技术领域

本发明涉及缺血性伤害和再灌注损伤，更具体地说，涉及治疗或预防缺血 和/或再灌注导致的损伤和伤害的组合物和方法。例如，出血性休克可导致缺血 和/或再灌注损伤。

背景

缺血通常是血液供给受限制，从而产生组织伤害或机能障碍。缺血指某器 官的血液供给的绝对或相对短缺。血液供给的相对短缺表示血液供给(氧输送) 与组织充分供氧的要求不匹配。

再灌注损伤指缺血一段时期后血液供给输回组织时对该组织导致的伤害。 血液中没有氧和养分导致恢复循环时会产生炎症和氧化或过氧化伤害这一状 况。

发明概述

可将一种或多种酮体和褪黑素给予个体以保护该个体免遭缺血性伤害和/ 或再灌注损伤。

一方面，本发明提供缺血/再灌注保护组合物。本文公开的缺血/再灌注保 护组合物包含一种或多种酮体和褪黑素或基本上由它们构成。所述一种或多种 酮体可以是，例如D-β-羟基丁酸或其药学上可接受的盐(例如，D-β-羟基丁酸 钠)，乙酰乙酸或其药学上可接受的盐，或D-β-羟基丁酸(盐)和乙酰乙酸(盐)的 组合。褪黑素可以是，例如5-甲氧基-N-乙酰色胺。在一些实施方式中，所述 组合物基本上不含无机阴离子。

在一些实施方式中，缺血/再灌注保护组合物是液体组合物。当配制成液 体时，缺血/再灌注保护组合物可具有约0.1M-约0.8M酮体和约4μM-约150 mM褪黑素。在一具体实施方式中，缺血/再灌注保护组合物可具有约4M D-β-羟基丁酸钠和约43mM褪黑素。在一些实施方式中，缺血/再灌注保护 组合物基本上不含Cl-。在液体组合物的某些实施方式中，溶剂是水。在一 些实施方式中，液体组合物包含增溶剂(例如DMSO)和/或稳定剂。

在其它实施方式中，缺血/再灌注保护组合物是干粉组合物。当配制成干 粉时，缺血/再灌注保护组合物中酮体与褪黑素的摩尔比是约100比1。

这种缺血/再灌注保护组合物还可包含一种或多种抗生素，一种或多种游 离脂肪酸，一种或多种镇痛剂，一种或多种激素，和/或改变细胞代谢的一种或 多种化合物(例如，多肽、反义或siRNA分子、药物或小分子)。

在一方面。本发明提供包含缺血/再灌注保护组合物的制品。在一个实施 方式中，所述制品可以是含有缺血/再灌注保护组合物(例如，液体制剂或干粉 制剂)的IV袋。在另一实施方式中，制品可以包含第一和第二容器，其中所述 第一容器装有缺血/再灌注保护组合物，所述第二容器装有溶剂。在这样的实施 方式中，可以将所述制品构建成第二容器中的溶剂能可控地与第一容器中的组 合物接触。在另一实施方式中，制品包括含有缺血/再灌注保护组合物的注射器 筒。在还有另一实施方式中，制品可包括包装材料和缺血/再灌注保护组合物， 其中所述包装材料可包括标签或包装插页，所述标签或包装插页载有关于治疗 正发生或曾发生失血，正发生或曾发生中风，将要或正进行医学措施(例如， 外科手术)的个体的使用说明。

在另一方面，本发明提供治疗正发生或曾发生失血的个体的方法。这些方 法包括将一种或多种酮体和褪黑素给予该个体。在一些实施方式中，所述一种 或多种酮体和褪黑素在一份组合物中一起给予。在某些实施方式中，需要治疗 的所述个体的StO2水平低于75％。所述给药步骤通常导致该个体的StO2水平 回复到高于75％，这表示该个体已经治疗过。在某些实施方式中，需要治疗的 所述个体的乳酸(盐)水平高于2.1mg/dl。所述给药步骤通常导致该个体的乳酸 (盐)水平回复到低于2.1mg/dl，这表示该个体已经治疗过。所述给药步骤通常 阻止个体的碱不足(base deficit)达到6mEq/L。

在某些实施方式中，所述个体正发生或曾发生大出血(例如，个体丧失其 至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、或至 少约60％的血液体积)。在一些实施方式中，个体失血导致收缩压为约70mm Hg(例如，65mm Hg、60mm Hg)或更低。在某些实施方式中，将一种或多 种酮体给予个体，其中所述酮体的给予量能在血液中有效达到约3mM-约 15mM的浓度，将褪黑素给予个体，其中所述褪黑素的给予量能在血液中 有效达到约20μM-约150μM的浓度。在某些实施方式中，所述一种或多 种酮体和褪黑素的给予体积是每公斤(kg)个体体重约0.3-约2毫升(ml)。在 某些实施方式中，所述一种或多种酮体和褪黑素的给予体积是每小时每kg 个体体重约0.3-约2ml。在某些实施方式中，以每kg个体体重约0.3-约2ml 的体积给予所述一种或多种酮体和褪黑素，然后以每小时每kg个体体重约 0.3-约2ml的体积给予所述一种或多种酮体和褪黑素。给予所述一种或多 种酮体和褪黑素的代表性途径的静脉内和骨内。

在另一方面，本发明提供治疗StO2水平低于75％和/或碱不足水平高于6 mEq/L的个体的方法，包括鉴定StO2水平低于75％或碱不足水平高于6mEq/L 的这种个体；和将一种或多种酮体和褪黑素高于该个体。

在还有另一方面，本发明提供保护个体免遭缺血性伤害或再灌注损伤的方 法。这些方法通常包括将一种或多种酮体和褪黑素给予个体。代表性的个体包 括曾中风或有中风风险的那些个体，正进行手术(例如，神经外科手术)的那些 个体。在一些实施方式中，所述一种或多种酮体和褪黑素的给予量是每kg个 体体重1ml。在某些实施方式中，这种给药之后可以缓慢输注一种或多种酮体 和褪黑素。

在还有另一方面，本发明提供在收集器官捐献者的器官之前先治疗该器官 的方法。这些方法通常包括将一种或多种酮体和褪黑素给予该器官捐献者(例 如，静脉内)。例如，所述一种或多种酮体和褪黑素的给予量可以是每kg器官 捐献者体重至少约1ml。在某些例子中，器官捐献者处于持续性植物状态 (persistent vegetative state)。

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域 的普通技术人员通常理解的相同。虽然与本文所述相似或等价的方法和材料可 用于实施或检验本发明，但以下描述的是合适的方法和材料。此外，材料、方 法和例子只是说明性而非限制性的。本文述及的所有出版物、专利申请、专利 和其它参考文献或参比材料通过引用全文纳入本文。如有冲突，以本说明书(包 括定义)为准。

附图和以下说明书列举了本发明一种或多种实施方式的细节。从附图和详 述以及权利要求可以明白本发明的其它特征、目的和优点。

附图描述

图1显示[1-13C]葡萄糖的结构。

图2显示[2，4-13C]D-β-羟基丁酸(盐)的结构。

图3显示了脑中13C-葡萄糖的基线水平。

图4是用加利福尼亚州帕洛阿尔托瓦里安公司(Varian；Palo Alto，CA) 的14.1Tesla UNITY INOVA分光光度计测定的冬眠地松鼠的选择代谢物的 标记图谱。图A显示在二月冬眠动物中IP注射1ml 1M 13C BHB的结果(处 死时Tb＝16.8℃)。图B显示在十二月冬眠动物中IP注射1ml 1M 13C葡萄 糖的结果(处死时Tb＝35.3℃)。两图中的数据均按照两个天然标记的13C-牛 磺酸峰作标准化，所述牛磺酸不随标记的输注而改变，从而可用于测定其 它各代谢物的浓度。缩写反映了指定的代谢物和标记的具体碳：Tau C1， 牛磺酸C1；BHB C2，β羟基丁酸C2；Tau C2，牛磺酸C2；Glu C4，谷氨 酸C4；BHB C4，β羟基丁酸C4；Lac C3，乳酸C3；G1c C1-α，葡萄糖C1α； G1c C1β，葡萄糖C1β。

图5显示大鼠和地松鼠(GS)脑中单羧酸转运蛋白(MCT1)和葡萄糖转运蛋 白(GLUT1)的免疫细胞化学结果。

图6显示根据免疫细胞化学试验，冬眠地松鼠中血脑屏障处的MCT1水 平升高。

图7显示根据血管中的MCT1光密度，在冬眠期间和八月(AUG)、十月 (OCT)和四月(APR)中，血脑屏障处MCT1的水平升高。

图8显示活动和冬眠地松鼠心脏中多肽的2-维凝胶。1，心室肌球蛋白轻 链(n.c.，活动，n＝5；冬眠，n＝4)；2，琥珀酰CoA转移酶(增加6-倍，*＝ p＜0.005)。

图9显示急性外伤实验的时间线。在用字母标记的时间点采血(A-J)。

图10显示给予每kg大鼠1ml 4M D-BHB或4M NaCl后的β-羟基丁酸 血清水平。一式三份计算样品以尽可能减少移液操作误差，并以mM浓度 表示。误差棒是平均值的标准误。

图11显示通过100微升/小时输注1ml/kg后，β-羟基丁酸的血清水平。 一式三份计算样品以尽可能减少移液操作误差，并以mM浓度表示。误差 棒是平均值的标准误。

图12显示出血性休克后温度维持(左柱)与循环血容量减少性冷却 (hypovolemic cooling)(右柱)对存活的影响。误差棒是平均值的标准误。

图13显示出血性休克后各种给药方案对存活的影响。误差棒是平均值的 标准误。

图14显示了在1小时期间给予所示治疗并发生60％失血的大鼠的卡-迈存 活图(Kaplan-Meyer survival plot)。失血60％后1小时，将流出的血液输回， 监测动物的存活率。假动物(sham animal)进行麻醉和插入导管，但并不失血。

