组织血流和供氧的中止诱发一种被称为缺血的病症。实质性供氧减 少诱发一种被称为低氧的病症。缺血和低氧如果延长，能够导致组织功 能的丧失，进而细胞死亡。导致缺血和低氧的病症有很多，既有天然的 也有医原性的，包括但不限于阻塞性血管疾病、冠脉血栓形成、脑血管 血栓形成、动脉瘤破裂、全身性出血、挤压损伤、脓毒病、严重的皮肤 灼伤、血管闭合性外科技术(例如胸腹动脉瘤手术期间的脊柱缺血)、 心肺旁路手术、器官移植、心肺萎陷(突发性心死亡)和窒息。
缺血和低氧的常规治疗是通过增加一般的氧合作用或者通过除去 血管阻塞的原因，恢复血流和供氧至正常水平。血流的恢复比缺血或低 氧维持更长时间的情形后果有所改善。不过，公认血流和供氧的恢复能 够导致另外的细胞死亡和功能丧失，与由缺血或低氧所导致的损害无 关。这种由血流和供氧恢复所诱发的另外损害被称为再灌注损伤。由再 灌注损伤所导致的反常组织损害似乎与急性炎症相似，起因是炎性细胞 与再灌注组织的粘连、这些炎性细胞的活化和随后自由基的生成 (Granger et al.Ann.Rev.Physiol.，57，311-332，(1995))。再灌 注组织内自由基和其他细胞毒性生物分子的生成通过坏死或细胞凋亡 途径的活化而能够诱发细胞死亡。
腺苷是一种由体内所有细胞生成的细胞内与细胞外信使。它在细胞 外也是由酶转化作用所生成的。缺血和低氧组织在能量消耗期间经由腺 苷三磷酸(ATP)的分解生成大量腺苷。基于对各种腺苷受体配体的相对 亲和性和编码这些受体的基因序列分析，腺苷受体分为四种已知的亚型 (即A1、A2a、A2b和A3)。每种亚型的活化引发独特的、有时是相反的效 应。
四种腺苷受体亚型中已知有三种在再灌注损伤期间影响炎性细胞 的功能。已经显示A2a腺苷受体的活化抑制受刺激的嗜中性白细胞释放 氧自由基，减少嗜中性白细胞与血管内皮的粘连，抑制TNF和LTB4的嗜 中性释放(例如参见Cronstein et al.，J.Immunology，148，pp. 2201-2206(1992)；Thiel et al.，(1995)J.Lab.Clin.Med.，126， pp.275-282；Krump et al.，J.Exp.Med.，186，pp.1401-6(1997))。
与A2a腺苷受体活化的抗炎效果相反，已经显示A1受体的活化促进 受刺激的嗜中性白细胞的趋化性和吞噬作用(例如参见Cronstein et al. (1992)，见上；Salmon et al.，J.Immunology 145，pp.2235-2240. (1990))，促进单核细胞分化为多核巨细胞(Merrill et al.，Arth. Rheum.，40，pp.1308-1315(1997))。而且，血管内皮细胞上A1受体 的活化在心脏再灌注损伤模型中促进炎症和组织损伤(Becker et al.， Pharm.Pharmacol.Letters，2，pp.8-11(1992)；Schwartz et al.， J.Mol.Cell.Cardio.，25，pp.927-938(1993)；Zahler et al.， Cardiovascular Res.，28，pp.1366-1372(1994)；和Forman et al.， J.Pharmacol.Exp.Ther.，292(3)，pp.929-38(2000))。
A2b受体的活化也能引起促炎活性，例如IL-6的产生增加 (Sitaraman et al.，J.Clin.Invest.，107，pp.861-9(2001)，和 肥大细胞脱粒，这是一种局部炎症的标志(Linden et al.，Life Sci.， 62，pp.1519-24(1998)；和Auchampach et al.，Mol.Pharmacol.， 52，846-60(1997))。另外，血管平滑肌细胞中A2b受体的活化经由直 接刺激细胞凋亡而引起细胞的损失(Peyot et al.，Circ.Res.，86，pp. 76-85(2000))。
目前对缺血再灌注损伤的治疗仅仅通过恢复血流和氧合作用适度 治疗缺血损害。不过，由再灌注损伤所导致的损害一般是治疗不足的。 缺血再灌注的研究性治疗包括腺苷和腺苷类似物的使用以及缺血肌细 胞上钠-钙交换泵的抑制。不过，这些疗法是不充分的。例如，腺苷和 腺苷类似物的使用受到压制剂活性和心动过缓副作用的困扰。同样，缺 血肌细胞上钠-钙交换泵的抑制是不充分的，因为它不会预防或治疗炎 症或细胞凋亡的直接刺激。因而，仍然需要新的药学上可接受的化合物 和组合物，用于预防、限制或治疗缺血再灌注损伤。
发明概述
申请人发现，A2b腺苷受体拮抗剂能够预防、限制或治疗缺血再灌注 损伤，从而解决了上述问题。本发明涉及使用A2b腺苷受体拮抗剂预防、 限制或治疗哺乳动物缺血再灌注损伤的方法，所述动物已经经历过缺血 事件，或者其中缺血事件即将来临。
在一些实施方式中，本发明的方法包含在缺血事件前后十天内对患 者给予治疗上有效量或预防上有效量的A2b腺苷受体拮抗剂。
在一些发明实施方式中，该A2b腺苷受体拮抗剂是式(I)化合物

或其药学上可接受的盐或N-氧化物，其中：
每一R1、R2和R3独立地是：
a)氢；
b)C1-6烷基、C2-6链烯基或C2-6炔基；其中所述烷基、链烯基或炔 基是未取代的或者被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由羟基、 烷氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、环烷基、芳基、杂环基、芳 烷基、杂环基烷基、酰氨基、烷基氨基羰基、烷基磺酰氨基和烷基氨基 磺酰基组成的组；
c)取代或未取代的芳基；或
d)取代或未取代的杂环基；
R4是单键、-O-、-(CH2)1-3-、-O(CH2)1-2-、-CH2OCH2-、-(CH2)1-2O-、 -CH＝CHCH2-、-CH＝CH-或-CH2CH＝CH-；
R5是：
a)苯基；或
b)二环或三环基团，选自由下列基团组成的组：

和
其中该苯基、二环或三环基团是未取代的或者被一个或多个Ra基团 取代，Ra选自由下列基团组成的组：
a)C1-6烷基、C2-6链烯基或C2-6炔基；其中所述烷基、链烯基或炔 基是未取代的或者被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由氨基、 单烷基氨基、二烷基氨基、取代或未取代的杂环基氨基羰基、(氨基)(Rb) 酰基肼基羰基-、(氨基)(Rb)酰氧基羧基-、(羟基)(烷氧羰基)烷基氨甲 酰基、酰氧基、醛基、链烯基磺酰氨基、烷氧基、烷氧基羰基、烷基氨 基烷基氨基、二烷基氨基烷基氨基、烷基膦酰基、烷基磺酰氨基、氨甲 酰基、Rb-、Rb-烷氧基-、Rb-烷基氨基-、氰基、氰基烷基氨甲酰基、环 烷基氨基、二烷基膦酰基、卤代烷基磺酰氨基、杂环基烷基氨基、杂环 基氨甲酰基、羟基、羟基烷基磺酰氨基、肟基、膦酰基、取代或未取代 的芳烷基氨基、取代或未取代的芳基羧基烷氧基羰基、取代或未取代的 杂芳基磺酰氨基、取代或未取代的杂环基、硫代氨甲酰基和三氟甲基组 成的组；和
b)(烷氧基羰基)芳烷基氨甲酰基、醛基、链烯氧基、链烯基磺酰 氨基、烷氧基、烷氧基羰基、烷基氨甲酰基、烷氧基羰基氨基、烷氧基 羰基烷基氨基、烷基磺酰氨基、烷基磺酰氧基、氨基、氨基烷基芳烷基 氨甲酰基、氨基烷基氨甲酰基、氨基烷基杂环基烷基氨甲酰基、氨基环 烷基烷基环烷基氨甲酰基、氨基环烷基氨甲酰基、芳烷氧基羰基氨基、 芳基杂环基、芳氧基、芳基磺酰氨基、芳基磺酰氧基、氨甲酰基、羰基、 Rb-、Rb-烷氧基-、Rb-烷硫基-、Rb-烷基(烷基)氨基-、Rb-烷基(烷基)氨 甲酰基-、Rb-烷基氨基-、Rb-烷基氨甲酰基-、Rb-烷基磺酰基-、Rb-烷基 磺酰氨基、Rb-烷硫基、Rb-杂环基羰基、氨基烷基氨基羰基、二烷基氨 基烷基氨基、烷基氨基烷基氨基、氰基、环烷基氨基、二烷基氨基烷基 氨甲酰基、卤素、杂环基烷基氨基、羟基、肟基、磷酸酯、取代或未取 代的芳烷基氨基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基磺酰 氨基、次硫酸(sulfoxy)酰氨基和硫代氨甲酰基；
Rb选自由-COOH、-C(CF3)2OH、-CONHNHSO2CF3、-CONHORc、-CONHSO2Rc、 -CONHSO2NHRc、-C(OH)RcPO3H2、-NHCOCF3、-NHCONHSO2Rc、-NHPO3H2、-NHSO2Rc、 -NHSO2NHCORc、-OPO3H2、-OSO3H、-PO(OH)Rc、-PO3H2、-SO3H、-SO2NHRc、 -SO3NHCORc、-SO3NHCONHCO2Rc和下列基团组成的组：

Rc选自由氢、-C1-4烷基、-C1-4烷基-CO2H和苯基组成的组，其中该 -C1-4烷基、-C1-4烷基-CO2H和苯基是未取代的或者被一至三个取代基取 代，所述取代基选自由卤素、-OH、-OMe、-NH2、-NO2、未取代的苄基和 被一至三个取代基取代的苄基组成的组，所述取代基选自由卤素、-OH、 -OMe、-NH2和-NO2组成的组；
X1和X2独立地选自由O和S组成的组；
X3是N或CRd，其中Rd选自由下列基团组成的组：
a)氢；
b)C1-6烷基、C2-6链烯基或C2-6炔基；其中所述烷基、链烯基或炔 基是未取代的或者被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由羟基、 烷氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、环烷基、芳基、杂环基、芳 烷基、杂环基烷基、酰氨基、烷基氨基羰基、烷基磺酰氨基和烷基氨基 磺酰基组成的组；
c)取代或未取代的芳基；和
d)取代或未取代的杂环基。
在本发明的一些实施方式中，R1是C1-6烷基。在一些实施方式中， R2是C1-6烷基。在一些实施方式中，R3是氢。在一些实施方式中，R4是 单键。
在一些发明实施方式中，R5是取代的苯基。在其他实施方式中，R5 是取代的二环或三环基团，选自由下列基团组成的组：

在其他实施方式中，R5是
或
其中所述R5是未取代的或者被一个或多个Ra基团取代，Ra选自由下 列基团组成的组：
