肿瘤的小鼠的处理提升了它们的存活14周。(F)每个处理组的肿
瘤体积的降低是如通过生物发光成像测量示出的。(I)进行在模型3中发展的肿瘤的组织学
检查。石蜡切片的TUNEL染色示出与对照相比，在用抗体单独或组合处理的组中增加的凋亡细胞。针对p-ERK和Ki-67的染色示出对照小鼠癌细胞中增加的活性，然而抗体处理的小鼠
没有示出癌细胞中的活性。定量指示在来自mAb处理的小鼠的肿瘤的切片中每个视野凋亡
细胞数的显著增加(*p<0.05)。

[0046] 图7A-D.细胞外rAGR2介导的功能。(A)将胰腺癌细胞(BxPC-3和MiaPaCa-2)用于这些研究。rAGR2的细胞外添加引起增殖的显著的剂量依赖性增加(BxPC-3-3倍增加；
MiaPaCa-2-4倍增加；p<0.05)。将胰腺癌细胞在用和不用rAGR2(0-100nM)的情况下铺板
(2x104个细胞)在Boyden室上用于迁移研究(B)，并且铺板在侵袭室上用于侵袭研究(C)。在
22h后，将细胞用甲醇固定并且用苏木精染色，并且将在10个随机视野中的细胞在100倍放
大下拍照并计数。rAGR2的细胞外添加引起迁移的显著的剂量依赖性增加(BxPC-3-7倍增
加；MiaPaCa-2-3倍增加)以及侵袭的显著的剂量依赖性增加(BxPC-3-10倍增加；MiaPaCa-
2-3倍增加)。(D)对于细胞凋亡分析，将BxPC-3细胞用或不用Gem(1μM)和AGR2(100nM)处理。
Gem处理导致细胞凋亡显著增加(1倍)。rAGR2的细胞外添加显著降低了Gem诱导的细胞凋亡
(50％降低)，由此提升了癌细胞的存活。示出的数据是3次实验的平均值±SE(*p<0.05对比
对照)。

[0047] 图8A-I.候选受体结合和沉默。蛋白质印迹，示出AGR2的候选受体：(A)CD59、(B)uPAR、和(C)C4.4A的免疫沉淀。使用可商购的抗AGR2抗体进行IP分析并且使用IgG作为对照抗体。将免疫沉淀的样本加载用于蛋白质印迹分析，并且将胶用各自的抗体探测。AGR2IP和全部三个候选受体发生免疫共沉淀。泳道1：分子量标记；泳道2：单独裂解物；泳道3：裂解物+IgG Ab(小鼠)；泳道4：裂解物+抗AGR2抗体(小鼠)。示出的显微照片代表三次独立的实验。
(D)将重组的AGR2和C4.4A在溶液中组合以测试直接物理相互作用，并且IP使用抗AGR2抗体
进行并且通过蛋白质印迹探测C4.4A。IgG用作对照抗体。如在这个拉下实验(pull-down 
experiment)中指示的，rAGR2和rC4.4A直接相互作用。泳道1：分子量标记；泳道2：重组蛋白+IgG Ab(小鼠)；泳道3：重组蛋白+抗AGR2抗体(小鼠)。(E)胰腺癌细胞系的RT-PCR示出
C4.4A在所有测试的细胞系中的表达。示出的显微照片代表三次独立的实验。(F)蛋白质印
迹还示出C4.4A在所有测试的胰腺癌细胞系裂解物中的蛋白水平的表达。示出的显微照片
代表三次独立的实验。(G-I)在AsPC-1细胞中，使用siRNA在两种最终浓度(5和10nM)下瞬时完成了每个候选受体的沉默。利用各自的抗体进行蛋白质印迹，并且还将相同的膜用充当
加载对照的β-肌动蛋白进行印迹。泳道1：分子量标记；泳道2：Si对照(5nM)；泳道3：Si对照(10nM)；泳道4：各自的siRNA(5nM)；和泳道5：各自的siRNA(10nM)。siRNA的两种浓度示出了每个受体的几乎完全沉默。示出的显微照片代表三次独立的实验。

[0048] 图9A-D.沉默C4.4A降低基底和rAGR2介导的功能。将BxPC-3胰腺癌细胞用Si对照、SiC4.4A、SiCD59、或SiuPAR瞬时转染。(A)为了增殖研究，将细胞不用(基底)和用rAGR2处理(100nM，每天)处理，并且48小时后通过MTS测定估算细胞数量。分析沉默候选受体对迁移
(B)和侵袭(C)的作用。C4.4A沉默显著降低了基底和rAGR2刺激的增殖、迁移、和侵袭。其他候选受体的沉默没有显著作用。(D)对于细胞凋亡研究，将细胞不用或用Gem(0.5μM)和
rAGR2(100nM)处理。在Si对照转染的细胞中，Gem刺激细胞凋亡并且该作用通过rAGR2的添
加改善。在这些细胞中，C4.4A的沉默诱导了细胞凋亡，然而Gem没有进一步增加细胞凋亡。
在C4.4A沉默后，rAGR2的添加没有保护细胞免于Gem的作用。示出的数据是3次实验的平均
值±SE(*p<0.05)。

[0049] 图10A-B.C4.4A和整合素β1相互作用来介导AGR2的作用。作为AGR2-C4.4A信号传导复合物的一部分，通过使用一组siRNA测试各种整合素的作用。(A)对于细胞凋亡研究，将siRNA转染的BxPC-3细胞不用或用Gem(0.5μM)和AGR2(100nM)处理。在Si对照转染的细胞
中，rAGR2的添加降低了Gem介导的细胞凋亡。相比之下，当整合素β1被沉默时，Gem刺激细胞凋亡但是此作用未通过AGR2降低。其他整合素的沉默对于消除AGR2介导的存活效应没有任
何显著的作用。因为已知层粘连蛋白1和5与C4.4A相互作用，将这些层粘连蛋白对于C4.4A
介导的AGR2存活效应的沉默作用进行评估。层粘连蛋白1和5的沉默消除了AGR2介导的存活
效应。(B)为了测定整合素β1的沉默对于AGR2刺激的细胞增殖的作用，将细胞用不同的
siRNA处理并且允许细胞生长48h，之后用MTS测定进行分析。层粘连蛋白1和5以及整合素β1的沉默消除了AGR2介导的增殖。示出的数据是3次实验的平均值±SE(*p<0.05)。

[0050] 图11A-D.开发的单克隆抗体各自结合至AGR2和C4.4A蛋白并且阻断它们的功能。从内源性裂解物(SU86.86/Panc-1)中，利用一组mAb鉴定AGR2(18kD)和C4.4A(50kD)。然而，商业Ab示出了非特异性条带。将用内源性蛋白鉴定的额外的条带使用重组蛋白进行再证
实。对于细胞凋亡研究，将AsPC-1细胞不用或用Gem(0.5μM)和rAGR2(100nM)处理并且用纯化的(A)AGR2和(B)C4.4A Ab(1μM)处理。可商购的Ab作为对照。Gem的添加导致增加的细胞凋亡，然而AGR2的添加导致存活益处。水平线代表细胞凋亡值中值。示出的数据是3次实验的平均值±SE(*p<0.05)。(C、D)使用如选自具有高阻断效率的细胞凋亡测定的纯化的(C)
AGR2和(D)C4.4A Ab进行结合测定。ELISA测定通过涂布抗原肽(0.5μg)进行并且使用各自
纯化的Ab探测。示出的数据是3次实验的平均值±SE(*p<0.05)。基于高度特异性和结合，选择克隆28B用于AGR2以及1A用于C4.4A。还将纯化的Ab跑4％-20％的梯度胶以检查重链
(50kD)和轻链(25kD)的存在。AGR2和C4.4A没有示出额外的条带。

[0051] 图12.Capan-2肿瘤中的存活曲线。图示出了具有原位形成的Capan-2肿瘤的以及用对照人IgG(HuCtrl)、人源化抗AGR2 mAb(HuAGR2)或人源化抗C4.4A mAb(HuC4.4A)抗体
处理的小鼠的存活曲线。
说明性实施方案的说明

[0052] 本发明部分基于C4.4A(LYPD3)是细胞外AGR2的功能性细胞表面受体这一发现。在此，将C4.4A(LYPD3)鉴定为细胞外AGR2的功能性细胞表面受体。为了支持AGR2/C4.4A自分
泌环路可以是癌症治疗靶标这一观点，开发出了针对AGR2和C4.4A两者的单克隆阻断性抗
体。用这些抗体的体内处理显著降低了PDAC肿瘤重量和转移并且延长了存活。这些结果表
明AGR2/C4.4A相互作用是具备癌症疗法治疗潜力的靶标。
I.AGR2和C4.4A

[0053] AGR2和若干肿瘤类型中不良结果相关(布里赫托娃(Brychtova)等人，2011)但是之前并不知道机制。已经报道AGR2涉及蛋白成熟和折叠(帕克(Park)等人，2009；赵(Zhao)等人，2010；阿特休尔(Altschul)等人，1997；比嘉(Higa)等人，2011)，以调节组织蛋白酶(迪马丹(Dumartin)等人，2011)，并且调节MUC-1水平(帕克(Park)等人，2009；诺里斯
(Norris)等人，2013)。然而，这些AGR2的作用没有解释它作为致癌基因起作用的能力(王
(Wang)等人，2008)或AGR2增加若干类型癌症的侵袭性的能力。因此，有可能的是这种蛋白具有多个细胞内和细胞外功能。潜在地，它的生理学和病理学功能不同。在本研究中，rAGR2的细胞外添加刺激PDAC细胞的增殖、迁移、侵袭、和化学抗性。这些反应需要细胞表面受体的存在。因此，基于这些数据，并且不受理论约束，AGR2在癌症中的作用与它在两栖动物中的作用在机制上相似，其中它是与特异性受体相互作用的被分泌的信号传导分子。

[0054] 在两栖动物中，AGR2通过和Prod1(一种与人类Ly6家族受体相关的GPI连接受体)(加拉特(Galat)，2008；查特吉(Chatterjee)和马约(Mayor)，2001),相互作用而促进肢体生长(库玛(Kumar)等人，2007；达席尔瓦(da Silva)等人，2002)。Lys6家族包括uPAR、C4.4A和CD59(加拉特(Galat)，2008；达席尔瓦(da Silva)等人，2002)。本研究指示Lys家族受体((uPAR、C4.4A、和CD59)与AGR2免疫共沉淀，可能是因为这些受体间的结构同源性(加拉特(Galat)，2008)。然而，只有通过沉默或阻断性抗体阻断AGR2和C4.4A的相互作用才降低内源性(基底)和细胞外的rAGR2刺激的PDAC细胞功能。虽然在酵母双杂交系统中报道了肌营
养不良蛋白聚糖-1结合至AGR2，本免疫共沉淀研究不能证实这个相互作用。出人意料地，观察到其他两个受体CD59和uPAR的沉默轻微地增加了PDAC细胞的迁移。这个观察是没有预料
到的，因为之前的报道表明沉默uPAR抑制PDAC细胞迁移(薛(Xue)等人，2009)。不清楚什么引起了这个区别，但是这可能由于研究是在不同的细胞系中进行。然而，在此示出的数据支持了AGR2和C4.4A参与了激活存活机制的自分泌环路的模型。