图15显示所示治疗对心率的影响。

图16显示所示治疗对平均动脉血压的影响。

图17显示所示治疗对体温的影响。

图18显示猪出血性休克的复苏方案。SBP＝收缩压；UO＝尿排出量； Hgb＝血红蛋白。

图19显示各组大鼠的卡-迈存活曲线，所述大鼠发生60％失血并给予含有 4M D-BHB和43mM褪黑素(4M D-BHB+M)的缺血/再灌注保护组合物或含 有4M D-BHB、4M NaCl或4M NaCl加43mM褪黑素(4M NaCl+M)的对 照溶液。假动物除采血外不发生失血，但经麻醉、插导管并与其它组的动物恢 复同样的时间。血液输回＝流出的血液输回之时；18小时、24小时、48小 时、72小时、96小时和10天分别＝流出的血液输回后18小时、24小时、48 小时、72小时、96小时和10天。x-轴上的时间点未按比例绘制。

图20显示在各时间点检测的大鼠血清平均乳酸水平，所述大鼠发生60％ 失血并给予含有D-BHB和褪黑素(4M D-BHB+M)的缺血/再灌注保护组合物 或含有4M D-BHB、4M NaCl或4M NaCl加褪黑素(4M NaCl+M)的对照溶 液。各处理组中有10只动物。假动物(SHAM)除采血外不发生失血，但经麻醉、 插导管并与其它组的动物恢复同样的时间。低血压前＝失血前；35mm Hg＝ 约40％失血；Post soln infus＝溶液输注后；60％BL＝60％失血；60％BL 后1小时＝60％失血后1小时；血液输回＝流出的血液输回之时。

图21显示在许多时间点检测的猪血清D-BHB水平(mM)，所述猪发生失 血并给予含有D-BHB加褪黑素的低、中或高剂量的缺血/再灌注保护组合物。 还绘制了对照猪的血清D-BHB水平。休克30、60、90分别＝休克后30、 60和90分钟。1小时、2小时、4小时、6小时和8小时分别＝复苏开始 后1、2、4、6和8小时。左右垂直线分别表明液体给予的起始和终止时间。

图22显示在几个时间点检测的猪血清平均乳酸水平(mmol/L)，所述猪发 生失血并用缺血/再灌注保护组合物或对照溶液治疗。休克30、休克60和休 克90分别＝休克后30、60和90分钟。1小时、2小时、3小时、4小时、 5小时、6小时、7小时和8小时分别＝复苏后1、2、3、4、5、6、7和8 小时。左右垂直线分别表明液体给予的起始和终止时间。

图23显示在许多时间点的猪碱不足/过量值(mmol/L)，所述猪发生失血 性休克并用缺血/再灌注保护组合物或对照溶液治疗。起始＝启动出血性休克 方案之时；休克30、休克60和休克90分别＝休克后30、60和90分钟。 1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时和8小时分别＝ 复苏后1、2、3、4、5、6、7和8小时。

图24显示在几个时间点检测的猪血清的pH值(mmol/L)，所述猪发生失 血性休克并用缺血/再灌注保护组合物或对照溶液治疗。起始＝启动出血性休 克方案之时；休克30、休克60和休克90分别＝休克后30、60和90分钟。 1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时和8小时分别＝ 复苏后1、2、3、4、5、6、7和8小时。

图25显示在几个时间点检测的猪的外周组织灌注(StO2；％)，所述猪发 生失血性休克并用缺血/再灌注保护组合物或对照溶液治疗。End Sx＝休克前 稳定动物；起始＝启动出血性休克方案之时；输注＝启动输注缺血/再灌 注保护组合物或对照溶液之时；休克30＝休克后30分钟；终止休克＝收 缩压约50mmHg之时；1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、 7小时和8小时分别＝复苏后1、2、3、4、5、6、7和8小时。左右垂直 线分别表明输注缺血/再灌注保护组合物或对照溶液的起始和终止时间。

图26显示在几个时间点的猪的氧输送(毫升O2/分钟)，所述猪发生失血 性休克并给予缺血/再灌注保护组合物或对照溶液。起始＝启动出血性休克 方案之时；休克30、休克60和休克90分别＝休克后30、60和90分钟； 1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时和8小时分别＝ 复苏后1、2、3、4、5、6、7和8小时。

图27显示取出的血液和给予猪的液体的总体积，所述猪发生失血性休克 并用缺血/再灌注保护组合物或对照溶液治疗。

图28显示在许多时间点给予猪的总液体(毫升/千克)，所述猪发生失血性 休克并给予缺血/再灌注保护组合物或对照溶液。OR液体-手术室液体；1 小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时和8小时分别＝复 苏后1、2、3、4、5、6、7和8小时。

图29显示在几个时间点猪的心输出量(升/分钟)，所述猪发生失血性休克 并用缺血/再灌注保护组合物或对照溶液治疗。起始＝启动出血性休克方案 之时；休克30、休克60和休克90分别＝休克后30、60和90分钟；1小 时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时和8小时分别＝复 苏后1、2、3、4、5、6、7和8小时。

图30显示在几个时间点猪的心率(跳/分钟)，所述猪发生失血性休克并用 缺血/再灌注保护组合物或对照溶液治疗。起始＝启动出血性休克方案之时； 推注＝给予推注剂量之时；休克30＝休克后30分钟；Resus＝复苏；1 小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时和8小时分别＝复 苏后1、2、3、4、5、6、7和8小时。左右垂直线分别表明输注缺血/再灌 注保护组合物或对照溶液的起始和终止时间。

图31显示在许多时间点猪的收缩压(mmHg)，所述猪发生失血性休克并 用缺血/再灌注保护组合物或对照溶液治疗。End Sx＝休克前稳定动物；起始 ＝启动出血性休克方案之时；推注＝给予推注剂量之时；休克30＝休克 后30分钟；终止休克＝休克终止之时；1小时、2小时、3小时、4小时、 5小时、6小时、7小时和8小时分别＝复苏后1、2、3、4、5、6、7和8 小时。左右垂直线分别表明输注缺血/再灌注保护组合物或对照溶液的起始 和终止时间。

图32显示在许多时间点猪的尿排出量(毫升/千克/小时)，所述猪发生失 血性休克并用缺血/再灌注保护组合物或对照溶液治疗。起始＝启动出血性 休克方案之时；休克30、休克60和休克90分别＝休克后30、60和90 分钟；1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时和8小时 分别＝复苏后1、2、3、4、5、6、7和8小时。左右垂直线分别表明输注 缺血/再灌注保护组合物或对照溶液的起始和终止时间。

详述

可将一种或多种酮体和褪黑素给予个体以保护该个体免遭缺血性伤害和/ 或再灌注损伤。可将一种或多种酮体和褪黑素给予正发生或曾经发生失血，正 发生或曾经发生中风或心肺功能停止，或将要或正进行某种医学措施，例如外 科手术的个体。此外，可先将一种或多种酮体和褪黑素给予器官捐献者再收集， 从而在收集前彻底灌注该组织或器官。

缺血/再灌注保护组合物

本发明提供包含一种或多种酮体和褪黑素的组合物。这些组合物是能保护 组织、器官，因而能保护个体免遭显著外伤的有用缺血/再灌注保护液。本文公 开的组合物可包含一种或多种酮体和褪黑素，还可包含其它成分，例如治疗性 化合物，其中一些如下所述。本文公开的组合物可基本上由一种或多种酮体和 褪黑素构成，表示这些组合物主要是一种或多种酮体和褪黑素，但该组合物中 也可含有不实质性或显著降低该组合物的缺血/再灌注保护性质的其它组分。

本文所用的“酮体”指β-羟基丁酸或乙酰乙酸(或β-羟基丁酸或乙酰乙酸 在生理上可接受的盐)。酮体是通过脂肪酸分解产生的天然产物，组织将其用 作能量。乙酰乙酸是从乙酰CoA形成，β-羟基丁酸通过乙酰乙酸的可逆还原形 成。在生理上，羟基丁酸与乙酰乙酸之比取决于细胞内的NADH/NAD+比率。 对于缺血/再灌注保护作用，本文所用的“酮体”指β-羟基丁酸或其药学上 可接受的盐或乙酰乙酸或其药学上可接受的盐，或它们的任何组合。术语 “药学上可接受的盐”指所具有的毒性处于能提供药学应用的范围内的盐。 除非另有明确指出，说明书中述及β-羟基丁酸或乙酰乙酸应理解成包括该 化合物的盐形式，而无论是否清楚表明。

可以从无机酸或有机酸制备合适的药学上可接受的酸加成盐。无机酸的例 子包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、硫酸和磷酸。合适的有机酸可选 自：脂族、环脂族、芳香族、芳脂族(araliphatic)、杂环、羧酸和磺酸类的有 机酸，其例子包括甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、葡糖酸、乳酸、 苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、葡糖醛酸、马来酸、延胡索酸、丙 酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、邻氨基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、苯乙 酸、扁桃酸、双羟萘酸(巴莫酸)、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、泛酸、三氟 甲磺酸、2-羟基乙磺酸、对甲苯磺酸、对氨基苯磺酸、环己基氨基磺酸、 硬脂酸、海藻酸、β-羟基丁酸、水杨酸、半乳糖二酸和半乳糖醛酸。

合适的药学上可接受的碱加成盐包括，例如金属盐，包括碱金属、碱土金 属和过渡金属盐，例如钙、镁、钾、钠和锌盐。药学上可接受的碱加成盐还包 括由碱性胺类制得的有机盐，例如N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、 二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)和普鲁卡因。

可通过常规方法，例如，将合适的酸或碱与β-羟基丁酸或乙酰乙酸反应而 从β-羟基丁酸或乙酰乙酸制备所有这些盐。所述盐优选是结晶形式，优选从合 适的溶剂中结晶所述盐来制备。本领域技术人员指导如何制备和选择合适的盐 形式，例如《药物盐手册：性质、选择和应用》(Handbook of Pharmaceutical Salts： Properties，Selection，and Use)，P.H.Stahl和C.G.Wermuth(W-V公司 (Wiley-VCH)，2002)所述。