a)C1-6烷基、C2-6链烯基或C2-6炔基；其中所述烷基、链烯基或炔 基是未取代的或者被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由氨基、 单烷基氨基、二烷基氨基、取代或未取代的杂环基氨基羰基、(氨基)(Rb) 酰基肼基羰基-、(氨基)(Rb)酰氧基羧基-、(羟基)(烷氧羰基)烷基氨甲 酰基、酰氧基、醛基、链烯基磺酰氨基、烷氧基、烷氧基羰基、烷基氨 基烷基氨基、二烷基氨基烷基氨基、烷基膦酰基、烷基磺酰氨基、氨甲 酰基、Rb-、Rb-烷氧基-、Rb-烷基氨基-、氰基、氰基烷基氨甲酰基、环 烷基氨基、二烷基膦酰基、卤代烷基磺酰氨基、杂环基烷基氨基、杂环 基氨甲酰基、羟基、羟基烷基磺酰氨基、肟基、膦酰基、取代或未取代 的芳烷基氨基、取代或未取代的芳基羧基烷氧基羰基、取代或未取代的 杂芳基磺酰氨基、取代或未取代的杂环基、硫代氨甲酰基和三氟甲基组 成的组；和
b)(烷氧基羰基)芳烷基氨甲酰基、醛基、链烯氧基、链烯基磺酰 氨基、烷氧基、烷氧基羰基、烷基氨甲酰基、烷氧基羰基氨基、烷氧基 羰基烷基氨基、烷基磺酰氨基、烷基磺酰氧基、氨基、氨基烷基芳烷基 氨甲酰基、氨基烷基氨甲酰基、氨基烷基杂环基烷基氨甲酰基、氨基环 烷基烷基环烷基氨甲酰基、氨基环烷基氨甲酰基、芳烷氧基羰基氨基、 芳基杂环基、芳氧基、芳基磺酰氨基、芳基磺酰氧基、氨甲酰基、羰基、 Rb-、Rb-烷氧基-、Rb-烷硫基-、Rb-烷基(烷基)氨基-、Rb-烷基(烷基)氨 甲酰基-、Rb-烷基氨基-、Rb-烷基氨甲酰基-、Rb-烷基磺酰基-、Rb-烷基 磺酰氨基、Rb-烷硫基、Rb-杂环基羰基、氨基烷基氨基羰基、二烷基氨 基烷基氨基、烷基氨基烷基氨基、氰基、环烷基氨基、二烷基氨基烷基 氨甲酰基、卤素、杂环基烷基氨基、羟基、肟基、磷酸酯、取代或未取 代的芳烷基氨基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基磺酰 氨基、次硫酸(sulfoxy)酰氨基和硫代氨甲酰基。
在本发明的一些实施方式中，Ra选自由下列基团组成的组：
a)C1-6烷基、C2-6链烯基或C2-6炔基；其中所述烷基、链烯基或炔 基是未取代的或者被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由氨基、 单烷基氨基、二烷基氨基、取代或未取代的杂环基氨基羰基、(氨基)(Rb) 酰基肼基羰基-、(氨基)(Rb)酰氧基羧基-、(羟基)(烷氧羰基)烷基氨甲 酰基、酰氧基、醛基、链烯基磺酰氨基、烷氧基、烷氧基羰基、烷基氨 基烷基氨基、烷基膦酰基、烷基磺酰氨基、氨甲酰基、Rb-、Rb-烷氧基-、 Rb-烷基氨基-、氰基、氰基烷基氨甲酰基、环烷基氨基、二烷基氨基烷 基氨基、二烷基膦酰基、卤代烷基磺酰氨基、杂环基烷基氨基、杂环基 氨甲酰基、羟基、羟基烷基磺酰氨基、肟基、膦酰基、取代的芳烷基氨 基、取代的芳基羧基烷氧基羰基、取代的杂芳基磺酰氨基、取代的杂环 基、硫代氨甲酰基和三氟甲基组成的组；和
b)(烷氧基羰基)芳烷基氨甲酰基、醛基、链烯氧基、链烯基磺酰 氨基、烷氧基、烷氧基羰基、烷基氨甲酰基、烷氧基羰基氨基、烷氧基 羰基烷基氨基、烷基磺酰氨基、烷基磺酰氧基、氨基、氨基烷基芳烷基 氨甲酰基、氨基烷基氨甲酰基、氨基烷基杂环基烷基氨甲酰基、氨基环 烷基烷基环烷基氨甲酰基、氨基环烷基氨甲酰基、芳烷氧基羰基氨基、 芳基杂环基、芳氧基、芳基磺酰氨基、芳基磺酰氧基、氨甲酰基、羰基、 Rb-、Rb-烷氧基-、Rb-烷基(烷基)氨基-、Rb-烷基(烷基)氨甲酰基-、Rb- 烷基氨基-、Rb-烷基氨甲酰基-、Rb-烷基磺酰基-、Rb-烷基磺酰氨基、 Rb-烷硫基、Rb-杂环基羰基、氰基、环烷基氨基、二烷基氨基烷基氨甲 酰基、卤素、杂环基烷基氨基、羟基、肟基、磷酸酯、取代的芳烷基氨 基、取代的杂环基、取代的杂环基磺酰氨基、次硫酸(sulfoxy)酰氨 基和硫代氨甲酰基。
在本发明的其他实施方式中，Ra选自由下列基团组成的组：
a)C1-6烷基或C2-6链烯基，它们各自是未取代的或者被一个或多个 取代基取代，所述取代基选自由氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、取代 或未取代的杂环基氨基羰基、Rb-、Rb-烷氧基-和取代或未取代的杂环基 组成的组；和
b)烷氧基羰基烷基氨基、氰基和羟基。
在一些发明实施方式中，X1是O。在一些实施方式中，X2是O。在 一些实施方式中，X3是N。
在一些发明实施方式中，每个R1和R2是C2-4烷基；R3是氢；R4是单 键；每个X1和X2是O；X3是N。在本发明的其他实施方式中，每个R1和 R2独立地是C2-4烷基；R3是氢；R4是单键；每个X1和X2是O；X3是N；且 R5是被Ra取代的苯基。
在本发明的其他实施方式中，每个R1和R2是C2-4烷基；R3是氢；R4 是单键；每个X1和X2是O；X3是N；且R5是被Ra取代的苯基；且Ra选自 由下列基团组成的组：
a)C1-6烷基或C2-6链烯基，它们各自是未取代的或者被一个或多个 取代基取代，所述取代基选自由氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、取代 或未取代的杂环基氨基羰基、取代或未取代的杂环基、Rb-和Rb-烷氧基 -组成的组；和
b)烷氧基羰基烷基氨基、Rb-烷氧基-、氰基、取代或未取代的杂 环基和羟基。
在本发明的其他实施方式中，每个R1和R2是C2-4烷基；R3是氢；R4 是单键；每个X1和X2是O；X3是N；R5是被Ra取代的苯基；Ra是氰基。
在本发明的一些实施方式中，每个R1和R2独立地是C2-4烷基；R3是 氢；R4是单键；每个X1和X2是O；X3是N；R5是

其中所述R5是未取代的或者被一个或多个Ra基团取代，Ra选自由下 列基团组成的组：
a)C1-6烷基、C2-6链烯基或C2-6炔基；其中所述烷基、链烯基或炔 基是未取代的或者被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由氨基、 单烷基氨基、二烷基氨基、取代或未取代的杂环基氨基羰基、(氨基)(Rb) 酰基肼基羰基-、(氨基)(Rb)酰氧基羧基-、(羟基)(烷氧羰基)烷基氨甲 酰基、酰氧基、醛基、链烯基磺酰氨基、烷氧基、烷氧基羰基、烷基氨 基烷基氨基、二烷基氨基烷基氨基、烷基膦酰基、烷基磺酰氨基、氨甲 酰基、Rb-、Rb-烷氧基-、Rb-烷基氨基-、氰基、氰基烷基氨甲酰基、环 烷基氨基、二烷基氨基烷基氨基、二烷基膦酰基、卤代烷基磺酰氨基、 杂环基烷基氨基、杂环基氨甲酰基、羟基、羟基烷基磺酰氨基、肟基、 膦酰基、取代或未取代的芳烷基氨基、取代或未取代的芳基羧基烷氧基 羰基、取代或未取代的杂芳基磺酰氨基、取代或未取代的杂环基、硫代 氨甲酰基和三氟甲基组成的组；和
b)(烷氧基羰基)芳烷基氨甲酰基、醛基、链烯氧基、链烯基磺酰 氨基、烷氧基、烷氧基羰基、烷基氨甲酰基、烷氧基羰基氨基、烷氧基 羰基烷基氨基、烷基磺酰氨基、烷基磺酰氧基、氨基、氨基烷基芳烷基 氨甲酰基、氨基烷基氨甲酰基、氨基烷基杂环基烷基氨甲酰基、氨基环 烷基烷基环烷基氨甲酰基、氨基环烷基氨甲酰基、芳烷氧基羰基氨基、 芳基杂环基、芳氧基、芳基磺酰氨基、芳基磺酰氧基、氨甲酰基、羰基、 Rb-、Rb-烷氧基-、Rb-烷硫基-、Rb-烷基(烷基)氨基-、Rb-烷基(烷基)氨 甲酰基-、Rb-烷基氨基-、Rb-烷基氨甲酰基-、Rb-烷基磺酰基-、Rb-烷基 磺酰氨基、Rb-烷硫基、Rb-杂环基羰基、氨基烷基氨基羰基、二烷基氨 基烷基氨基、烷基氨基烷基氨基、氰基、环烷基氨基、二烷基氨基烷基 氨甲酰基、卤素、杂环基烷基氨基、羟基、肟基、磷酸酯、取代或未取 代的芳烷基氨基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基磺酰 氨基、次硫酸(sulfoxy)酰氨基和硫代氨甲酰基。
在本发明的另一种实施方式中，每个R1和R2是C2-4烷基；R3是氢； R4是单键；每个X1和X2是O；X3是N；R5是

其中所述R5是未取代的或者被一个或多个Ra基团取代，Ra选自由下 列基团组成的组：
a)C1-6烷基或C2-6链烯基，它们各自是未取代的或者被一个或多个 取代基取代，所述取代基选自由氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、取代 或未取代的杂环基氨基羰基、取代或未取代的杂环基、Rb-和Rb-烷氧基 -组成的组；和
b)烷氧基羰基烷基氨基、Rb-烷氧基-、氰基、取代或未取代的杂 环基和羟基。
在另一种实施方式中，每个R1和R2是C2-4烷基；R3是氢；R4是单键； 每个X1和X2是O；X3是N；R5是
和
其中所述R5是未取代的或者被一个或多个Ra基团取代，Ra选自由被 一个或多个取代基取代的C2-5烷基组成的组，所述取代基选自由氨基、 单烷基氨基和二烷基氨基组成的组。
在本发明的一些实施方式中，每个R1和R2是C2-4烷基；R3是氢；R4 是单键；每个X1和X2是O；X3是N；R5是

其中所述R5是未取代的或者被一个或多个Ra基团取代，Ra选自由下 列基团组成的组：
a)C1-6烷基、C2-6链烯基或C2-6炔基；其中所述烷基、链烯基或炔 基是未取代的或者被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由氨基、 单烷基氨基、二烷基氨基、取代或未取代的杂环基氨基羰基、(氨基)(Rb) 酰基肼基羰基-、(氨基)(Rb)酰氧基羧基-、(羟基)(烷氧羰基)烷基氨甲 酰基、酰氧基、醛基、链烯基磺酰氨基、烷氧基、烷氧基羰基、烷基氨 基烷基氨基、二烷基氨基烷基氨基、烷基膦酰基、烷基磺酰氨基、氨甲 酰基、Rb-、Rb-烷氧基-、Rb-烷基氨基-、氰基、氰基烷基氨甲酰基、环 烷基氨基、二烷基膦酰基、卤代烷基磺酰氨基、杂环基烷基氨基、杂环 基氨甲酰基、羟基、羟基烷基磺酰氨基、肟基、膦酰基、取代或未取代 的芳烷基氨基、取代或未取代的芳基羧基烷氧基羰基、取代或未取代的 杂芳基磺酰氨基、取代或未取代的杂环基、硫代氨甲酰基和三氟甲基组 成的组；和
b)(烷氧基羰基)芳烷基氨甲酰基、醛基、链烯氧基、链烯基磺酰 氨基、烷氧基、烷氧基羰基、烷基氨甲酰基、烷氧基羰基氨基、烷氧基 羰基烷基氨基、烷基磺酰氨基、烷基磺酰氧基、氨基、氨基烷基芳烷基 氨甲酰基、氨基烷基氨甲酰基、氨基烷基杂环基烷基氨甲酰基、氨基环 烷基烷基环烷基氨甲酰基、氨基环烷基氨甲酰基、芳烷氧基羰基氨基、 芳基杂环基、芳氧基、芳基磺酰氨基、芳基磺酰氧基、氨甲酰基、羰基、 Rb-、Rb-烷氧基-、Rb-烷硫基-、Rb-烷基(烷基)氨基-、Rb-烷基(烷基)氨 甲酰基-、Rb-烷基氨基-、Rb-烷基氨甲酰基-、Rb-烷基磺酰基-、Rb-烷基 磺酰氨基、Rb-烷硫基、Rb-杂环基羰基、氨基烷基氨基羰基、二烷基氨 基烷基氨基、烷基氨基烷基氨基、氰基、环烷基氨基、二烷基氨基烷基 氨甲酰基、卤素、杂环基烷基氨基、羟基、肟基、磷酸酯、取代或未取 代的芳烷基氨基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基磺酰 氨基、次硫酸(sulfoxy)酰氨基和硫代氨甲酰基。
