局部缺血/再灌注损伤专利检索-再灌注疗法专利检索查询-专利查询网

局部缺血/再灌注损伤

阅读：193发布：2020-05-11

专利汇可以提供局部缺血/再灌注损伤专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提出使用增加局部缺血组织中BAG3 水平的组合物来治疗局部缺血/ 再灌注损伤的方法和组合物。还提出使用该组合物减少局部缺血/再灌注损伤风险的方法。，下面是局部缺血/再灌注损伤专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种治疗受试者体内局部缺血/再灌注损伤的方法，所述方法包含给药治疗有效量的增加局部缺血组织内BAG3水平的药物组合物。
2.如权利要求1所述的方法，进一步包含鉴别具有局部缺血/再灌注损伤的受试者的步骤。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述局部缺血/再灌注损伤是心肌梗死、动脉粥样硬化、周围血管病症、肺栓塞、静脉血栓形成、短暂性脑缺血发作、不稳定性心绞痛、脑血管局部缺血、中风、局部缺血性神经障碍、局部缺血性肾病、血管炎、移植术、动脉内膜切除术、动脉瘤修复手术、炎性病症或创伤性损伤的结果。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述局部缺血/再灌注损伤出现于心脏、脑、骨骼肌、血管、肾脏或肝脏组织。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述药物组合物包含编码BAG3多肽或其片段的核酸、BAG3多肽或其片段、或蛋白酶体抑制剂。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述蛋白酶体抑制剂是硼替佐米。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述组合物在再灌注过程中给药。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述组合物在再灌注后给药。
9.如权利要求1所述的方法，其中，所述组合物经静脉给药。
10.如权利要求1所述的方法，进一步包含给药另一种治疗剂。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述治疗剂包含抗炎剂、血管舒张剂、β阻滞剂、胆固醇减少剂、钙通道阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂或抗凝剂。
12.一种治疗处于局部缺血/再灌注损伤风险下的受试者的方法，所述方法包含给药治疗有效量的增加BAG3水平的药物组合物。
13.如权利要求12所述的方法，进一步包含鉴别处于局部缺血/再灌注损伤风险下的受试者的步骤。
14.如权利要求12所述的方法，其中，所述受试者预定进行血管介入治疗过程。
15.如权利要求12所述的方法，其中，所述血管介入治疗过程包含使用导管或支架的过程。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述过程包含使用血管成形术导管、激光导管、斑块旋切术导管、血管内视镜装置、β-或γ-辐射导管、血管内超声装置、旋磨术装置、放射性气球、可加热的线、可加热的气球、生物可降解支架支柱或生物可降解套筒的过程。
17.如权利要求12所述的方法，其中，所述局部缺血/再灌注损伤是心肌梗死、动脉粥样硬化、周围血管病症、肺栓塞、静脉血栓形成、短暂性脑缺血发作、不稳定性心绞痛、脑血管局部缺血、中风、局部缺血性神经障碍、局部缺血性肾病、血管炎、移植术、动脉内膜切除术、动脉瘤修复手术、炎性病症或创伤性损伤的结果。
18.如权利要求12所述的方法，其中，所述局部缺血/再灌注损伤出现于心脏、脑、骨骼肌、血管、肾脏或肝脏组织。
19.如权利要求12所述的方法，其中，所述药物组合物包含编码BAG3多肽或其片段的核酸、BAG3多肽或其片段、或蛋白酶体抑制剂。
20.如权利要求12所述的方法，其中，所述蛋白酶体抑制剂是硼替佐米。
21.如权利要求12所述的方法，其中，所述组合物在再灌注前给药。
22.如权利要求12所述的方法，其中，所述组合物在再灌注过程中给药。
23.如权利要求12所述的方法，其中，所述组合物在再灌注后给药。
24.如权利要求12所述的方法，其中，所述组合物经静脉给药。
25.如权利要求12所述的方法，进一步包含给药另一种治疗剂。
26.如权利要求25所述的方法，其中，所述治疗剂包含抗炎剂、血管舒张剂、β阻滞剂、胆固醇减少剂、钙通道阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂或抗凝剂。

说明书全文

局部缺血/再灌注损伤

[0001] 联邦资助研究的声明

[0002] 本发明在美国国立卫生研究院的政府资助下完成，补助款号为P01 HL 091799-01和RO1 HL 123093。美国政府享有本发明的某些权利。

技术领域

[0003] 本发明涉及治疗和预防局部缺血/再灌注损伤的方法和组合物。该组合物可包括增加Bcl2相关的永生基因3(BAG3)水平的药剂，且可给药至苦于局部缺血/再灌注损伤的受试者或处于局部缺血/再灌注损伤风险下的受试者。

背景技术

[0004] 局部缺血通常指的是，供给至器官或组织的血液受限。依据特定的组织，血液供给的下降可能导致细胞死亡和组织损害。自相矛盾的是，血液供给的恢复，也称为再灌注，可能对已经损害的组织造成其它损害。局部缺血/再灌注损伤与包括心肌梗死、中风和周围血管疾病在内的错中病症有关。局部缺血/再灌注损伤也可在外科手术过程中和等待从供体移植的器官内出现。与局部缺血/再灌注损伤相关的死亡率和发病率居高不下。例如，仅在美国，每年有超过735,000人经历心脏病发作，即心肌梗死。局部缺血性心脏病是全世界范围内人类种群死亡的主要肇因，2012年有大约7,400万人死于该疾病。中风是世界范围内死亡的第二大肇因，2012年有大约6,700万人死于该疾病。尽管已经成功地尝试限制罹患急性心肌梗死的患者的冠状动脉堵塞发作与冠状动脉介入治疗之间的时间，但由于再灌注损伤造成的心肌损害仍然是多种药理学途径无法产生作用的主要临床问题。对于治疗和预防局部缺血/再灌注损伤的新途径存在持续需求。

发明内容

[0005] 本文提供涉及治疗局部缺血/再灌注损伤的方法和组合物。该方法可包括向受试者给药治疗有效量的增加局部缺血组织内BAG3水平的药物组合物。一些具体实施例中，局部缺血/再灌注损伤是心肌梗死、中风或周围血管疾病的结果。该组合物可包括编码BAG3多肽或其片段的核酸、BAG3多肽或其片段、或蛋白酶体抑制剂。一些具体实施例中，该组合物在再灌注过程中给药。还提供治疗处于局部缺血/再灌注损伤风险下的受试者的方法和组合物。一些具体实施例中，该受试者可预订进行血管介入治疗过程。该方法可包括向受试者给药治疗有效量的增加局部缺血组织内BAG3水平的药物组合物的方法。一些具体实施例中，该组合物在再灌注前给药。附图说明

[0006] 本发明的这些和其它特征和优点将更完全地揭露于下述本发明具体具体实施例的详细说明书中或通过该详细说明书而明晰，该详细说明书应与附图一并考虑，其中，类似的数字指代类似部件，以及：

[0007] 图1显示缺氧/复氧作用(I/R)降低新生心肌细胞内的BAG3水平。将新生小鼠心室心肌细胞(NMVC)在缺氧条件(5％CO2和95％氮气，3L/分钟)下及葡萄糖缺失下于37℃培养14小时，随后使用5％CO2和95％湿润空气以及含有葡萄糖的孵化介质对该细胞复氧4小时。
随后收获心肌细胞，对该细胞裂解液进行免疫印迹以测定BAG3、被裂解的半胱天冬酶
(caspase)-3、Bcl-2和LAMP2的水平。使用β-肌动蛋白作为蛋白质印迹上负载蛋白量的对照。每一实验重复进行三次独立实验，且每次实验中，n＝3。数据表示为均值±SEM。使用具有Bonferroni多重比较调整的双因素方差分析(two-way ANOVA)来评估各调查组之间的差异。图1A显示一次实验的代表性免疫印迹。图1B显示，说明对I/R后BAG3的水平进行蛋白质印迹定量的图。图1C显示，说明对I/R后Bcl2的水平进行蛋白质印迹定量的图。图1D显示，说明对I/R后被裂解的半胱天冬酶-3的水平进行蛋白质印迹定量的图。图1E显示，说明对I/R后溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)的水平进行蛋白质印迹定量的图。图1F显示代表性的蛋白质印迹，表明通过以腺病毒转染的siRNA

[0008] (Ad-siBAG3)进行BAG3敲除，导致了BAG3水平显著降低、Bcl2和LAMP-2降低、以及被裂解的半胱天冬酶-3增加。在培养中，以Ad-siBAG3或Ad-GFP(对照)将新生小鼠心肌细胞感染3天，之后收获细胞，并使用特定抗体进行免疫印迹。每次实验均重复三次，且每次独立实验中，n＝3。评估β-肌动蛋白的水平，将其用作蛋白质水平的对照。数据表示为均值±SEM。图1G显示说明蛋白质印迹定量的图，该图显示BAG3水平下降。图1H显示说明蛋白质印迹定量的图，该图显示Bcl2水平下降。图1I显示说明蛋白质印迹定量的图，该图显示被裂解的半胱天冬酶-3水平增加。图1J显示说明蛋白质印迹定量的图，该图显示LAMP-2水平下降。

[0009] 图2显示，BAG3的过度表达减轻了信使小时心室心肌细胞(NMVC)内与缺氧/复氧作用相关的细胞凋亡和自体吞噬标记物的变化，并阻滞自体吞噬：NMVC以Ad-BAG3或Adv-GFP感染3天。随后，将该NMVC在37℃缺氧条件(5％CO2和95％氮气，3L/分钟)下暴露14小时，之后使用5％CO2和95％湿润空气复氧4小时或在含氧量正常的条件(5％CO2和95％湿润空气)下培养。随后收获细胞并进行免疫印迹。每一实验包括各实验组中n＝3，并重复三个独立实验。图2A显示来自三次独立实验之一的代表性蛋白质印迹，表明在正常量的O2和CO2下细胞内的细胞内，BAG3的过度表达导致BAG3水平增加(在图2B中说明)，但p-JNK(在图2C中说明)、LAMP-2(在图2D中说明)、Bcl2(在图2E中说明)、或被裂解的半胱天冬酶-3(在图2F中说明)水平的变化不显著。相比之下，由Ad-BAG3造成的BAG3过度表达，令BAG3(在图2B中说明)、p-JNK(在图2C中说明)、LAMP-2(在图2D中说明)、Bcl2(在图2E中说明)、以及被裂解的半胱天冬酶-3(在图2F中说明)的水平朝着以Ad-BAG3或Ad-GFP在正常含氧量条件下处理的NMVC内所见的水平显著改变。