缺血/再灌注保护组合物中优选β-羟基丁酸和/或乙酰乙酸的盐，因为与使 用酸时相比，该组合物更接近生理上可接受的pH。用于缺血/再灌注保护组合 物的β-羟基丁酸的合适盐是D-β-羟基丁酸的钠盐(即，D-β-羟基丁酸钠)。D-β- 羟基丁酸和乙酰乙酸(或它们在药学上可接受的盐)可商品化购自许多公司，例 如密苏里州圣路易斯的西格玛化学品公司(Sigma Chemical Co.，St.Louis， MO)。应该注意，相对于“L”立体异构体，本文所述缺血/再灌注保护组合物 中优选β-羟基丁酸的“D”立体异构体，有时称为“R”立体异构体。

褪黑素(5-甲氧基-N-乙酰色胺)是从氨基酸色氨酸的天然合成的激素，而色 氨酸是从血清素合成的，褪黑素参与昼夜节律(睡眠-清醒模式)是熟知的。褪黑 素用作广谱抗氧化剂，其显示不依赖受体的自由基清除活性。褪黑素的自由基 清除能力延伸至其第二、第三和第四代谢物，因此褪黑素与活性氧和氮物质的 相互作用是涉及其许多代谢物的一种长期和级联型的过程。因此，褪黑素的代 谢物、直接前体或类似物(或它们的组合)可用于本文所述的缺血/再灌注保护组 合物中。褪黑素的代表性代谢物包括，例如6-羟基-褪黑素(6-HMEL)、6-硫 酸氧基(sulphatoxy)-褪黑素(aMT6)、N1-乙酰基-N2-甲酰基-5-甲氧基犬尿胺 (kynuramine)(AFMK)、N1-乙酰基-5-甲氧基犬尿胺(AMK)和3-羟基褪黑素 (3-HMEL)；褪黑素的代表性直接前体包括，例如N-乙酰血清素、5-羟色胺、 5-羟基色氨酸或L-色氨酸；褪黑素的代表性类似物包括，例如2-氯褪黑素、 6-氟褪黑素、6-氯褪黑素、6-羟基褪黑素、N-异丁酰基5-甲氧基色胺、N- 戊酰基5-甲氧基色胺、6-甲氧基褪黑素、5-甲基N-乙酰色胺、5-苯甲酰基 N-乙酰色胺、O-乙酰基5-甲氧基色胺、N-乙酰色胺、N-乙酰基5-羟色胺和 5-甲氧基色胺。褪黑素、褪黑素代谢物、前体或类似物或功能相似的小分 子通过受体-介导的途径(例如，通过褪黑素受体1A(MTNR1A)或褪黑素受 体1B(MTNR1B))行使其作用，从而导致本文报道的缺血/再灌注保护作用， 但不受任何具体的理论所限。如本文所示，说明书中述及褪黑素或褪黑素 代谢物、前体或类似物应理解成包括盐形式，除非另有表述。

除褪黑素或褪黑素代谢物、前体或类似物外，缺血/再灌注保护组合物可 包含一种或多种其它抗氧化剂。代表性抗氧化剂包括但不限于白藜芦醇、维生 素A、抗坏血酸(维生素C)、α-生育酚(维生素E)、谷胱甘肽、β-胡萝卜素、 番茄红素和/或4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶-N-氧基(TEMPOLTM)。此外，由 于褪黑素是色氨酸衍生的抗氧化剂，具有抗氧化剂活性的其它氨基酸衍生 物(例如，半胱氨酸，如(R)-2-乙酰胺基-3-巯基丙酸(N-乙酰基-半胱氨酸) 或合成的半胱氨酸衍生物，2-[(2-甲基-2-硫烷基丙酰基)氨基]-3-硫烷基丙酸 (Bucillamine))也适用于缺血/再灌注保护组合物中。

可将本文所述的缺血/再灌注保护组合物配制成，例如可立即使用的液体 或要在使用前溶解或重悬的干粉。当配制成干粉时，缺血/再灌注保护组合物中 每摩尔的褪黑素或褪黑素代谢物、前体或类似物可对应于不到1摩尔直至最多 1×107摩尔或更多的酮体(例如，(0.67-10,000,000)：1)。本文示例的酮体与 褪黑素之比是约100比约1，但缺血/再灌注保护组合物可含有更多或更少 的酮体或更多或更少的褪黑素(或代谢物、前体或类似物)。缺血/再灌注保 护组合物中酮体与褪黑素或褪黑素代谢物、前体或类似物的代表性摩尔比 可包括以下比例，例如：约1∶1、5∶1、10∶1、25∶1、50∶1、100∶1、200∶1、500∶1、 800∶1、1000∶1、2000∶1、4000∶1、6000∶1、8000∶1、10,000∶1、50,000∶1、75,000∶1、 100,000∶1、250,000∶1、500,000∶1、750,000∶1、1×106∶1、1.13×106∶1、1.27×106∶1、 1.35×106∶1、1.44×106∶1、1.5×106∶1、1.62×106∶1、1.76×106∶11.89×106∶1 1.97×106∶1、2.11×106∶1、2.33×106∶1、2.5×106∶1、3.5×106∶1、4.2×106∶1、 5.4×106∶1、6.7×106∶1、7.3×106∶1、8.8×106∶1、9.1×106∶1或1×107∶1。技术人 员应知道这些比例是示范性的。

配制成液体时，组合物可含有约0.1M到约8M酮体(例如，约0.4M 到0.5M、0.4M到0.6M、0.4M到0.8M、0.6M到0.8M、0.5M到0.9M、 0.5M到1M、0.8M到1.3M、1M到2M、0.5M到8M、1M到8M、2 M到8M、3M到8M、0.1M到7.5M、0.1M到7M、0.1M到6M、0.1 M到5M、0.5M到7.5M、1M到7M、2M到6M、3M到5M、3.5M 到4.5M或约3M、4M或5M酮体)和约4nM到约150mM褪黑素或褪黑 素代谢物、前体或类似物(例如，约4nM到50nM、4nM到100nM、4nM 到200nM、4nM到0.4μM、50nM到100nM、100nM到0.4μM、0.4μM 到8μM、0.4μM到40μM、0.4μM到100μM、0.4μM到500μM、0.4μM 到1mM、0.4μM到50mM、4μM到50μM、4μM到200μM、4μM到 500μM、4μM到1mM、4μM到50mM、4μM到100mM、8μM到50μM、 8μM到250μM、20μM到2mM、200μM到500μM、500μM到2mM、 2mM到4mM、2mM到50mM、4mM到6mM、4mM到7mM、4mM 到9mM、4mM到125mM、4mM到100mM、4mM到75mM、4mM到 50mM、5mM到10mM、5mM到11mM、6mM到9mM、8mM到15mM、 10mM到25mM、10mM到150mM、20mM到150mM、25mM到150mM、 30mM到150mM、35mM到150mM、40mM到150mM、10mM到130mM、 12.5mM到120mM、15mM到110mM、20mM到100mM、25mM到80 mM、30mM到50mM、40mM到45mM、0.5μM到125mM、1μM到100 mM、150μM到150mM、200μM到2mM、500μM到100mM、800μM 到150mM或750μM到125mM褪黑素或褪黑素代谢物、前体或类似物)。 各组分的浓度必须低于溶剂的饱和点，从而不会发生沉淀，但各组分的浓 度可以较高，因为酮体和褪黑素的毒性低。缺血/再灌注保护组合物中各组 分的终浓度取决于几种因素，包括血液中各组分的所需浓度和待给予的体 积。

任何数量的溶剂可用于液体缺血/再灌注保护组合物中，或用于溶解或重 悬缺血/再灌注保护组合物的干粉制剂。由于酮体易溶于水，可将无菌蒸馏水用 作主要溶剂。由于褪黑素更具疏水性，可利用增溶剂(例如，低于50％、低于 40％、低于30％、低于25％、低于24％、低于23％、低于22％、低于21％、 低于15％、低于10％、低于8％、低于6％、低于5％、低于4％、低于3％、 低于2％或低于1％的最终体积)，例如二甲基亚砜(DMSO)或另一种非极性溶 剂溶解褪黑素。除了用作增溶剂，DMSO还用作羟基清除剂(Paller等，1985，J. Lab.Clin.Med.，105(4)：459-63)。乙醇(EtOH)也可用作褪黑素的增溶剂，但 要求浓度较高，因此，虽然不是最理想，但在某些情况下仍是有用的。可 使用的其它溶剂包括，例如甲基磺酰基甲烷(MSM或二甲基砜)和二甲基甲 酰胺(DMF)。

可作为液体保存任何时间的缺血/再灌注保护组合物还可包含一种或多种 稳定剂，例如有机糖、糖醇或糖类、氨基酸和低分子量多肽或蛋白质(例如， 血清白蛋白或免疫球蛋白)以防止活性组分降解并延长液体组合物的储存期。 例如，堪萨斯州列涅萨的赛得克斯公司(Cydex，Inc.，Lenexa，KS)的 是可用于改善药物组合物的溶解性、稳定性和生物利用度的代 表性化合物(即，改性的环糊精)。此外，酮体或褪黑素(或褪黑素代谢物、 前体或类似物)中的一种或两种可共价连接于能口服给予或能改善酮体和/ 或褪黑素(或褪黑素代谢物、前体或类似物)的药代动力学或药效学性质的低 聚物，例如短的两亲低聚物。低聚物可包含水溶性聚乙二醇(PEG)和/或脂 溶性烷基类化合物(短链脂肪酸聚合物)。参见，例如WO 2004/047871。

本文所述的缺血/再灌注保护组合物通常基本上不含无机阴离子。无机阴 离子包括，例如氟离子、氯离子、溴离子、亚硝酸根、硝酸根、正磷酸根和硫 酸根。“基本上不含”通常指无机阴离子的含量低于约10mM(例如，低于约 5mM、1mM、0.5mM、0.1mM、0.05mM、0.01mM或0.001mM)。