在本发明的其他实施方式中，每个R1和R2是C2-4烷基；R3是氢；R4 是单键；每个X1和X2是O；X3是N；R5是
且
其中所述R5是未取代的或者被一个或多个Ra基团取代，Ra选自由下 列基团组成的组：
a)C1-6烷基或C2-6链烯基，它们各自是未取代的或者被一个或多个 取代基取代，所述取代基选自由氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、取代 或未取代的杂环基氨基羰基、取代或未取代的杂环基、Rb-和Rb-烷氧基 -组成的组；和
b)烷氧基羰基烷基氨基、Rb-烷氧基-、氰基、取代或未取代的杂 环基和羟基。
在本发明的另一种实施方式中，每个R1和R2是C2-4烷基；R3是氢； R4是单键；每个X1和X2是O；X3是N；R5是
且
其中所述R5是未取代的或者被一个或多个Ra基团取代，Ra选自由下 列基团组成的组：
a)C1-4烷基或C2-4链烯基，它们各自是未取代的或者被一个或多个 取代基取代，所述取代基选自由氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、取代 或未取代的杂环基氨基羰基、取代或未取代的杂环基和Rb-组成的组； 和
b)Rb-烷氧基-和取代的杂环基。
在本发明的一些实施方式中，每个R1和R2是丙基；R3是氢；R4是单 键；R5是被一个或多个Ra基团取代的苯基、
或
其中所述二环或三环基团是未取代的或者被一个或多个Ra基团取 代，Ra选自由下列基团组成的组：
a)C1-6烷基或C2-6链烯基，它们各自是未取代的或者被一个或多个 取代基取代，所述取代基选自由氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、取代 或未取代的杂环基氨基羰基、Rb-、Rb-烷氧基-和取代或未取代的杂环基 组成的组；和
b)烷氧基羰基烷基氨基、氰基和羟基；
每个X1和X2是O；且
X3是N。
在优选的实施方式中，本发明方法中所用的式(I)化合物是 3-[4-(2，6-二氧代-1，3-二丙基-2，3，6，7-四氢-1H-嘌呤-8-基)-二环 [2.2.2]辛-1-基]-丙酸。
在一些实施方式中，将A2b腺苷受体拮抗剂对人给药。
在一些实施方式中，将用于本发明方法中的A2b腺苷受体拮抗剂与 药学上适合的载体一起配制成药学上可接受的组合物。
本发明可用于治疗已经经历缺血事件的患者或者其中缺血事件即 将来临的患者。缺血事件的实例包括急性冠脉综合征(包括心肌梗塞)、 中风、器官移植、肾缺血、休克和器官移植手术。
在一些实施方式中，本发明的方法包括在缺血事件前后两天内给予 A2b腺苷受体拮抗剂。在另一种实施方式中，该方法包括在缺血事件后两 天内给予A2b腺苷受体拮抗剂。
在一些实施方式中，用于本发明方法中的化合物表现对A2b腺苷受 体的亲和性比对A2a腺苷受体或A3腺苷受体的亲和性至少大10倍。在其 他实施方式中，用于本发明方法中的化合物进一步表现对A1腺苷受体的 亲和性比对A2a腺苷受体或A3腺苷受体的亲和性至少大10倍。
在一些实施方式中，用在本发明方法中的化合物对A2b腺苷受体表 现低于500nM的Ki值。在其他实施方式中，用在本发明方法中的化合物 对A2b腺苷受体表现低于200nM的Ki值。
在一些实施方式中，本发明涉及治疗由A2b腺苷受体活化介导的疾 病或病症的方法，包含对需要的哺乳动物给予有效量的上述式(I)化合 物。
在一些实施方式中，本发明涉及使用A2b腺苷受体拮抗剂在已经经 历缺血事件或者其中缺血事件即将来临的哺乳动物中限制由缺血事件 引起组织坏死的方法。
在一些实施方式中，本发明涉及使用A2b腺苷受体拮抗剂在已经经 历心肌梗塞或者其中心肌梗塞即将来临的哺乳动物中限制心肌梗塞后 梗塞大小的方法。
附图的简要说明
图1描绘方案I所得心肌梗塞大小数据(见实施例2)。图A描绘 四个实验组中的危险区大小，以左心室的百分比表示。图B描绘梗塞大 小，为危险区的百分比。图C描绘梗塞大小，以左心室的百分比表示。 图D反映梗塞大小的图形，以危险区的百分比和冠脉闭合后30分钟所 测量的透壁旁系血流表示。
图2描绘方案II所得心肌梗塞大小数据(见实施例3)。图A描绘 四个实验组中的危险区大小，以左心室的百分比表示。出于对比的目的， 来自方案I的对照组也包括在内。图B描绘梗塞大小，为危险区的百分 比。图C描绘梗塞大小，以左心室的百分比表示。图D反映梗塞大小的 图形，以危险区的百分比和冠脉闭合后30分钟所测量的透壁旁系血流 表示。
图3描绘方案III所得心肌梗塞大小数据(见实施例4)。图A描 绘四个实验组中的危险区大小，以左心室的百分比表示。图B描绘梗塞 大小，为危险区的百分比。图C描绘梗塞大小，以左心室的百分比表示。 图D反映梗塞大小的图形，以危险区的百分比和冠脉闭合后30分钟所 测量的透壁旁系血流表示。
图4描绘BG9928对重组人A1腺苷受体的竞争性结合。将从稳定表 达人A1腺苷受体的HEK-293细胞制备的膜(50μg膜蛋白)、0.92nM放 射性配体[3H]-DPCPX和不同浓度BG9928一式三份培育在0.1ml缓冲液 HE加2单位/mL腺苷脱氨基酶中，在21℃下培育2.5小时。在10μM NECA 的存在下测量非特异性结合。通过过滤终止结合测定(N＝1)。
图5描绘BG9928对重组人A2a腺苷受体的竞争性结合。将从稳定表 达人A2a腺苷受体的HEK-293细胞制备的膜(50μg膜蛋白)、1.16nM放 射性配体[3H]-ZM241385和不同浓度BG9928一式三份培育在0.1ml缓冲 液HE加2单位/mL腺苷脱氨基酶中，在21℃下培育2.5小时。在10μM XAC的存在下测量非特异性结合。通过过滤终止结合测定(N＝1)。
图6描绘BG9928对重组人A2b腺苷受体的竞争性结合。将从稳定表 达人A2b腺苷受体的HEK-293细胞制备的膜(40-70μg膜蛋白)、30- 40nM放射性配体[3H]-ZM241385和不同浓度BG9928一式三份培育在 0.1ml缓冲液HE加2单位/mL腺苷脱氨基酶中，在21℃下培育2.5小 时。在10μM NECA的存在下测量非特异性结合。通过过滤终止结合测定 (N＝3)。
图7描绘BG9928对重组人A3腺苷受体的单点结合。将从稳定表达 人A3腺苷受体的HEK-293细胞制备的膜(50μg膜蛋白)和0.12nM放射 性配体[125I]-AB-MECA单独或者与10μM IB-MECA或与10μM BG9928一起 一式三份培育在0.1ml缓冲液HE加2单位/mL腺苷脱氨基酶中，在21℃ 下培育2.5小时。通过过滤终止结合测定(N＝2)。
图8描绘BG9928的FLIPR测定法，采用在CHO-K1细胞中稳定表达 的重组人A1腺苷受体。FLIPR测定法测量表达重组人A1腺苷受体的 CHO-K1细胞对激动剂(CPA)浓度增加的响应(顶部图形)，以利用零点 法测定拮抗剂BG9928在固定激动剂浓度(200nM CPA)下的IC50(获得50％ 响应时的浓度)和KB值(底部图形)。
图9描绘BG9928的FLIPR测定法，采用在HEK-293细胞中稳定表 达的重组人A2b腺苷受体。FLIPR测定法测量稳定表达重组人A2b腺苷受 体的HEK-293细胞对激动剂(NECA)浓度增加的响应(顶部图形)，以利 用零点法测定拮抗剂BG9928在固定激动剂浓度(5μM NECA)下的IC50(获 得50％响应时的浓度)和KB值(底部图形)。
图10描绘BG9928的FLIPR测定法，采用在HEK-293细胞中稳定表 达的重组人A2b腺苷受体。FLIPR测定法在递增浓度激动剂(NECA)的存在 下测量在表达大鼠A2b腺苷受体的HEK-293细胞中用1O、100和300nM BG9928所观察到的对照响应部分(顶部图形)。底部图形是顶部途径中 所列数据的Schild分析。
发明的详细说明
除非另有限定，本文所用所有技术和科学术语都具有为本发明所属 领域普通技术人员所普遍理解的含义。尽管在本发明的实施或试验中可 以使用与本文所述那些相似或相同的方法和材料，不过下面描述适合的 材料和方法。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献 都全文结合在此作为参考。另外，材料、方法和实施例仅供例证，并非 限制。
在说明书全文中，“包含”将被理解为暗示包括所述整体或整体组， 但是不排除任意其他整体或整体组。
本文所用的“烷基”是饱和的脂族烃基。烷基可以是直链或支链的， 例如可以在链中具有1至6个碳原子。直链烷基的实例包括但不限于乙 基和丁基。支链烷基的实例包括但不限于异丙基和叔丁基。烷基可以可 选地被一个或多个取代基取代，取代基例如烷氧基、氨基、硝基、羧基、 烷酯基、氰基、卤代、羟基、巯基、三卤甲基、次硫酸(sulfoxy)或 氨甲酰基。
本文所用的“链烯基”是具有至少一条双键的脂族含碳基团。链烯 基可以是直链或支链的，例如可以在链中具有3至6个碳原子和1或2 条双键。链烯基的实例包括但不限于烯丙基和异丙烯基。链烯基可以可 选地被一个或多个取代基取代，取代基例如烷氧基、氨基、硝基、羧基、 烷酯基、氰基、卤代、羟基、巯基、三卤甲基、次硫酸(sulfoxy)或 氨甲酰基。
本文所用的“炔基”是具有至少一条叁键的脂族含碳基团。炔基可 以是直链或支链的，例如可以在链中具有3至6个碳原子和1或2条叁 键。炔基的实例包括但不限于炔丙基和丁炔基。炔基可以可选地被一个 或多个取代基取代，取代基例如烷氧基、氨基、硝基、羧基、烷酯基、 氰基、卤代、羟基、巯基、三卤甲基、次硫酸(sulfoxy)或氨甲酰基。
本文所用的“芳基”是苯基或萘基、或其衍生物。“取代的芳基” 是被一个或多个取代基取代的芳基，取代基例如烷基、烷氧基、氨基、 硝基、羧基、烷酯基、氰基、烷基氨基、二烷基氨基、卤代、羟基、羟 基烷基、巯基、烷基巯基、三卤烷基、羧基烷基、次硫酸(sulfoxy) 或氨甲酰基。
本文所用的“芳烷基”是被芳基取代的烷基。芳烷基的实例有苄基。
本文所用的“环烷基”是例如3至8个碳原子的脂族环。环烷基的 实例包括环丙基和环己基。
本文所用的“酰基”是直链或支链烷基-(＝O)-基团或甲酰基。酰基 的实例包括烷酰基(例如在烷基中具有1至6个碳原子)。乙酰基和新 戊酰基是酰基的实例。酰基可以是取代的或未取代的。
本文所用的“氨甲酰基”是具有结构H2N-CO2-的基团。“烷基氨甲 酰基”和“二烷基氨甲酰基”表示其中氮分别连接一个或两个烷基代替 氢的氨甲酰基。同样，“芳基氨甲酰基”和“芳基烷基氨甲酰基”包括 芳基代替一个氢，在后者情况下，烷基代替第二个氢。