[0010] 图3显示，自体吞噬的水平在缺氧/复氧和BAG3敲除过程中被削弱，但由于BAG3的过度表达而被增加：自体吞噬并非静态的进程，反而代表吞噬体至自噬体以及随后转变为自噬溶酶体的持续转变。因此，为了确定自体吞噬是否与心脏中BAG3水平的改变相应地增加或减少，以由双标记的mRFP-GFP-LC3-I构成的自体吞噬报告系统转染NMVC。RFP(红色荧光)和GFP(绿色荧光)在自噬体中均可作为黄色斑块而得以辨认，然而，当自噬体与溶酶体融合时，自溶酶体的酸性淬灭该GFP荧光，导致占主导地位的红色斑块。图3A显示共聚焦图像，该些图像中，黄色荧光在已经进行H/R或已经使用siBAG3感染的NMVC中更为突出。相比之下，RFP 信号在以Ad-BAG3处理的细胞内更为突出，表明合并入自溶酶体的LC3的增加与自噬体水平的增加相一致。图3B是说明对图3A中图像进行定量分析的图。对该些共聚焦图像的主观评估，通过计数各组(对照组、H/R组、siBAG3组和H/R+Ad-BAG3组)中黄色和红色斑块的数目而得以确认。图3C是为了测定自噬体的量而比较自溶酶体(红色斑块)/自噬体(黄色斑块)/总斑块的比的图。图3C显示，该比在H/R后显著减小，这一变化是通过Ad-BAG3造成的BAG3过度表达而减弱该比而导致的，鉴于BAG3过度表达恢复自体吞噬的水平，这变化表明H/R和BAG3水平下降均阻滞自体吞噬。

[0011] 图4显示，在通过缺氧/复氧作用(I/R)降低BAG3水平或通过感染Ad-siBAG3而敲除BAG3后，BAG3的位置改变为新生小鼠心室心肌细胞(NMVC)的细胞核内。图4A显示或进行H/R或通过Ad-siBAG3进行BAG3敲除的NMVC的代表性共聚焦图像。将NMVC在正常条件下(CTRL)、缺氧条件下(5％CO2和95％氮气，3L/分钟)于37℃培养14小时，之后使用5％CO2和95％湿润空气复氧4小时。(HR)或是以Ad-siBAG3感染。随后固定心肌细胞，并使用BAG3抗体、α-辅肌动蛋白抗体或原子核复染剂4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。从每一重复三次的实验中计数最少10个细胞。图4B显示，缺氧/复氧作用(I/R)下或通过感染Ad-siBAG3而进行敲除后，细胞溶质部分和细胞核部分的BAG3水平的免疫印迹分析。使用Ad-siBAG3或Ad-GFP将NMVC感染过夜，改变培养基，并将该细胞在正常条件下孵化3天时间。随后将细胞随机分配，以在缺氧条件(5％CO2和95％氮气，3L/分钟)下于37℃培养14，随后使用5％CO2和95％湿润空气复氧4小时；或在正常含氧量条件下培养。随后收获心室肌细胞，并使用细胞的逐步裂解以及细胞核蛋白部分与细胞质蛋白部分的离心分离而分为细胞质部分和细胞核部分。蛋白质部分通过SDS-Page分离，并转移至膜上。随后使用BAG3抗体、β-微管蛋白抗体或组蛋白抗体对它们进行免疫印迹。图4C显示的图说明，将细胞暴露于Ad-GFP或Ad-BAG3并随后暴露于缺氧-复氧条件或正常含氧量条件后，对评价该细胞的细胞核提取物或细胞质提取物中BAG3水平的三次独立实验的定量分析。数据表达为均值±SEM，并使用双因素ANOVA进行分析，之后通过Bonferroni修正进行多重比较。将p值<0.05者视为显著。

[0012] 图5显示，在进行局部缺血/再灌注后的小鼠体内，BAG3的过度表达保持了心脏功能并限制了梗死面积。在巨细胞病毒(CMV)启动子(rAAV9-BAG3)的对照下，对野生型8至10周龄雄性FVB小鼠经由眶后静脉丛(retro-orbital plexus)注射含有BAG3的腺相关病毒血清型9(AAV9)。三周后，将冠状动脉左前降支堵塞30分钟，之后再灌注72小时。通过超声波心动描记术在再灌注终了时测量心脏功能。图5A显示代表性M模式超声波心动图，显示注射AAV9-GFP的野生型FVB小时的LV短轴，注射AAV9-GFP的小鼠在I/R后72小时的回声和注射AAV9-BAG3的小鼠在I/R后72小时的回声。图5B显示，通过超声波心动描记术测量的注射AAV9-BAG3或AAV9-GFP并在之后再灌注72小时的小鼠的左心室射血分数(LVEF)。图5C显示，注射AAV9-BAG3或AAV9-GFP的小鼠在I/R后的心肌BAG3水平。图5D显示，来自进行虚假手术的小鼠、在I/R前注射注射rAAV-GFP的小鼠、以及在I/R前注射rAAV9-BAG3的小鼠的代表性伊文思蓝/三苯基四唑染色截面。伊文思蓝染色的区域表示心室的该区域未处于风险下，TTC阴性区域表示梗死区域，而处于风险下的区域(AAR)包括TTC阴性和TTC阳性两个区域。处于风险下的区域(AAR)表达为基于总LV的百分比，而梗死区域表达为基于AAR的百分比。
图5E显示，对进行AAV9-GFP或AAV9-BAG3以及后续I/R后的小鼠体内处于风险下的区域
(AAR/LV)的定量评估。图5F显示，在I/R之前三周接受AAV9-GFP或AAV9-BAG3的小鼠的梗死面积，表明接受AAV9-BAG3组的梗死面积的显著减少。

[0013] 图6显示，在进行局部缺血/再灌注的小鼠体内，BAG3的过度表达减轻了细胞凋亡和自体吞噬标记物的变化。图6A显示，从已经在I/R之前三周经眶后静脉丛注射rAAV9-GFP或rAAV9-BAG3的野生型小鼠获得的组织中，生物标记物的代表性蛋白质印迹，显示与使用Ad-BAG3治疗后的NMVC中所见一致的变化。图6B显示的图说明，对在I/R之前注射rAAV9-GFP或rAAV9-BAG3的小鼠的蛋白质印迹(对于GFP，n＝5；对于BAG3，n＝4)进行Bcl2的定量。图6C显示的图说明，对在I/R之前注射rAAV9-GFP或rAAV9-BAG3的小鼠的蛋白质印迹(对于GFP，n＝5；对于BAG3，n＝4)进行被裂解的半胱天冬酶-3的定量。图6D显示的图说明，对在I/R之前注射rAAV9-GFP或rAAV9-BAG3的小鼠的蛋白质印迹(对于GFP，n＝5；对于BAG3，n＝4)进行LAMP-2的定量。图6E显示的图说明，对在I/R之前注射rAAV9-GFP或rAAV9-BAG3的小鼠的蛋白质印迹(对于GFP，n＝5；对于BAG3，n＝4)进行p-JNK的定量。

具体实施方式

[0014] 对于优选具体实施例的本说明书倾向于与附图联合阅读，该附图视为本发明的完整说明书的一部分。附图不一定按比例绘制，且出于清晰和简洁的目的，本发明的某些特征可能在比例上夸大显示或在某种程度上为示意图。说明书中，相关术语如“水平”、“垂直”、“上”、“下”、“顶”和“底”及其衍生术语(如，“水平地”、“向下地”、“向上地”等)应理解为其在讨论语境下在附图中揭示或显示的取向。这些相关术语是为了说明便利起见，且正常情况下不试图需要特定取向。包括“向内地”对“向外地”、“纵向”对“横向”等在内的术语，酌情解释为相对于彼此或相对于延长轴或旋转轴或旋转中心。关于附着、偶联等的术语，如“连接”和“互连”，指的是相互关系，其中，除非明确排除，结构或直接或通过间隔结构而间接地彼此支持或附接，彼此之间可以是活动的或刚性的附接或关系。术语“可操作地连接”是这样的一个令相关结构可凭借该关系而操作的附接、偶联或连接。但仅例示性说明单一机械时，该术语“机械”也应视为包括独立或共同执行一组(或多组)指令以上述本文中讨论的任何一种或多种方法的机械的任意集合。权利要求书中，如果使用手段+功能的子句，则该子句试图覆盖为用于上述所述功能的文字说明或附图所揭示、暗示或使其明了的结构，不仅包括结构等效物，而且包括等效结构。

[0015] 本发明是部分地基于我们的下述发现：Bcl2相关永生基因3(BAG3)的过度表达保护心脏不被再灌注损伤。我们使用了新生小鼠心室肌细胞(NMVM)的缺氧/复氧(H/R)体外模型和成年小鼠的局部缺血/再灌注(I/R)的体内模型。我们发现，缺氧/复氧(H/R)和局部缺血/再灌注(I/R)两者均与BAG3水平的下降相关，且I/R之前BAG3在小鼠体内的过度表达显著减小了梗死面积并改善了左心室(LV)功能。

[0016] 更具体地，我们发现，缺氧/复氧(H/R)后的新生小鼠心室心肌细胞(NMVC)中的BAG3水平大幅度减少，局部缺血/再灌注(I/R)后的小鼠心室心肌的梗死边界区域内的BAG3水平也大幅度减少。H/R后NMVC中BAG3水平的下降和I/R后小鼠心脏肌肉中BAG3水平的下降，均与自体吞噬和/或细胞凋亡的标记物水平的变化有关，该变化包括被裂解的半胱天冬酶2的水平增加以及Bcl2和LAMP-2水平的降低。我们还发现，使用siRNA(siBAG3)在NMVC进行BAG3敲除，获得确切反映在H/R后的NMVC中所见的细胞凋亡/自体吞噬生物标记物表型。我们还发现，通过腺病毒(Ad-BAG3)造成的NMVC中BAG3的过度表达，令H/R后细胞凋亡和自体吞噬的生物标记物的改变正常化。此外，腺相关病毒血清型9在CMV启动子控制下偶联至BAG3(rAAV9-BAG3)，显著提升了I/R后小鼠的左心室(LV)功能并降低了梗死面积，同时还将自体吞噬和细胞凋亡的生物标记物水平修饰为与NMVC中所见者相当。这些结果表明，对于在缺氧/局部缺血和再灌注的应力下维持心脏的内稳态，正常水平的BAG3是必需的。

[0017] 据此，本文件提出包含一种或多种增加BAG3水平的剂的组合物以及多种剂的药物组合物，其增加处于局部缺血/再灌注损伤风险下或受其影响的组织中的BAG3水平。还提出将该组合物给药至处于局部缺血/再灌注损伤风险下或正苦于局部缺血/再灌注损伤的患者。本文中揭示的治疗方法可与其它治疗如药物治疗或医疗装置合用。

[0018] 组合物

[0019] Bcl2相关永生基因3(BAG3)是由575个氨基酸构成的蛋白质，大量地见于心脏、骨骼肌和多种癌症中。BAG3作为辅陪伴分子与热休克家族蛋白质成员一起发挥作用以调节蛋白质品质控制，与Bcl2相互作用以抑制细胞凋亡，以及通过将丝蛋白与Z-盘通过与肌动蛋白加帽蛋白β-1(CapZβ1)结合而链接以维持肌小节的结构完整性。