[0055] 在之前的基因谱研究中，发现C4.4A在胰腺癌中高度表达，但是在正常或慢性胰腺炎组织中并非如此(洛格斯登(Logsdon)等人，2003)。C4.4A是之前被描述为癌细胞转移调
节因子(罗斯 等人，1998；雅克布森(Jacobsen)和普卢(Ploug)，2008)的孤儿受体。
C4.4A在黑素瘤(罗斯 等人，1998)和非小细胞肺癌(汉森(Hansen)等人，2007)中增
加转移，并且在乳腺癌(汉森(Hansen)等人，2007)和结肠直肠癌(帕雷特(Paret)等人，
2007；小西(Konishi)等人，2010)中，C4.4A蛋白水平与不良预后相关。在此，将C4.4A定义为AGR2的功能性细胞表面受体。C4.4A的沉默或抗体介导的阻断消除了细胞外AGR2的作用，因此支持AGR2是C4.4A的配体。然而，之前尚未探究C4.4A的作用机制。因此，检查与C4.4A相互作用的信号传导复合物分子以鉴定特异性分子。

[0056] 像其他的糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接的细胞膜受体，C4.4A没有细胞内结构域以介导下游信号传导机制。基于C4.4A和uPAR(Ly6家族的另一个成员)的同源性，这些相互作用
可能包括细胞外基质蛋白和特定的整合素受体。已知C4.4A通过和α6β4关联来促进迁移(恩戈拉(Ngora)等人，2012)。之前报道C4.4A结合层粘连蛋白1和5，虽然没有进行功能性研究(帕雷特(Paret)等人，2005)。认为层粘连蛋白1和5主要和整合素α3β1相互作用(史密斯
(Smith)等人，2001；比嘉(Higa)等人，2011)。整合素α3β1由胰腺导管细胞表达(姜(Jiang)等人，2002)。层粘连蛋白1、层粘连蛋白5或整合素β1的沉默消除了AGR2处理的作用，因此表明了它们涉及AGR2介导的C4.4A受体复合物。

[0057] 为了检查阻断AGR2/C4.4A自分泌环路的潜在的治疗效益，开发出了针对配体(AGR2)和受体(C4.4A)的阻断性mAb。这两种Ab阻断了基底和AGR2介导的功能。使用阻断性
mAb在三个不同类型的临床前模型中的临床前研究导致肿瘤重量和转移的显著降低并且改
善存活。用mAb的处理比用吉西他滨(Gem)的处理(用于PDAC的临床护理标准)具有更佳的益
处。在用单独的mAb或用两种mAb的组合处理后，在几只小鼠中观察到部分或完全的肿瘤消
退。甚至在处理后的几周，没有观察到肿瘤复发。

[0058] 因此，AGR2具有增加癌细胞侵袭性的细胞外功能并且C4.4A是AGR2的功能性受体。C4.4A的信号传导复合物可能包括层粘连蛋白1、层粘连蛋白5、和β1整合素。针对AGR2和/或C4.4A的阻断性mAb显著降低了肿瘤生长和转移，并且引起肿瘤消退，导致明显改善的存活。
II.治疗性抗体

[0059] 在某些实施例中，考虑到了结合至AGR2或C4.4A蛋白的至少一部分并且抑制AGR2/C4.4A结合的抗体或其片段，以及它在疾病治疗中的相关用途。如在此使用的，术语“抗体(antibody)”旨在广泛地指代任何免疫结合剂，如IgG、IgM、IgA、IgD、和IgE以及包括维持抗原结合活性的抗体CDR结构域的多肽。该抗体可以选自下组，该组由以下各项组成：嵌合抗体、亲和性成熟抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人类抗体、或抗原结合抗体片段或天然的或合成的配体。优选地，抗AGR2或抗C4.4A抗体是单克隆抗体或人源化抗体。通过已知的手段并且如在此描述的，可以创造对AGR2蛋白或C4.4A蛋白、一个或多个其各自的表位、或任何前述物的缀合物具有特异性的多克隆抗体或单克隆抗体、抗体片段、以及结合结构域和CDR(包括任何前述物的工程化形式)，无论此类抗原或表位是从天然来源分离还
是天然化合物的合成衍生物或变体。

[0060] 适合于本发明实施例的抗体片段的实例包括而不限于：(i)由VL、VH、CL、和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的“Fd”片段；(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的“Fv”片段；(iv)由VH结构域组成的“dAb”片段；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段，一个包括两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(“scFv”)，其中VH结构域和VL结构域是由允许两个结构域关联以形成结合结构域的肽接头连接；(viii)双特异性的单链Fv二聚体(参见美国专利号5,091,513)；以及(ix)由基因融合构建的双抗体、多价或多特异性片段(美国专利申请公开案20050214860)。Fv、scFv、或双抗体可以通过连接VH和VL结构域的二硫键的掺入来稳定。还可以制造包括连接至CH3结构域上的scFv的微型抗体(胡(Hu)等
人，1996)。

[0061] 在实施例中还考虑了抗体样结合拟肽。刘(Liu)等人(2003)描述了“抗体样结合拟肽”(ABiP)，该抗体样结合拟肽是充当精简抗体的肽并且具有血清半衰期较长和合成方法
不太繁琐的某些优点。

[0062] 如本领域技术人员熟知的，可以使用AGR2和C4.4A mRNA序列(分别是和SEQ ID NO:1和2)生产重组蛋白质和肽。例如，可以将这样的mRNA序列工程化到一种合适的表达系
统如酵母、昆虫细胞、或哺乳动物细胞中，以用于AGR2或C4.4A蛋白或肽的生产。

[0063] 可以将动物用抗原如可溶性AGR2或C4.4A蛋白接种，以生产对AGR2或C4.4A蛋白具有特异性的抗体。通常抗原与另一个分子结合或缀合以增强免疫应答。如在此所用的，缀合物是与抗原结合以用于在动物中引发免疫应答的任何肽、多肽、蛋白质或非蛋白质性物质。
在动物中产生的、响应于抗原接种的抗体包括由各种产生单独抗体的B淋巴细胞制造的各
种不同的分子(多克隆抗体)。多克隆抗体是抗体种类的混合群体，其中的每一个识别相同
抗原上的不同表位。在给出在动物中产生多克隆抗体的正确条件的情况下，动物血清中的
大部分抗体将识别已免疫动物的抗原化合物上的共同表位。该特异性进一步通过亲和纯化
以便仅选择那些识别感兴趣的抗原或表位的抗体来增强。

[0064] 单克隆抗体是单一种类抗体，其中每个抗体分子识别相同的表位，因为所有的产生抗体的细胞衍生自单一的B淋巴细胞系。生产单克隆抗体(mAb)的方法通常沿着与制备多
克隆抗体的路线相同的路线开始。在一些实施例中，使用啮齿动物如小鼠和大鼠生产单克
隆抗体。在一些实施例中，使用兔子、绵羊、或青蛙细胞生产单克隆抗体。使用大鼠是熟知的并且可以提供某些优点。小鼠(如BALB/c小鼠)是常规使用的并且通常给出高百分比的稳定
融合。

[0065] 杂交瘤技术涉及来自之前用AGR2或C4.4A抗原免疫的小鼠的单一B淋巴细胞与永生骨髓瘤细胞(通常是小鼠骨髓瘤)的融合。这个技术提供了繁殖一种产生单一抗体的细胞
以用于无限数量的生产的方法，使得可以产生无限数量的具有相同抗原或表位特异性的结
构相同的抗体(单克隆抗体)。

[0066] 在一个实施例中，该抗体是嵌合抗体，例如包括来自非人供体的被接枝到异源的非人、人类、或人源化序列(例如，框架和/或恒定结构域序列)上的抗原结合序列的抗体。已经开发出用类似的人源结构域替代单克隆抗体的轻链和重链恒定结构域、完整地保留外来
抗体的可变区的方法。可替代地，“全人”单克隆抗体是在针对人免疫球蛋白基因进行了转基因的小鼠中产生。还开发出通过重组构建具有啮齿动物如小鼠和人类氨基酸序列两者的
抗体可变结构域从而将单克隆抗体的可变结构域转化为较多人类形式的方法。在“人源化”单克隆抗体中，只有高变CDR衍生自小鼠单克隆抗体，并且框架区和恒定区衍生自人类氨基酸序列(参见美国专利号5,091,513和6,881,557)。认为用在人类抗体中的相应位置发现的
氨基酸序列替代抗体中具有啮齿动物特征的氨基酸序列在治疗使用期间将降低不良免疫
反应的可能性。还可以将产生抗体的杂交瘤细胞或其他细胞进行基因突变或其他改变，这
可以或不可以改变由杂交瘤细胞产生的抗体的结合特异性。

[0067] 用于在各种动物物种中产生多克隆抗体以及用于产生各种类型的单克隆抗体(包括人源化抗体、嵌合抗体和全人抗体)的方法在本领域中是熟知的并且是高度可预测的。例如，下列美国专利和专利申请提供了这样的方法的实现性描述：美国专利号3,817,837；3,
850,752；3,939,350；3,996,345；4,196,265；4,275,149；4,277,437；4,366,241；4,469,
797；4,472,509；4,606,855；4,703,003；4,742,159；4,767,720；4,816,567；4,867,973；4,
938,948；4,946,778；5,021,236；5,164,296；5,196,066；5,223,409；5,403,484；5,420,
253；5,565,332；5,571,698；5,627,052；5,656,434；5,770,376；5,789,208；5,821,337；5,
844,091；5,858,657；5,861,155；5,871,907；5,969,108；6,054,297；6,165,464；6,365,
157；6,406,867；6,709,659；6,709,873；6,753,407；6,814,965；6,849,259；6,861,572；6,
875,434；6,891,024；7,407,659；以及8,178,098。特此将在此或其中引用的所有的专利、专利申请公开和其他出版物通过引用结合在本申请中。

[0068] 可以从包括鸟和哺乳动物的任何动物来源生产抗体。优选地，抗体是绵羊的、鼠类的(如小鼠或大鼠)、兔的、山羊的、豚鼠的、骆驼的、马的、或鸡的。另外的，更新的技术允许人类抗体从人类组合抗体库中的发展和筛选。例如，噬菌体抗体表达技术允许在缺乏动物免疫时产生特异性抗体，如在美国专利号6,946,546中描述的，将其通过引用结合在此。这些技术进一步在马克斯(Marks)等人(1992)；施特默尔(Stemmer)(1994)；格拉姆(Gram)等
人(1992)；玛巴斯(Barbas)等人(1994)；和席尔(Schier)等人(1996)中描述。

[0069] 完全希望针对AGR2和/或C4.4A的抗体将具有阻断AGR2/C4.4A结合的能力，而不论动物物种、单克隆抗体细胞系、或抗体的其他来源是什么。某些动物物种对于生产治疗性抗体是不太优选的，因为它们更可能由于通过抗体“Fc”部分的补体系统活化而引起过敏反
应。然而，可以将完整的抗体经酶消化成“Fc”(补体结合)片段和具有结合结构域或CDR的抗体片段。Fc部分的去除降低了抗原抗体片段将引发不希望的免疫应答的可能性，并且因此，不具有Fc的抗体可以优选用于预防或治疗处理。如上描述的，还可以构建抗体以便成为嵌
合或部分或全部人类的，以降低或消除由向动物给予已在其他物种中产生的抗体或具有来
自其他物种的序列的抗体引起的不良免疫后果。

[0070] 取代变体典型地包含在蛋白内的一个或多个位点处一个氨基酸用另外一个替换，并且可以被设计为调节多肽的一种或多种特性，有或没有其他功能或特性的损失。取代可
以是保守的，即一个氨基酸被一个相似形状和电荷的氨基酸替代。保守的取代在本领域中
是熟知的并且包括例如以下的交换：丙氨酸到丝氨酸；精氨酸到赖氨酸；天冬酰胺到谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸到谷氨酸；半胱氨酸到丝氨酸；谷氨酰胺到天冬酰胺；谷氨酸到天冬氨酸；甘氨酸到脯氨酸；组氨酸到天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸到亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸到缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸到精氨酸；甲硫氨酸到亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸到酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸到苏氨酸；苏氨酸到丝氨酸；色氨酸到酪氨酸；酪氨酸到色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸到异亮氨酸或亮氨酸。可替代地，取代可以是非保守的，使得影响多肽的功能或活性。非保守改变典型地涉及用一个化学不相似的残基取代一个残基，如
将极性或带电氨基酸改变为非极性或不带电氨基酸，并且反之亦然。