本文所用的“羧基”是-COOH基团。
本文所用的“烷氧基”是烷基-O-基团，其中“烷基”是如前面所 述的。
本文所用的“烷氧基烷基”是如前面所述的烷基，其中氢被如前面 所述的烷氧基代替。
本文所用的“卤素”或“卤代”基团是氟、氯、溴或碘。
本文所用的“杂环基”是5至约10元环结构，其中该环中一个或 多个原子是除碳以外的元素，例如N、O、S。杂环基可以是芳族的或非 芳族的，也就是可以是饱和的或者可以是部分或完全不饱和的。芳族杂 环基也可以被称为“杂芳基”。杂环基的实例包括吡啶基、咪唑基、呋 喃基、噻吩基、噻唑基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、吗啉基、硫吗啉基、 吲哚基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、哌啶基、嘧啶基、哌嗪基、异噁 唑基、异噁唑烷基、四唑基和苯并咪唑基。
本文所用的“取代的杂环基”是其中一个或多个氢被取代基代替的 杂环基，取代基例如烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧羰基、氨甲 酰基、羧基、氰基、卤代、三卤甲基、羟基、羰基、硫代羰基、羟基烷 基或硝基。
本文所用的“羟基烷基”表示被羟基取代的烷基。
本文所用的“氨磺酰基”具有结构-S(O)2NH2。“烷基氨磺酰基”和 “二烷基氨磺酰基”表示其中氮分别连接一个或两个烷基代替氢的氨磺 酰基。同样，“芳基氨磺酰基”和“芳基烷基氨磺酰基”包括芳基代替 一个氢，在后者情况下，烷基代替第二个氢。
本文所用的“拮抗剂”是与受体结合但不激活该受体的分子。它与 内源性配体竞争该结合部位，因而减少内源性配体刺激该受体的能力。
本文所用的“选择性拮抗剂”是与腺苷受体特定亚型结合亲和性高 于其他亚型的拮抗剂。本文所用的“A2b选择性拮抗剂”是对A2b受体具 有高亲和性的拮抗剂，并且(a)对A2b受体亚型具有纳摩尔级结合亲和性， (b)对A2b亚型的亲和性比A2a和A3受体亚型至少大10倍，更优选50倍， 最优选100倍。A2b选择性拮抗剂可以可选地对A1受体亚型具有亲和性， 并且(a)对A1受体亚型具有纳摩尔级结合亲和性，(b)对A1亚型的亲和 性比A2a和A3受体亚型至少大10倍，更优选50倍，最优选100倍。
本文所用的“梗塞”表示由对组织(例如心肌)血液供应梗阻引起 的局部坏死。
本文所用的“缺血”表示由于局部区域(即器官或组织)血管阻塞， 该区域血液供应(循环)不足。缺血包括组织血流和供氧的完全停止以 及低氧，由此组织供氧有实质性减少。
本文所用的“再灌注”表示器官或组织血流的恢复。
本文所用的“缺血再灌注损伤”表示由缺血继之以再灌注所导致的 组织损伤。
本文所用的“药学上可接受的”表示在治疗或预防以腺苷浓度升高 和/或对腺苷敏感性增加为特征的病症中有效的量。
本文所用的术语“患者”表示动物，包括哺乳动物(例如人类)。
本文所用的“药学上可接受的载体或助剂”表示无毒的载体或助剂， 可以与本发明化合物一起对动物给药，不会破坏其药理活性。
药学上可接受的阴离子盐包括下列酸的盐：甲磺酸、盐酸、氢溴酸、 硫酸、磷酸、硝酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、富马酸、马来酸、 CH3-(CH2)n-COOH(其中n是0-4)、HOOC-(CH2)n-COOH(其中n是如上 所定义的)。
在使用溶剂对时，所用溶剂的比例是体积/体积(v/v)。
在使用固体在溶剂中的溶解度时，固体与溶剂的比例是重量/体积 (wt/v)。
另外，下列缩写将适用于说明书全文：
BCA表示Bicinchoninic acid。
BG9928表示3-[4-(2，6-二氧代-1，3-二丙基-2，3，6，7-四氢-1H-嘌 呤-8-基)-二环[2.2.2]辛-1-基]-丙酸。
(Ca2+)i表示细胞内钙。
CCD表示荷电偶联装置。
CPA表示N6-环戊基腺苷。
CPM表示每分钟的个数。
DPM表示每分钟的分解。
DR表示浓度比，也就是在拮抗剂的存在下产生限定响应(通常但不 是必需为最大程度的50％)的激动剂浓度除以在没有拮抗剂的存在下产 生相同响应的浓度。
EDTA表示乙二胺四乙酸。
FLIPR表示荧光成像平板读数。
[3H]-BG9928表示氚标记的BG9928。
[3H]-DPCPX表示氚标记的8-环戊基-1，3-二丙基黄嘌呤，它是A1与 A2b腺苷受体的竞争性底物。
[3H]-ZM241385表示氚标记的4-(2-[7-氨基-2-(呋喃基)(1，2，4)三 唑并(2，3-a)(1，3，5)三嗪-5-基氨基]乙基)苯酚，它是A2a腺苷受体的竞 争性底物。
[I]表示游离放射性配体的浓度。
[125I]-AB-MECA表示[125碘]标记的N6-(4-氨基苄基)-9-(5-甲基羰 基)-β-D-呋喃核糖基)腺嘌呤。
IB-MECA表示1-脱氧-1-[6-[[(3-碘苯基)甲基]氨基]-9H-嘌呤-9- 基]-N-甲基-βN6-(4-氨基苄基)-9-(5-(甲基羰基)-β-D-呋喃核糖酰胺。
IC50表示抑制50％所测量活性的试剂浓度。
KB表示拮抗剂离解常数。
KD表示由饱和度分析所测定的放射性标记药物离解常数。
KI表示药物的抑制常数；在竞争测定法中占据50％受体时的竞争性 配体浓度，如果没有放射性配体存在的话。
AB-MECA表示N6-(4-氨基苄基)-9-(5-(甲基羰基)-β-D-呋喃核糖基) 腺苷。
N表示观察的数量。
NECA表示5’N-乙酰氨基腺苷。
pA2表示拮抗剂效力的对数量度；拮抗剂在激动剂浓度-响应曲线中 产生2-倍偏移的浓度的负对数。
PMSF表示苯甲基磺酰氟。
RFU表示相对荧光单位。
3H-R-PIA表示[3H]-R-N6苯基异丙基腺苷(A3腺苷受体的放射性配 体)。
Schild图形表示log(浓度比-1)、即log(DR-1)对log(拮抗剂 浓度)作图。log浓度轴上的截距等于pA2值，而斜率给出关于拮抗作用 属性的信息。
SD表示标准偏差。
SEM平均值的标准误差。
XAC表示黄嘌呤氨基同类物。
一般而言，本发明以高度有效的选择性A2b腺苷受体拮抗剂为特征。 在一些实施方式中，本发明化合物可以可选地是选择性A1腺苷受体拮抗 剂。
腺苷拮抗剂化合物的合成
可用于本发明的化合物可以借助本领域已知的常规方法制备。例 如，式I化合物的合成描述在国际专利公报WO 01/34604和WO 01/34610 中。
本文描述两种一般方法。每种方法采用共同的原料1，3-二取代的 -5，6-二氨基尿嘧啶(化合物(VI))，如下两个流程所示。1，3-二取代 的-5，6-二氨基尿嘧啶可以这样制备，将相应的对称或不对称取代的脲 用氰基乙酸处理，继之以亚硝化和还原作用(例如参见J.Org.Chem. 16，1879，1951；Can J.Chem.46，3413，1968，结合在此作为参考)。 不对称取代的黄嘌呤可以经由Mueller的方法获得(J.Med.Chem.36， 3341，1993，结合在此作为参考)。在这种方法中，在Vorbruggen条 件下使6-氨基尿嘧啶的尿嘧啶N3位单烷基化。或者，未取代的N1或 N3位可以在合成的最后阶段被官能化(例如烷基化)。
在第一种一般方法中，1，3-二取代的-5，6-二氨基尿嘧啶(化合物 (VI))可以首先经历环闭合反应，生成8-位未取代的黄嘌呤中间体。这 种中间体继而可以与Z-R3部分的前体化合物偶联，生成所需8-取代的 黄嘌呤。参照下列流程1，原料1，3-二取代的-5，6-二氨基尿嘧啶(即 化合物(VI))首先与HC(OEt)3经历环闭合反应，生成8-位未取代的黄 嘌呤中间体(即化合物(A))。这种中间体在被氨基保护基团保护(例 如用THP或BOM保护N7位)后，进一步在强碱(例如正丁基锂(n-BuLi) 或二异丙氨基化锂(LDA))的存在下与Z-R3部分的前体化合物(例如醛 或酮)经历偶联反应，生成醇(即化合物(C))。然后可以借助本领域 普通技术人员熟知的方法使醇羟基反应，将醇转化为胺、硫醇、醚、内 酯(例如化合物(E))或其他官能化化合物。然后可以除去N7保护，得 到去保护产物(即化合物(F))，它可以进一步官能化，得到本发明化 合物。
流程1

在第二种一般方法中，本发明化合物可以这样制备，使原料1，3- 二取代的-5，6-二氨基尿嘧啶与Z-R3部分的前体化合物(例如醛或羧酸 或羧酸酰氯)反应，生成6-酰胺取代的尿嘧啶中间体，后者继而可以经 历环闭合反应，得到所需的黄嘌呤化合物。参照下列流程2，原料1，3- 二取代的-5，6-二氨基尿嘧啶(即化合物(VI))首先与二羧基/酯取代的 Z-R3部分的前体化合物HOOC-Z-R3-COORa(即化合物(G)；Ra代表H、C1-5 烷基或苄基，所述苯基环可选地被1-3个取代基取代，取代基选自由 卤素、羟基或C1-3烷氧基组成的组)偶联，得到6-酰胺取代的尿嘧啶中 间体(即化合物(H))该反应是本领域普通技术人员熟知的(例如采用 偶联试剂，例如苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)膦六氟磷酸盐(BOP)、 O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)或O-(7- 氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU))。 化合物(G)的实例包括二环[3.2.1]辛烷-1，5-二羧酸一甲基酯和二环 [2.2.2]辛烷-1，4-二羧酸一乙基酯。尿嘧啶中间体然后可以在碱性条件 下(例如采用KOH和异丙醇)经历环闭合反应，得到黄嘌呤化合物(即 化合物(J))，后者可以进一步经历官能化作用，生成各种本发明化合 物。
流程2

所需的醛、酮、羧酸和羧酸酰氯是商业上可得到的(例如来自 Aldrich Chemical Co.，Inc.，Milwaukee，Wisc.)或者可以容易借助 熟知的合成方法从商业上可得到的原料制备。这类合成方法包括但不限 于氧化、还原、水解、烷基化和Wittig确认(homologation)反应。 就关于本发明二环烷烃羧酸(例如化合物(III)，它是化合物(G)的实例) 制备的参考文献而言，例如参见Aust.J.Chem.38，1705，1985；Aust J.Chem.39，2061，1986；J.Am.Chem.Soc.75，637，1953；J.Am. Chem.Soc.86，5183，1964；J.Am.Chem.Soc.102，6862，1980；J. Org.Chem.46，4795，1981；和J.Org.Chem.60，6873，1995。