[0020] BAG3在维持心脏的内稳态中扮演角色。小鼠体内BAG3的纯合子缺失导致了LV功能障碍、肌原纤维瓦解以及在四周龄时死亡；幼体的单一等位基因突变与前进肢和中轴肌无力、重度呼吸功能不全和心肌症有关。已经证实，BAG3的删除与具有独立于周围肌无力或神经病学并发症的射血分数(HFrEF)减少的心力衰竭相关；在患有作为LAD闭塞继发疾病的HFrEF的小鼠体内和患有末期HFrEF的患者体内，BAG3水平降低。新生肌细胞中的BAG3敲除导致了拉伸该细胞时的肌纤维无序。在成年肌细胞中，BAG3定位在肌纤维膜和t-小管处，在该处，其通过与β1-肾上腺素能受体和L型Ca2+通道的特异性相互作用而调节肌细胞收缩和动作电位时程。

[0021] 具有BAG3中的单核苷酸多态性以及肌纤维性肌病的患者的线粒体结构可能存在畸形。最近，我们发现，BAG3促进通过自噬体-溶酶体途径进行的和通过直接与线粒体相互作用进行的对受损的线粒体的清除。相比之下，BAG3敲除则显著降低了自体吞噬通量，导致受损线粒体的蓄积和细胞凋亡的增加。

[0022] BAG3，亦称MFM6、Bcl-2结合蛋白Bis、CAIR-1、船坞蛋白CAIR-1、BAG家族分子伴侣调节因子3、BAG-3、BCL2结合永生基因、或BIS，是与Hip-1竞争结合至HSP 70的细胞保护性多肽。BAG3的NCBI参考氨基酸序列可见于基因银行(Genbank)，登录号NP 004272.2；Public GI:14043024。我们将基因银行登录号NP 004272.2；Public GI:14043024的氨基酸序列记为SEQ ID NO:1。BAG3的NCBI参考核酸序列可见于基因银行，登录号NM 004281.3GI:62530382。我们将基因银行登录号NM 004281.3GI:62530382的核酸序列记为SEQ ID NO:2。
其它BAG3氨基酸序列包括，例如而不限于：095817.3GI:12643665(SEQ ID NO:3)、
EAW49383.1

[0023] GI:119569768(SEQ ID NO:4)、EAW49382.1GI:119569767(SEQ ID NO:5)、和CAE55998.1GI:38502170(SEQ ID NO:6)。本发明的BAG3多肽可以是本文中所揭示多肽的变体，只要其保留功能性即可。

[0024] 本文件提供药剂，其增加处于局部缺血/再灌注损伤风险下或受其影响的组织内的BAG3水平。我们可使用术语“增长”、“增加”或“上调”来通常地意指将BAG3增加统计学显著的量。一些具体实施例中，增加可以是比对照样本或参考水平增加至少10％，例如，与参考水平相比，增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或高达且包括100％，或增加10％至
100％之间的任意量；或者，与参考水平相比，增加至少约0.5倍、或至少约1.0倍、或至少约
1.2倍、或至少约1.5倍、或至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍，或增加1.0倍至10倍之间的任意倍数。

[0025] 对照样本可以是参考样本。参考样本可以是在一个或多个在前时间点从该受试者获得的样本。或者，或此外，参考样本可以是源自更大的个体种群的BAG3水平的标准水平。该参考种群可包括年龄、身体大小、种族背景或一般健康状况与该受试者相似的的个体。因此，可将BAG3的水平与源自健康个体比较，该健康个体为没有苦于局部缺血/再灌注损伤的个体或没有处于局部缺血/再灌注损伤风险下的个体。参考样本也可以是从已经从局部缺血/再灌注损伤中康复的个体种群。该个体种群可包括，患有类似的导致局部缺血/再灌注损伤的病症如心肌梗死或中风的个体。

[0026] 核酸

[0027] 增加处于局部缺血/再灌注损伤风险下或受其影响的组装内BAG3水平的剂，可能是编码BAG3多肽或其片段的核酸。我们可互换地使用术语“核酸”和“多核苷酸”来指代RNA和DNA两者，包括cDNA、基因组DNA、合成DNA、以及含有核酸类似物的DNA(或RNA)，其中任何一种均可编码本发明的多肽，且全部为本发明所涵盖。多核苷酸可本质上具有任何三维结构。核酸可以是双链的或单链的(即，正义链或反义链)。多肽的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)及其部位、转移RNA、核糖体RNA、siRNA、micro-RNA、核糖酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何分离的DNA序列、任何分离的RNA序列、核酸探针、引物、以及核酸类似物。在本发明的语境中，核酸可编码天然出现的BAG3的片段或其生物活性的变体。

[0028] “分离的核酸”可以是，举例而言，天然出现的DNA分子或其片段，但须满足，正常情况下发现的在天然出现的基因组内位于该DNA分子侧翼并紧邻该DNA分子的至少一种核酸序列被移除或不存在。因此，分离的核酸包括而不限于，作为独立于其它序列的独立分子存在的DNA分子(如，化学合成的核酸，或通过聚合酶链反应(PCR)或限制性内切核酸酶处理而产生的cDNA或基因组DNA片段)。分离的核酸也指代被并入自体、自主复制质粒、病毒、或原核生物或真核生物基因组DNA内的DNA分子。此外，分离的核酸可包括经工程化的核酸，如作为杂交或融合核酸的一部分的DNA分子。存在于例如cDNA库或基因组库内很多个(如，数十、或数百至数百万)其它核酸中或存在于含有基因组DNA限制酶切消化的凝胶切片中的核酸，不是分离的核酸。

[0029] 分离的核酸分子可通过标准技术制备。例如，可使用聚合酶链反应(PCR)技术来获得含有本文中所揭示序列的分离的核酸，包括编码本文中所揭示多肽的核苷酸序列。PCR可用来从DNA以及RNA扩增特定的序列，包括来自总基因组DNA或总细胞RNA的序列。多种PCR方法揭示于，例如《，PCR引物：实验室手册》(PCR Primer:A Laboratory Manual,Dieffenbach and Dveksler,eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1995)中。通常，采用来自感兴趣的区域两端或超出该区域的序列信息来设计寡核苷酸引物，其序列与待扩增模板的相反链相同或相似。也可使用可借以将位点特异性核苷酸修饰序列引入模板核酸中的多种PCR策略。

[0030] 分离的核酸也可以是化学合成的，或作为单个核酸分子(如，使用自动化DNA合成在3'至5'方向使用磷酸亚酰胺技术)或作为一系列寡核苷酸而合成。例如，可合成含有所希望的序列的一对或多对长寡核苷酸(如，>50至100个核苷酸)，且每对的长寡核苷酸均含有互补的短片段(如，约15个核苷酸)，因此，当该寡核苷酸对退火时，形成双螺旋。使用DNA聚合酶来延长该寡核苷酸，每对寡核苷酸均得到单个的双链核酸分子，随后将该双链核酸分子结扎入载体内。本发明的分离的核酸也可通过对BAG3编码DNA的天然出现部位(例如，根据上式)进行诱变而得。

[0031] 两个核酸或它们所编码的多肽可揭示为彼此具有某种程度的一致性。例如，BAG3蛋白及其生物活性的变体可揭示为展现某种程度的一致性。可通过将短BAG3序列定位在蛋白质信息研究(Protein Information Research(PIR))网站(http://pir.georgetown.edu)中而完成排比，之后使用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)上的“几乎相同的短序列”局部序列排比检索基本工具(Basic Local Alignment Search Tool(BLAST))算法进行分析。

[0032] 本文中，术语“序列一致性百分比”指的是，任何给定检测序列与目标序列之间的一致性程度。例如，天然出现的BAG3可以是该检测序列，而BAG3蛋白的片段可以是该主体序列。同样，BAG3蛋白的片段可以是该检测序列，而其生物活性的标题可以是该目标序列。

[0033] 为了测定序列一致性，可使用计算机程序ClustalW(1.83版，缺省参数)将查询核酸或氨基酸序列分别与一个或多个主题核酸或氨基酸序列比对，该程序允许待执行的核酸或蛋白质序列在其整个长度上比对(全局比对)。

[0034] ClustalW计算检测序列与一个或多个目标序列间的最佳匹配并比对它们，因此，可测定一致性、相似性和差异性。可将一个或多个残基的空位(Gap)引入检测序列、目标序列或两者中，以最大化序列比对。对于核酸序列的成对快速比对，使用下述缺省参数：字长：2；窗口大小：4；计分方法：百分比；顶部对角线数(number of top diagonals)：4；空位罚分：5。对于核酸序列的多重比对，使用下述参数：空位开启罚分：10.0；空位延伸罚分：5.0；
转换权重(weight transitions)：yes。对于蛋白质序列的成对快速比对，使用下述参数：字长：1；窗口尺寸：5；计分方法：百分比；顶部对角线数：5；空位罚分：3。对于蛋白质序列的多重比对，使用下述参数：权重矩阵：blosum；空位开启罚分：10.0；空位延伸罚分：0.05；亲水性空位：on；亲水性残基：Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg和Lys；残基特异性空位罚分：
on。输出结果为反映序列间关系的序列比对。例如，ClustalW可以在贝勒医学院(Baylor College of Medicine)的Search Launcher网站(searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html)和欧洲生物信息学会(European Bioinformatics Institute site)网站(ebi.ac.uk/clustalw)上运行。

[0035] 为了测定检测序列与目标序列之间的一致性百分比，ClustalW令最优比对中的一致性数除以所比较的残基数(排除空位位置)，结果再乘以100。输出结果即为该目标序列关于该检测序列的一致性百分比。注意，一致性百分比值可以四舍五入至最接近的小数点后一位。例如，78.11、78.12、78.13和78.14向下四舍五入至78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18和78.19向上四舍五入至78.2。

[0036] 本文中揭示的核酸和多肽可称为“外源性的”。术语“外源性的”表明该核酸或多肽是重组核酸构造的一部分或由该重组核酸构造编码，或并非出于天然环境中。例如，外源性的核酸可以是引入一个物种中的另一物种的序列，即异源性核酸。典型地，经由重组核酸构造将该外源性核酸引入其它物种内。外源性核酸也可以是有机体的原生序列，以及已经被再次引入该有机体内的序列。包括原生序列在内的外源性核酸与天然出现的序列的区别通常为，链接至该外源性核酸的非天然序列的存在，如重组核酸构造中位于原生序列侧翼的非原生调节序列。此外，经稳定转化的外源性核酸典型被整合在除发现原生序列的位置之外的位置处。

[0037] 本文中还提供重组构造，且该重组构造可用来转化细胞以表达BAG3。重组核酸构造包含编码可操作地链接之调节区的BAG3序列的核酸，适用于在特定细胞内表达BAG3。应知悉，大量核酸可编码具有特定氨基酸序列的多肽。基因密码的简并性是该领域中周知的。对于多种氨基酸，存在超过一个用作该氨基酸密码子的核酸三元组。例如，可使用适宜的用于特定有机体的密码子偏倚表来修饰BAG3的编码序列中的密码子，由此获得在该有机体中的最优表达。

[0038] 还提供含有例如本文所述的那些核酸的载体。“自体”是复制子，如质粒、是具体、或粘粒，可将另一DNA片段插入载体中以造成对所插入片段的复制。通常，当载体与适宜的控制成分关联时，载体能进行复制。适当的载体骨架包括，例如，该领域中常规使用的那些，如质粒、病毒、人造染色体、BAC、YAC或PAC。术语“载体”包括克隆载体和表达载体，以及病毒载体和整合载体。“表达载体”是包括调节区的载体。多种宿主/表达载体的组合可用来表达本文中所揭示的核酸序列。适当的表达载体包括而不限于，源自例如是具体、杆状病毒和逆转录酶病毒的质粒和病毒载体。