[0071] 蛋白可以是重组的或在体外合成的。可替代地，非重组蛋白或重组蛋白可以从细菌分离。还考虑了包含这样变体的细菌可以在组合物和方法中实施。因此，不需要分离蛋
白。

[0072] 考虑了在组合物中具有在约0.001mg和约10mg之间的总的多肽、肽、和/或蛋白/ml。这样，蛋白在组合物中的浓度可以是约、至少约或至多约0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、
0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、
7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0mg/ml或更多(或其中衍生的任何范围)。这当中，约、至少约或至多约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、
16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、
31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、
46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、
61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、
76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％可以是结合AGR2或C4.4A的抗体。

[0073] 抗体或优选地抗体的免疫部分可以与其他蛋白化学缀合或者表达为具有其他蛋白的融合蛋白。出于本说明书和所附权利要求书的目的，将所有这样的融合蛋白包括在抗
体或抗体免疫部分的定义之内。

[0074] 实施例提供了针对AGR2和C4.4A的抗体和抗体样分子、与至少一种药剂连接以形成抗体缀合物或有效负载的多肽和肽。为了增加抗体分子作为诊断或治疗药剂的效率，常
规的是连接或共价结合或复合至少一种期望的分子或部分。这样的分子或部分可以是，但
不限于，至少一种效应因子或报告分子。效应分子包括具有期望活性如细胞毒性的分子。已经被附接到抗体上的效应分子的非限制性实例包括毒素、治疗酶、抗生素、放射性标记的核苷酸等。相比之下，报告分子定义为可以用测定进行检测的任何部分。已经缀合到抗体上的报告分子的非限制性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标签、磷光分子、化学发光分子、发色团、发光分子、光亲和分子、带色粒子或配体，如生物素。

[0075] 在本领域中已知若干种方法可用于将抗体附接或缀合至它的缀合物部分。一些附接方法涉及金属螯合物的使用，例如使用附接到抗体上的有机螯合剂，如二亚乙基三胺五
乙酸酸酐(DTPA)；亚乙基三胺四乙酸；N-氯代-对甲苯磺酰胺；和/或四氯-3-6-联苯甘脲。单克隆抗体还可以在偶联剂如戊二醛或高碘酸盐的存在下与酶反应。具有荧光素标记的缀合
物在这些偶联剂的存在下或通过与异硫氰酸盐的反应而制备。
III.疾病的治疗

[0076] 本发明实施例的某些方面可以用于预防或治疗与AGR2/C4.4A介导的自分泌存活环路相关的疾病或障碍。AGR2/C4.4A自分泌环路的功能发挥可以通过任何合适的用以阻止
AGR2/C4.4A相互作用的药物而降低。优选地，这样的物质可以是抗AGR2或抗C4.4A抗体。

[0077] “治疗(Treatment和treating)”是指向受试者给予或应用治疗药剂或在受试者上执行程序或形式，目的在于获得疾病或健康相关病症的治疗效益。例如，治疗可以包括给予药学上有效量的抑制AGR2/C4.4A介导的自分泌存活环路的抗体。

[0078] “受试者(Subject)”和“患者(patient)”指人类或非人类，例如灵长类动物、哺乳动物和脊椎动物。在具体实施例中，受试者是人。

[0079] 如贯穿本申请使用的，术语“治疗益处(therapeutic benefit)”或“治疗有效的(therapeutically effective)”是指关于这种病症的医学治疗而言，促进或增强受试者健康的任何事项。这包括但不限于疾病信号或症状的频率或严重性的降低。例如，癌症的治疗可以涉及，例如，肿瘤大小的降低、肿瘤侵袭性的降低、癌症生长率的降低、或转移的防止。
癌症的治疗还可以指代延长患有癌症的受试者的存活。

[0080] 可以给予结合至AGR2或C4.4A的抗体以治疗癌症。该癌症可以是实体瘤、转移癌或非转移癌。在某些实施例中，该癌症可以起源于膀胱、血液、骨、骨骼、脑、乳腺、结肠、食管、十二指肠、小肠、大肠、结肠、直肠、肛门、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、胰腺、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌、或子宫。

[0081] 癌症具体可以是下列组织学类型，但它不限于这些：赘生物，恶性的；上皮癌；未分化上皮癌；巨梭形细胞癌；小细胞癌；小细胞肺癌；非小细胞肺癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；组合的肝细胞癌和胆管癌；小梁状腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；家族性结肠息肉病腺癌；实体癌；恶性类癌瘤；细支气管肺泡癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞腺癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包裹性硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特病；腺泡细胞癌；腺鳞状癌；腺癌w/鳞状上皮化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性卵泡膜细胞瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性男性母细胞瘤；支持细胞癌；恶性间质细胞瘤；恶性脂细胞瘤；
恶性副神经节瘤；恶性乳房外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑色素瘤；无黑素性黑色素瘤；浅表扩散性黑色素瘤；巨大色素痣恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；恶性蓝色痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；腺泡状横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；苗勒氏管混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间质瘤；恶性布伦纳瘤；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎性癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺肿；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西氏肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间叶性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；
恶性胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆型星形细胞瘤；纤维型星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；成少突胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金；副肉芽肿；小淋巴细胞恶性淋巴瘤；大细胞弥漫性恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样霉菌病；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；
白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴瘤细胞白血病；髓系白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；
髓系肉瘤；以及毛细胞白血病。
A.药物制剂

[0082] 在包含抑制性抗体的治疗组合物的临床应用开始进行的情况下，制备适合于预期应用的药物组合物或治疗组合物通常是有益的。这将典型地需要制备基本上不含致热源和
任何其他可对人类或动物有害的杂质的药物组合物。还可以使用合适的缓冲液以使得复合
物稳定并允许靶细胞吸收。在某些实施例中，药物组合物可以包括例如至少约0.1％的活性化合物。在其他实施例中，活性化合物可以包括单元的重量的约2％至约75％之间，或例如约25％至约60％之间，以及其中可衍生的任何范围。

[0083] 将本发明实施例的治疗组合物以作为液体溶液或悬浮液的可注射组合物的形式有利地给予；也可以制备在注射前适于溶于或悬浮于液体中的固体形式。还可以将这些制
剂乳化。

[0084] 短语“药学上可接受的或者药理学上可接受的”指当给予动物如人类时，不产生不利的、过敏的或者其他不良反应的分子实体和组合物。鉴于本披露，包括抗体或另外的活性成分的药物组合物的制备将是本领域的技术人员已知的。此外，对于动物(例如，人类)给药，应当理解，制剂应该满足FDA生物标准办公室所要求的无菌性、致热原性、一般安全性以及纯度标准。

[0085] 如在此使用的，“药学上可接受的载体”包括任何和所有的水性溶剂(例如，水、醇/水溶液、盐水溶液、肠胃外运载体，如氯化钠、林格氏右旋糖等)、非水性溶剂(例如丙二醇、聚乙二醇、植物油、和可注射有机酯类(如油酸乙酯))、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌或抗真菌剂，抗氧化剂，螯合剂和惰性气体)、等渗剂，吸收延迟剂、盐、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、流体和营养补充剂，类似材料和其组合，正如本领域普通技术人员已知的。药物组合物的各种组分的pH和精确浓度是根据熟知的参数来调节的。

[0086] 术语“单位剂量”或“剂量”指代与给药(即适当的路径和治疗方案)相关的适用于在受试者中使用的物理离散单元，每个单元包含预定量的经计算以产生期望的上文讨论的反应的治疗组合物。根据治疗次数和单位剂量两者的给药量取决于所期望的效果。

[0087] 给予患者或受试者的本发明实施例的组合物的实际剂量可以由物理和生理因素决定，如受试者的体重、年龄、健康和性别，所治疗疾病的类型，疾病的渗透程度，先前或同时的治疗介入，患者的原发病，给药途径，以及具体治疗物质的效力、稳定性和毒性。例如，每次给药的剂量可以包括约1μg/kg/体重至约1000mg/kg/体重(这种范围包括中间剂量)或
更多，以及其中可衍生的任何范围。在从此处所列举的数字中衍生的范围的非限制性实例
中，可以给予约5μg/kg/体重至约100mg/kg/体重范围、约5μg/kg/体重至约500mg/kg/体重范围等。在任何情况下，负责给药的执业医师都将确定组合物中一种或多种活性成分的浓
度以及对于个体受试者的一种或多种合适剂量。

[0088] 可以将活性化合物配制为用于肠胃外给药，例如配制为用于通过静脉、肌内、皮下、或甚至腹腔内路径注射。典型地，这样的组合物可以制备为液体溶液或者悬浮液；也可以制备在注射前适合用于在添加液体时制备溶液或悬浮液的固体形式；并且还可以将制剂
乳化。

[0089] 适用于注射用途的药物形式包括无菌水性溶液或分散体；包括芝麻油、花生油或水性丙二醇的配制品；以及用于无菌注射溶液或分散体的临时制备的无菌粉末。在所有情
况下，该形式必须是无菌的并且必须具有达到容易注射的程度的流动性。它在制造和储存
条件下还应该稳定并且必须抗诸如细菌和真菌的微生物污染作用而保存。

[0090] 可将蛋白质性组合物配制成为中性形式或盐形式。药学上可接受的盐，包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)以及与无机酸(例如像盐酸或磷酸)或有机酸(如乙酸、草
酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的酸加成盐。与自由羧基形成的盐还可以衍生自无机碱(例如像钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物)、和有机碱(例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。

[0091] 药物组合物可以包括包含例如以下各项的溶剂或分散介质：水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物、以及植物油。可以例如通过使用一种包衣(如卵磷脂)、通过在分散情况下维持所需颗粒大小以及通过使用表面活性剂来维持
适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来防止微生物的作用。在许多情况下，优选地包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可通过使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)的组合物来实现可注射组合物的延长的吸
收。

[0092] 可以在与表面活性剂(如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备治疗组合物溶液。分散体还可以在甘油、液态聚乙二醇、其混合物、以及油中制备。在普通贮存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。

[0093] 将本发明的治疗组合物以作为液体溶液或悬浮液的可注射组合物的形式有利地给予；也可以制备在注射前适于溶于或悬浮于液体中的固体形式。还可以将这些制剂乳化。
用于这种目的的典型组合物包括药学上可接受的载体。例如，该组合物可以包含10mg、
25mg、50mg或高达约100mg的人血清白蛋白/毫升磷酸盐缓冲盐水。其他药学上可接受的载
体包括水性溶液、无毒赋形剂，包括盐、防腐剂、缓冲液等。

[0094] 非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水性溶液、盐水溶液、肠胃外运载体，如氯化钠、林格氏右旋糖等。静脉运载体包括流体和营养补充剂。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、以及惰性气体。药物组合物的各种组分的pH和精确浓度是根据熟知的参数来调节的。

[0095] 在具体实施例中，本发明的组合物适合应用于哺乳动物眼睛。例如，该配制品可以是溶液、悬浮液或凝胶。在一些实施例中，将该组合物通过生物可降解植入物进行给药，如玻璃体内植入物或眼内插入物，例如被设计用于抵靠结膜表面放置的眼内插入物。在一些实施例中，治疗剂涂覆医疗装置或可植入装置。本发明的配制品可以在水性溶液中以滴剂
形式施用于眼睛。这些滴剂可以从单剂量安瓿递送，该安瓿优选地是无菌的，并因此使得配制品的抑菌成分不必要。可替代地，滴剂可以从多剂量瓶递送，该多剂量瓶优选地包括在配制品释放时从配制品中提取防腐剂的装置，此类装置在本领域中是已知的。在其他方面，可以将本发明的组分以形成放在眼睑下的可溶性插入物的浓缩凝胶或类似运载体递送到眼
睛。