进一步使化合物(J)官能化有很多方法，所述化合物含有与R3部分 连接的羧酸或酯。例如，化合物(J)可以转化为对应的丙烯酸衍生物。 一种方式是首先水解化合物(J)的酯基(只要Ra不是H)，得到对应的 羧酸，还原羧酸为对应的醇，氧化醇为对应的醛，然后进行 Wadsworth-Horner-Emmons或Witting反应，生成对应的丙烯酸衍生物。 化合物(J)也可以直接转化为其对应的醇。一种不同的变化是直接转化 化合物(J)为其对应的醛。进一步的变化是转化含酯化合物(J)为其对应 的羧酸，然后直接转化为醛。或者，可以先使Z-R3部分的前体化合物官 能化，再在流程1中与1，3-二取代的-8-未取代的黄嘌呤偶联或者在流 程2中与1，3-二取代的-5，6-二氨基尿嘧啶偶联。进而，本发明化合物 可以在固体载体(例如Wang树脂)上制备。
3-[4-(2，6-二氧代-1，3-二丙基-2，3，6，7-四氢-1H-嘌呤-8-基)-二 环[2.2.2]辛-1-基]-丙酸(BG9928)的合成描述在国际专利公报WO 01/34610中。
在一些实施方式中，化合物可以是非手性化合物、旋光活性化合物、 纯的非对映体、非对映体混合物、前体药物或药理学上可接受的盐的形 式。
在一些发明实施方式中，式I化合物表现对A2b腺苷受体的亲和性 比对A2a腺苷受体或A3腺苷受体的亲和性至少大10倍。在其他实施方式 中，式I化合物表现对A2b腺苷受体的亲和性比对A2a腺苷受体或A3腺苷 受体的亲和性至少大50倍。在其他实施方式中，式I化合物表现对A2b 腺苷受体的亲和性比对A2a腺苷受体或A3腺苷受体的亲和性至少大100 倍。在一些实施方式中，除了对A2b腺苷受体的亲和性以外，式I化合 物可选地表现对A1腺苷受体的亲和性。
在一些发明实施方式中，式I化合物对A2b腺苷受体表现低于500nM 的Ki值。在其他发明实施方式中，式I化合物对A2b腺苷受体表现低于 200nM的Ki值。在其他发明实施方式中，式I化合物对A2b腺苷受体表 现低于10nM的Ki值。
A2b腺苷受体抗体的产生
本发明还涵盖抗A2b腺苷受体抗体作为该受体拮抗剂的用途。这类 抗体阻滞A2b腺苷受体上的配体(例如腺苷)结合部位，或者防止配体 (例如腺苷)与该受体结合。
利用本领域普通技术人员熟知的多种技术，A2b腺苷受体可以用于引 发与A2b腺苷受体结合的多克隆或单克隆抗体。或者，可以按照熟知方 法合成相当于A2b腺苷受体特定区域的肽，并用于创造免疫试剂。
人们已经克隆了人A2b腺苷受体，并且已经鉴别了编码该受体的DNA 序列以及该受体的蛋白质序列(Rivkee et al.，Mol.Endocrinol.，6， pp.1598-1604(1992)；Pierce et al.，Biochem.Biophys.Res. Commun.，187，pp.86-93(1992)；Reppert et al.，美国专利 5,516,894)。
针对本发明A2b腺苷受体的抗体是免疫球蛋白分子或其部分，它们 与本发明A2b腺苷受体有免疫反应性。更优选地，用在本发明方法中的 抗体与A2b腺苷受体的配体结合域有免疫反应性。
针对A2b腺苷受体的抗体可以借助适合宿主的免疫接种而生成。这 类抗体可以是多克隆的或单克隆的。优选地，它们是单克隆的。多克隆 和单克隆抗体的产生属于本领域的普通技能。就可用于实施发明的方法 评论而言，例如参见Harlow and Lane(1988)，Antibodies，A Laboratory Manual，Yelton，D.E.et al.(1981)；Ann.Rev.of Biochem.，50，pp.657-80.，和Ausubel et al.(1989)；Current Protocols in Molecular Biology(New York：John Wiley&Sons)， 每年更新。对A2b腺苷受体的免疫反应性测定可以借助本领域熟知的任 意若干方法进行，例如包括免疫印迹测定法和ELISA。
亲和性为10-8M-1或优选10-9至10-1M-1或者更强的单克隆抗体通常是 借助标准工艺制备的，例如Harlow and Lane，(1988)所述，出处同上。 简而言之，选择适当的动物，遵循所需的免疫接种方案。在适当的时间 之后，切除这类动物的脾脏，在适当的选择条件下使单个的脾细胞通常 与无限增殖化骨髓瘤细胞融合。之后，无性系分离细胞，测试每种克隆 体上清液中适当的特异于目的抗原区域的抗体的产生。
其他适合的技术涉及将淋巴细胞体外暴露于抗原性A2b腺苷受体， 或者，在噬菌体或相似载体中选择抗体文库。参见Huse et al.，Science， 246，pp.1275-81(1989)。可用于本发明的抗体在采用时可以经过或 者不经修饰。抗原(在这种情况下是A2b腺苷受体)和抗体可以这样进 行标记，以共价或非共价方式结合一种提供可检测信号的物质。各种标 记和缀合技术是本领域已知的，都可以用于实施本发明。适合的标记包 括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光剂、化学发光剂、磁 性粒子等。教导这类标记用途的专利包括美国专利3,817,837、 3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和 4,366,241。还可以生产重组免疫球蛋白(参见美国专利4,816,567)。
本发明的抗体还可以是一种杂合分子，由来自不同物种(例如小鼠 和人)的免疫球蛋白序列生成或者由来自相同物种的免疫球蛋白轻链与 重链序列部分生成。抗体可以是一种单链抗体或人源化抗体。它可以是 具有多种结合特异性的分子，例如一种双功能抗体，借助本领域技术人 员已知的大量技术制备，包括杂合杂交瘤的产生、二硫化物交换、化学 交联、在两种单克隆抗体之间加入肽连接基团、向特定细胞系引入两套 免疫球蛋白重链与轻链等等。本发明的抗体还可以是人单克隆抗体，例 如由无限增殖化人细胞产生的那些、由SCID-hu小鼠或其他能够产生 “人”抗体的非人类动物产生的那些或者由所克隆的人免疫球蛋白基因 的表达所产生的那些。美国专利5,777,085和5,789,554教导了人源化 抗体的制备。
总之，本领域技术人员根据本发明的教导，获得多种可以用于改变 本发明抗体生物学性质的方法，包括增加或降低给定抗体分子的稳定性 或半衰期、免疫性、毒性、亲和性或收率，或者以任意其他方式改变之， 可以使其更适合于特定应用。
A2b腺苷受体拮抗剂的用途
本发明的方法和组合物可以用于预防、限制或治疗已经经历缺血事 件或者其中缺血事件即将来临的患者。缺血事件例如可以是急性冠脉综 合征(包括心肌梗塞)、中风、器官移植、肾缺血、休克和器官移植手 术。在一些实施方式中，缺血事件是心肌梗塞。
在本发明的一些实施方式中，在缺血事件前后十天内给予A2b腺苷 受体拮抗剂。在本发明的其他实施方式中，在缺血事件前后五天内给予 A2b腺苷受体拮抗剂。在本发明的其他实施方式中，在缺血事件前后两天 内给予A2b腺苷受体拮抗剂。在其他实施方式中，在缺血事件后两天内 给予A2b腺苷受体拮抗剂。
本发明还提供治疗由A2b腺苷受体活化介导的疾病或病症的方法， 该方法对需要的哺乳动物给予药学上有效量或预防上有效量的本发明 A2b腺苷受体拮抗剂。
缺血事件经常导致患病组织的坏死。本发明还提供限制由缺血事件 引起组织坏死的方法，包括确定已经经历缺血事件或者其中缺血事件即 将来临的哺乳动物，再给予治疗上有效量或预防上有效量的本发明A2b 腺苷受体拮抗剂。在一些实施方式中，在缺血事件前后十天内给予A2b 腺苷受体拮抗剂。在其他实施方式中，在缺血事件前后五天内给予A2b 腺苷受体拮抗剂。在其他实施方式中，在缺血事件前后两天内给予A2b 腺苷受体拮抗剂。
心肌梗塞是由氧供应与心肌需求之间的失衡所导致的心肌坏死的 进一步发展，导致心肌坏死。心肌梗塞经常是由冠状血管中血栓形成斑 块破裂所导致的，导致心肌部分血液供应的急剧减少。这可以导致血管 的部分或完全阻塞和随后的心肌缺血。冠状血管完全阻塞若干小时(例 如4-6小时)导致不可逆的心肌坏死。不过，在这一阶段内的再灌注 能够挽救心肌，减少发病和死亡。因此，本发明还提供在心肌梗塞之后 限制梗塞大小的方法，该方法确定已经经历心肌梗塞或者其中心肌梗塞 即将来临的患者，再给予治疗上有效量或预防上有效量的本发明A2b腺 苷受体拮抗剂。在一些实施方式中，在缺血事件前后十天内给予本发明 的A2b腺苷受体拮抗剂。在其他实施方式中，在缺血事件前后五天内给 予A2b腺苷受体拮抗剂。在其他实施方式中，在缺血事件前后两天内给 予A2b腺苷受体拮抗剂。
药物组合物
可以将A2b腺苷受体拮抗剂配制成药物组合物，用于对动物、包括 人类给药。这些药物组合物优选地包括有效治疗、限制或预防缺血再灌 注损伤量的A2b腺苷受体拮抗剂和药学上可接受的载体。
可用于这些药物组合物的药学上可接受的载体例如包括离子交换 剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如人血清白蛋白)、缓 冲物质(例如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸 的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、 磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁)、聚乙烯吡咯烷 酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、 聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
本发明组合物可以肠胃外、口服、吸入喷雾、局部、经直肠、鼻、 颊、阴道或者经由植入药库的方式给药。本文所用的术语“肠胃外”包 括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、损伤 内和颅内注射或输注技术。优选地，组合物经口服、腹膜内或静脉内给 药。