如果需要，可能在使用前要根据用的是酸还是盐来调节液体组合物的pH。 如果是这样，可用合适的酸(例如，HCl)或盐(例如，NaOH)将pH调节至 生理上可接受的范围(例如，pH约为7.2到7.6；例如，pH约7.4)。在这 些情况中，加入以实现可接受的pH的酸或盐的量足够少，从而组合物仍可 认为基本上不含无机阴离子。除了调节组合物的pH，可先过滤液体缺血/ 再灌注保护组合物，例如使组合物灭菌和/或除去组合物中任何不溶的晶体， 然后再使用。

虽然只含有一种或多种酮体和褪黑素或褪黑素代谢物、前体或类似物的缺 血/再灌注组合物也能起作用，但缺血/再灌注保护组合物还可含有一种或多种 治疗性化合物。治疗性化合物包括但不限于抗生素或抗菌剂(例如，头孢菌素 类(如，头孢曲松)、四环素类(如，米诺环素)或其它β-内酰胺类，特别是 显示神经保护作用的那些，以及二氨基-二苯砜(氨苯砜)或D-青霉胺)，镇 痛剂，游离脂肪酸，激素，代谢产物和代谢途径分子。此外，治疗性化合 物包括改变细胞代谢的化合物，例如但不限于多肽、反义或siRNA分子、 药物和针对一种或多种合适靶点的小分子。缺血/再灌注保护组合物还可包 含可用作代谢底物的一种或多种组分，例如但不限于葡萄糖、乙酸(盐)或丙 酮酸(盐)。

缺血/再灌注保护组合物的使用方法

可利用酮体和褪黑素或褪黑素代谢物、前体或类似物治疗正发生缺血性伤 害/再灌注损伤或具有发生缺血性伤害/再灌注损伤的风险或曾经发生缺血性伤 害/再灌注损伤的组织、器官或个体。许多不同的外伤可导致缺血性伤害/再灌 注损伤。例如，正发生或曾发生失血的个体，曾发生中风或有发生中风风险的 个体或要进行或正进行外科手术的个体可能发生缺血伤害/再灌注损伤。

当个体失血，组织和器官未充分供氧时，组织和器官中会发生缺血性损伤， 当血流恢复或者随后对该个体输血并且组织和器官再供氧时会发生再灌注损 伤。本文所称的失血可以由，例如大出血事件(例如，突然或迅速丧失大量血 液)导致。大出血事件包括但不限于失去肢体、长骨骨折、动脉割破、或枪炮 伤口。大出血事件还包括钝伤事件，例如可由内出血导致。机动车事故是大出 血事件的主要原因。大出血事件的其它原因包括但不限于胃肠道、产道和妇产 科出血。

大出血事件还包括出血性休克。导致急性外伤患者休克的主要原因包括但 不限于氧摄取受损，例如气道开放丧失、呼吸减弱、误吸和肺部损伤；心输 出量减少，例如血胸或气胸、心脏压塞、血容量不足、先前存在的心肌缺 血或心脏损伤；血管紧张度丧失，例如外源性血管扩张剂(例如，药物和 酒精)、医源性血管扩张剂(例如，麻醉剂和镇静剂、闭合性头部外伤、脊 髓损伤、过敏反应)；携氧能力降低，例如贫血或氰化物中毒；微血管衰竭， 例如再灌注损伤，“无再次血流(no reflo)”现象或细胞代谢衰竭(例如，败 血症)。

在例如个体失血体积至少约10％(例如，至少约20％、至少约30％、至 少约40％、至少约50％、至少约60％或更高)的情况下，可给予本文所述的 缺血/再灌注保护组合物。应注意，据认为成年人的血液体积是他们总体重 的约7％-9％。收缩压为约90mm Hg或更低(例如，约85mm Hg或更低、 约80mm Hg或更低、约75mm Hg或更低、约70mm Hg或更低、65mm Hg 或更低、约60mm Hg或更低、约55mm Hg或更低、或约50mm Hg或更 低)、StO2水平低于75％(例如，低于70％、低于65％、低于60％、低于55％ 或低于50％)和基础碱不足水平高于6mEq/L(例如，高于6.5mEq/L或高于 7mEq/L)表明显著失血。

失血期间，个体的心率升高、血压降低、尿排出量减少、乳酸水平升高、 组织血红蛋白氧饱和度(StO2)水平降低、心输出量减少、组织pH降低和线粒 体功能减弱(例如，通过NADH水平测得)。个体从这种失血中恢复通常会表现 出这些症状的逆转；心率降低、血压升高、尿排出量增加、乳酸水平降低、StO2 水平升高、心输出量增加、组织pH升高和线粒体功能增强。例如，总体健康 的个体(例如，未发生出血性休克的个体)通常的心率低于100跳/分钟，血压 高于100mm Hg收缩压，尿排出量大于30毫升/小时(或者儿童是1毫升/ 千克/小时)，乳酸水平低于2.1毫克/分升(dl)，StO2水平高于75％，心脏指 数为2.5-4.5升/分钟/米2(体表面积)，血液pH为7.35-7.45，而正发生出血 性休克的个体(例如，失血10％或更多)的心率为高于100跳/分钟，血压低 于100mm Hg收缩压，尿排出量低于300毫升/小时，乳酸水平高于2.1 mg/dl，StO2水平低于75％，心脏指数低于2.5升/分钟/米2，血液pH低于 7.35。生物物理参数改变的严重程度往往与失血量直接相关，因此，可监测 正发生失血或从这种失血中恢复的个体的这些生物物理参数。给予本文所 述的缺血/再灌注保护组合物可显著缓和个体对失血的反应(与具有相似失 血量但未给予所述组合物的个体相比，通过本文所述一种或多种生物物理 参数来衡量)和/或提高生物物理参数回复“正常”的速度(即，在总体健康 个体中观察到的水平)。

缺血伤害/再灌注损伤可由(但不限于)中风(例如，阻塞性中风)、心动停止、 心肌梗塞、心脏病发作、动脉血流减少或肾衰竭导致。缺血伤害/再灌注损伤还 可由破坏或可能破坏血流和/或氧气流的外科手术导致。某些外科手术过程，例 如神经外科手术或心脏外科手术的缺血伤害/再灌注损伤的风险更高，即使在外 科手术期间利用机械装置(例如，人工心肺机)也不可能完全防止缺血伤害/再灌 注损伤。可将本文所述缺血/再灌注保护组合物给予个体以显著减少或防止这些 医学紧急情况(例如，严重的体温过低或低氧)或过程(例如，外科手术)期间或 之后组织和器官可能经历的缺血伤害/再灌注损伤。

如本文所述，可溶解一种或多种酮体和褪黑素或褪黑素代谢物、前体或类 似物并静脉内给予以将这些组分直接引入血流。然而，其它给药途径也是合适 的，包括，例如骨内、腹膜内、口服、含服、吸入或直肠给予(通过，例如栓 剂)。缺血/再灌注保护组合物的具体制剂适合于所需给药途径，本领域熟知用 于给药的制剂。参见，例如《雷明顿：药物科学和实践》(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)，2005，第21版，Lippincott Williams & Wilkins。 根据具体制剂，缺血/再灌注保护组合物可包含一种或多种以下组分：无菌 稀释剂，例如水、盐溶液(例如，磷酸缓冲盐水(PBS))、不挥发油、多元醇 (例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇，等)、甘油、或其它合成的溶剂；抗 菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、 硫柳汞，等；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸、柠檬酸或 磷酸和用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。

口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用运载体，所述口服组合物可以是 液体，或包封在明胶胶囊中或包含在片剂中。片剂、丸剂、胶囊等可含有以下 成分的任一种：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉 或乳糖；崩解剂，例如海藻酸、羧甲基纤维素钠(Primogel)或玉米淀粉；润滑 剂，例如硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、延胡索酸或氢化植物油(Sterotes)； 助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或调味剂，例如 薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。缺血/再灌注保护组合物的口服制剂可包 含泡腾组分，其用作渗透增强剂以增加一种或多种成分的吸收。例如，当 泡腾片加入水中时，其因酸碱之间的反应而产生二氧化碳气体。酸常是柠 檬酸(水合或无水的)，但也可以是酒石酸、延胡索酸、己二酸或苹果酸。碱 可以是水溶性碱性碳酸盐，例如碳酸氢钠或碱金属或碱土金属碳酸盐，例 如钾或钙的碳酸盐或碳酸氢盐、碳酸钠或甘氨酸碳酸钠。

此外，缺血/再灌注保护组合物可经适当包封(例如，在脂质体中)并经气溶 胶化或喷雾形式递送。参见，例如美国专利号5,049,388、5,141,674、7,083,572 和7,097,827。喷雾作用将颗粒剪切成易从喷雾器的喷嘴放出的大小，从而 能吸入这些剪切颗粒，随后将包封的物质释放入呼吸道、肺的上皮细胞和 血流中。在某些情况中，酮体和褪黑素或褪黑素代谢物、前体或类似物均 可包封在一起；在其它情况中，酮体和褪黑素或褪黑素代谢物、前体或类 似物可分别包封，并在气溶胶化或喷雾期间混合。可将直径最多数微米的 脂质体剪切成直径小于500nm，根据喷雾器和其它因素还可以明显减小。

可将缺血/再灌注保护组合物作为推注制剂(bolus)，例如由第一响应者(例 如，部队医师、急诊医师(EMT)或任何其他训练有素的医学人员)给予正发生大 出血或中风或心肺功能停止的个体。或者，或除推注给药外，可将缺血/再灌注 保护组合物作为缓慢滴剂或输注液在一定时间内给予。例如，可在外伤当场、 运送至医疗机构的途中和/或一旦个体到达医疗机构即给予缓慢滴剂或输注液。 在生理学上，损伤或外伤后的早期至关重要，有时称为“黄金小时”，但给予 个体缺血/再灌注保护组合物可以持续长达72小时或更长时间(例如，最长1 小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、18小时、24小时、36 小时、48小时、60小时、90小时或更长时间)。除缓慢滴剂或输注液外， 可在，例如24、48或72小时期间通过推注多次给予缺血/再灌注保护组合 物。