[0039] 可用的载体包括，例如，病毒载体(如腺病毒(Ad)、腺相关病毒(AAV)、慢病毒、水疱性口炎病毒(VSV)和逆转录酶病毒)。也可使用复制缺陷型重组腺病毒载体。载体还可包含进一步调节基因输送及/或基因表达的组分或功能性，或者该组分或功能性反而向靶标细胞提供有益性质。如下文中更详细的揭示和例示性说明，此类其它组分包括，举例而言，影响结合至细胞或与细胞为靶向的组分(包括街道细胞类型或组装特异性结合的组分)；影响该载体核酸被该细胞吸收的组分；影响该多核苷酸被吸收后在该细胞内定位的组分(如，街道细胞核定位的剂)；以及影响该多核苷酸表达的组分。此类组分亦可包括标记物，如可用来检测或选择细胞的可检测的及/或可选择的标记物，其中该细胞已经吸收并正在表达通过该载体输送的核酸。此类组分可提供为天然特征的载体(如，使用某些具有介导结合和吸收的组分和功能性的病毒载体)，或可修饰载体以提供此类功能性。其它载体包括Chen et al；BioTechniques,34:167-171(2003)揭示的那些载体。

[0040] “重组病毒载体”指代是，包含一种或多种异源性基因产物或序列的病毒载体。由于多种病毒载体展现与封装相关的体积约束，典型通过替换该病毒基因组的一个或多个部位引入该异源性基因产物或序列。此类病毒可变为具有复制缺陷性，需要在病毒复制和衣壳化过程中反向提供所缺失的功能(通过使用诸如携带复制及/或衣壳化所必需的基因产物的辅助病毒或封装细胞系)。将待输送的多核苷酸携带在病毒颗粒外侧的经修饰的病毒载体也已经被揭示。

[0041] 病毒载体可包括可操作地链接至该多核苷酸的真核生物强启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子。该重组病毒载体可在其内部包括一种或多种多核苷酸，优选约一种多核苷酸。一些具体实施例中，本发明方法中使用的病毒载体的pfu(空斑形成单位)为约108至约5×1010pfu。在待使用非病毒载体给药该多核苷酸的具体实施例中，用量往往为约0.1纳克(ng)至约4000微克(μg)，如，约1ng至约100μg。

[0042] 其它载体包括逆转录病毒载体，如莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒和HIV系病毒。一个HIV系病毒载体包含至少两个载体，其中，gag基因和pol基因来自HIV基因组，而env基因来自另一种病毒。DNA病毒载体包括痘病毒载体，如天花或禽痘病毒载体、疱疹病毒载体如I型单纯疱疹病毒(HSV)载体。

[0043] 痘病毒载体将基因引入细胞的细胞质中。禽痘病毒载体仅造成该核酸的断其表达。腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒(HSV)载体可作为一些发明具体实施例的指标。腺病毒载体造成比腺相关病毒更短期(如，不超过一个月)的表达，一些具体实施例中，可展现更长期的表达。所选择的特定载体将取决于靶点细胞和待治疗的病症。对适宜启动子的选择可轻易实施。适当启动子的一个实例为763碱基对的巨细胞病毒(CMV)启动子。其它适用于基因表达的启动子包括但不限于，劳斯氏肉瘤病毒(RSV)、SV40早期启动子区、疱疹胸苷激酶启动子、金属硫蛋白(MMT)基因的调节序列、原核表达载体如β-内酰胺酶启动子、tac启动子、来自酵母或其它真菌的启动子成分如Gal 4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子；以及展现组织特异性且已经用于转基因动物的动物转录控制区：在胰腺泡细胞中具有活性的弹性蛋白酶I基因控制区，在胰腺β细胞中具有活性的胰岛素基因控制区，在淋巴细胞中具有活性的免疫球蛋白基因控制区，在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中具有活性的鼠乳腺肿瘤病毒控制区，在肝脏中具有活性的白蛋白基因控制区，在肝脏中具有活性的甲胎蛋白基因控制区，在肝脏中具有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区，在骨髓细胞中具有活性的β-球蛋白基因控制区，在脑内少突细胞中具有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区，在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区，以及在下丘脑中具有活性的促性腺释放激素基因控制区。某些蛋白可使用它们的原生启动子而被表达。也可包括其它可提升表达的成分，如造成高水平表达的增强子或系统，如tat基因和tar成分。随后，可将这一片匣插入载体内，如质粒载体如pUC19、pUC118、pBR322或其它已知的质粒载体，包括例如大肠杆菌(E.coli)复制的起源。质粒载体也可包括可选择的标记物，如用于氨苄青霉素耐药性的β-内酰胺酶基因，但须满足，该标记物多肽不对待治疗有机体的新陈代谢产生负面影响。该片匣也可结合至合成输送系统中的核酸结合部位。

[0044] 一些具体实施例中，输送系统可包括使用仅选择性地转导心肌细胞的载体的周围静脉注射，该载体是，例如，具有强烈心脏趋性的AAV血清型。其它牵涉经皮技术和外科手术技术的系统包括，例如，具有或不具有冠状动脉闭塞的顺行植入冠状动脉内输注；闭环再循环，其中，该载体从体外氧化的冠状窦被输注入从循环中移除的冠状动脉中，并再次向下输送至冠状动脉；通过冠状窦逆行输注；直接心肌注射；周围静脉输注；以及心包注射。

[0045] 一些具体实施例中，本发明的多核苷酸也可与微输送载体如阳离子脂质体、其它含有脂质的复合物、及其它能介导多核苷酸至宿主细胞的输送的大分子复合物合用。

[0046] 另一种输送方法是使用产生单链DNA的载体，该载体可在细胞内产生所表达的产物。见，例如，Chen et al,BioTechniques,34:167-171(2003)，该文献通过引用而以其整体并入本文。

[0047] 本文中提供的载体也可包括，例如，复制的起源、核骨架附着区(SAR)、及/或标记物。标记物可将可选择的血清型提供于宿主细胞上。例如，标记物可提供杀生物剂耐药性，如抗生素(如，卡那霉素、G418、博来霉素、或潮霉素)耐药性。如上所述，表达载体可包括被设计为促进所表达多肽的扩增或检测(如，纯化或定位)的标签序列。标签序列如绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽5-转移酶(GST)、多组氨酸、c-myc、血细胞凝集素、或FlagTM标签(Kodak,New Haven,CT)序列，该等序列典型被表达为与所编码多肽的融合体。此类标签可插入该多肽内的任何位置，包括羧基端或氨基端。

[0048] 其它表达载体也可包括，例如，染色体、非染色体和合成DNA序列的片段。适当的载体包括SV40和已知细菌质粒的衍生物，如大肠杆菌质粒col El、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX、pMB9及其衍生物，质粒如RP4；噬菌体DNA，如噬菌体1如NM989及其它噬菌体DNA如M13和丝状单链噬菌体DNA的多种衍生物；酵母质粒如2μ质粒或其衍生物；可用于真核细胞的载体如可用于昆虫或哺乳动物细胞中的载体；源自质粒与噬菌体DNA的组合的载体，如已经修饰以采用噬菌体DNA或其它表达控制序列的质粒。

[0049] 载体也可包括调节区。术语“调节区”指的是核苷酸序列，其影响转录和翻译起始和速率、转录或翻译产物的稳定性及/或移动性。调节区包括而不限于，启动子序列、增强子序列、应答成分、蛋白质识别位点、诱导型成分、蛋白质结合序列、5'和3'未翻译区(UTR)、转录开始位点、终止序列、聚腺苷酸化序列、核定位信号、以及内含子。

[0050] 本文中，术语“可操作地链接”指的是，将调节区和待转录的序列定位在核酸内，以影响该序列的转录和翻译。例如，为了将编码序列带至启动子的控制之下，该多肽的翻译阅读框的翻译起始位点典型位于该启动子下游的1至约50个核苷酸之间。但是，启动子可被定位在该翻译起始位点上游多达约5,000个核苷酸处，或转录开始位点上游约2,000个核苷酸处。启动子典型至少包含核心(基础)启动子。启动子也可包括至少一个控制成分，如增强子序列、上游成分或上游激活区(UAR)。选择待包括的启动子，取决于若干因素，包括但不限于，效率、可选择性、可诱导性、所希望的表达水平、以及细胞或组织优先的表达。通过相对于编码序列而适宜地选择并定位启动子和其它调节区而调整该编码序列的表达，对于该领域技术人员来说是常规操作。

[0051] 多肽

[0052] 一些具体实施例中，本发明的组合物可包括由上述任何核酸序列编码的BAG3多肽。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，但它们典型指的是多种尺寸的肽序列。我们可将基于氨基酸的本发明的组合物称为“多肽”，以表示它们是氨基酸残基的线性聚合物并帮助它们与全长度蛋白质区分开来。本发明的多肽可“构建”或“包括”BAG3的片段，且本发明涵盖构建或包括BAG3的生物活性变体的多肽。应理解，该多肽可因此仅包括BAG3(或其生物学活性变体)的片段，但也可以包括其它残基。因此，BAG3的片段和BAG3其生物学活性变体及其片段，将会保留足够的生物学活性以在本文所揭露的方法中发挥功能。

[0053] 氨基酸残基之间的键可以是传统的肽键或另一种共价键(如，酯键或醚键)，且该多肽可通过酰胺化、磷酸化或糖基化修饰。修饰可影响多肽骨架及/或一个或多个侧链。化学修饰可以是在编码该多肽的mRNA翻译后在体内做出的天然出现的修饰(如，在细菌宿主体内的糖基化)，或是在体外做出的合成修饰。BAG3的生物学活性变体可包括一个或多个来自天然出现的修饰(即，在体内自然地做出)与合成修饰(即，在体外做出的天然出现或非天然出现的修饰)的任意组合的结构性修饰。修饰的实例包括但不限于，酰胺化(如，将C端的游离羧基替换为胺基)、生物素化(如，使用生物素分子对赖氨酸或其它反应性氨基酸残基进行酰化)、糖基化(如，将糖基加成至天冬酰胺、羟基赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基上，以生成糖蛋白或糖肽)、酰化(如，酰基的加成，典型发生在多肽的N端)、烷基化(如，烷基的加成)、异戊二烯化(如，类异戊二烯基团的加成)、脂化(如，脂化部分的附接)、和磷酸化(如，将磷酸根加成至丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或组氨酸)。

[0054] 生物学活性变体中的一个或多个氨基酸残基可以是非天然出现的氨基酸残基。天然出现的氨基酸残基包括由基因密码天然编码的那些氨基酸残基以及非标准氨基酸(如，具有D构型而非L构型的氨基酸)。本发明的肽也可包括作为标准残基的修饰物的氨基酸残基(如，吡咯赖氨酸可用来替代赖氨酸，而硒代半胱氨酸可用来替代半胱氨酸)。非天然出现的氨基酸残基是自然界中尚未发现的那些氨基酸残基，但其遵循氨基酸的碱基式且可并入肽内。这些包括D-别异亮氨酸((2R,3S)-2-氨基-3-甲基戊酸)和L-环戊基甘氨酸((S)-2-氨基-2-环戊基乙酸)。对于其它实例，可查阅教科书或网站(目前由加州理工学院日常维护的网站，其显示已经被成功并入功能性蛋白质内的非天然氨基酸的结构)。