[0096] 另外的配制品适用于口服给予。口服配制品包括典型的赋形剂，如例如，医药级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采用溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释配制品或粉末的形式。

[0097] 本发明的治疗组合物可以包括经典的药用制剂。根据本发明的治疗组合物的给药将是通过任何通用路经，只要靶标组织通过该路径是可用的。这包括经口服、鼻、颊、直肠、阴道或局部。局部给药对皮肤癌的治疗尤其有利，以阻止化学疗法诱导的脱发或其他真皮
过度增生性障碍。可替代地，给药可通过原位、真皮内、皮下、肌内、腹腔内或静脉注射。此类组合物通常作为药学上可接受的组合物给药，这些组合物包括生理上可接受的载体、缓冲
液或其他赋形剂。对于肺部或呼吸道病症的治疗，可以使用气溶胶输送.气溶胶的体积是在约0.01mL和0.5mL之间。

[0098] 治疗组合物的有效量取决于预期目标。例如，本领域技术人员通过考虑到因素如受试者的大小和体重；新血管形成或疾病渗透的程度；受试者的年龄、健康和性别；给药途径；以及给药是会否是局部或全身的，可以容易地确定给予至给定受试者的本发明抗体的
有效量。术语“单位剂量”或“剂量”指代与给药(即适当的路径和治疗方案)相关的适用于在受试者中使用的物理离散单元，每个单元包含预定量的经计算以产生期望的上文讨论的反
应的治疗组合物。根据治疗次数和单位剂量两者的给药量取决于所期望的防护或效果。

[0099] 精确的治疗组合物的量还取决于从业者的判断，并对每个个体而言是特定的。影响剂量的因素包括患者的身体和临床状态，给药途径，治疗的预期目标(例如，症状缓解对比治愈)以及具体治疗物质的效力、稳定性和毒性。
B.组合治疗

[0100] 在某些实施例中，本发明实施例的组合物和方法涉及针对AGR2或C4.4A的抗体或抗体片段以与第二或另外的疗法相组合来抑制AGR2/C4.4A相互作用。这种疗法可以应用于
任何与AGR2/C4.4A介导的自分泌存活环路相关的疾病的治疗。例如，该疾病可以是癌症。

[0101] 包括组合疗法的方法和组合物增强了治疗或保护作用，和/或增加了另一种抗癌或抗过度增殖疗法的疗效。可以按有效实现期望效果(如杀灭癌细胞和/或抑制细胞过度增
殖)的组合量提供治疗性和预防性方法和组合物。这个过程可以涉及将细胞与抗体或抗体
片段和第二疗法两者接触。组织、肿瘤或细胞可与包含一种或多种药物(即，抗体或抗体片段或抗癌剂)的一种或多种组合物或药理学配制品接触，或通过使组织、肿瘤和/或细胞与
两种或更多种不同的组合物或配制品接触，其中一种组合物提供1)抗体或抗体片段，2)抗
癌剂，或3)抗体或抗体片段和抗癌剂两者。另外考虑可将这种组合疗法与化学疗法、放射疗法、外科疗法或免疫疗法结合使用。

[0102] 当术语“接触”和“暴露”应用至细胞时，在此用以描述一种过程，通过该过程将一种治疗性构建体以及一种化学治疗剂或放射治疗剂递送至靶细胞或置于与靶细胞直接毗邻。例如，为了实现细胞杀死，将两种试剂以有效杀死细胞或防止其分裂的组合量递送至细胞。

[0103] 抑制性抗体可以在相对于抗癌治疗之前、期间、之后或以各种组合给予。给药的时间间隔范围可以是从同时到几分钟到几天到几周。在将抗体或抗体片段与抗癌剂分开提供给患者的实施例中，通常可以保证每次递送之间不会期满显著长的时间，这样使得两种化
合物仍然能够对患者发挥有利的组合作用。在这样的情况下，考虑了人们可以在彼此约12
到24或72小时内，特别是彼此在约6-12小时内，为患者提供抗体疗法和抗癌疗法。当在各次给予之间消逝若干天(2、3、4、5、6、或7)或若干周(1、2、3、4、5、6、7或8)时，在一些情况下，可能希望显著地延长用于治疗的时间段。

[0104] 在某些实施例中，一个疗程将持续1-90天或更长(此范围包括中间天数)。考虑了在第1天至第90天(此范围包括中间日)的任何一天或其任何组合给予一种药剂，并且在第1
天至第90天(此范围包括中间日)的任何一天或其任何组合给予另一种药剂。在一天内(24
小时内)，可以将一种或多种药剂给予患者一次或多次。此外，经过一个疗程后，考虑有一段没有给予抗癌治疗的时间。这段时间可持续1-7天，和/或1-5周，和/或1-12个月或更长(此范围包括中间日)，这取决于患者的情况，如他们的预后、力量、健康等。期望治疗周期将在必要时重复。

[0105] 可以使用不同组合。例如下文，抗体疗法是“A”并且抗癌疗法是“B”：A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

[0106] 考虑到药剂的毒性(如果有的话)，向患者给予本发明实施例的任何化合物或疗法将遵从用于给予此类化合物的一般方案。因此，在一些实施例中，具有监测归因于组合疗法的毒性的步骤。
1.化学疗法

[0107] 根据本发明实施例，可使用多种化学治疗剂。术语“化学疗法”是指使用药物治疗癌症。“化学治疗剂”是用来表示在治疗癌症中给予的化合物或组合物。这些药剂或药物按它们在细胞内的活性方式进行分类，例如，它们是否或在什么阶段影响细胞周期。可替代地，可以将药剂基于其直接交联DNA、插入DNA中、或者通过影响核酸合成诱导染色体和有丝分裂畸变的能力进行表征。

[0108] 化学治疗剂的实例包括烷化剂，如噻替哌和环磷酰胺；烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡、和哌泊舒凡；氮杂环丙烷，如苯佐多巴、卡波醌、美妥多巴、和脲多巴；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三乙烯蜜胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺、和三甲蜜胺；乙酰精宁(acetogenins)(尤其是泡番荔枝辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成的类似物拓扑替康)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括它的阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他
汀；多卡米新(duocarmycin)(包括合成的类似物，KW-2189和CB1-TM1)；伊斯罗宾
(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵素1；氮芥类(nitrogen  mustard)，如瘤可宁、萘氮芥、氯磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、氮芥
(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、以及尿嘧啶氮芥；亚硝脲类，如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、和雷莫司汀；抗生素，如烯二炔抗生素(例如，卡里奇霉素，尤其是卡里奇霉素γ1和卡里奇霉素ω
I1)；dynemicin，包括dynemicin A；双膦酸盐类，如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素；以及新制癌菌素生色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素生色团、阿克拉霉素类、放线菌素、氨茴霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、道诺霉素、地托比星、6-重氮-5-氧-L-亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星，2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素(如丝裂霉素C、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、和佐柔比星；抗代谢物类，如甲氨蝶呤和5-氟脲嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、蝶罗呤、和三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、和氟尿苷；雄激素类，如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、表硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺类，如米托坦和曲洛司坦；
叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；贝塔布辛(bestrabucil)；比生群；依达曲沙；地磷酰胺
(defofamine)；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类，如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合物；雷佐生；根霉素；西佐喃；螺旋锗；
细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉素类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A和蛇行菌素(anguidine))；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；盖托新(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷，例如，紫杉醇与多西他赛吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位络合物，如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾；诺安托(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐；
依立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维甲酸，如维甲酸；卡培他滨；卡铂、丙卡巴肼、普卡霉素(plicomycin)、吉西他滨、诺维本、法尼基蛋白转移酶抑制剂、反铂、和药学上可接受的盐、酸、或任何上述的衍生物。
2.放射疗法

[0109] 导致DNA损伤并且已经被广泛使用的其他因素包括通常所称的γ射线、X射线、和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向传递。还考虑了其他形式的DNA损伤因子，例如微波、质子束照射(美国专利5,760,395和4,870,287)和UV-照射。最有可能的是，所有这些因素对
DNA、对DNA的前体、对DNA复制和修复、以及对染色体的组装和维持产生宽范围的损伤。X射线的剂量范围在从每日用量为50至200伦琴持续长时间时段(3至4周)至单次剂量为2000至
6000伦琴的范围内。放射性同位素的剂量范围广泛地变化，并且取决于同位素的半衰期、所发射的辐射的强度和类型、以及赘生性细胞的摄取。
3.免疫疗法

[0110] 技术人员将理解，另外的免疫疗法可以与实施例的方法组合或结合使用。通常，在癌症治疗的背景中，免疫治疗剂依赖于使用免疫效应细胞和分子以靶向和破坏癌细胞。(利妥昔单抗)是这样一个实例。 (易普利姆玛；百时美施贵宝)是
批准的抗CTLA-4抗体的实例。 (派姆单抗；默克)和 (纳武单抗；
百时美施贵宝公司)是批准的抗PD-1抗体的实例。免疫效应物可以是例如对肿瘤细胞表面
上的某种标记物有特异性的抗体。抗体可单独地作为治疗的效应物或者它可以募集其他细
胞以实际影响细胞杀灭。抗体还可以缀合至一种药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)并且仅充当一种靶向剂。可替代地，效应物可以是携带与肿瘤细胞靶标直接或间接相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞
毒性T细胞和NK细胞。

[0111] 在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞必然携带某种适于靶向的标记物，即所述标记物不存在于大部分其他细胞上。存在许多肿瘤标记物并且在本发明实施例的背景下，任何
这些标记物都可以适用于靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(P97)、gp68、TAG-72、人乳脂肪球、唾液酸化路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erb B、和p155。免疫疗法的替代方面是组合抗癌效应和免疫刺激效应。也存在免疫刺激分子，包括：细胞因子如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-干扰素，趋化因子如MIP-1、MCP-1、IL-8、和生长因子，如FLT3配体。

[0112] 目前正在探究或使用的免疫疗法的实例是免疫佐剂，如牛结核分支杆菌、镰状疟原虫、二硝基氯苯、和芳香族化合物(美国专利5,801,005和5,739,169)；慧(Hui)和桥本
(Hashimoto)，1998；克里斯杜莱德(Christodoulides)等人，1998)；细胞因子疗法：例如干扰素α、β、和γ、IL-1、GM-CSF和TNF(布科夫斯基(Bukowski)等人，1998；戴维森(Davidson)等人，1998；赫尔斯特兰德(Hellstrand)等人，1998)；基因疗法，例如TNF、IL-1、IL-2、和p53(秦(Qin)等人，1998；豪斯丁-伍德(Austin-Ward)和比利亚塞卡(Villaseca)，1998；美国专利5,830,880以及5,846,945)；以及单克隆抗体，例如，抗CD20、抗神经节苷脂GM2、和抗p186(霍兰德尔(Hollander)，2012；汉尼布驰(Hanibuchi)等人，1998；美国专利5,824,311)。考虑了一种或多种抗癌疗法可以与在此描述的抗体疗法一起使用。
4.外科手术

[0113] 约60％患有癌症的人群将经历某种类型的外科手术，这包括预防性、诊断性或分期、治愈性以及姑息性外科手术。治愈性外科手术包括切除(其中全部或部分癌组织被物理去除、切除、和/或破坏)，并且可以结合其他疗法使用，所述其他疗法例如本发明实施例的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代性疗法。肿瘤切除术是指物理去除至少一部分肿瘤。除了肿瘤切除术之外，通过外科手术治疗包括激光外科手术、冷冻外科手术、电外科手术、以及显微控制外科手术(microscopically controlled 
surgery)(莫氏外科手术(Mohs’surgery))。