曾经发生大出血事件的个体通常在到达医疗机构后接受输血，根据具体情 况，损伤后可以在数分钟或最多数小时或更长时间内开始输血。在一些情况中， 一旦认为可能有缺血或再灌注损伤则立即给予个体缺血/再灌注保护组合物，这 可以在输血开始后进行。技术人员应知道可以在输血或血浆置换的同时给予缺 血/再灌注保护组合物，在一些情况中，可将缺血/再灌注保护组合物与血液或 血浆直接混合并给予个体。

采用，例如每公斤个体体重约4M酮体和约43mM褪黑素的浓度，约0.3- 约2毫升(ml；例如，约0.3-0.4ml、0.3-0.7ml、0.5-1.5ml、0.5-1.0ml、0.6-0.7 ml、0.75-2ml、1.0-2.0ml、1.5-2.0ml、或约0.5、0.1或1.5ml)的体积可有 效保护个体免遭严重失血导致的缺血伤害/再灌注损伤。对于现场急诊医疗护理 或在供给和空间有限的其它情况下这种小体积明显有益。然而，在其它情况下， 例如在医院或创伤中心，可将较大体积的缺血/再灌注保护组合物(例如，每公 斤100ml或更大体积)给予个体，可适当调节各组分的浓度。

虽然不是必需的，但在某种程度上，以下给药量通常是理想的，即给予个 体的酮体量足以在给药后某个时间点在血液中达到约3mM到最多约12或15 mM的浓度(例如，约3mM-10mM、3mM-7.5mM、3mM-5mM、3.5 mM-10mM、4mM-10mM、6mM-10mM、或约4mM、5mM、6mM、7mM、 8mM或9mM)，而给予个体的褪黑素或褪黑素代谢物、前体或类似物的量足 以在给药后某个时间点在血液中达到约30μM到约150μM的浓度(例如， 约30μM-125μM、30μM-100μM、30μμM-80μM、30μM-60μM、30μM-50 μM、30μM-40μM、35μM-150μM、40μM-150μM、50μM-150μM、60 μM-150μM、70μM-150μM、80μM-150μM、100μM-150μM、35μM-125 μM、40μM-100μM、50μM-75μM、或45μM-65μM)。在一些情况中，给 予个体少得多的褪黑素或褪黑素代谢物、前体或类似物(例如，给予量足以 在血液中达到约1×10-10mol/L、2×10-10mol/L、3×10-10mol/L、4×10-10 mol/L、5×10-10mol/L、6×10-10mol/L或7×10-10mol/L)是理想的。根据具 体病例，医学从业人员可估计是否可通过，例如采用后续给药或采用连续 输注或其它方法维持目标浓度以及能维持多长时间。可采用本领域常规方 法测定血液中酮体和褪黑素或褪黑素代谢物、前体或类似物的浓度。

缺血伤害/再灌注损伤还可能发生在打算移植的器官中。可先将一种或多 种酮体和褪黑素或褪黑素代谢物、前体或类似物给予器官捐献者再收集器官。 器官捐献者可以处于持续性植物状态，或者可以是健在和健康的并且与受者适 当匹配。可先将酮体和褪黑素或褪黑素代谢物、前体或类似物静脉内给予器官 捐献者以彻底灌注该器官后再收集器官，从而防止或降低随后运输和移植入受 者期间那些组织和器官的缺血伤害。可将一种或多种酮体和褪黑素或褪黑素代 谢物、前体或类似物给予器官捐献者以达到上述血液浓度(例如，3-15M酮体 和30-150μM褪黑素)或达到甚至更高的浓度。除了给予个体缺血/再灌注保护 组合物外，可以，例如用缺血/再灌注保护组合物灌注一个或多个收集的器官或 将其浸在(例如在运输期间)缺血/再灌注保护组合物中。

一种或多种酮体和褪黑素或褪黑素代谢物、前体或类似物的组合可以高度 有效地保护个体免遭缺血伤害和/或再灌注损伤。例如，可将一种或多种酮体和 褪黑素或褪黑素代谢物、前体或类似物给予曾发生失血、曾发生中风或心肺功 能停止、要进行或正进行诸如外科手术等措施、或作为器官捐献者的个体。一 种或多种酮体和褪黑素或褪黑素代谢物、前体或类似物的组合还能保护丧失一 个或多个手指(或足趾)或完整肢体的个体。

制造品

本文所述的缺血/再灌注保护组合物或其中的组分可包含在制造品中。包 含一种或多种酮体和褪黑素或褪黑素代谢物、前体或类似物的制造品可采取任 何构造，本文只讨论其中少数。制造品的以下代表性实例并非限制性的。

在制造品的一个实施方式中，在IV袋中提供一种或多种酮体和褪黑素或 褪黑素代谢物、前体或类似物的液体制剂。参见，例如美国专利号5,098,409； 5,257,985和5,853,388。在IV袋中提供的缺血/再灌注保护组合物可以是无 菌和可立即使用的，袋上有合适的有效日期。或者，可在IV袋中提供一种 或多种酮体和褪黑素或褪黑素代谢物、前体或类似物的干粉组合物从而易 用合适溶剂溶解或重悬。

在另一实施方式中，制造品可至少具有第一容器和第二容器，有时有第三 和第四容器。根据构造，第一容器可含有酮体和褪黑素或褪黑素代谢物、前体 或类似物，第二容器可含有溶剂。在备选构造中，酮体可包含在第一容器中， 褪黑素或褪黑素代谢物、前体或类似物可包含在第二容器中，而第三容器可包 含褪黑素或褪黑素代谢物、前体或类似物的增溶剂，第四容器可包含溶解或重 悬酮体的溶剂(例如，水性溶剂)。在具有多个容器的制品的某些实施方式中， 液体部分可与诸组分或组合物部分可控地接触。“可控地接触”指用户借助有 利于这种受控接触的制造品的结构元件而主动决定液体部分何时与干粉部分 组合的能力。这种结构元件可包括，例如易碎或可刺穿的密封或分隔结构。

在另一实施方式中，可在注射器筒中提供一种或多种酮体和褪黑素或褪黑 素代谢物、前体或类似物。注射器筒中的缺血/再灌注包含组合物可以是已重悬 的，在用前重悬的干粉形式，或者注射器筒还含有重悬干粉或其诸组分的一种 或多种溶剂的干粉形式。用于分配缺血/再灌注保护组合物的制造品可以是能给 予所需剂量(例如，根据个体体重或大致体重)的保护组合物的自动装置。

在某些情况中，可先混合含有一种或多种酮体的溶液和含有褪黑素或褪黑 素代谢物、前体或类似物的溶液再给予，从而个体可以在一种组合物中接受两 种组分。在其它实施方式中，可以在给予褪黑素或褪黑素代谢物、前体或类似 物之前或之后(分别)将一种或多种酮体给予个体。在一些实施方式中，如果褪 黑素和酮体具有不同半衰期，可首先在一种组合物中一起给予这两种组分，然 后将一种组分(例如，褪黑素或褪黑素代谢物、前体或类似物)以高于另一种组 分(例如，酮体)的频率给予个体。

制造品通常包含除酮体和褪黑素或褪黑素代谢物、前体或类似物以外的包 装材料。包装材料可包括具有用于治疗正发生或曾发生失血的个体，发生中风 或心肺功能停止或具有发生中风或心肺功能停止的个体，要进行或正进行外科 手术的个体，或要捐献器官或组织的个体的使用说明书的标签或包装插页。

优选将缺血/再灌注保护组合物配制成易于给药且剂量均匀的单位剂型。 本文所用的单位剂型指适合作为给予个体的单位剂量的物理上离散的单位，其 中各单位含有预定量的缺血/再灌注保护组合物以产生所需疗效。本发明组合物 的单位剂型通常取决于，例如酮体和褪黑素或褪黑素代谢物、前体或类似物在 个体血液中的所需浓度和个体体重。

本发明可采用本领域技术人员已知的常规微生物、生物化学和生物生理学 技术。参考文献充分解释了这些技术。以下实施例进一步描述了本发明，但这 些实施例不限制权利要求书所描述的本发明范围。

实施例

实施例1-冬眠和活动的地松鼠的脑和心脏中葡萄糖和D-β-羟基丁酸的 代谢

目标

通过输注[2，4-13C2]-BHB(图2)然后检测脑中的13C-标记的BHB和代谢 物来检测活动和冬眠地松鼠的脑中D-β-羟基丁酸(BHB)的转运和代谢情 况。

这些实验的总体方案是检测掺入13C-BHB脑库和源自三羧酸(TCA)循环 的代谢物，例如谷氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸中的输注的13C-BHB同位素。 利用[1-13C2]-葡萄糖平行进行相同的实验(图1)。定量测定合适温度下的非 冬眠地松鼠和4-6℃的冬眠地松鼠的BHB血脑运送和消耗速度(相对于葡萄 糖消耗)。

动物

先麻醉(异氟烷)地松鼠，再置于磁共振(MR)仪器的磁体上并用13C-BHB 或[1-13C2]-葡萄糖注射。

分析组织提取物中的脑代谢物

13C实验完成时，在仍然完全麻醉下以液氮对脑进行漏斗冷冻(funnel freezing)来处死动物。-25℃，将冷冻的脑凿出颅骨，在液氮条件下用研钵粉碎。 在明尼苏达大学用14特斯拉(600MHz)的高分辨率NMR分析高氯酸脑提取物。

结果和解读

应该注意，冬眠松鼠中的标记速度非常慢，要求的最低体温约为12-16℃。

为检验冬眠期间优先利用酮体这一假设，对注射了1ml 1M 13C-标记的 外消旋纯D-β-羟基丁酸(13C-D-BHB)或1ml 1M 13C-葡萄糖的冬眠地松鼠 的脑提取物进行高场(high-field)NMR。图3显示摄入脑的葡萄糖的相对水平。 结果证明D-β-羟基丁酸是优于葡萄糖的底物，不产生显著量的乳酸。