[0055] 或者，或此外，生物学活性变体中的一个或多个氨基酸残基可以是天然出现的氨基酸残基，但该天然出现的氨基酸残基不同于在野生型序列的相应位置发现的天然出现的残基。换言之，生物学活性变体可包括一处或多处氨基酸替换。我们可将氨基酸残基的替换、加入或缺失称为对野生型序列的突变。注意，该替换可将天然出现的氨基酸残基替代为非天然出现的残基或仅替代为不同的天然出现的氨基酸。再者，该替换可构建保守替换或非保守替换。保守的氨基酸替换典型包括在下述各组内进行的替换：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。

[0056] 作为BAG3的生物学活性变体的多肽，可表征为其序列与相应的野生型多肽类似或相同的程度的术语。例如，该生物学活性变体的序列与该野生型多肽的序列一致性可以为至或约80％。例如，BAG3的生物学活性变体的氨基酸序列与BAG3如BAG3参考序列如SEQ ID NO:2、或其同源物或直接同源物的一致性为至少或约80％(如，至少或约85％、90％、95％、97％、98％、或99％的序列一致性)。

[0057] BAG3多肽的生物学活性变体将会保留足够的生物学活性，以令其可用于本发明的方法中。该生物学活性变体将会保留足够的活性，以在靶点DNA裂解中发挥功能。该生物学活性可使用该领域技术人员已知的途径评估，该途径包括而不限于，体外裂解分析或功能分析。

[0058] 可通过包括例如重组技术或化学合成技术在内的多种方法生成多肽。一旦生成多肽，即通过该领域中周知的手段将其分离并纯化至所希望的程度。例如，可使用冻干技术，之后进行例如在多糖凝胶介质如Sephadex G-25上的反相(优选)或正相HPLC、或体积排阻或分配色谱。可通过肽降解后使用标准手段、氨基酸测序或FAB-MS技术验证最终多肽的组合物。可使用该领域中已知的方法制备多肽的包括酸盐在内的盐、酯、酰胺和氨基的N-酰基衍生物，且这些肽可用于本发明的情境中。

[0059] 无论组合物是否作为核酸或多肽而给药，它们均可以此途径配制，以促进其被哺乳动物细胞吸收。可用的载体系统和配方揭示与上文中。一些具体实施例中，该载体可将组合物输送至特定的细胞类型。但本发明并不限于此，还预期其它DNA输送方法，如使用例如磷酸钙、DEAE右旋糖酐、脂质体、脂质复合体、表面活性剂、和全氟化学液体的化学转染；物理输送方法，如电穿孔、显微注射、弹道颗粒和“基因枪”系统。

[0060] 一些具体实施例中，增加处于局部缺血/再灌注损伤风险下或受其影响的组织内BAG3水平的剂，可以是以Bcl2家族为靶向的剂。一些具体实施例中，该剂可以是蛋白酶体抑制剂，如硼替佐米(bortezimib)。

[0061] 治疗方法

[0062] 本文中所揭露的组合物通常且在多方面可用于治疗具有局部缺血/再灌注损伤或处于局部缺血/再灌注损伤风险下的受试者。我们可互换地指代受试者、患者或个体。

[0063] 局部缺血/再灌注损伤通常在最初的导致组织损伤及/或死亡的局部缺血症状后出现。供给至受害组织的恢复，即再灌注，反而对该组织进一步造成伤害。再灌注损伤的根本机理仍未完全理解。通常，局部缺血/再灌注损伤作为一种复杂的作用而出现，是一种牵涉多因素的现象，其至少涉及：1)通过在血液流动的重建过程中分子氧的再引入而促成的反应性氧物质的(ROS)的生成；2)钙过载；3)线粒体通透性转换孔(MPT)的开放，其令线粒体膜电位消散并进一步损害三磷酸腺苷(ATP)的产生；4)内皮功能紊乱；5)前凝血表型(prothrombogenic phenotype)的出现；以及6)明显的炎症反应。

[0064] 局部缺血/再灌注损伤可出现于多种不同的组织内，包括心脏、脑、肾脏、肠、骨骼肌、前列腺和睾丸。除了具备损害之外，局部缺血/再灌注还可诱发有害的远端效果，导致全身性炎症反应的发展和多器官功能障碍综合征。大多数组织可抵挡并不导致可检测的损伤的短期的局部缺血。具体的组织可抵挡局部缺血的时间长度根据细胞类型和器官而变。典型地，一旦超过局部缺血的临界时长，即出现细胞损伤及/或细胞死亡。

[0065] 特定组织或器官中的局部缺血可能是由供给至该组织或器官的血液丢失或严重减少而造成的。血液供给的丢失或严重减少可能是由于，举例而言，冠状动脉粥样硬化、血栓栓塞性中风、或周围血管疾病。心肌局部缺血典型是由动脉粥样硬化或血栓形成性堵塞引起的，其导致通过心动脉和毛细血管供给的输送至心脏组织的氧减少或丢失。骨骼肌或肠平滑的局部缺血也可能是由动脉粥样硬化或血栓形成性堵塞造成的。

[0066] 再灌注是血液流至任何其内部血液流动已经降低或堵塞的器官或组织的恢复。血液流动可恢复至受局部缺血或缺氧影响的器官或组织。再灌注典型作为血管介入治疗过程，如血管成形术如气囊血管成形术，或冠状动脉旁路搭桥术的结果而出现。例示性的血管介入治疗过程可包括采用支架、血管成形术导管(如，经皮腔内血管成形术)、激光导管、斑块切除术导管、血管内视镜装置、β-或γ-辐射导管、血管内超声装置、斑块旋磨术装置、放射性气球、可加热的线、可加热的气球、生物可降解的支架支柱、或生物可降解的套筒的过程。

[0067] 一些具体实施例中，可使用药剂如溶血栓药物修复血液流动。一些具体实施例中，可使用介入治疗过程与药剂的组合修复血液流动。

[0068] 局部缺血/再灌注损伤的症状可依据所牵涉的组织或器官而变。在心血管组织的情形中，局部缺血/再灌注损伤可导致心肌梗死程度增加、L/V功能受损、收缩性功能障碍的严重性增加、以及心律不齐的发病率增加。

[0069] 尽管我们相信，我们理解某些在给药增加患有局部缺血/再灌注损伤或处于其风险下的患者体内BAG3水平的组合物时出现的事件，本发明的组合物并不限于这些通过影响任何特定细胞机理而完成的工作。我们的工作假说是，增加患有局部缺血/再灌注损伤或处于其风险下的患者体内的BAG3水平，可通过部分地借由限制细胞凋亡和修复自体吞噬而维持心脏内稳态，从而保护组织不被损伤。

[0070] 本文中揭露的方法可用于治疗可能导致局部缺血/再灌注损伤或可能将患者带至局部缺血/再灌注损伤风险下的疾病或病变。此类病毒包括而不限于，心肌梗死、心脏病发作、局部缺血性心脏病(即，由于斑块形成而导致的冠状动脉狭窄和闭塞，造成供给至心脏的血液流动和氧减少)、源自局部缺血性心脏病的心力衰竭、心搏停止、动脉血液流动减少、中风(例如，阻塞性中风)、短暂性脑缺血发作、不稳定性心绞痛、脑血管局部缺血、周围血管疾病、肾衰竭、炎性病症(如，类风湿性关节炎或全身性红斑狼疮)、头部创伤、溺水、败血症、动脉粥样硬化、高血压(如，肺动脉高血压)、药物引起的心脏病、出血、毛细血管渗漏综合征(如，儿童及成人呼吸窘迫综合征)、多器官系统衰竭、低胶体渗透压状态(如，由于绝食、神经性厌食症、或伴有血清蛋白质产生量减少的肝衰竭)、过敏症、低体温症、冻伤(如，冻疮)、肝肾综合征、震颤性谵妄、肠系膜供血不足、跛行、烧伤、触电、药物引起的血管舒张、药物引起的血管收缩、移植术后的组织排异、移植物抗宿主疾病、辐射照射、肺栓塞、静脉血栓形成、局部缺血性神经障碍、局部缺血性肾病、或创伤性损伤。

[0071] 局部缺血/再灌注损伤也可能缘于血液流动及/或氧流动被中断或可能被中断的外科手术。某些外科手术过程如神经外科和心外科手术，具有较高的局部缺血/再灌注损伤风险，即使在手术过程中使用机械手段(如，人工心肺机)，可能仍无法完全防止局部缺血/再灌注损伤。本文中揭示的组合物可给药至个体，以显著降低或防止组织和器官在此类医疗事件(如，严重的低体温症或缺氧)或医疗过程(如，外科手术)期间或之后经历的局部缺血/再灌注损伤。

[0072] 因此，本文中揭露的方法和组合物可用于治疗处于局部缺血/再灌注损伤风险下的受试者，例如，预定进行与局部缺血/再灌注损伤相关的过程的患者，在过程中可能导致血液流动堵塞，如血管介入治疗过程。处于局部缺血/再灌注损伤风险下的受试者可包括那些处于心血管疾病或局部缺血疾病风险下的受试者。经历局部缺血/再灌注损伤的风险增加的受试者可包括，例如，吸烟者、糖尿病患者、具有高血压或血脂异常的受试者、具有血管疾病家族病史的受试者、有冠状动脉疾病、周围血管疾病或脑血管疾病记录的受试者、或者正在进行诊断性或治疗性放疗或化疗的受试者。此类受试者亦可存在与体能活动补足、肥胖、精神压力、饮酒、饮食不良和年龄有关的因素。

[0073] 每当发生临床上有益的结果时，受试者即被有效治疗。这可能意味着，例如，疾病症候的完全消退、疾病症候的严重程度下降、或疾病进展变慢。这些方法可进一步包括下述步骤：a)鉴别患有局部缺血/再灌注损伤或处于其风险下的受试者(如，患者，且更具体为人类患者)；和b)向该受试者提供治疗有效量的增加BAG3水平的药物组合物。受试者可以是需要进行与局部缺血/再灌注损伤相关的外科手术的受试者。例如，对于患有急性心肌梗死的患者，用于减轻急性心肌局部缺血性损伤并限制心肌梗死面积的最有效的治疗性干预手段，是使用血栓溶解疗法或直接精辟冠状动脉介入治疗(PPCI)进行的心肌再灌注。可使用传统临床测试鉴别受试者，例如，验血、胸部x光片、心电图(ECG)、超声波心动图、负荷试验、CT扫描、MRI、或心导管插入术。将一定量的此组合物提供给该受试者，若导致局部缺血/再灌注损伤症状的完全消退、局部缺血/再灌注损伤症候严重程度的下降、或局部缺血/再灌注损伤的进展变慢，则将该量视为治疗有效的量。本发明的方法也可包括监控步骤，以帮助优化给药剂量和给药时间表并预测结果。