[0114] 切除部分或全部癌细胞、组织或肿瘤时，可在体内形成空腔。治疗可以用另外的抗癌疗法通过区域的灌注、直接注射、或局部应用来完成。这种治疗可以重复，例如，每1、2、3、4、5、6、或7天，或每1、2、3、4、和5周，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗还可具有变化的剂量。
5.其他药剂

[0115] 考虑了其他药剂可与本发明实施例的某些方面相组合使用，以改进治疗的疗效。这些另外的药剂包括影响细胞表面受体和间隙连接的上调的药剂、细胞生长抑制剂和分化
剂、细胞粘附抑制剂、增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂、或其他生物剂。通过提高间隙连接数量来增加胞间信号传导会增加对邻近的过度增殖细胞群的抗过度增殖
效应。在其他实施例中，细胞生长抑制剂或分化剂可与本发明实施例的某些方面相组合使
用，以改进治疗的抗过度增殖功效。考虑了细胞粘附抑制剂以改进本发明实施例的功效。细胞粘附抑制剂的实例是粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。进一步考虑了增加过度增殖
细胞对细胞凋亡的敏感性的其他药剂，例如抗体c225，可以与本发明实施例的某些方面组
合使用以改进治疗功效。
II.试剂盒和诊断

[0116] 在实施例的各个方面，设想包含治疗剂和/或其他治疗剂和递送剂的试剂盒。在一些实施例中，考虑了用于制备和/或给予实施例的疗法的试剂盒。该试剂盒可以包括一个或多个密封小瓶，所述密封小瓶包含本发明实施例的任何药物组合物。该试剂盒可以包括，例如，至少一种AGR2或C4.4A抗体以及用以制备、配制、和/或给予实施例的组份或执行本发明方法的一个或多个步骤的试剂。在一些实施例中，该试剂盒还包括合适的容器，该容器是一个不会与试剂盒组分反应的容器，如Eppendorf管、测定板、注射器、瓶、或管。这些容器可以由可灭菌的材料如塑料或玻璃制成。

[0117] 该试剂盒可以进一步包括说明单，该说明单概述了本文所述的方法的程序步骤，并将基本上遵循如本文所述的相同程序或是本领普通技术人员已知的。说明信息可以在包
含机器可读指令的计算机可读介质中，当使用计算机执行时，这些指令引起递送药学有效
量的治疗剂的真实或虚拟程序的显示。
III.实例

[0118] 包括以下实例来说明本发明的优选实施例。本领域的技术人员应理解，以下实例中所披露的技术代表本发明人所发现的技术以在本发明的实践中良好地发挥功能，并且因
此可以被认为构成本发明实践的优选模式。然而，本领域技术人员根据本披露应理解，可以对披露的具体实施例做出许多改变并且仍然获得相同或相似的结果而不背离本发明的精
神和范围。
材料和方法

[0119] 细胞系。NIH 3T3、BXPC3、su86.86、MiaPaCa-2、AsPC-1和Capan-2细胞从ATCC中获得(马纳萨斯，弗吉尼亚州)。使用DNA指纹分析证实细胞系的身份( 16系统，普洛麦格)。将细胞在含10％FBS的DMEM中进行常规培养并且在37℃维持在5％的CO2的
湿润气氛中。

[0120] 抗体和重组蛋白。购买针对以下的抗体：AGR2(小鼠多克隆)、DAG-1、CD59(Cat#ab56703，ab105504，ab9182，Abcam公司，坎布里奇，马萨诸塞州)、层粘连蛋白1、层粘连蛋白
5、ITGβ1、α6、β4(sc-74417，sc-20145，sc-9936，sc-10730，圣克鲁斯生物技术，达拉斯，德克萨斯州)、C4.4A、uPAR(Cat#AF5428，MAB807，研发系统(R&D Systems)，明尼阿波利斯，明尼苏达州)、p-ERK(Cat#9160，细胞信号传导，丹弗斯，马萨诸塞州)、β-肌动蛋白(Cat#A2066，西格玛，圣路易斯，密苏里州)；以及对照IgG(Cat#OB010701；南方生物技术，伯明翰，阿拉巴马州)。人类和小鼠AGR2蛋白有96％的同源性(布里赫托娃(Brychtova)等人，2011)，因此人类重组体(rAGR2)(ab64013，AbCam，剑桥，马萨诸塞州)用于所有研究。重组C4.4A也是购买的(5428-C4-050，研发系统(R&D Systems)，明尼阿波利斯，明尼苏达州)。

[0121] siRAN的瞬时转染。以下的预先设计和预验证的siRNA购自凯杰(Qiagen)(洛杉矶，加利福尼亚州)：si对照(Cat#1027281)、siAGR2(Cat#SI04274522)、siC4.4A(Cat#
SI00105700,707,714,721)、siUPAR(Cat#SI03033289)、siCD59(Cat#SI03052616)、层粘连蛋白(α1)(Cat#SI02779511)、层粘连蛋白5(β3)(Cat#SI02664116)、整合素α6(Cat#
SI02654078)、整合素β1(Cat#SI00300573)、整合素β2(Cat#SI03648848)、和整合素β4(Cat#SI02664109)。将细胞使用siRNA(5或10nM)使用 转染试剂(Cat#301705；凯
杰，洛杉矶，加利福尼亚州)转染，并且裂解物在72h后制备。

[0122] IP研究。商业AGR2抗体(2μg；AbCam)用于从SU86.86裂解液中(100μg)免疫共沉淀AGR2，并且进行蛋白质印迹。然后将相同的膜针对每个抗体单独探测并用混合抗体进行探测。另外，将rAGR2和rC4.4A一起(各自2μg)悬浮于裂解缓冲液中并且进行IP。IgG(小鼠)用作对照。蛋白质印迹成像和处理是用 成像系统(LI-COR生物科学，林肯，内布
拉斯加州)进行。

[0123] 细胞生长、迁移、侵袭和凋亡测定。野生型和siRNA转染的PDAC细胞在用rAGR2(0-500nM)的情况下在抗体(多克隆商业或新开发的mAb)(1μM)存在或不存在的情况下生长。培养基每天更新。在48小时后通过MTS测定来估算细胞数，如先前所述(拉马钱德兰
(Ramachandran)等人，2007)。为了避免在每个细胞系的基础值的差异，数据作为于合适的对照相比的活细胞的百分比呈现。迁移和侵袭测定如前所述地在24h处进行(拉马钱德兰
(Ramachandran)等人，2007)。在添加吉西他滨(Gem)至Gem敏感型BxPC-3细胞(1μM)和Gem抗性AsPC-1细胞(5μM)(阿鲁穆加姆(Arumugam)等人，2009)后72h，如前所述地(拉马钱德兰
(Ramachandran)等人，2008)进行细胞凋亡测定。因为siRNA转染本身诱导基底的细胞凋亡，将用siRNA转染的细胞用较低浓度的Gem处理(BxPC3：0.5μM；AsPC-1：1μM)。

[0124] 免疫组织化学(IHC)染色。如之前描述的(拉马钱德兰(Ramachandran)等人，2008)，将IHC在组织微阵列(TMA)载玻片上用mAb(1:1000)进行并且使用
通用试剂盒(载体实验室(Vector Laboratories)，伯林格姆，加利福尼亚州)显影。结果由病理学家盲性评估，并且将表达水平归类为阳性或阴性(分别是>10％或<10％的肿瘤细胞
胞质染色)，并且将染色强度归类为强、中、或无染色。在石蜡切片中通过荧光标记的TUNEL染色(普洛麦格，Cat#G3250)检测凋亡细胞。通过对p-ERK(细胞信号传导(Cell 
Signaling)，Cat#9160；1:1000)的水平分析来评价MapK通路的激活，并且将癌细胞的增殖指数通过Ki-67染色(赛默科技(Thermo Scientific)，Cat#RM-9106-S0；1:200)来测量。

[0125] 阻断性单克隆抗体开发。在UT MDACC的单克隆抗体核心(Monoclonal Antibody Core of UT MDACC)，使用未缀合的抗原肽开发针对AGR2和C4.4A的小鼠单克隆抗体(mAb)。
通过ELISA使用KLH缀合肽针对靶标识别筛选几种杂交瘤细胞集落(每个抗体2400个)。然后
克隆选出的杂交瘤细胞集落，并且再次用ELISA筛选以选择具备最高亲和性的那些。将所选的克隆进行亚克隆并且使用蛋白A柱进行纯化。抗体特异性、阻断能力和纯度的证实是通过针对重组体和细胞裂解蛋白的蛋白质印迹、功能筛选(细胞凋亡测定)、结合测定(ELISA测
定)、和所选的Ab的纯度分析(SDS-PAGE)来进行(如在图11A-D所示的)。选定的抗体进行的
体外验证实验包括癌细胞迁移和侵袭的抑制和增加Gem诱导的细胞凋亡的能力。将具有高
亲和力和功能阻断能力的前几个候选抗体(每一个针对AGR2和C4.4A)进行纯化并进一步用
于体内实验。最终所选的克隆是针对AGR2的28B和针对C4.4A的1A。将抗体分型为针对AGR2
的IgG1以及针对C4.4A的IgG2b。用于体内实验的纯化的抗体在单克隆抗体核心中生产。

[0126] 体内研究。根据UT MDACC的监管标准和IUCAC委员会批准，体内实验用去胸腺裸鼠(B6.Cg-Foxn1nu/J–雌性–9周龄)(NCI，贝塞斯达，马里兰州)进行。用荧光素酶标记的细胞(0.25×106)建立原位肿瘤。IgG(Cat#OB010701；南方生物技术，伯明翰市，阿拉巴马州)作为对照Ab。

[0127] 模型1(AsPC-1-侵袭性细胞模型)-在注射侵袭性AsPC-1细胞两周后，当肿瘤重量少于0.5g(如从平行的未处理组中手术证实的)时，将小鼠(n＝6)用对照或mAb(AGR2/C4.4A mAb各自5mg相组合/kg/体重/一周两次/i.p)并且用或者不用Gem(100mg/kg体重/每周一
次/i.p)处理直到所有对照小鼠已经死亡(七周)。在实验结束时，离体比较对照组和处理组之间的肿瘤重量以及到肝脏和肺的转移。

[1128] 模型2(Capan-2-基质模型)-注射基质形成性Capan-2细胞后的两周，将小鼠(n＝7)用15mg AGR2或C4.4A抗体/kg/体重/一周两次/i.p处理。在15周之后停止处理(13周的处
理)，并且通过生物发光监测在存活的动物中的肿瘤大小直到63周。

[0129] 模型3(Capan2-回归研究)-在注射Capan-2细胞之后四周，当肿瘤重量超过1g(如从平行的未处理组中手术证实的)，将小鼠(n＝5)用AGR2或C4.4A mAb以15mg/kg/体重/一
周两次/i.p处理或用两种mAb组合处理(每种7.5mg)。12周之后停止处理。在存活动物中监
测生物发光直到18周。在注射荧光素底物(精诺真(Xenogen)，阿拉米达，加利福尼亚州)后，利用 活体动物生物发光成像系统每周测量肿瘤生长和转移。每周记录存活的小鼠的
数量，并以原来的组大小的百分比来显示。

[0130] 统计分析。所有体外实验一式三份进行并且在三个或更多个单独场合中进行。将数据用三个或更多独立实验的平均值±SEM呈现。体内实验用7-10只小鼠的组进行。统计学
显著差异是通过ANOVA分析(纽曼-科伊尔斯(Newman-Keuls)多重比较检验)确定，并且被定
义为<0.05的p-值。
实例1-在体外细胞外AGR2刺激PDAC侵袭性和化学抗性