图4显示冬眠期间13C-D-BHB和13C-葡萄糖有效转运入心脏，但各能 量来源有效利用和掺入代谢物中的机理不同。在BHB-注射的动物中，源自 TCA循环的代谢中间体在低体温(Tb)下产生。图4A显示了心脏中的谷氨酸 (在4号碳作标记；谷氨酸C4)水平非常高，有许多多重谱线，表明利用了 谷氨酸底物以及产生了谷氨酸和谷氨酰胺C3和C2。

在给予葡萄糖的动物中，大多数13C-葡萄糖进入心脏，但代谢水平不如 D-BHB高(图4B)。TCA-循环中间体，例如谷氨酸C4等的水平不易观察， 其形成量非常少，没有多重谱线，即使处死时地松鼠具有温度正常的Tb， 35.3℃(图4B)。注射标记葡萄糖后最显著的结果是乳酸有非常大的尖峰。 这些结果表明葡萄糖的利用不如BHB有效，绝大多数代谢的葡萄糖转化成 乳酸，而不是进入TCA循环。

实施例2-脑和心脏中酮体转运蛋白和解酮酶的表达

目标

通过免疫细胞化学和蛋白质印迹分析活动和冬眠地松鼠以及对照和酮血 症大鼠的单羧酸转运蛋白MCT1和MCT2以及葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)。这 些实验检查了这些转运蛋白的定位和表达的改变是否与动物的代谢状态差异 (活动与冬眠；对照与酮血症)有关。

通过蛋白质印迹检测脑MCT1和MCT2

通过蛋白质印迹分析来分析冬眠和非冬眠大鼠的脑蛋白质以根据季节和 动物的活动状态来定量测定各种形式的MCT是否有差别地表达。麻醉活动 (N＝5)和冬眠(N＝5)的地松鼠，立即取出它们的脑。将脑再分成大脑和脑干，并 立即在液氮中冷冻。通过组织匀浆然后进行离心分离收集膜沉淀物以获得脑膜 蛋白。

已知MCT1在内皮细胞膜中发现，在发生酮血症的高脂饮食动物中表达 更高。MCT1还主要出现在脉络丛上皮和神经胶质限制性膜中。最早将MCT2 描述成在星形胶质细胞足突和其它神经胶质细胞中丰富的膜转运蛋白，但 最近的证据提示MCT2在神经元中也显著表达。

用大鼠MCT1的羧基末端产生的鸡多克隆抗血清(已显示能与大鼠MCT1 相同大小的地松鼠蛋白质交叉反应)用于检测地松鼠中MCT1含量的改变。类 似地，用大鼠MCT2的羧基末端产生的家兔多克隆抗血清(已显示能与大鼠 MCT2相同大小的地松鼠蛋白质交叉反应)用于检测地松鼠中MCT2含量的改 变。

测定MCT1、MCT2和GLUT1的细胞定位的免疫细胞化学方法

先用5％氟烷(halothane)麻醉大鼠和地松鼠，再用福尔马林-乙酸固定剂 (4％甲醛、2％乙酸)作心脏穿刺灌注。灌注时间是12分钟，4℃将组织保存在 固定剂中过夜，然后处理它们。用含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)和1.5％普通 山羊血清的磷酸缓冲盐水(PBS)封闭组织切片。用0.1％BSA对第一抗体作 1∶1200稀释，室温下涂布在切片上1小时。然后将切片与生物素化的山羊抗- 小鼠IgG(封闭溶液配制成5μg/ml)温育30分钟，用亲和素-生物素-过氧化物 酶复合物(ABC)试剂(两种试剂均购自加利福尼亚州伯林格姆的载体实验室 公司(Vector Laboratories，Burlingame，CA))温育30分钟。在0.6g/ml 3，3’- 二氨基联苯胺(西格玛公司(Sigma))中显色1-6分钟。

将检测上述蛋白质印迹所用的相同抗体制品(MCT1和MCT2)用于测定 脑中的细胞定位。特别感兴趣的是活动和冬眠地松鼠中的相对量和分布。 测定活动和冬眠地松鼠脑的大脑皮层、海马状突起和小脑中MCT1、MCT2 和GLUT1的定位。这些实验关注这些大脑区域以鉴定这些MCT同种型和 GLUT1是否优先表达在内皮细胞、星形胶质细胞和/或神经元中。已知海马 状突起对缺氧特别敏感。根据Gerhart等(1997，Am.J.Physiol.， 273：E207-213)进行光学显微术。

结果和解读

图5显示了大鼠和地松鼠脑中MCT1和葡萄糖转运蛋白(GLUT1)的免疫细 胞化学结果。图6显示根据免疫细胞化学，地松鼠脑中MCT1表达有季节差异， 表明冬眠期间血脑屏障的MCT1水平升高。图7显示根据MCT1的光密度， 冬眠动物的血管中MCT1水平升高。图8显示活动和冬眠地松鼠心脏的2-维凝 胶。2-D蛋白质凝胶显示冬眠动物中琥珀酰CoA转移酶(SCOT)(酮体代谢的限 速步骤)增加6-倍。根据这些结果，冬眠期间脑中的酮转运蛋白，MCT1水平 升高，在冬眠动物的心脏中观察到SCOT相似地升高。

实施例3-保护小哺乳动物免遭大量失血的伤害

目标

使输注了酮体的大鼠在至少1小时时间内丧失60％的血液，然后输回流出 的血液。神经保护的终末点检测是定量分析皮层、海马体突起和小脑中神经元 存活和凋亡以及神经机能检验评分。其目标是测定D-型β-羟基丁酸(D-BHB) 与褪黑素的组合在保护脑免遭缺血和在血液输回后提供再灌注损伤的保护作 用的效力。

以下实验的目的是利用最少量的液体维持60％失血至少3小时以维持存 活。采用以下方程计算60％失血：总血液体积＝动物体重×0.06。约40％失 血后，将每公斤动物体重1ml推注体积的缺血/再灌注保护组合物给予动物。 一些动物只接受一次1ml/kg推注，而其它动物在给予推注后接受缓慢输注(100 微升/小时)以模拟溶液的静脉内滴注。

动物

雄性Sprague-Dawley大鼠(280-350g)购自威斯康星州麦迪逊的HT公 司(Harland Teklad，Madison，WI)，先适应至少7天再进行外科手术准备。 给所有的动物喂食标准实验室食物，随意饮水直至实验之日。动物的照料 和处理得到明尼苏达大学动物照料和使用学会委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)(IACUC)的批准。

外科手术准备

在呼吸级的空气中用异氟烷简单麻醉动物，然后肌肉内注射用于麻醉的氯 胺酮/赛拉嗪混合物(100/20mg/kg)。无菌分离左股骨动脉，插入含肝素化盐 水(10单位/毫升)的聚乙烯(PE-50)导管(0.023ID，0.038OD)。将导管与压强 传感器相连以连续监测平均动脉血压(MABP)和心率(HR)(PA仪器公司 (Powerlab，AD Intruments)，黑斯廷斯(Hastings)，英国)。在右股骨动脉中类 似地插入导管以便于抽血和取样。

一旦大鼠完全麻醉并稳定20分钟，开始失血。失血约40％时，将1ml 4M D-BHB或4M NaCl/公斤体重输注入插入导管的左股骨静脉。推注输注后， 将4M D-BHB或4M NaCl以100微升/小时的速度缓慢输注入动物。用直肠 探针监测体温。整个实验期间用氯胺酮/赛拉嗪混合物将动物维持麻醉。20 分钟稳定期间后进行该实验，同时监测MABP、HR和体温。当血压、呼吸 和心前区运动停止时记录动物死亡(时间线见图9)。输回流出的血液3天后 处死大鼠。

溶液

4M D-BHB：将0.5g D-β-羟基丁酸加入1ml蒸馏水中。该溶液经0.2 微米过滤器(阿克罗盘式注射过滤器(Acrodisc Syringe Filter)，波尔公司 (PALL))过滤灭菌。

4MNaCl：将0.233g氯化钠加入最多1ml蒸馏水中。该溶液经0.2微 米过滤器(阿克罗盘式注射过滤器，波尔公司)过滤灭菌。

褪黑素/DMSO：将100mg褪黑素加入0.6ml微量离心管。加入DMSO (＞99％纯度)至200μl。溶液经漩涡振荡，等分成6μl装入1.5ml微量离心 管中。将离心管冷冻(-20℃)待用，1周后弃去。

输注溶液：打开一个6μl褪黑素/DMSO储备离心管，加入294μl 4M D-BHB或NaCl。轻柔地漩涡振荡离心管以确保混合。在输注入动物之前几 分钟制备输注溶液。剩余的溶液如果不用则弃去。

血清试验

3500rpm离心在某些时间点(见图9)经右股骨动脉取得的血液样品5分钟。 将在各时间点收集的血清吸出，等分成20微升的体积。这些血清等份试样冷 冻于-80℃以永久保存。利用标准生物实验室公司的液体颜色检验试剂盒 (Liquicolor test kits，Stanbio Laboratories)，通过分光光度法(Multiskan)获得 血清样品的β-羟基丁酸和葡萄糖水平。样品作一式三份测试以减小移液误差。

分析出血性休克导致的缺血-诱导组织伤害

将通过经心灌注固定的大鼠脑包埋在石蜡中，将前海马突起区域的冠状 10-μm-厚脑切片安装在聚-L-赖氨酸包被的玻璃载玻片上。采用三种组织学 技术检测受损组织的区域，并在选择的显微镜视野中定量测定特定脑区域 中存活和凋亡的神经元。

制备Nissl(甲酚紫)-和苏木精伊红(H&E)-染色的切片以区分脑组织切 片中缺血-破坏的区域与未破坏的区域。通过细胞计数定量评估CA1、CA2、 CA3海马区域和齿状回中的神经元损伤。此外，在取自各脑(离前囟点3.7、 4.0和4.3mm)的3个切片中检测与这些脑区域的总面积相比，大脑皮层和 丘脑中总体细胞毒性破坏的面积。利用数字显微镜获得破坏区域的显微照 片，利用图像分析软件程序(例如，NIH Image)进行定量分析来鉴定破坏的 和正常的脑区域。采用斯氏t检验统计学评估结果。