本发明组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬液。这些悬液 可以按照本领域已知的技术加以配制，并使用适合的分散或湿润剂和悬 浮剂。无菌可注射制备物还可以是在无毒性肠胃外可接受的稀释剂或溶 剂中的无菌可注射溶液或悬液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。可以采用 的可接受的载体和溶剂有水、Ringer氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外， 无菌的不挥发油习惯上用作溶剂或悬浮介质。为此，可以采用任意品牌 的不挥发油，包括合成的单-或二-甘油酯。脂肪酸、例如油酸及其甘油 酯衍生物可用于注射剂的制备，它们是天然的药学上可接受的油，例如 橄榄油或蓖麻油，尤其是它们的聚氧乙基化版本。这些油溶液或悬液还 可以含有长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或相似的分散剂， 它们普遍用在药学上可接受的剂型的制剂中，包括乳剂和悬液。出于制 剂的目的，还可以使用其他常用的表面活性剂，例如吐温、司盘和其他 乳化剂或生物利用度增强剂，它们普遍用于制造药学上可接受的固体、 液体或其他剂型。
肠胃外制剂可以是单一的大丸剂、输液或者负载性大丸剂继之以维 持剂量。这些组合物可以每天给药一次或者在“根据需要”的基础上给 药。
本发明的药物组合物可以在任意口服可接受的剂型中口服给药，所 述剂型包括胶囊剂、片剂、水悬液或溶液。在口服片剂的情况下，常用 载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还加入润滑剂，例如硬脂酸镁。对于胶 囊剂形式口服给药，有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当需要 口服水悬液时，使活性成分与乳化剂和悬浮剂混合。如果需要的话，还 可以加入某些甜味剂、矫味剂或着色剂。
或者，本发明的药物组合物可以以直肠给药用栓剂的形式给药。这 些栓剂可以这样制备，将药物与适合的无刺激性赋形剂混合，所述赋形 剂在室温下是固体，但是在直肠温度下是液体，因此将在直肠内熔化， 释放出药物。这类材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
本发明的药物组合物还可以借助鼻用气雾剂或者吸入给药。这类组 合物是按照药物制剂领域熟知的工艺制备的，可以制成在盐水中的溶 液，并采用苯甲醇或其他适合的防腐剂、增强生物利用度的吸收促进剂、 碳氟化合物和/或其他常规的增溶剂或分散剂。
可以与载体材料混合形成单一剂型的A2b腺苷受体拮抗剂量将因所 治疗的宿主和特定给药方式而异。组合物可以这样配制，以便对接受这 些组合物的患者给予剂量在0.01-100mg/kg体重之间的A2b腺苷受体拮 抗剂。在本发明的一些实施方式中，剂量为0.1-10mg/kg体重。组合 物可以作为单剂量、多剂量或者历经既定时间输注给药。
用于任意特定患者的具体剂量和治疗方案将依赖于多种因素，包括 特定的A2b腺苷受体拮抗剂、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别 与饮食、给药的时间、排泄的速率、药物组合和所治疗特定疾病的严重 性。医护人员对这类因素的判断属于本领域的普通技能。拮抗剂的量还 将依赖于所治疗的个体患者、给药的途径、制剂的类型、所用化合物的 特征、疾病的严重性和所需效果。拮抗剂的量可以取决于本领域熟知的 药理学与药动学原理。
按照一些实施方式，本发明提供预防、限制或治疗缺血再灌注损伤 的方法，包含对患者给予上述药物组合物之一的步骤。
为了更充分地理解本文所述发明，提供下列实施例。应当认为，这 些实施例仅供例证，不被解释为以任何方式限制本发明。
实施例
1、动物模型和一般工艺
研究是在开胸的、巴比妥麻醉的犬中进行的，仪器测量心率、血压、 左心室压和区域性心肌血流(放射性微球)。将机械咬合器置于左前下 行冠状动脉近侧附近，形成缺血和再灌注。在实验结束时，通过组织化 学染色测定梗塞大小(专利蓝染剂和三苯基四唑鎓)，以危险区域的百 分比或全部左心室的百分比表示。
2、预处理实验方案
在预处理方案(见图1，方案I)中，对犬进行60分钟冠状动脉闭 合和3小时再灌注，然后取出心脏，评估梗塞大小。将四组犬随机分配 接受载体、CPX(8-环戊基-1，3-二丙基-3，7-二氢-嘌呤-2，6-二酮)、 BG9719(8-(2S-5，6-外-环氧-内-降冰片-2-基)-1，3-二丙基-3，7-二氢- 嘌呤-2，6-二酮)或BG9928(3-[4-(2，6-二氧代-1，3-二丙基-2，3，6，7- 四氢-1H-嘌呤-8-基)-二环[2.2.2]辛-1-基]-丙酸)，开始于闭合之前 10分钟。按照1mg/kg剂量i.v.给予全部拮抗剂大丸剂，继之以按 10μg/kg/min输注，持续至再灌注前不久(总计70分钟)。
在四组之间，全身血液动力学(心率和血压)、最大左心室dP/dt 或区域性心肌血流没有显著性差异(见表1、4和5)，证明了血液动力 学变量不受拮抗剂的影响。左心室在冠脉闭合期间受到缺血的比例(危 险区大小；图1A)也没有差异。不过，以危险区百分比表示(图1B) 或者以左心室百分比表示(图1C)的梗塞大小在用CPX(减少51％)或 BG9928(减少49％)处理的两组犬中显著较小。BG9928处理组犬的梗塞 大小与对照组相似。当将以危险区百分比表示的梗塞大小对透壁旁系血 流作图时(图1D)，借助线性回归分析可以得出明显的反比关系。在 CPX处理组和BG9928处理组中，这种关系与对照组相比向下移动，表明 梗塞大小在这两组中在任意给定程度的旁系血流下都较小。梗塞大小与 旁系血流之间的关系在对照组与BG9719处理组之间是相似的。因而， 在闭合之前用CPX或BG9928处理(但不是用BG9719处理)导致梗塞大 小有显著减少，所述减少不涉及全身血液动力学或区域性旁系血流的变 化。
表1
方案I(预处理)的血液动力学变量 基线   occ30′ occ60′ rep1hr   rep2hr   rep3hr 载体 HR(心跳数/min) MBP(mmHg) LVdP/dt(mmHg/sec) CPX HR MBP LVdP/dt BG9719 HR MBP LVdP/dt BG9928 HR MBP LVdP/dt   155±3 107±5 1663±89    150±2 90±4 1650±106    155±2 104±6 1838±141    152±2 87±6 1518±154     153±2   105±5   1650±121      153±4   94±7   1481±146      161±4   109±5   1931±125      150±2   92±5   1631±115   154±3 102±5 1813±119    152±4 98±8 1631±92    159±4 103±5 1819±205    151±4 95±5 1650±136   154±3 104±5 1650±76    150±5 97±5 1506±77    157±5 106±3 1706±102    153±4 87±3 1463±62     152±2   110±6   1538±87      153±5   102±6   1538±74      160±4   114±4   1781±125      153±4   97±5   1463±141     152±5   109±6   1513±75      151±5   105±6   1538±135      161±4   112±5   1725±113      154±4   99±4   1463±84
HR：心率；MBP：平均动脉血压；LVdP/dt：最大左心室dP/dt
3、预调节实验方案
在预调节方案(见图2，方案II)中，对全部犬进行60分钟冠状 动脉闭合继之以三小时再灌注。在60-分钟闭合之前10分钟进行四个 5-分钟闭合/5-分钟再灌注循环，引发预调节。将四组犬随机分配接受 载体、CPX、BG9719或BG9928，开始于第一次预调节性闭合之前10分 钟。按照1mg/kg剂量i.v.给予拮抗剂，继之以按10μg/kg/min输注， 持续至长期闭合的解除(总计115分钟)。
与处理组相似，在预调节方案中的四组之间，全身血液动力学、区 域性心肌血流或危险区大小没有显著差异(见表2、4和5，图2A)。 在60-分钟闭合之前用四个5-分钟闭合/5-分钟再灌注周期预调节，与 来自方案I的非预调节对照组相比明显减少梗塞大小(减少-65％)(图 2B和2C)。腺苷受体拮抗剂处理组中犬的平均梗塞大小(以危险区或 左心室的百分比表示)也显著小于非预处理对照组，并且相似于或者略 小于预调节对照组(图2B和2C)。与非预调节对照组相比，预调节使 梗塞大小与旁系血流之间的关系向下偏移(图2D)。这种关系在CPX 或BG9928处理组而非BG9719处理组中进一步向下偏移。这些结果证明， 用CPX、BG9719或BG9928处理不会阻滞由多个闭合/再灌注循环引发的 缺血预调节的保护作用。这些结果也提示，用CPX或BG9928(而非 BG9719)处理增加缺血预调节的保护作用。
表2
方案II(预调节)的血液动力学变量 基线   occ30′ occ60′   rep1hr    rep2hr     rep3hr 载体 HR(心跳数/min) MBP(mmHg) LVdP/dt(mmHg/sec) CPX HR MBP LVdP/dt BG9719 HR MBP LVdP/dt BG9928 HR MBP LVdP/dt   155±4 103±6 1606±196    151±1 87±6 1369±140    156±3 105±7 1693±121    149±1 86±2 1300±50     153±4   101±6   1625±142      150±3   88±4   1294±130      152±4   103±5   1671±111      149±2   84±3   1400±74   152±4 104±6 1550±124    148±3 96±8 1388±113    152±5 103±5 1736±130    150±1 84±3 1375±72       144±3     107±6     1394±94        150±5     91±5     1181±82        155±7     97±6     1500±164        149±1     80±5     1100±50      144±3    108±4    1356±75       151±4    100±5    1256±89       156±6    99±6    1457±153       148±1    87±5    1125±64       146±2     106±5     1281±60        152±4     100±6     1313±105        156±6     101±5     1479±155        148±1     86±3     1175±72