[0131] 之前示出AGR2由PDAC细胞高表达和分泌，并促成化学抗性(拉马钱德兰(Ramachandran)等人，2008)。在此，在本文评价细胞外AGR2(rAGR2)是否模拟AGR2表达作
用。由于PDAC细胞系是非均质的，使用多细胞模型-BxPc-3(上皮表型，对Gem敏感)、AsPC-1和MiaPaCa-2细胞(间质表型，对Gem高抗)(阿鲁穆加姆(Arumugam)等人，2009)。

[0132] 在AsPC-1细胞中，用rAGR2处理以浓度依赖的方式增加增殖(3倍)、迁移(10倍)、和侵袭(3倍)(图1A-C)。类似的效应在用BxPC-3和MiaPaCa-2细胞系的情况下观察到(图7A-C)。为了确定rAGR2对癌细胞针对治疗剂抗性的作用，将PDAC细胞在rAGR2的存在或不存在
的情况下用Gem处理。虽然AsPC-1细胞是高抗的，在5μM Gem浓度下，显著3倍增加的细胞凋亡被诱导(图1D)。用rAGR2的同时处理将Gem的作用降低至接近对照水平(>50％降低)，证实了强的存活效应。用对Gem更敏感的BxPC3细胞的AGR2处理具有甚至更大的效应(图7D)。因
此，细胞外重组AGR2重申了之前用AGR2表达观察到的对PDAC细胞的作用(拉马钱德兰
(Ramachandran)等人，2008)。
实例2-C4.4A是AGR2的功能性受体

[0133] AGR2的候选受体选自文献并且检查了在AGR2功能中的重要性。LY6受体家族成员uPAR、C4.4A和CD59与AGR2免疫共沉淀(图2A)，然而DAG-1不能免疫共沉淀(图8A-C)。为确定每个受体的功能重要性，将这些受体使用siRNA进行沉默并且证实了显著的沉默(图2C和图
8G-I)。只有沉默C4.4A显著降低基底细胞增殖、迁移、和侵袭，并且在AsPC-1中(图3A-C)和BxPC-3细胞(图9A-C)中几乎完全消除rAGR2刺激的细胞增殖、迁移、以及侵袭。在另一方面，沉默CD59和uPAR显著增加AsPC-1细胞的迁移。

[0134] C4.4A沉默还阻断AGR2介导的对Gem的化学抗性(图3D和图9D)。C4.4A单独以及与Gem组合的沉默导致显著上升的细胞凋亡率(2倍)，这是与用Gem处理对照细胞观察到的相
比更大的增加(图3D)。重要地，AGR2处理以保护细胞免受Gem的能力在C4.4A沉默后消除了。
为了控制脱靶效应，针对C4.4A检查四种siRNA序列，它们中的每一个示出可比结果(图3E)。
这些数据支持细胞外AGR2的作用是通过和C4.4A相互作用而被介导的观点。

[0135] 要确定AGR2与C4.4A是否直接或通过关联于复合物中而相互作用，在不存在其他蛋白的情况下将rAGR2和rC4.4A组合并且进行免疫共沉淀。通过在此测定中明显条带的存
在指示rAGR2和rC4.4A之间的直接相互作用(图2B)。还对九个PDAC细胞系进行C4.4A mRNA
和蛋白表达的检查，并观察到它存在于所有细胞系中(图8D-F)。
实例3-C4.4A需要整合素β1和层粘连蛋白1和5以用于活性

[1136] 鉴于先前鉴定的uPAR(该受体家族的一个成员)(史密斯(Smith)和马歇尔(Marshall)，2010)的信号传导复合物，对表面受体进行了研究，包括可能参与C4.4A信号传导的整合素和细胞外基质组分。虽然功能性结果是未知的，报道C4.4A结合层粘连蛋白1和5(帕雷特(Paret)等人，2005)。因此，对候选的整合素和层粘连蛋白1和5进行沉默，并且评估AGR2介导的Gem抗性作用。层粘连蛋白1、层粘连蛋白5或整合素β1的沉默完全消除了AGR2的保护作用，然而整合素β2、β4或α6的沉默没有作用(图4A)。类似地，层粘连蛋白1、层粘连蛋白5、和整合素β1的商业阻断性抗体还消除了AGR2介导的刺激增殖和化学保护的作用(图
4B-C)。对于BxPC-3细胞系的相似结果示于图10A-B中。结合这些数据表明，层粘连蛋白1和5和整合素β1参与AGR2/C4.4A受体复合物。
实例4-开发的AGR2和C4.4A单克隆抗体具有高度特异性并且阻断AGR2结合至C4.4A

[0137] 为了进一步理解AGR2和C4.4A在癌症中作用，将它们之间的相互作用使用抗体阻断。可商购的抗体，虽然识别AGR2(18kD)和C4.4A(50kD)(图5A)，但并没有阻断AGR2诱导的细胞迁移(图5B)或Gem抗性(图5C)。因此，开发出识别它们各自的抗原并阻断它们的相互作用的AGR2和C4.4A mAb(分别为163-28B-1和162-1A-1)(图5A)。将针对AGR2的非缀合的抗原
肽(CIHHLDESPHSQALKKVFAENKEIQKLAEQ；SEQ ID NO:3)和针对C4.4A的非缀合的抗原肽
(CPVRPTSTTKPMPAPTSQTPRQGVEHEASRDEEPRL；SEQ ID NO:4)连同佐剂皮下注射进Balb/C小
鼠中持续6周。收集脾脏并与骨髓瘤细胞(SP2/0-Ag14)融合，并且将杂交瘤细胞通过ELISA
使用KLH-缀合的肽筛选。通过蛋白质印迹分析检查它们对抗原的结合效率来鉴定候选杂交
瘤细胞。相比可商购的抗体，这两种抗体均示出各自与它们的重组蛋白和内源性蛋白的结
合(图5A)。新的mAb比商业抗体更具特异性，如在胰腺癌细胞裂解物的蛋白质印迹中缺乏非特异性条带所指示的。用蛋白A柱进行杂交瘤细胞的进一步纯化，并将纯化的蛋白针对功能性阻断测定进行测试。虽然可商购的抗体没有作用，但新型mAb阻断了AGR2对细胞迁移和
Gem抗性的刺激(图5B-C)。进行了迁移测定，并且与非特异性抗体相比，在添加两种阻断性抗体(163-28B-1和162-1A-1)时消除了基底和AGR2介导的迁移刺激，而可商购的AGR2和
C4.4A抗体不阻断AGR2的功能。细胞凋亡测定是在AsPC-1细胞中进行。AGR2和C4.4A抗体(分别为163-28B-1和162-1A-1)消除了AGR2介导的存活效应，由此改进细胞凋亡，而非特异性
抗体和可商购的AGR2和C4.4A抗体不这样。
实例5-AGR2/C4.4A在胰腺癌中广泛表达

[0138] 还在患者组织(TMA-组织微阵列)中，使用开发的mAb评估了AGR2和C4.4A的表达模式(图5D)。两种抗体示出强的PDAC标记，但正常胰腺没有标记。对于AGR2，140个中的105个(75％)是阳性的，对应的染色率为46％(高)、29％(中度)、和25％(无染色)。高水平的AGR2表达与整体患者群体和II期患者中淋巴结转移的更高频率相关(p<0.05)。在AGR2表达和分
化之间也有弱的相关性。对于C4.4A，74个中的67个(91％)是阳性的，对应的染色率为52％(高)、39％(中度)、和9％(无染色)。这些数据证实AGR2和C4.4A均在晚期PDAC中高表达。因为在PDAC患者中，AGR2和C4.4A的表达之间的相关性是显著的(p<0.0001，相关系数0.74(斯皮尔曼(Spearman)r))，这两种分子倾向于一起表达。
实例6-AGR2/C4.4A自分泌环路的抑制提供了潜在的治疗益处

[0139] 为了评价抑制AGR2/C4.4A自分泌环路的潜在治疗益处，测试了在临床前模型中在用阻断性mAb时具有的治疗作用。在侵袭性细胞模型(模型1)(图6A-B)中，使用AsPC-1，一种高度致瘤、转移性和抗Gem的细胞系。在具有或不具有Gem的情况下，测试了两种mAb的组合作用。对小鼠原位注射荧光素酶表达型AsPC-1细胞，并且治疗开始之前，允许肿瘤形成持续两周。治疗四周后(一共六周)，在对照Ab组中的全部小鼠已死亡，并将其余小鼠处死，以比较肿瘤重量和转移。在那时，30％的用对照Ab和Gem组合处理的小鼠，100％的用AGR2和
C4.4A mAb(分别为163-28B-1和162-1A-1)组合处理的小鼠，以及80％的用mAb和Gem组合处
理的小鼠仍然活着。实验在七周末尾时结束。与对照Ab相比，组合mAb处理使肿瘤重量减少
33％(p＜0.03)，并且转移发生率降低66％(p＜0.05)(图6G-H)。组合GEM和mAb并没有显著
的优势，因为这种组合导致肿瘤重量减少40％(p＜0.003)并使转移发生率降低50％(p＜
0.05)。由于在模型1中结合GEM处理没有获得实质性的益处，在模型2和3中没有考虑Gem处
理。与对照Ab处理的小鼠相比，用mAb处理并没有减少动物的体重，这表明缺乏与阻断此通路相关的全身毒性。

[0140] 在基质模型(模型2)(图6C-D)，使用Capan-2，一种抗Gem的、致密基质形成性但无转移性的细胞系。对照Ab组中的小鼠在九周内全部死亡(处理七周)(图6C)。在那时，43％的用AGR2 mAb(163-28B-1)处理的小鼠和57％的用C4.4A mAb(162-1A-1)处理的小鼠存活。在
15周后停止处理(13周的处理)，并允许动物存活直到它们死亡或呈严重病态。存活中值
(50％的动物存活的点处)对于对照Ab是六周，对于AGR2 Ab是九周，并且对于C4.4A mAb是
10周(p＜0.05)。与对照Ab相比，AGR2和C4.4A Ab处理均将肿瘤体积降低50％(p＜0.05)(图
6D)。如生物发光成像指示的和手术检查证实的，一些小鼠(1/7用AGR2 mAb处理；3/7用
C4.4A mAb处理)示出了完全的肿瘤消退。63周后，在AGR2 Ab和C4.4A Ab组的每一组中一只小鼠存活。处死后，对这些动物进行检查，并且没有观察到肿瘤的证据。

[0141] 在癌细胞植入开始五周后，当肿瘤超过1g时，对小鼠进行回归研究(模型3)(图6E-F)。在这项研究中，对照Ab组中的全部小鼠在治疗开始后三周死亡(共8周)。在那时，每个mAb处理的组中60％存活。使用mAb的处理在12周后停止，并允许小鼠存活，直到它们死亡或呈严重病态。存活时间中值对于对照Ab处理的动物是八周，对于AGR2或C4.4A mAb处理的动物是12周，并且对于AGR2和C4.4A mAb组合处理的动物是11周(p＜0.05)。针对此模型，示出每周通过生物发光成像测量的肿瘤体积的减少(图6F)。用AGR2 mAb处理的五个小鼠中的一
个小鼠示出其肿瘤完全消退。存活的小鼠中的肿瘤残留分析指示在mAb处理的组中存在高
水平的凋亡细胞(图6I)。p-ERK水平的分析指示这一通路的活性在抗体处理组中完全消除。
增殖指标Ki-67的分析没有示出mAb处理组的染色。在其他PDAC细胞模型中观察到了类似的
结果。
实例7-162-1A-1和163-29B-1单克隆抗体的VH和VL区的测序