为定量测定神经元细胞死亡，加工脑切片以供利用德国曼海姆BM公司 (Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany)的原位细胞死亡检测试剂盒的末 端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素化UTP切口末端标记法(TUNEL)染色。利 用NIH Image，在选择的显微镜视野中双向计数海马突起、齿状回、大脑皮 层和丘脑中TUNEL-阳性神经元(即，正经历凋亡的细胞)。随后，用0.5％ 甲酚紫染色同一切片以评估存活的神经元。

神经缺损评分系统

在血液输回后第1和第3天，通过神经缺损评分系统评估动物的神经功能 (表1)。

表1.大鼠的神经缺损评分系统

统计学分析

采用双尾斯氏t-检验(two-tailed Student’s t-test)，p＜0.05认为统计学显 著。对于参数数据的多组统计学分析，进行单向ANOVA。统计学值表示为平 均值±S.D。

结果和解读

这些实验证明包含BHB和褪黑素的缺血/再灌注保护组合物能维持发生 60％失血的动物存活约3小时，与NaCl的作用相比，这是显著的改善。此外， BHB和褪黑素的缺血/再灌注保护组合物在大鼠中提供神经保护作用，从而改 善了流出的血液输回后的结果。

图9显示了实验的时间线，该实验证明β-羟基丁酸可用于保护个体免遭大 量失血的伤害。可在以下时间点取血：血压过低之前(A)；约40％失血(B)；输 注溶液后(C)；60％失血(D)；60％失血后30分钟(E)；60％失血后60分钟 (F)；60％失血后90分钟(G)；60％失血后120分钟(H)；60％失血后150分 钟(I)；和60％失血后180分钟(J)。

在所示时间点收集血清，分析是否存在D-BHB。在推注给予1ml/kg(图 10)之后或在推注给予1ml/kg和随后以100微升/小时输注D-BHB(图11) 之后分析血清D-BHB水平。

检查了体温对曾发生出血性休克的动物的影响。发生出血性休克并通过反 馈热灯装置(feedback heating lamp mechanism)人工维持在37℃的动物(图12， 左柱)比趋向室温的动物(图12，右柱)明显更快死亡。趋向室温的动物比体温 37℃的动物平均存活长3倍。应该注意，趋向室温的动物未冷至27℃以下。

检查了各种组合物对曾发生出血性休克的动物存活的影响。动物给予1 ml/kg的4M D-BHB推注或4M NaCl或推注100μl后输注100微升/小时 的4M D-BHB或4M NaCl。失血60％后，使动物趋向室温，不人工维持在 37℃。失血60％后1小时输回流出的血液，监测大鼠的存活情况。接受 D-BHB的动物存活长于接受相同重量克分子渗透浓度NaCl的动物。重要 的是，给予D-BHB推注然后输注D-BHB的动物的存活明显长于(p-值＜0.016) 给予NaCl的动物(图13)。

将43mM褪黑素加入4M D-BHB中可观察到在血液输回后明显的额外存 活益处(图14和19)。失血期间，监测动物的心率(图15)、平均动脉血压(MABP； 图16)和体温(图17)。

此外，手术后第1-6天，对大鼠进行神经学评分，手术后第7-10天，对 大鼠进行记忆检验，手术后第10天，处死大鼠并进行脑组织学检验。

总结

给予基于酮体的4M D-BHB溶液的动物在出血性休克后比给予4M NaCl 的动物存活得长。此外，用反馈灯维持于37℃的动物明显比趋向室温的动物死 得快。趋向室温的动物存活比热维持的动物平均长3倍。这提示适度低温对于 出血性休克的存活至关重要，证明温度对失血60％的存活有影响。

实施例4-关于大鼠中显著失血的额外实验

在额外的实验中，在如实施例3所述出血性休克的大鼠模型中比较用含 20％DMSO的水性溶液配制的含4M D-BHB和43mM褪黑素的缺血/再灌注保 护组合物与对照溶液。对照溶液是含20％DMSO和(1)4M D-BHB、(2)4M NaCl或(3)4M NaCl和43mM褪黑素的水性溶液。

如实施例3所述制备溶液，除了通过将褪黑素浓度减半来稀释实施例3 所述褪黑素/100％DMSO储备溶液，用两倍体积的褪黑素储备溶液制备输注 入大鼠的溶液。输注用溶液含有20％DMSO(替代实施例3所述的10％ DMSO)。

大鼠通常在开始放血后10分钟左右失血约40％。失血约40％后，给大鼠 输注含D-BHB加褪黑素的1mL/kg推注剂量的缺血/再灌注保护组合物或对 照溶液。推注输注的时间跨度为约10分钟，随后开始连续输注(100微升/ 小时)含D-BHB和褪黑素的缺血/再灌注保护组合物或对照溶液。在随后约 10分钟期间，血压进一步降低直至流出的血液总量等于总血液的约60％。 继续输注(100微升/小时)含D-BHB和褪黑素的缺血/再灌注组合物或对照溶 液直至失血约60％后1个小时。然后开始输回流出的血液。该项研究的终 点是血液输回后死亡，或在观察10天后施以安乐死。

这些研究的结果显示与输注含4M D-BHB、4M NaCl或4M NaCl加褪黑 素的对照溶液的大鼠相比，输注含D-BHB和褪黑素的缺血/再灌注保护组合物 的失血60％大鼠的存活时间显著增长(图19)。实际上，用含D-BHB加褪黑素 的缺血/再灌注保护组合物治疗的大鼠和未发生失血的假治疗大鼠之间没有显 著差异。任何治疗组之间未观察到血清乳酸浓度有显著差异(图20)。

实施例5-对显著失血的大动物的保护作用

目标

在出血性休克的临床相关大动物模型中测试缺血/再灌注保护组合物的效 力。采用出血性休克的受控模型，其将50mm Hg收缩压用作放血终点来模拟 大血管损伤和血块形成。参见，例如Skarda等，2006，J.Amer.Coll.Surg.， 203(3S)：S32-S33。

利用两组动物，并经处理以模拟实际生活环境。动物被施以出血性休克方 案，然后在出血后15分钟静脉内接受缺血/再灌注保护组合物或运载体溶液以 模拟第一响应者的现场初始治疗。为模拟到达治疗机构，在休克后1.5小时， 采用标准方案对所有动物进行复苏。动物在8小时期间复苏至血压、尿排出量 和血红蛋白的标准临床终点，然后处死以供分析。

表2.出血性休克/复苏期间检测的终点

  生理参数   氧输送(DO2)和消耗(VO2)、尿排出量、   心率、血压、心输出量、肺毛细血管楔

  压(PCWP)   近红外分光检测   组织氧合血红蛋白饱和度(StO2)   骨骼肌、胃、肝   BIS监测器   麻醉下的镇静检测   实验室检测   乳酸、BUN、肌酸酐、AST、ALT、碱   性磷酸酶、胆红素、LDH、CPK、血糖、   动脉和静脉血气   复苏指数   液体消耗、输血

实验的主要终点是组织灌注充分性的参数。这些包括乳酸水平、碱不足和 StO2。乳酸和碱不足是外伤患者临床复苏的公认且广泛使用的终点，而StO2 是检测组织血红蛋白中氧饱和度的参数，其显示与外伤模型中的氧输送相关。 在最近的严重伤害外伤患者的观察实验中，StO2可预测死亡率以及乳酸和碱不 足。其它参数列于表2并实验期间记录，如表3所示。

表3.测量矩阵

  基线   休克 30，60，90   1小时   复苏  2小时   复苏  4小时   复苏  6小时   复苏  8小时   复苏   介入性血液动力学   (Invasive Hemodynamicsa)   x   x   x   x   x   x   x   实验室检测   x   x   x   x   x   x   x   NIR参数(mm、肠、肝)   x   x   x   x   x   x   x   肌肉、肝活检   x   休克90   x

实验方案

利用阿法双酮和氯胺酮的组合麻醉动物。采用由阿法双酮(新泽西州凯 尼尔沃思仙林葆雅动物健康公司(Schering-Plough Animal Health， Kenilworth，N.J.)的一种类固醇麻醉剂)和一氧化二氮构成的方案，使动物在 最初的手术期间和休克期间接受麻醉，该组合已证明能保留身体对休克的 许多反射性反应同时维持合适的麻醉水平。在预备手术期间，采用机械呼 吸机经气管内插管给动物通气，其中FiO2调节至PaO2为80-120mm Hg和 PaCO2为37-43mm Hg。预备手术包括剖腹脾切除术(防止自身输血)、IVC 的套管插入术和膀胱导管插入术。经颈部切开安置动脉和肺动脉导管。稳 定期后，通过将血抽入肝素化血袋中从而获得50mm Hg的收缩压以诱导出 血性休克。休克15分钟后，动物静脉内接受含有D-BHB和褪黑素或乙酰 乙酸和褪黑素的缺血/再灌注保护组合物，或运载体溶液。

休克90分钟后，开始按照体重给动物输注缺血/再灌注保护组合物或运载 体溶液。此外，采用图18所概述的标准复苏方案使动物复苏至临床终点。在 整个休克和复苏期间，动物用呼吸机维持并接受剂量调整的异丙酚和一氧化二 氮以维持合适的镇静和舒适水平(利用BIS监测器监测)。复苏开始8小时后， 处死存活的动物。

实施例6-对显著失血的大动物的保护作用

如它处所述，在出血性休克的猪模型中测试含有D-BHB加褪黑素的缺血/ 再灌注保护组合物的效力(实施例5；Beilman等，1999，Shock，12(3)：196-200； Skarda等，2007，Resuscitation，75(1)：135-44；Taylor等，2004，Shock， 21(1)：58-64；Taylor等，2004，J.Trauma，56(2)：251-258；Mulier等，2005， Shock，23(3)：248-52；Skarda等，2006，J.Amer.Coll.Surg.，203(3)：S32-S33； Taylor等，2005，J.Trauma，58(6)：1119-25)。选择猪模型是因为可接受其作为 人出血性休克的临床相关模型。采用失血至收缩压约为50mm Hg来触发在严 重失血的外伤患者中观察到的血管代偿不全(vascular decompensation)。