[0074] 给药该组合物的时机可变。在急性局部缺血事件如心脏病发作、心肺骤停、中风或大出血事件的情形中，可在再灌注之前给药该组合物。该组合物可作为大药丸，例如由现场急救员(如，战地军医、急救医务人员(EMT)或任何其它训练有素的医疗人员)给药至该受试者。或者，或除了作为药丸给药之外，该组合物还可通过持续一段时间的慢滴输液或输注给药。例如，慢滴或输注给药可在创伤现场、转运至医疗机构的过程中、及/或个体到达医疗机构时进行。生理上，紧随损伤或创伤之后的时期是关键期，这一时期有时称为“黄金小时”，但将该组合物给药至个体可持续长达72小时或更久(如，长达1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、60小时、90小时或更久)。作为慢滴或输注给药的替代，可将组合物的药物在24、48、或90小时的时间段内分多次给药。

[0075] 一些具体实施例中，可在意识到潜在的局部缺血或再灌注损伤后，立即将该组合物给药至受试者。一些具体实施例中，可恰好在再灌注治疗之前或该治疗过程中给药该组合物。该给药可在再灌注治疗完成后继续进行。一些具体实施例中，该组合物可在再灌注治疗之后给药。该组合物亦可在可能导致局部缺血/再灌注损伤的医疗过程之前，例如，作为术前治疗的一部分，给药至计划进行外科手术过程的受试者。

[0076] 本文中揭露的方法可用于大量物种，如人类、非人灵长动物(如，猴)、马或其它家畜、狗、猫、雪貂或其它宠物类哺乳动物、大鼠、小鼠、或其它实验室动物。

[0077] 本发明的方法可表达为制备药剂的术语。据此，本发明涵盖本文中揭示的剂和组合物在制备药剂中的用途。本文中揭示的化合物可用于治疗性组合物和治疗方案中，或用于制造用于治疗本文中揭示的疾病或病症的药剂。

[0078] 本文中揭示的任何组合物均可给药至宿主身体的任何部位，以便随后将其输送至靶点细胞。可将组合物输送至，但不限于，心脏、脑、脑脊液、肾脏、关节、鼻粘膜、肺、肠、肌肉组织、皮肤、前列腺、睾丸、或哺乳动物的腹腔。就输送途径而言，组合物可通过静脉注射、颅内注射、腹膜注射、肌肉注射、皮下注射、肌肉注射、直肠注射、阴道注射、鞘内注射、气管内注射、皮内注射、透皮注射、口服、鼻腔给药、或随时间逐步灌流给药。进一步的实例中，组合物的喷雾制剂可通过吸入而给药至宿主。

[0079] 所需的剂量将取决于给药的途径、配方的特性、患者疾病的特性、患者身体尺寸、体重、体表面积、年龄和性别、正在使用的其它药物、以及临床医生的判断。考虑到细胞靶点以及多种给药途径的不同效率，所需剂量的变动预计较大。这些剂量水平的变动，可使用标准经验优化途径调节，如该领域中所周知。给药可以是单一加量或多倍剂量(如，2倍或3倍、4倍、6倍、8倍、10倍、20倍、50倍、100倍、150倍、或更多倍)。将该化合物封装在适当的输送运载剂(如，聚合物微粒或可移植的装置)内，可增加输送效率。

[0080] 使用本文中提供的任何组合物进行治疗的持续时间可以是从短至一天至长达该宿主生命长度(如，很多年)之间的任何时间长度。例如，化合物可每周给药一次(例如，给药4周至多个月或多年)；每月给药一次(例如，给药3至12个也或给药多年)；或每年一次，给药
5年、10年、或更久。还应注意，治疗的频率可变。例如，本发明的化合物可每天、每周、每个月、或每年给药一次(或两次、三次等)。

[0081] 可将有效量的本文中提供的任何组合物给药至需要治疗的个体。本文中使用的术语“有效的”指的是，在患者体内引发所希望的响应而不引发显著毒性的任何量。可通过评估患者在给药已知量的特定组合物后的响应来确定这一量。此外，若存在任何毒性，则可通过评估患者在给药已知量的特定组合物之前和之后的临床症状来确定该毒性的水平。注意，可根据所希望的结果以及该患者的响应和毒性水平来调节给药至患者的特定组合物的有效量。对于每一特定患者的显著毒性可变，且该显著毒性取决于多种因素，包括但不限于，该患者的疾病状态、年龄和对副作用的耐受性。

[0082] 该领域技术人员已知的任何方法，均可用于确定是否引发特定的响应。可评估特定疾病状态的程度的临床方法，可用来确定是否引发响应。用以评估响应的特定方法将取决于该患者病症的特性、该患者的年龄和性别、正在使用的其它药物、以及临床医生的判断。

[0083] 该组合物也可在其它治疗的同时给药。该组合物可与另一治疗剂同时给药，该另一治疗剂包括但不限于，抗炎剂(如，阿司匹林、布洛芬(ibuprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、吡罗昔康(piroxicam)、吲哚美辛(indomethacin)、双氯灭痛(diclofenac)、舒林酸(sulindac)、萘普生或塞来昔布)、血管舒张药(如，硝化甘油)、β-受体阻滞药(如，烯丙心安(alprenol)、布新洛尔(bucindolol)、美开朗(cartelol)、卡维地洛(carvedilol)、纳多洛尔(nadolol)、吲哚洛尔(pindolol)、普萘洛尔(propranolol)、阿替洛尔(atenolol)、比索洛尔(bisoprolol)、美托洛尔(metoprolol)、奈比洛尔(nebivolol)、醋丁洛尔
(acebutolol)、倍他洛尔(betaxolol)或布他沙明(butaxa分钟e))、降胆固醇药物(如，他汀类、纤维酸类、烟酸、胆酸树脂、或胆固醇吸收抑制剂)、钙通道阻滞药(如，洛美利嗪(lomerizine)或苄普地尔(bepridil))、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂(如，苯那普利(benazepril)、卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、福辛普利(fosinopril)、赖诺普利(lisinopril)、莫西普利(moexipril)、培哚普利(perindopril)、喹那普利
(quinapril)、雷米普利(ramipril)或群多普利(trandolapril))、雷诺嗪(ranolazine)、或抗凝血剂(如，香豆素类或肝素类)。其它例示性的剂可包括腺苷、心房利钠肽、阿托伐他汀、环孢菌素A、delcasertib、红细胞生成素、艾塞那肽、葡萄糖胰岛素钾(GIK)疗法、和硝酸钠。

[0084] 该组合物也可在其它治疗形式的同时给药，该其它治疗形式包括外科手术，如血管介入治疗过程，例如，血管成形术、冠状动脉搭桥手术、或支架。该组合物也可在使用医疗装置的同时协同给药。例示性的医疗装置包括左心室辅助装置。

[0085] 或者，或此外，该组合物可在局部缺血性后处理(IPost)过程中给药，该Ipost是急性心肌局部缺血的间歇性再灌注。其它治疗手段包括而不限于，远程局部缺血处理、治疗性低体温、以及治疗性血酸过多。

[0086] 该组合物也可与生活方式的修正协同给药，如戒烟、减重、短链、饮食控制、和减少酒精摄入。

[0087] 两种或多种治疗剂的并行给药并不需要将这些剂同时给药或通过相同途径给药，只要这些剂在其疗效存在的时间段内有所重叠即可。设想为同步或依次给药，亦可在不同日期或周内给药。这些治疗剂可以节律性方案给药，如，连续低剂量的治疗剂。

[0088] 可通过标准药学过程在细胞培养物或实验动物体内测定组合物的剂量、毒性和疗效，如，测定LD50(将群体中50％致死的剂量)和ED50(对群体中50％产生疗效的剂量)。毒性效果与疗效之间的计量比是治疗指数，治疗指数可表达为LD50/ED50之比。

[0089] 从细胞培养分析和动物实验中获得的数据可用于制订用于人类的剂量范围。该组合物的剂量优选处于包括具有低毒或无毒的ED50在内的循环浓度范围内。在这范围内，该剂量可依据所采用的剂型和所使用的给药途径而变。对于本发明的方法中使用的任意组合物，最初可从细胞培养分析中构建治疗有效的剂量。可在动物模型中制订剂量，以实现包括在细胞培养中测得的该IC50(即，测试化合物实现对症状的半最大抑制的浓度)在内的循环血浆浓度范围。这信息可用来更准确地确定可用于人类的剂量。可通过例如高效液相色谱测量血浆中的水平。

[0090] 制品

[0091] 本文中揭示的组合物可封装在适当的标有标签的容器中，该标签为，例如，用作治疗正苦于局部缺血/再灌注损伤或处于其风险下的受试者的治疗剂。该容器可包括组合物，该组合物包含增加局部缺血组织内BAG3水平的剂。

[0092] 一些具体实施例中，该剂可以是编码BAG3多肽或其片段的核酸序列或编码该核酸的载体，以及，若适用于所期待的用途，一种或多种适当的稳定剂、载剂分子、芳香剂等。一些具体实施例中，该剂可以是BAG3多肽或其片段，以及，若适用于所期待的用途，一种或多种适当的稳定剂、载剂分子、芳香剂等。一些具体实施例中，该剂可以是增加靶点组织中的BAG3表达或活性的剂，以及，若适用于所期待的用途，一种或多种适当的稳定剂、载剂分子、芳香剂等。一些具体实施例中，该剂可以是蛋白酶体抑制剂，如硼替佐米。据此，封装的产品(如，含有一种或多种本文中揭示的组合物并经封装以便以浓缩浓度或即用浓度储存、运输或售卖的无菌容器)和试剂盒包括至少一种本发明的组合物，如，编码BAG3多肽或其片段的核酸序列或编码该核酸的载体。产品可包括含一种或多种本发明的组合物的容器(如，小瓶、罐、瓶、袋等)。此外，制品可进一步包括，例如，封装材料、使用说明书、注射器、输送装置、缓冲液、或用于治疗或监控需要进行预防或治疗的症状的其它对照试剂。

[0093] 一些具体实施例中，该试剂盒可包括一种或多种额外的治疗剂。该额外的治疗剂可与增加局部缺血组织内BAG3水平的剂，即编码BAG3多肽或其片段的核酸序列或编码该核酸的载体、BAG3多肽或其片段、或一些抑制剂，一起封装在同一容器内，或者它们可以单独封装。增加局部缺血组织内BAG3水平的剂和该额外的剂可在将要使用之前合并，或可单独给药。

[0094] 该产品可包括说明(如，揭示产品用途的标签或插页或其它媒介(如，音频或视频))。该说明可与容器关联(如，粘贴在该容器上)，且可揭示其内部的组合物应采取的给药模式(如，给药的频率和途径)、该组合物的适应症、以及其它用途。该组合物可直接给药(如，以剂量适宜的单位存在)，且可包括一种或多种额外的药学可接受的佐剂、载剂或其它稀释剂及/或额外的治疗剂。或者，该组合物可提供为浓缩形式，同时提供稀释剂和稀释说明。

[0095] [实施例]