HR：心率；MBP：平均动脉血压；最大LVdP/dt，左心室dP/dt
4、再灌注实验方案
在再灌注方案(见图3，方案III)中，对犬进行60分钟冠状动脉 闭合继之以三小时再灌注。将四组犬随机分配接受载体、CPX、BG9719 或BG9928，开始于闭合的解除之前10分钟。按照1mg/kg剂量i.v.给 予拮抗剂大丸剂，继之以按10μg/kg/min输注一小时。
在本实验方案中的四组犬之间，血液动力学变量、区域性心肌血流 或危险区大小没有显著差异(见表3-5和图3A)。在再灌注早期给予 CPX或BG9928显著减少以危险区百分比表示的梗塞大小(图3B)。不 过，BG9719给药没有保护作用。与对照组相比，用CPX或BG9928处理 的两组犬中梗塞大小与旁系血流之间的关系向下偏移(图3C)。当在缺 血之前给药时，本方案中由CPX和BG9928产生的梗塞大小减少幅度(分 别为42％和44％)小于方案I，当数据以全部左心室的百分比表示时没有 观察到梗塞大小有显著的减少(图3D)，这也许是因为所研究的动物数 量少。这些数据证明，CPX和BG9928(而非BG9719)当在再灌注时给 药时减少梗塞大小。
表3
方案III(再灌注)的血液动力学变量   基线     occ30′     occ60′    rep1hr   rep2hr     rep3hr 载体 HR(心跳数/min) MBP(mmHg) LVdP/dt(mmHg/sec) CPX HR MBP LVdP/dt BG9719 HR MBP LVdP/dt BG9928 HR MBP LVdP/dt     155±3   107±5   1663±89      150±2   102±4   1556±85      150±3   102±5   1519±125      151±1   90±6   1594±106       153±2     105±5     1650±121        149±1     99±7     1531±159        154±3     95±7     1400±149        151±3     90±5     1638±132       154±3     102±5     1813±119        151±1     105±6     1688±105        153±4     101±5     1569±165        150±2     96±4     1744±69      154±3    104±5    1650±76       152±3    108±5    1688±97       154±5    101±3    1500±102       147±2    88±5    1406±49     152±2   110±6   1538±87      151±4   112±4   1650±57      155±6   103±3   1425±85      148±2   92±5   1463±74       152±5     109±6     1513±75        156±4     114±4     1631±72        151±4     97±5     1350±90        150±3     95±4     1463±79
HR：心率；MBP：平均动脉血压；最大LVdP/dt，左心室dP/dt
表4
非缺血区(被左旋绕冠状动脉灌注的区域)中方案I、II和III的 区域性心肌血流数据(ml/min/gm)               方案I                 方案II                方案III 载体  occ30  rep3hr     occ30     rep3hr     occ30   rep3hr epi mid endo 透壁 CPX epi mid endo 透壁 B9719 epi mid endo 透壁 BG9928 epi mid endo 透壁  0.65±0.06  0.75±0.09  0.76±0.09  0.72±0.07     0.60±0.08  0.66±0.08  0.54±0.04  0.60±0.06     0.70±0.08  0.77±0.06  0.77±0.08  0.75±0.07     0.87±0.08  0.80±0.07  0.80±0.11  0.82±0.06  0.53±0.05  0.60±0.05  0.69±0.09  0.61±0.05     0.66±0.07  0.64±0.07  0.61±0.06  0.64±0.06     0.64±0.09  0.64±0.07  0.67±0.08  0.65±0.08     0.73±0.07  0.71±0.07  0.79±0.06  0.74±0.06     0.66±0.06     0.62±0.07     0.61±0.10     0.63±0.07        0.97±0.20     0.78±0.12     0.73±0.22     0.83±0.20        0.91±0.22     0.92±0.14     0.86±0.16     0.90±0.13        0.48±0.14     0.49±0.14     0.51±0.12     0.49±0.13     0.69±0.10     0.57±0.09     0.59±0.11     0.62±0.05        0.85±0.12     0.76±0.12     0.81±0.15     0.81±0.13        0.83±0.13     0.87±0.11     0.88±0.20     0.86±0.12        0.45±0.06     0.47±0.12     0.56±0.14     0.50±0.13     0.65±0.06     0.75±0.09     0.76±0.09     0.72±0.07        0.69±0.05     0.67±0.07     0.71±0.07     0.69±0.06        0.60±0.08     0.66±0.06     063±0.06     0.63±0.05        0.83±0.07     0.87±0.06     0.85±0.06     0.85±0.05   0.53±0.05   0.60±0.05   0.69±0.09   0.61±0.05      0.96±0.12   0.94±0.12   1.02±0.12   0.97±0.11      0.46±0.03   0.50±0.02   0.59±0.06   0.52±0.03      0.84±0.10   0.89±0.08   0.88±0.08   0.87±0.08
epi：心外膜；mid：心肌中层；endo：心内膜；trans：透壁
表5
缺血再灌注区(被左前下行冠状动脉灌注的区域)中方案I、II和 III的区域性心肌血流数据(ml/min/gm)               方案I                 方案II            方案III  occ30     rep3hr     occ30     rep3hr occ30   rep3hr 载体 epi mid endo 透壁 CPX epi mid endo 透壁 B9719 epi mid endo 透壁 BG9928 epi mid endo 透壁    0.08±0.01  0.06±0.01  0.05±0.01  0.06±0.01     0.15±0.04  0.08±0.02  0.05±0.01  0.09±0.02     0.11±0.03  0.06±0.02  0.05±0.01  0.09±0.02     0.14±0.05  0.09±0.03  0.05±0.01  0.09±0.03       0.47±0.10     0.50±0.08     1.01±0.16     0.66±0.10        0.48±0.06     0.49±0.04     0.90±0.16     0.62±0.06        0.44±0.10     0.31±0.04     0.77±0.19     0.51±0.10        0.48±0.11     0.39±0.05     0.73±0.12     0.54±0.06       0.10±0.04     0.06±0.02     0.07±0.02     0.08±0.02        0.07±0.03     0.05±0.01     0.04±0.01     0.06±0.02        0.14±0.04     0.08±0.02     0.06±0.01     0.09±0.02        0.12±0.04     0.06±0.01     0.03±0.01     0.07±0.01       0.48±0.12     0.35±0.04     1.06±0.13     0.63±0.04        0.62±0.12     0.54±0.11     0.68±0.12     0.61±0.10        0.63±0.12     0.43±0.04     0.64±0.10     0.56±0.10        0.45±0.13     0.31±0.10     0.72±0.30     0.49±0.14   0.08±0.01 0.06±0.01 0.05±0.01 0.06±0.01    0.10±0.01 0.07±0.01 0.04±0.01 0.07±0.01    0.10±0.03 0.07±0.03 0.04±0.01 0.09±0.03    0.10±0.02 0.08±0.02 0.05±0.01 0.08±0.02     0.47±0.10   0.50±0.08   1.01±0.16   0.66±0.10      0.50±0.04   0.40±0.04   0.93±0.15   0.61±0.05      0.31±0.04   0.33±0.05   0.72±0.13   0.45±0.06      0.66±0.12   0.67±0.15   1.20±0.15   0.84±0.12