基本上如实施例5所述进行实验。两实验组的猪经历出血性休克并接受处 理以模拟实际情况。一组猪接受含20％DMSO的水性溶液配制的含4M D-BHB 和43mM褪黑素的缺血/再灌注保护组合物。另一组接受含4M NaCl和20％ DMSO的对照溶液。溶液经中央静脉导管给予(经外周静脉给予缺血/再灌注 保护组合物可导致一定程度的局部组织坏死)。

出血后15分钟时给予每只猪1mL/kg的推注输注缺血/再灌注保护组合 物或对照溶液以模拟急诊医护人员在现场的初始治疗。推注输注后，立即 将两组猪各自再分入3个给药组中的一组。一个给药组连续输注0.66毫升/ 千克/小时的缺血/再灌注保护组合物或对照溶液直至复苏后4小时(高剂 量)。第二给药组连续输注0.33毫升/千克/小时的缺血/再灌注保护组合物或 对照溶液直至复苏后4小时(中等剂量)。第三组在推注输注后(休克后15分 钟)不立即给予连续输注，但在休克后60-90分钟(复苏之时)开始给予连续 输注0.33毫升/千克/小时的缺血/再灌注保护组合物或对照溶液并持续至复 苏后4小时(低剂量)。

为模拟到达治疗机构，在休克后60-90分钟对所有动物进行复苏。当动物 发生乳酸水平＞8mg/dl、显示组织血红蛋白氧饱和度(StO2)降低至低于 50％，并表现出血管紧张度丧失(收缩压降低超过10mm Hg)的迹象时开始 复苏。动物复苏至血压、尿排出量和血红蛋白的标准临床终点(图18)。复苏8 小时后处死动物。

检测对照猪以及给予低、中或高剂量缺血/再灌注保护组合物的猪中 D-BHB的血清水平(mM)。检测基线时；休克后30、60和90分钟时；复苏开 始后1、2、4、6和8小时的水平(图21)。这些结果表明给予缺血/再灌注保护 组合物的猪中观察到的血清D-BHB水平与给予缺血/再灌注保护组合物的大鼠 中观察到的血清D-BHB水平类似(比较图21与图11)。这些实验的结果表明含 有D-BHB加褪黑素的缺血/再灌注保护组合物在猪出血性休克模型中的安全性 并改善了复苏期间监测的重要临床测量值。

猪出血性休克实验期间检测的主要终点之一是血清乳酸水平(图22)。血清 乳酸水平是广泛用作外伤患者临床复苏终点的组织灌注充分性的指标。许多研 究显示经历外伤性休克而存活的患者的乳酸水平比未存活的那些患者更快恢 复正常。血液中的乳酸累积是死亡的预后指标。与对照相比，在用缺血/再灌注 保护组合物治疗的动物中观察到乳酸水平降低更快(图22)。对照动物复苏6小 时的平均乳酸水平与用缺血/再灌注保护组合物治疗的动物只复苏4小时后发 现的水平相同。这些数据表明与对照动物相比，用缺血/再灌注保护组合物治疗 的猪中出血性休克后的组织稳态更好。应该注意，将接受缺血/再灌注保护组合 物的猪的测量值一起取平均值，接受对照溶液的猪的测量值也一样。

碱不足/过量是大动物实验期间评估的另一参数(图23；Siggaard-Andersen， 1974，《血液的酸碱状态》(The acid-base status of the blood)，第4版， Copenhagen：Munksgaard；Schmelzer等，2008，Am.J.Emerg.Med.，26：119-23； Eastridge等，2007，J.Trauma，63：291-9；Englehart和Schreiber，2006，Curr. Opin.Crit.Care，12：569-74)。利用血气分析仪(碱不足药盒编号24315009的 GP 3000型，马萨诸塞州莱克星顿仪器实验室公司(Gem Premier Model 3000 with Base Deficit Cartridge No.24315009；Instrumentation Laboratories Inc.， Lexington，MA))检测碱不足。与乳酸水平相似，碱不足/过量公认是组织灌注 充分性的量度，并广泛用于评估外伤患者的临床复苏。用缺血/再灌注保护组合 物治疗的动物中，休克开始后90分钟时达到的碱不足水平不如给予对照溶液 的动物中严重(图23)。此外，在用缺血/再灌注保护组合物治疗的组中观察到碱 不足恢复快于对照组。在对照组中，休克后约45分钟开始观察到大于6mEq/L 的碱不足并持续至复苏后约2小时，但在用缺血/再灌注保护组合物治疗的组中 未观察到这种情况，该值是死亡率指标(Cohn等，2007，J.Trauma， 62(1)：44-54)。

总之，图22和23所示的结果显示用包含D-BHB和褪黑素的缺血/再灌注 保护组合物治疗与更快清除乳酸和碱不足的趋势相关。这些结果强烈支持用缺 血/再灌注包含组合物治疗可降低人外伤患者的死亡率并改善后果。

还检测了给予缺血/再灌注保护组合物或对照溶液的猪的血清pH值(图 24)。在用缺血/再灌注包含组合物治疗的动物中，血清pH水平未降低至对照 动物中的水平。此外，在用缺血/再灌注保护组合物治疗的动物中观察到pH水 平比对照动物更快恢复正常。

还通过检测组织氧合血红蛋白饱和度检测了组织灌注的充分性(StO2；图 25；Zenker等，2007，J.Trauma，63：573-80；Puyana和Pinsky，2007，Crit.Care， 11：116；Cohn等，2007，J.Trauma，62：44-55；和Myers等，2005，J.Biomed. Opt.，10：034017)。StO2值表明组织血红蛋白中的氧饱和度，并显示与外伤模 型中的氧输送相关。在严重伤害的外伤患者的研究中，StO2至少预计了死亡率 以及乳酸和碱不足(Cohn等，2007，J.Trauma，62(1)：44-54)。此外，认识到如 果在复苏后早期阶段尽可能提高发生外伤性休克的患者的组织氧输送和消耗， 则他们更可能存活。观察了如StO2水平检测的休克期间用缺血/再灌注保护组 合物治疗的动物与对照相比组织再灌注的维持情况(图25)。用缺血/再灌注保护 组合物治疗的动物中StO2水平较高表明有本文所述缺血/再灌注保护组合物存 在下重要器官有更多的氧可用，这通常能改善患者和存活率和结局。除了用缺 血/再灌注保护组合物处理的动物中StO2水平较高，观察到相比于用对照溶液 治疗的猪，用缺血/再灌注保护组合物治疗的猪的氧输送增加(图26)。

除了利用多个矩阵来评估用缺血/再灌注保护组合物或对照溶液治疗的出 血性休克猪中组织灌注是否成功并回复正常稳态，还检测了复苏期间需要给予 的液体体积(图27和28)。复苏所需的液体总量是重要参数，因为进攻性 (aggressive)液体给予会增加死亡率。具体地说，在达到稳态前逆转低血压的进 攻性液体给予会部分除去形成的血块并稀释已有的凝血因子，从而进一步造成 失血。给予缺血/再灌注保护组合物与复苏需要较低液体体积的一致趋势相关 (图27)。这些结果进一步证明给予缺血/再灌注保护组合物可降低发生出血性休 克的个体的死亡率。

猪实验期间还监测了心输出量、心率、收缩压和尿排出量等基础生命体征， 因为它们也是人出血性休克患者的基础生命体征。当外周组织过分损失血液和 氧从而造成细胞能量水平太低和毒性副产物太高时，发生致死性休克。在这些 条件下，外周组织不能再维持外周血管收缩以维持血液流至脑和心脏。这种血 管收缩的丧失常是死亡的最后原因。在对照组中，伴有外周血管紧张度丧失的 失血会导致收缩压降低(图31)，随后心输出量补偿性地增加(图28)以维持脑和 心脏血流。然而，与对照相比，用缺血/再灌注保护组合物治疗的动物似乎维持 了外周组织血管收缩，从而在心率增加(图29)和收缩压增加(图30)的情况下导 致心输出量降低(图28)。此外，用缺血/再灌注保护组合物治疗的猪的肾排出量 恢复更快(图32)。尿排出量是肾功能的指标，进而由流向肾脏的血液和肾细胞 的完整性决定。这些结果表明本文所述的缺血/再灌注保护组合物通过提供更有 效的能量供给和抵消副产物的累积毒性而促进外周组织的活力。

用缺血/再灌注保护组合物治疗动物能防止腹内间隔综合征 (intra-abdominal compartment syndrome)(IACS)，从而进一步证明缺血/再灌注 保护组合物在供应组织能量和维持细胞完整性中的有益作用。IACS是涉及腹 部快速肿胀的综合征，其在外伤患者复苏期间可能发生并且是死亡迫近的前 兆。虽然接受低剂量的缺血/再灌注保护组合物的两只猪在明确复苏之前死亡， 但用缺血/再灌注保护组合物治疗的猪无一发生IACS。另一方面，在对照组中， 动物在复苏开始后4.5小时因IACS而死亡。表4显示了发生出血性休克并给 予对照溶液或低、中和高剂量的本文所述缺血/再灌注保护组合物的各组中存活 和死亡的猪数量。

表4.猪死亡率

其它实施方式

应该知道，虽然结合详述描述了本发明，但以上描述是为了说明而非限制 由随附权利要求书的范围限定的本发明范围。其它方面、优点和改进落在所附 权利要求书的范围内。

相关申请的交叉引用

根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2007年4月12日提交的美国申请号 60/911,460，2008年2月5日提交的61/026,321的优先权，其内容通过引 用全文纳入本文。

联邦资助的研究或开发

按照国防部高等研究计划署(Defense Advanced Research Projects Agency) (DARPA)授予的基金号W911NF-05-1-0432和W911NF-06-1-0088，美国政府 对本发明享有一定权利。