[0096] 实施例1：材料和方法

[0097] 动物协议：新生小鼠是从雌性FVB小鼠获得的出生三天内的新生小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)。使用8至10周龄的雄性FVB小鼠(Jackson Laboratory)，如先前所述，进行30分钟的冠状动脉结扎和后续的再灌注后，进行梗死面积的评估。除LAD未结扎之外，以完全相同的手法处理经虚假手术的对照动物。所有实验均根据《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》(National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)实施，并得到天普大学动物护理与使用委员会(Temple University Institutional Animal Care and Use Committee)的批准(ACUP#4031)。

[0098] 初代新生小鼠心室心肌细胞(NMVC)的制备：使用初代心肌细胞分离试剂盒(Cat.88281,赛默科技公司(Thermo scientific,Rockford,IL))，根据制造商的使用说明书，从1至3日龄FVB小鼠分离NMVC。将心肌细胞以2×106个细胞/板的浓度种植在6孔板的每孔内，并在具有1％胎牛血清(丹维尔科学公司(Denville Scientific Inc.Holliston,MA))和1％青霉素-链霉素(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific,Waltham,
MA))的杜尔贝科改进伊格尔培养基(DMEM,GIBCO,CA)中培养。24小时后，在37℃和5％CO2下，将全部培养基替换为含有心肌细胞生长补充剂的新鲜DMEM。

[0099] BAG3腺病毒的构建和使用：如先前所述，使用BD Adeno-X表达系统2PT3674-1和BD敲除RNAi系统PT3739(BD-生物科学-分子生物学公司(BD Biosciences-Clontech,Palo Alto,CA))构建表达GFP的腺病毒(Ad-GFP)、表达BAG3的腺病毒(Ad-BAG3)或表达siBAG3的腺病毒(Ad-siBAG3)。分离后48小时，以腺病毒感染NMVC，感染复数为8。将NMVC在腺病毒中暴露过夜，之后，抽出培养基并应用新鲜培养基。每天更换培养基。在感染后，实验再进行72小时。

[0100] 缺氧/复氧作用：如先前所述并做修改，令NMVC进行H/R。简单地说，将NMVC在37℃的湿润5％CO2:95％N2下暴露14小时，并在不含葡萄糖的培养基中孵化。随后在含有葡萄糖的培养基中使用5％CO2:95％湿润空气将细胞复氧4小时。每天更换培养基。

[0101] 免疫印迹：切除心脏，并将左心室分为梗死边界(尖端接近最末端的3mm)和远区(邻近隔膜)。将组织在液氮中快速冷冻，并在-80℃存储备用。如先前所述，制备膜蛋白。简单地说，将组织在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(ThermoScientific；Rockford,IL)的缓冲液(细胞信号转导技术公司(Cell Signaling Technologies,Beverly,MA))中裂解，并使用微球在Bullet Blender组织细胞破碎仪(Next Advance,Averill Park,NY)内均质化。以冰冷的PBS冲洗NMVC，收集，并在缓冲液中裂解。在4℃以13,000g离心5分钟后，收集上清液，并通过Bradford分析(伯乐公司(Bio-Rad,Philadelphia,PA))测定蛋白质水平。将等量的蛋白质(90μL)与30μL的4X NuPAGE SDS样本缓冲液(ThermoFisher,Carlsbad,CA,USA)和
15μL的10X NuPAGE还原剂(ThermoFisher)混合，煮沸，在NuPAGE Novex 4-12％Bis-Tris蛋白质凝胶(ThermoFisher)上使用NuPAGE电泳系统(ThermoFisher)分离，再转移至硝酸纤维素膜(LiCor,Lincoln,NE)上。将这些膜于室温下在Odyssey封闭缓冲液(LiCor)中封闭1小时，之后使用初级抗体孵化过夜。该膜以1X PBS-T(0.1％Tween 20)洗涤，并使用次级抗体于室温孵化1小时。使用Odyssey 扫描仪检测蛋白质条带信号。初级抗体是Myc(Cell
Signaling Technologies)、BAG3(Protein Tech)、Bcl-2(Cell Signaling
Technologies)、LAMP-2(ThermoFisher)、被裂解的半胱天冬酶-3(Cell Signaling
Technologies)、JNK(圣克鲁兹生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology,Dallas,TX))、P-JNK(Cell Signaling Technologies)、组蛋白、β-微管蛋白、以及β-肌动蛋白(Santa Cruz Biotechnology)。次级抗体是：羊抗鼠IRDye 800(LiCor)和IRDye 680羊抗兔
(Rockland,Gilbertsville,PA)。

[0102] 共聚焦显微镜：如先前所述，使用共聚焦显微镜来检测成熟心肌细胞中的BAG3位置。简单地说，分离新生小鼠LV心肌细胞并将其置于涂覆层粘连蛋白的4孔室玻片(Lab-Tek.,Rochester,NY)上。使用初级兔抗体(1:200；蛋白质技术集团公司(Proteintech Group Inc,Chicago IL))鉴别BAG3，并使用鼠抗体(1:200,西格玛-阿德瑞希公司(Sigma Ldrich))鉴别α-肌节肌动蛋白。该刺激抗体是Alexfluor 594-标记的羊抗兔抗体(1:500；英杰公司(Invitrogen,Eugene,OR))，且封固剂含有4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)(伯林盖姆载体实验室(Vector Laboratories Burlingame,CA))。使用具有ZEN 软件的Carl Zeiss 710共聚焦显微镜(63x油浸物镜)对BAG3(594nm ex.,667nm em.)、α-辅肌动蛋白(488nm ex.,543nm em.)和DAPI(405nm ex.,495nm em.)成像。所有组的总激光强度和光电倍增管增益设定为恒定，且通过两位不了解该实验组的独立观察者核实设定和数据。
每一实验组使用最少三片盖玻片，且从每片盖玻片撷取至少三张细胞图像。

[0103] 自体吞噬RFP-GFP-LC3报告系统：如先前所述，以表达mRFP-GFP-LC3的腺病毒感染经分离的NMVC，感染复数为1。感染后，令NMVC进行24小时的H/R，随后以多聚甲醛固定在磷酸盐缓冲盐水中。以PBS冲洗后，使用0.3％Triton X-100在10％正常山羊血清封闭溶液(英杰生命技术公司(Invitogen,Life technologies corporation,Frederick.MD))中将该细胞渗透60分钟。使用Hardset抗褪色封固剂(Vector Laboratories.,Burlingame,Ca)将盖玻片装在载玻片上，如上所述，使用在594nm激发和667nm发光撷取的mRFP以及在488nm激发和543nm发光撷取的GFP实施共聚焦成像。获得数码图像后，计数每一实验组中7至10个细胞的斑块。融合通道中的黄色斑块的数目表示自噬体的数目。如先前所述，自溶酶体(自噬体-溶酶体的融合体)的数目通过红色斑块的数目表示。

[0104] 细胞分级分离：使用NE-PER细胞核与细胞质萃取试剂盒(Thermo scientific,Rockford,IL,USA)，根据制造商的使用说明书，制备NMVC的细胞质部分和细胞核部分。细胞质提取物和细胞核提取物均在-80℃存储，以备蛋白质印迹之用。

[0105] rAAV9-BAG3的构建和给药：将编码鼠科动物myc-示踪的BAG3的序列(NCBI登录号BC145765)插入含有巨细胞病毒(CMV)启动子的pAAV载体(Vector Biolabs,Malvern,PA)内。随后，通过HEK293的转染而将该构造封装入AAV-9中，并通过CsC12离心分离(Vector Biolabs)来纯化病毒颗粒。重组AAV9-BAG3也表达绿色荧光蛋白(GFP)，但GFP不在具有BAG3的序列中。通过测序核实克隆体和最终载体的保真度。MI小鼠和虚假手术(Sham)小鼠均随机分配，以在37℃通过注射入眶后静脉丛而接受60-80μL的处于无菌PBS中的rAAV9-BAG3(5.0-6.5×1013个基因组拷贝(GC)/ml)或rAAV9-GFP对照物(3.1×1012GC/ml)，如先前所述。

[0106] 超声波心动描记术：在轻度镇静(2％异氟烷)后，如先前所述，使用VisualSonics Vevo 770成像系统和707扫描头(Miami,FL)评价所有小鼠的总体LV功能。使用式EF％＝[(LVEDV-LVESV)/LVEDV]×100计算左心室射血分数(LVEF)，其中，LVEDV和LVESV分别是左心室舒张末容积和左心室收缩末容积。

[0107] 梗死面积的测定：如先前所述，2％三苯基四邻(TTC)染色心肌，以测量梗死面积。简言之，I/R后72小时，重系LAD周围的活结，之后注射2％伊文思蓝染料(0.2ml)。切除心脏，将LV切为三片垂直于心脏短轴的1.2mm厚的切片，并在含有TTC的PBS中孵化。20分钟后，在室温对该切片进行数码照相。使用基于计算机的图像分析仪SigmaScan Pro 5.0(SPSS Science,Chicago,IL)测量伊文思蓝染色的区域(未处于风险下的区域)、TTC阴性区域(梗死的心肌)和处于风险下的区域(AAR，包括TTC阴性区和阳性区)。AAR表达为基于总LV的百分比，而梗死的心肌则表达为基于AAR的百分比。对于蛋白质印迹分析，边界区包括从心脏尖端计的3mm心室区域。

[0108] 统计分析：使用Graph Pad Prizm 6或JMP第12版分析数据。数据表达为连续变量的均值±SEM。使用双因素ANOVA和Bonferroni多重比较调整来评估各调查组之间的差异。对于蛋白质印迹分析，将p<0.05的p值视为显著。每一实验的对照(如，Ad-GFP或正常含氧量)设定为1.0。

[0109] 实施例2：缺氧/复氧作用降低NMVC中的BAG3水平

[0110] 当与含氧量正常的对照物相比时，H/R后的NMVC中的BAG3水平显著减少(图1A和图1B，p<0.01)。根据实施例1中的方法，制备NMVC并培养。简而言，将NMVC于37℃在正常含氧量条件(5％CO2和95％氮气，3L/分钟)下以及葡萄糖的缺失下培养14小时，随后使用5％CO2和
95％湿润空气以及含有葡萄糖的孵化培养基复氧4小时。为了探索BAG3水平在H/R后降低可能借以影响细胞损伤的潜在信号传导途径，我们测量细胞凋亡和自体吞噬的标记物。收获心肌细胞，对细胞裂解液进行免疫印迹，以测定BAG3、被裂解的半胱天冬酶-3、Bcl-2、和LAMP2的水平。β-肌动蛋白作为对照物用于加载至蛋白质印迹上的蛋白质的量。每一实验重复进行三次独立实验，且每一实验中，n＝3。如图1中所示，与正常含氧量的对照物相比，Bcl-2水平(图1C；p<0.01)和LAMP-2水平(图1E；p<0.01)显著减少，而被裂解的半胱天冬酶-
3(图1D；p<0.01)的水平显著增加。