epi：心外膜；mid：心肌中层；endo：心内膜；trans：透壁
表6
利用放射性配体结合分析法测定的重组犬A1、A2a与A3腺苷受体拮 抗剂的离解常数   化合物     A1     A2a     A3   CPX   BG9719   BG9928     18.1±4.4     35.8±4.0     28.9±4.1     162±22     2,820±268     4,307±1,230     1,960±420     19,070±540     37,670±9,030
分别使用3H-CPX、3H-ZM241385和3R-PIA作为A1、A2a和A3受体的放 射性配体，从转染的HEK 293的细胞膜的竞争结合实验得到Ki值(nM± SEM；n＝3)
5、膜的准备
表达人A2b腺苷受体的HEK 293(人胚胎肾)细胞膜是从Receptor Biology购买的；表达人A2a受体的HEK 293细胞膜是从Perkin Elmer (Boston，MA)购买的；表达人A1受体的CHO-K1细胞膜和表达人A3受体 的HEK 293细胞膜是从既定的相应稳定转染细胞制备的。
6、放射性配体结合测定法
将膜(40-70μg膜蛋白)、放射性配体和不同浓度的竞争性配体 在0.1mL缓冲液HE加2单位/mL腺苷脱氨基酶中、在21℃下培育2.5 小时，一式三份。用于竞争结合测定法的放射性配体是：用于A1和A2b 腺苷受体的[3H]-8-环戊基-1，3-二丙基黄嘌呤([3H]-DPCPX)(NEN， Boston，MA)、用于A2a腺苷受体的[3H]-4-(2-[7-氨基-2-(呋喃 基)(1，2，4)三唑(2，3-a)(1，3，5)三嗪-5-基氨基乙基)苯酚 ([3H]-ZM241385)(Tocris，Bristol，UK)和用于A3腺苷受体的[125碘]- 标记的N6-(4-氨基苄基)-9-(5-(甲基羰基)-β-D-呋喃核糖基)腺嘌呤 ([125I]-AB-MECA)或[3H]-R-N6-苯基异丙基腺苷([3H]-R-PIA)(都来自 NEN，Boston，MA)。就A1和A2b受体而言，在10μM 5’N-乙基甲酰胺腺 苷(NECA，来自RBI-Sigma，Natick，MA)的存在下测量非特异性结合， 或者就A2a受体而言，在10μM黄嘌呤氨基同类物(XAC，来自RBI-Sigma， Natick，MA)的存在下测量非特异性结合。利用BRANDEL细胞收获器 (Gaithersburg，MD)通过Whatman GF/C玻璃纤维滤器过滤，终止结合 测定。将滤器用3-4mL冰冷的10mM Tris-HCl，pH 7.4和5mM氯化镁 (MgCl2)在4℃下冲洗三次，在Wallac β-计数器(Perkin Elmer，Boston， MA)中计数。
表7
10μM拮抗剂在放射性配体竞争结合测定法中的抑制KI值(nM)或百 分比(％)   种类 10μM拮抗剂在放射性配体竞争结合测定法中的抑制KI值(nM)或百分比(％)                               腺苷受体     A1     A2a     A2b     A3   BG9928     12.2     4059     88.53±21.03a     30％b   DPCPX     5.3     156c     56     262   BG9719     10.3     9152     853±270a     40.6％
ND：未进行
a：N＝3
b：10μM BG9928的抑制百分比
c：参见J.Linden，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.，41，pp. 775-787(2001)
在以重组人A1腺苷受体和[3H]-DPCPX为放射性配体的竞争结合测 定法中，BG9928、DPCPX和BG9717的KI值分别为12.2nM、5.3nM和10.3nM (见表7，图4)。在以重组人A2a腺苷受体和[3H]-ZM241385为放射性 配体的竞争结合测定法中，BG9928、DPCPX和BG9717的KI值分别为 4059nM、156nM和9152nM(见表7，图5)。在以重组人A2b腺苷受体和 [3H]-ZM241385为放射性配体的竞争结合测定法中，BG9928、DPCPX和 BG9717的KI值分别为88.53±21.03nM(N＝3)、56nM和853±270nM (N＝3)(见表7，图6)。
进行单点结合测定法，以测定10μM BG9928对[125I]-AB-MECA与重 组人A3腺苷受体膜结合的影响。在重组人A3腺苷受体的单点结合测定 法中，10μM BG9928抑制30％的[3H]-ZM241385结合(图7)。
7、放射性配体结合测定法
将膜(50μg膜蛋白)、放射性配体和不同浓度竞争性配体在0.1mL 缓冲液HE加2单位/mL腺苷脱氨基酶中、在21℃下培育2小时，一式 三份。用于竞争结合测定法的放射性配体是：用于人A2b腺苷受体的 [3H]-8-环戊基-1，3-二丙基黄嘌呤([3H]-DPCPX，30-40nM)(NEN， Boston，MA)。在10μM 5’N-乙基甲酰胺腺苷(NECA，来自RBI-Sigma， Natick，MA)的存在下测量非特异性结合。利用BRANDEL细胞收获器 (Gaithersburg，MD)通过Whatman GF/C玻璃纤维滤器过滤，终止结合 测定。将滤器用3-4mL冰冷的10mM Tris-HCl，pH 7.4和5mM氯化镁 (MgCl2)在4℃下冲洗三次，在Wallac β-计数器(Perkin Elmer，Boston， MA)中计数。
将竞争结合数据带入单部位结合模型，并利用Prizm GraphPad作 图。利用Cheng-Prusoff方程KI＝IC50/(1+[I]/KD)从IC50值计算KI值， 其中KI是对竞争性配体的亲和性常数，[I]是游离放射性配体的浓度， 且KD是对放射性配体的亲和性常数(Cheng和Prusoff 1973)。表8提供 了若干本发明化合物的KI值。
表8
放射性配体竞争结合测定法中的KI(nM)




8、荧光成像平板读数(FLIPR)功能测定法
利用HEK 293细胞和CHO-K1细胞进行用于钙测定的荧光成像平板 读数(FLIPR)测定法，所述HEK 293细胞表现稳定的人与大鼠A2b腺苷受 体表达，所述CHO-K1细胞表现稳定的重组人A1腺苷受体表达。将细胞 接种在带有黑壁和透明底的96-孔组织培养平板中，培养至单层汇合率 为80-90％。不除去培养基，加入等体积染剂(购自Molecular Devices 的钙测定试剂盒)。将细胞平板在37℃下培育1小时，然后转移至FLIPR 单元(Molecular Devices)。
就重组人A1腺苷受体的测定而言，将CHO-K1细胞用递增剂量的激 动剂(N6-环戊基腺苷，CPA)培育，以测定激动剂产生50％最大响应的浓 度。然后将这种浓度的激动剂(200nM CPA)用递增浓度(10-12M至10-5M) 的拮抗剂BG9928培育。就重组人与大鼠A2b腺苷受体的测定而言，将HEK 293细胞用递增剂量的激动剂(5’N-乙基甲酰胺腺苷，NECA)培育，以 测定激动剂产生50％最大响应的浓度。然后将这种浓度的激动剂(就人 A2b受体而言是5μM NECA)或递增浓度(就人A2b受体而言是10-12M至5× 10-6M，就大鼠A2b受体而言是10,1100或300nM)的拮抗剂BG9928培育。
FLIPR整合有氩激光激发光源、96-孔吸移器和采用CCD(带电偶联 装置)成像照相机的检测系统。分别在488和520nm的激发和发射波长 下同时监测来自96-孔的荧光发射。在向96-孔平板同时迅速加入化合 物前后按1秒间隔收集荧光数据。结果为相对荧光单位(RFU)。
使用在CHO-K1细胞中稳定表达的重组人A1腺苷受体进行BG9928 的FLIPR功能测定。利用零点法，BG9928和BG9719对重组人A1腺苷受 体的拮抗剂离解常数(KB)分别为0.60nM和0.46nM(见表9和图8)。
使用在HEK 293细胞中稳定表达的重组人A2b腺苷受体进行BG9928 的FLIPR功能测定。利用零点法，BG9928、BG9719和DPCPX对重组人 A2b腺苷受体的拮抗剂KB分别为3.36nM、182nM和23.6nM(见表9和图 9)。
使用在HEK 293细胞中稳定表达的重组大鼠A2b腺苷受体进行 BG9928的FLIPR功能测定。利用零点法，BG9928的拮抗剂KB为257nM， 利用Schild分析，pA2为6.59(见表9和图10)。
表9
拮抗剂在FLIPR功能测定法中的KB值(nM)总结(人受体亚型)     种类 拮抗剂在FLIPR功能测定法中的KB(nM)                    腺苷受体     A1     A2a     A2b     A3     BG9928     0.60     ND     3.36     ND     BG9719     0.46     ND     182     ND     DPCPX     ND     ND     23.6     ND
ND：未进行
9、数据分析
数据以平均值±平均值的平均标准误差(SEM)或标准偏差(SD)表示。 利用Marquafdt氏非线性最小平方法分析饱和数据，利用Prizm GraphPad作图。将竞争结合数据带入单位点结合模型，利用Prizm GraphPad作图。利用Cheng-Prusoff方程KI＝IC50/(1+[I]/KD)从IC50 值计算KI值，其中KI是对竞争性配体的亲和性常数，[I]是游离放射性 配体的浓度，而KD是对放射性配体的亲和性常数(Cheng和Prusoff 1973)。
在FLIPR功能测定法中，利用Prizm GraphPad中的非线性回归程 序，将激动剂浓度-响应曲线带入逻辑方程。利用由Lazareno和Roberts (1987)开发的零点法估计拮抗剂离解常数(KB)。进行Schild分析，以 估计化合物作为拮抗剂的效力(pA2)。pA2是拮抗剂能够在浓度-响应曲线 中产生2-倍偏移的浓度的负对数，其中该响应被定义为最大响应的50％。