[0142] 细胞培养。将162-1A-1和163-28B-1杂交瘤细胞在含10％胎牛血清(FBS；HyClone，洛根，犹他州)、1mM丙酮酸钠(Mediatech，赫恩登，弗吉尼亚州)和1x青霉素-链霉素混合物(HyClone)的RPMI-1640培养基中，在37℃在7.5％CO2培养箱中生长。

[0143] 同种分型。将由162-1A-1和163-28B-1杂交瘤细胞各自产生的小鼠单克隆抗体的同种型用ELISA法如下测定。将ELISA板涂覆1/1000稀释在PBS中的100μL/孔的以下五种山
羊多克隆抗体之一(均来自南方生物技术，伯明翰，阿拉巴马州)，在4℃过夜：
1.抗-小鼠IgG，γ链特异性
2.抗-小鼠IgG，γ1链特异性
3.抗-小鼠IgG，γ2a链特异性
4.抗-小鼠IgG，γ2b链特异性
5.抗-小鼠IgM，μ链特异性

[0144] 在用洗涤缓冲液(含0.05％吐温20的PBS)洗涤孔，用ELISA缓冲液以300μL/孔(含2％脱脂乳和0.05％吐温20的PBS)在室温下封闭30分钟，并用洗涤缓冲液洗涤后，将ELISA
缓冲液和每个杂交瘤细胞培养上清的100μL/孔的1:1混合物一式两份地施加到ELISA板。在将ELISA板室温孵育1h并用洗涤缓冲液洗涤后，用100μL/孔的以1/1000稀释在ELISA缓冲液中的下列两种山羊多克隆抗体之一(均来自南方生物技术)在室温检测结合的抗体持续
30min：
A.HRP-偶联山羊抗小鼠κ链多克隆抗体
B.HRP-偶联山羊抗小鼠λ链多克隆抗体

[0145] 用洗涤缓冲液洗涤后，通过添加100μL/孔的 底物(AMRESCO，梭伦，俄亥俄州)进行显色，并通过添加100μL/孔的2％草酸终止。在405nm下读取吸光度。

[0146] 分型结果是162-1A-1：IgG2b/κ，和163-28B-1：IgG1/κ。

[0147] 小鼠免疫球蛋白可变区基因的克隆与测序。从约5×106个的162-1A-1和163-28B-1各自细胞中根据供应商的方案用 试剂(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)
提取总RNA。遵循供应商的方案，使用SMARTERTMRACE cDNA扩增试剂盒(克罗泰克公司，山景，加利福尼亚州)，合成用于5'-RACE的寡聚dT引发的cDNA。重链和轻链的可变区cDNA通过聚
合酶链反应(PCR)用 DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司，贝弗利，马萨诸塞
州)，使用特异性与小鼠重链和轻链恒定区退火的3'引物以及在SMARTERTMRACE cDNA扩增试剂盒中提供的5'-RACE引物(通用引物A混合物)扩增。

[0148] 对于重链可变区(VH)的PCR扩增，3'引物具有如下所示的序列：MCG1:5'-GCCAGTGGATAGACAGATGG-3'(对于γ1链)(SEQ ID NO:5)
MCG2B:5'-GCCAGTGGATAGACTGATGG-3'(对于γ2b链)(SEQ ID NO:6)

[0149] 对于κ轻链可变区(VL)的PCR扩增，3'引物具有如下所示的序列：MCK:5'-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3'(SEQ ID NO:7)

[0150] 将扩增的VH和VL cDNA亚克隆到pJet1.2载体(赛默科技，罗克福德，伊利诺伊州)以用于序列测定。DNA测序是使用下列两个引物在Tocore(门洛帕克，加利福尼亚州)进行：
JetFwd:5'-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3'(SEQ ID NO:8)
JetRev:5'-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3'(SEQ ID NO:9)

[0151] 将几个重链和轻链克隆进行测序并且鉴定与典型的小鼠重链和轻链可变区同源的独特序列。每个V基因的共同cDNA序列用至少四个独立的克隆得到。

[0152] VH和VL基因的序列。162-1A-1和163-28B-1单克隆抗体的VH和VL区的氨基酸序列在表1中示出。根据卡巴特(Kabat)等人(1991)的定义，CDR 1、2和3的序列加下划实线示出。
表1.抗体序列。
实例8-回归研究-在Capan-2肿瘤中的存活曲线

[0153] 将原位肿瘤用荧光素酶标记的CaPan-2细胞(150万个细胞)发展，并且允许肿瘤生长变大直到它达到如在平行实验中测量的约1g大小的肿瘤(5周)。将小鼠用指示为HuCtrl
(n＝5)的运载体(人IgG同种形对照–Cat#0160-01，南方生物技术，伯明翰，阿拉巴马州)或用指示为HuAGR2(n＝7)的AGR2人源化Ab或用指示为HuC4.4A(n＝7)的C4.4A人源化Ab处理
(25mg/kgb.wt/i.p./一周两次)，直到40周。肿瘤用生物发光成像每周测量。测定存活曲线，如图12所示。在那时，当对照组示出100％死亡时，HuAGR2组示出71％的存活并且HuC4.4A示出87％的存活。存活中值对于对照为10周，对于HuAGR2为16周，并且对于HuC4.4A组为18周。
存活曲线的比较(对数秩曼特尔考克斯检验(Log-Rank Mantel Cox test))表明，如与对照
组相比，HuAGR2(p＝0.0118)和HuC4.4A(p＝0.0032)示出存活的显著改善。(p<0.05)
预示性实例9-对163-28B-1和162-1A-1抗体测定结合表位。

[0154] 163-28B-1和162-1A-1的结合表位可以经实验测定。可以在AGR2和C4.4A蛋白序列中引入系统突变，并且可以测定所得序列的抗体结合以鉴定包含表位的氨基酸。这种技术
可以用来映射线性和构象表位两者。高通量诱变映射是另一种途径，该途径利用全面的突
变文库，其中每个克隆含有独特的氨基酸突变(保守、非保守的，或丙氨酸)，并且整个文库覆盖靶蛋白中的每一个氨基酸。将来自突变文库的数百个质粒克隆单独以阵列排在384孔
微板中，在哺乳动物细胞中表达，并测试抗体结合。抗体结合所需的氨基酸可以通过荧光反应损失来鉴定并且映射到蛋白质结构以可视化表位。
***