[0111] 为了评估仅BAG3水平的减少是否阻抑改变细胞凋亡和自体吞噬标记物的水平，我们使用siRNA(Ad-siBAG3)将NMVC中的内源BAG3比使用Ad-GFP对照物感染的细胞减少大约90％(图1F和图1G)。如实施例1中所述，将NMVC在培养中使用Ad-siBAG3或Ad-GFP(对照物)感染3天，之后收获细胞，并使用特定抗体进行免疫印迹。在H/R后的NMVC中观察到的细胞凋亡和自体吞噬标记物的变化概括于NMVC中，在该细胞中，随着被裂解的半胱天冬酶-3的水平增加(图1H；p<0.01)，BAG3表达被siRNA减少；而Bcl2水平(图11；p<0.01)和LAMP-2水平(图1J；p<0.01)比暴露于Ad-GFP对照物的细胞显著减少。

[0112] 实施例3：BAG3过度表达减少自体吞噬和细胞凋亡标记物的变化

[0113] 如上述实施例1中所述，制备NMVC，令其进行H/R，收获，随后进行免疫印迹。使用Ad-BAG3将NMVC感染3天，之后评估比以Ad-GFP感染的NMVC适度增加的BAG3水平(p<0.01)，如图2A和图2B中所示。同源，在进行H/R的肌细胞中，Ad-BAG3大幅度增加BAG3水平(p<0.05)，如图2A和图2B中所示。对于NMVC中的JNK激活或被裂解的半胱天冬酶-3、Bcl2和LAMP-2的水平，Ad-BAG3没有效果，如图2A和图2C至图2F中所示。相比之下，与使用Ad-GFP感染的对照NMVC相比，在H/R之前3天接受Ad-BAG3的NMVC已经显著降低了p-JNK的水平(p<
0.05)和被裂解的半胱天冬酶-3的水平(p<0.05)，并显著增加Bcl2的水平(p<0.05)和LAMP-
2的水平(p<0.01)，如图2A和图2C至图2F中所示。

[0114] 实施例4：BAG3调节心肌细胞自体吞噬

[0115] 为了确定自体吞噬标记物的变化是否代表H/R后自体吞噬的量的实际变化，使用Ad-BAG3或Ad-siBAG3操控NMVC内的BAG3水平，之后使用双标记的RFP-GFP-LC3-I自体吞噬报告系统转染该细胞，随后将该细胞暴露于H/R，如上述实施例1中所述。这一系统具备下述事实的优点：LC3-I在翻译后为类泛素系统所修饰，该类泛素系统将LC3-I转化为其脂质化的LC3-II形式。LC3-II被隔绝入自溶酶体内，在该处，LC3-II被降解或循环。在自噬体中，LC3斑块发出绿色和红色两种荧光。但在自溶酶体的酸性环境中，GFP荧光被淬灭，留下占据主导的红色斑块。因此，鉴于红色斑块仅表示RFP，黄色斑块代表合并的GFP荧光(绿色)和RFP荧光(红色)，且反映自噬体的存在。鉴于当自体吞噬受到削弱的吞噬体-溶酶体融合阻碍时，黄色荧光占据主导，因此在吞噬体-溶酶体的正常融合中，红色荧光将多于黄色荧光。图3A中的共聚焦图像还显示，在已经进行H/R或已经使用siBAG3感染的NMVC中，黄色斑块更为突出。相比之下，RFP信号更为突出，表明合并入自溶酶体的LC3增加。通过技术各组(对照组、H/R组、siBAG3组合H/R+Ad-BAG3组：图3B)中黄色斑块和红色斑块的数目，对于共聚焦图像的主观评价得以核实。此外，在H/R后，自溶酶体(红色斑块)/自噬体(黄色斑块)/所计数的细胞数的比显著减少，这一变化是通过Ad-BAG3造成的BAG3过度表达减弱该比而导致的，鉴于BAG3过度表达恢复自体吞噬的对照水平，这一变化表明H/R和BAG3水平下降均减少自体吞噬的量(图3C)。

[0116] 实施例5：在缺氧/复氧的应力下，BAG3位置转移至细胞核周围和细胞核区域

[0117] 在正常条件下，共聚焦成像表明，BAG3主要见于新生肌细胞的细胞质中，与我们先前的观察结果一致。然而，当令NMVC进行H/R时，BAG3主要见于细胞核周围区域中和细胞核中，如图4A中所示。通过siRNA在正常含氧量的NMVC中敲除BAG3，也导致BAG3位置转移至细胞核周围区域和细胞核内，如图4A中所示。细胞分级分离研究证实了通过共聚焦显微镜获得的形态学发现，在H/R后或使用siRNA敲除BAG3后，细胞溶质部分中的BAG3减少但细胞核部分中的BAG3增加(图4B and 4C)。如图4B中可见，这些部分的特异性通过主要存在于细胞溶质提取物中的β-微管蛋白和主要存在于细胞核部分中的组蛋白而得以证实。

[0118] 实施例6：小鼠体内的BAG3过度表达在局部缺血/再灌注(I/R)后增强左心室功能并降低梗死面积

[0119] 为了评估对于NMVC中BAG3的研究是否与小鼠体内相关，我们测量了I/R后心脏的心室功能和梗死面积，其中，在经眶后注射表达myc-示踪的BAG3的rAAV9后，BAG3在CMV启动子的控制下被过度表达。如图5A和图5B中可见，在接受眶后注射rAAV9-BAG3的小鼠进行I/R后两天所测量的左心室(LV)射血分数(EF)，显著大于接受rAAV9-GFP对照物的小鼠(p<0.01)。与从新生肌细胞获得的结果一致，心肌的BAG3水平在I/R后下降但在rAAV9-BAG3后上升(图5C)。注射rAAV9-BAG3并未改变处于风险下的区域(图5D和图5E)，但与已经接受注射rAAV9-GFP的小鼠的梗死面积相比，在I/R后72小时的梗死面积显著(p<0.01)减小(图5D和图5F)。

[0120] 实施例7：I/R后小鼠梗死边缘区域的BAG3过度表达概括了在H/R后的NMVC中见到的自体吞噬和细胞凋亡标记物的变化

[0121] 在接受rAAV9-BAG3的小鼠心脏内观察到myc表达，但在接受rAAV9-GFP的小鼠心脏内未观察到myc表达，借由上述发现可知，rAAV9-BAG3在进行眶后注射的小鼠心脏中被表达(图6A)。与从NMVC获得的结果一致，rAAV9-BAG3显著增加Bcl2的水平(p<0.01；图6A和图6B)和LAMP-2的水平(p<0.01；图6A和图6B)，并显著减少被裂解的半胱天冬酶-3的水平(p<0.01；图6A和图6C)和p-JNK的水平(p<0.01；图6A和图6D)。

[0122] LAMP2是自噬体-溶酶体融合的重要决定因素；Bcl2通过中断其与Beclin 1的导致Beclin 1相关III类ptdlns3K复合体激活的联合而刺激自体吞噬，同时，当结合至BAG3的Bcl2结合位点时，在限制细胞凋亡中扮演角色；而被裂解的半胱天冬酶-3是对细胞凋亡执行过程中的核染色质边集、DNA片段化和细胞核崩溃负责的蛋白酶。但是，围绕生物标记物用于测量自体吞噬的用途存在巨大争议，因为自体吞噬是一种动态多步骤进程，该进程始于吞噬泡的形成，通过该吞噬泡的成熟而向前发展，同时将来自不同细胞内来源的膜复原并蓄积目标蛋白质，并最终与溶酶体融合以形成自溶酶体，以便开始蛋白质消解进程。

[0123] 为了更好地评估BAG3水平的下降和上升对于自体吞噬的影响，我们使用了由双标记的微管相关蛋白轻链3(LC3-I)组成的自体吞噬包含系统。这一系统具备下述事实的优点：LC3-I在翻译后为类泛素系统所修饰，该类泛素系统将LC3-I转化为锚定于自噬体膜的外部或内部的其脂质化的LC3-II形式。LC3-II被隔绝入自溶酶体内，在该处，LC3-II被降解或循环。这一分析具备下述事实的优点：自噬体中的LC3斑块发出绿色和红色两种荧光。但是，在自溶酶体的酸性环境中，GFP荧光被淬灭，留下占据主导的红色斑块。鉴于BAG3的过度表达修复该自体吞噬进程，这些研究表明，H/R和BAG3敲除均导致自体吞噬减少。这些结果与Ma et al早前的报导一致，证明局部缺血/再灌注损伤对部分地由反应性氧诱发的LAMP-2下降介导的自噬体清除造成削弱。

[0124] 当BAG3的水平在H/R或I/R过程中下降时，INK被激活(p-JNK)；但当分别通过Ad-BAG3或rAAV9-BAG3增加NMVC或成年心脏中的BAG3水平时，该激活的水平降低。JNK属于MAPK家族的激酶，但不同于其它激酶的是，它属于术语可令包括转录因子和支架蛋白在内的非激酶底物磷酸化的MAPK组(p-JNK、ERK1/2和p38)。先前研究已经证明，JNK在局部缺血后的再灌注过程中在心脏内被激活，而非仅由局部缺血激活。而且，在非肌细胞中的研究表明，鉴于JNK抑制剂降低BAG3表达，JNK的激活提升了BAG3基因表达。因此，可能存在一个反馈环，当BAG3水平高时，该反馈环减少JNK激活，而当BAG3水平低时，则增加JNK激活。但是，BAG3与JNK见的相互作用极为复杂，需要进一步研究来弄清心脏中BAG3与JNK之间的关系。

[0125] 在缺氧与复氧的应力下，BAG3的位置从细胞质转移至细胞核。在尚未有关于心肌细胞中BAG3位置转移的报导。这一发现与先前研究一致，先前研究证明BAG3可见于人类胶质细胞内，导致其具有刺激通过牵涉其5'-未翻译序列的正反馈环而进行自我转录的能力。因此，除了增加BAG3在心脏中的一系列功能之外，似乎BAG3亦可调节基因表达。这一可塑性是由于该BAG3蛋白内存在大量蛋白质结合基序。

[0126] 实施例8：硼替佐米(Bortezomib)增加NMVC体内的BAG3水平

[0127] 在H/R后，使用硼替佐米将NMVC处理0.5、1、2、4或18小时。通过实施例1中揭示的免疫印迹法分析BAG3的水平。硼替佐米处理导致BAG3水平相对于以运载剂处理的对照细胞发生时间依赖性的增加。

标题	发布/更新时间	阅读量
GW3965用于制备防治肾缺血再灌注损伤药物的应用	2020-05-12	300
缺血/再灌注保护组合物和使用方法	2020-05-11	566
治疗缺血再灌注的方法和组合物	2020-05-11	755
用于治疗再灌注损伤的方法	2020-05-11	672
与缺血再灌注相关的水肿的治疗方法	2020-05-11	139
用于治疗缺血再灌注损伤的糖脂	2020-05-12	816
一种用于防治缺血再灌注损伤的组合物	2020-05-12	99
一种用于防治缺血再灌注损伤的组合物	2020-05-12	113
局部缺血/再灌注损伤	2020-05-11	193
复苏中的再灌注保护	2020-05-11	992

局部缺血/再灌注损伤

局部缺血/再灌注损伤

技术领域

背景技术

发明内容

具体实施方式

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：