[0155] 在此所披露和要求的所有方法都可根据本披露在无过度实验的情况下制成和进行。虽然在优选实施例方面已经描述了本发明的组合物和方法，但本领域技术人员将清楚
的是可以将变体应用到在此描述的方法和方法中的步骤或步骤的顺序中，而不脱离本发明
的概念、精神和范围。更具体地，将清楚的是与化学和生理学均相关的某些药剂可以用在此描述的药剂取代，同时实现相同或相似的结果。所有此类对本领域技术人员而言清楚的相
似取代和修改被认为处于如所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念之内。
参考文献
将以下参考，在它们提供示范性程序或补充本文所述的那些的其他细节的程度，通过
引用特定地结合在此。
美国专利3,817,837
美国专利3,850,752
美国专利3,939,350
美国专利3,996,345
美国专利4,196,265
美国专利4,275,149
美国专利4,277,437
美国专利4,366,241
美国专利4,469,797
美国专利4,472,509
美国专利4,606,855
美国专利4,703,003
美国专利4,742,159
美国专利4,767,720
美国专利4,816,567
美国专利4,867,973
美国专利4,870,287
美国专利4,938,948
美国专利4,946,778
美国专利5,021,236
美国专利5,091,513
美国专利5,164,296
美国专利5,196,066
美国专利5,223,409
美国专利5,403,484
美国专利5,420,253
美国专利5,565,332
美国专利5,571,698
美国专利5,627,052
美国专利5,656,434
美国专利5,739,169
美国专利5,760,395
美国专利5,770,376
美国专利5,789,208
美国专利5,801,005
美国专利5,821,337
美国专利5,824,311
美国专利5,830,880
美国专利5,844,091
美国专利5,846,945
美国专利5,858,657
美国专利5,861,155
美国专利5,871,907
美国专利5,969,108
美国专利6,054,297
美国专利6,165,464
美国专利6,365,157
美国专利6,406,867
美国专利6,709,659
美国专利6,709,873
美国专利6,753,407
美国专利6,814,965
美国专利6,849,259
美国专利6,861,572
美国专利6,875,434
美国专利6,881,557
美国专利6,891,024
美国专利6,946,546
美国专利7,407,659
美国专利8,178,098
阿伯格(Aberger)等人，胚胎外胚层早期说明书：非洲爪蟾蜍粘腺特异性基因XAG-2的
作用(Anterior specification of embryonic ectoderm:the role of the Xenopus 
cement gland-specific gene XAG-2).发育机制(Mech.Dev.),72:115-130,1998。
阿特休尔(Altschul)等人，有缺口的BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程
序(Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search 
programs).核酸研究(Nucleic Acids Res.),25:3389-3402,1997。
阿鲁穆加姆(Arumugam)等人，上皮-间质转化有助于胰腺癌中耐药性(Epithelial to 
mesenchymal transition contributes to drug resistance in pancreatic cancer).
癌症研究(Cancer Res.),69:5820-5828,2009。
奥斯丁-瓦德(Austin-Ward)和比利亚塞卡(Villaseca)，智利中药杂志(Revista 
Medica de Chile),126(7):838-845,1998。
巴巴斯(Barbas)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA),91:3809-
3813,1994。
巴拉克拉夫(Barraclough)等人，转移相关的前梯度蛋白2与乳腺癌患者的不良存活相
关(The metastasis-associated anterior gradient 2 protein is correlated with 
poor survival of breast cancer patients).美国病理学杂志(Am.J.Pathol.)175:
1848-1857,2009。
布里赫托娃(Brychtova)等人，前梯度蛋白2：肿瘤细胞生物学中的新参与者(Anterior 
gradient 2:a novel player in tumor cell biology).癌症快报(Cancer Lett.),304:
1-7,2011。
布科夫斯基(Bukowski)等人，临床癌症研究(Clinical Cancer Res.),4(10):2337-
2347,1998。
查特吉(Chatterjee)和美约(Mayor)，GPI锚定与蛋白质分选(The GPI-anchor and 
protein sorting).细胞分子生命科学(Cell.Mol.Life Sci.),58:1969-1987,2001。
克里斯杜莱德(Christodoulides)等人,微生物学(Microbiology),144(Pt 11):3027-
3037,1998。
达席尔瓦(da Silva)等人，CD59的蝾螈直系同源物在两栖动物肢体再生过程中牵涉近
远同一性(The newt ortholog of CD59is implicated in proximodistal identity 
during amphibian limb regeneration).细胞发育(Dev.Cell.)，3:547-555,2002。
戴维森(Davidson)等人，免疫治疗杂志(J.Immunother.),21(5):389-398,1998。
杜马丁(Dumartin)等人，AGR2是一种新型的表面抗原，其通过调节组织蛋白酶B和D促
进胰腺癌细胞的扩散(AGR2 is a novel surface antigen that promotes the 
dissemination of pancreatic cancer cells through regulation of cathepsins B 
and D).癌症研究(Cancer Res.),71:7091-7102,2011。
弗莱彻(Fletcher)等人，参与分化的基因的人类同源物hAG-2和hAG-3与雌激素受体阳
性的乳腺癌相关并且与转移基因C4.4a和肌营养不良蛋白聚糖相互作用(hAG-2 and hAG-
3,human homologues of genes involved in differentiation,are associated with 
oestrogen receptor-positive breast tumours and interact with metastasis gene 
C4.4a and dystroglycan).英国癌症杂志(Br.J.Cancer)，88:579-585,2003。
加拉特(Galat),人类基因组的三指蛋白结构域(The three-fingered protein 
domain of the human genome).细胞分子生命科学(Cell.Mol.Life Sci.),65:3481-
3493,2008。
古德芬格(Goldfinger)等人，α3层粘连蛋白亚基，α6β4和α3β1整合素协调调节培养的上皮细胞和皮肤中的伤口愈合(The alpha3 laminin subunit,alpha6beta4 and 
alpha3beta1 integrin coordinately regulate wound healing in cultured 
epithelial cells and in the skin).细胞科学杂志(J.Cell Sci.),112:2615-2629,
1999。
格拉姆(Gram)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),89:3576-3580,
1992。
古普塔(Gupta)等人，AGR2基因功能需要独特的内质网定位基序(AGR2 gene function 
requires a unique endoplasmic reticulum localization motif).生物化学杂志
(J.Biol.Chem.),287:4773-4782,2012。
汉尼布驰(Hanibuchi)等人，国际癌症杂志(Int.J.Cancer),78(4):480-485,1998。
汉森(Hansen)等人，尿激酶受体的结构同源物C4.4A的肿瘤细胞表达与非小细胞肺癌
的不良预后相关(Tumour cell expression of C4.4A,a structural homologue of the 
urokinase receptor,correlates with poor prognosis in non-small cell lung 
cancer).肺癌(Lung Cancer)，58:260-266,2007。
赫尔斯特兰德(Hellstrand)等人，肿瘤学报(Acta Oncologica),37(4):347-353,
1998。
比嘉(Higa)等人，促致癌蛋白二硫键异构酶(PDI)-家族成员前梯度蛋白2(AGR2)在内
质网稳态中的作用(Role of the pro-oncogenic Protein Disulfide Isomerase(PDI)-
family member Anterior Gradient 2(AGR2)in the control of endoplasmic 
reticulum homeostasis).生物化学杂志(J.Biol.Chem.),286:44855-44868,2011。
霍兰德尔(Hollander)，免疫前沿(Front.Immun.)，3:3,2012。
胡(Hu)等人，癌症研究(Cancer Res.),56:3055-3061,1996。
惠(Hui)和桥本(Hashimoto)，感染免疫(Infection Immun.),66(11):5329-5336,
1998。
英尼斯(Innes)等人，转移诱导性蛋白AGR2对激素治疗的乳腺癌患者中的结果的意义
(Significance of the metastasis-inducing protein AGR2for outcome in 
hormonally treated breast cancer patients).英国癌症杂志(Br.J.Cancer)，94:1057-
1065,2006。
雅各布森(Jacobsen)和普卢(Ploug)，尿激酶受体及其结构同源物C4.4A在人类癌症：
表达、预后和药物抑制中(The urokinase receptor and its structural homologue 
C4.4A in human cancer:expression,prognosis and pharmacological inhibition).当
前医疗化学(Curr.Med.Chem.),5:2559-2573,2008。
姜(Jiang)等人，层粘连蛋白及其整合素受体在胰腺中的不同分布(Distinct 
distribution of laminin and its integrin receptors in the pancreas).组织化学
细胞化学杂志(J.Histochem.Cytochem.),50:1625-1632,2002。
卡巴特(Kabat)等人，免疫感兴趣的蛋白质序列(Sequences of  Proteins of 
Immunological Interests)，第五版，NIH公开号91-3242，美国卫生与公共服务部，1991。
小宫(Komiya)等人，在小鼠小肠杯状细胞中表达的基因gob-4的克隆(Cloning of the 
gene gob-4,which is expressed in intestinal goblet cells in mice).生物化学与
生物物理学学报(Biochim.Biophys.Acta.),1444:434-438,1999。
小西(Konishi)等人，C4.4A在侵袭前沿的表达是结直肠癌疾病复发的一种新型预后标
记(Expression of C4.4A at the invasive front is a novel prognostic marker for 
disease recurrence of colorectal cancer).癌症科学(Cancer Sci.),101:2269-2277,
2010。
库玛(Kumar)等人，成体干细胞在火蜥蜴肢体再生中的位置同一性(Positional 
identity of adult stem cells in salamander limb regeneration).法国科学院报告
生物学(C.R.Biol.),330:485-490,2007。
刘(Liu)等人，细胞分子生物学(Cell Mol.Biol.)，49:209-216,2003。
刘(Liu)等人，粘腺蛋白的人类同源物-一种与乳腺癌相关的新型转移诱导剂(Human 
homologue of cement gland protein,a novel metastasis inducer associated with 
breast carcinomas).癌症研究(Cancer Res.),65:3796-3805,2005。
洛格斯登(Logsdon)等人，胰腺癌和慢性胰腺炎的分子谱鉴定胰腺癌中差异调节的多
个基因(Molecular profiling of pancreatic adenocarcinoma and chronic 
pancreatitis identifies multiple genes differentially regulated in pancreatic 
cancer).癌症研究(Cancer Res.),63:2649-2657,2003。
马克思(Marks)等人，生物/技术(Bio/Technology),10:779-783,1992。
恩戈拉(Ngora)等人，膜结合的和胞外体转移相关的C4.4A通过和α(6)β(4)整合素以及
MT1-MMP关联而促进迁移(Membrane-Bound and Exosomal Metastasis-Associated C4.4A 
Promotes Migration by Associating with theα(6)β(4)Integrin and MT1-MMP).瘤形
成(Neoplasia),14:95-107,2012。
诺里斯(Norris)等人，AGR2是调节MUC1水平并促进胰腺上皮内瘤变发生和发展的
SMAD4抑制基因(AGR2 is a SMAD4-suppressible gene that modulates MUC1 levels 
and promotes the initiation and progression of pancreatic intraepithelial 
neoplasia).致癌基因(Oncogene),32:3867-3876,2013。
帕雷特(Paret)等人，LY6家族成员C4.4A结合层粘连蛋白1和5，与半乳凝素-3相关联，
并且支持细胞迁移(Ly6 family member C4.4A binds laminins 1 and 5,associates 
with galectin-3 and supports cell migration).国际癌症杂志(Int.J.Cancer),115:
724-733,2005。
帕雷特(Paret)等人，C4.4A在结直肠癌的诊断中作为候选标记(C4.4A as a 
candidate marker in the diagnosis of colorectal cancer).英国癌症杂志
(Br.J.Cancer),97:1146-1156,2007。
帕克(Park)等人，蛋白质二硫键异构酶AGR2对于肠粘液产生是必不可少的(The 
protein disulfide isomerase AGR2 is essential for production of intestinal 
mucus).美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U S A),106:6950-6955,2009。
佩尔松(Persson)等人，蛋白质二硫键异构酶家族的多样性：将乳腺肿瘤诱导的Hag2和
Hag3鉴定为该蛋白家族的新成员(Diversity of the protein disulfide isomerase 
family:identification of breast tumor induced Hag2 and Hag3as novel members 
of the protein family).分子系统发育与进化(Mol.Phylogenet.Evol.),36:734-740,
2005。
秦(Qin)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),95(24):14411-
14416,1998。
拉马钱德兰(Ramachandran)等人，肾上腺髓质素在胰腺癌中表达，并且以自分泌方式
通过肾上腺髓质素受体ADMR刺激细胞增殖和侵袭(Adrenomedullin is expressed in 
pancreatic cancer and stimulates cell proliferation and invasion in an 
autocrine manner via the adrenomedullin receptor,ADMR).癌症研究(Cancer Res.),
67:2666-2675,2007。
拉马钱德兰(Ramachandran)等人，前梯度蛋白2在胰腺癌的发展中表达和分泌并且促
进癌细胞存活(Anterior gradient 2 is expressed and secreted during the 
development of pancreatic cancer and promotes cancer cell survival).癌症研究
(Cancer Res.),68:7811-7818,2008。
罗斯 等人，大鼠转移性胰腺肿瘤中新的磷脂酰肌醇锚定分子的克隆和功能
表征(Cloning and functional characterization of a new phosphatidyl-inositol 
anchored molecule of a metastasizing rat pancreatic  tumor).致癌基因
(Oncogene),17:1989-2002,1998。
席尔(Schier)等人，基因(Gene),169(2):147-155,1996。
赛特(Seiter)等人，黑色素瘤的进展过程中C4.4A表达的上调(Upregulation of 
C4.4A  expression during  progression of melanoma).皮肤病学研究杂志
(J.Invest.Dermatol.),116:344-347,2001。
斯米尔诺夫(Smirnov)等人，循环肿瘤细胞的全局基因表达谱(Global  gene 
expression profiling of circulating tumor cells).癌症研究(Cancer Res.),65:
4993-4997,2005。
史密斯(Smith)等人，涉及人类尿路上皮细胞-基质相互作用的基因的鉴定：对恶性尿
路上皮发展通路的影响(Identification of genes involved in human urothelial 
cell-matrix interactions:implications for the progression pathways of 
malignant urothelium).癌症研究(Cancer Res.),61:1678-1685,2001。
史密斯(Smith)和马歇尔(Marshall)，由uPAR进行的细胞信号传导的调节(Regulation 
of cell signalling by uPAR).分子细胞生物学自然评论(Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.),
11:23-36,2010。
施特默尔(Stemmer)，自然(Nature),370:389-391,1994。
赛明顿(Symington)和卡特(Carter).通过表皮整联配体蛋白和整合素α3β1调节表皮
分化(Modulation of epidermal differentiation by epiligrin and integrin alpha 
3 beta 1).细胞科学杂志(J.Cell Sci.),108:831-838,1995。
汤普森(Thompson)和魏格尔(Weigel)，hAG-2即非洲爪蟾蜍粘腺基因XAG-2的人类同源
物与乳腺癌细胞系中的雌激素受体共表达(hAG-2,the human homologue of the Xenopus 
laevis cement gland gene XAG-2,is coexpressed with estrogen receptor in 
breast  cancer  cell  lines).生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem 
Biophys.Res.Commun.),251:111-116,1998。
王(Wang)等人，腺癌相关抗原AGR2促进肿瘤生长、细胞迁移和细胞转化(The 
adenocarcinoma-associated antigen,AGR2,promotes tumor growth,cell migration,
and cellular transformation).癌症研究(Cancer Res.),68:492-497,2008。
伟伏(Würfel)等人，与转移相关的大鼠C4.4A的人类同源物的克隆(Cloning of the 
human homologue of the metastasis-associated rat C4.4A).基因(Gene),262:35-41，
2001。
薛(Xue)等人，尿激酶纤溶酶原激活剂受体的压制通过调节ERK/p38信号传导来抑制胰
腺癌细胞的增殖和迁移(Suppression of urokinase plasminogen activator receptor 
inhibits proliferation and migration of pancreatic adenocarcinoma cells via 
regulation  of  ERK/p38  signaling).国际生物化学与细胞生物学杂志
(Int.J.Biochem.Cell.Biol.),41:1731-1738,2009。
张(Zhang)等人，AGR2，雄激素诱导的分泌蛋白在前列腺癌中过表达(AGR2,an 
androgen-inducible secretory protein overexpressed in prostate cancer).基因染
色体癌症(Genes Chromosomes Cancer)，43:249-259,2005。
赵(zhao)等人，在Agr2-/-小鼠中破坏帕内特细胞和杯状细胞稳态和提高的内质网应
激(Disruption of Paneth and goblet cell homeostasis and increased endoplasmic 
reticulum stress in Agr2-/-mice).生物学发展(Dev.Biol.),338:270-279,2010。
朱(Zhu)等人，通过分裂中期和阵列比较基因组杂交的基因组畸变的高分辨率分析鉴
定肺癌细胞系中的候选肿瘤基因(High resolution analysis of genomic aberrations 
by metaphase and array comparative genomic hybridization identifies candidate 
tumour genes in lung cancer cell lines).癌症快报(Cancer Lett.),245:303-314,
2007。