使用血液结合素的组合物和治疗方法
阅读：699发布：2023-03-13
专利汇可以提供使用血液结合素的组合物和治疗方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且使用具有充分唾液 酸化 和/或缺乏中性聚糖的重组血液结合素分子，使其得以充分循环以便将游离血红素从 生物 有 机体 中除去，以提供用于 治疗 性治疗的组合物和方法。在其他实施方式中，提供了用于治疗性治疗的重组血液结合素分子，在使用 荧光 探针2‑ 氨 基苯 甲酸 标记后通过HPLC测得，所述重组血液结合素分子具有的中性聚糖占总聚糖的百分数在从约百分之2至约百分之30的范围。，下面是使用血液结合素的组合物和治疗方法专利的具体信息内容。
1.一种用于治疗性治疗的重组血液结合素分子，其包含在使用荧光探针2-氨基苯甲酸标记后通过HPLC测得占总聚糖约百分之2至约百分之30百分比范围的中性聚糖。
2.根据权利要求1所述的重组血液结合素分子，其由CHO细胞表达的。
3.根据权利要求1所述的重组血液结合素分子，其中所述CHO细胞包括CHO-K1细胞。
4.根据权利要求1所述的重组血液结合素分子，其中所述重组血液结合素分子包括哺乳动物血液结合素分子。
5.一种用于治疗性治疗的重组血液结合素分子，其包含在使用荧光探针2-氨基苯甲酸标记后通过HPLC所测得的，占约百分之2至约百分之30百分比范围的中性聚糖，占约百分之
2至约百分之40百分比范围的单唾液酸化聚糖，以及占约百分之20至约百分之90百分比范围的二/三唾液酸化聚糖。
6.根据权利要求5所述的重组血液结合素分子，其中所述血液结合素分子用于治疗疾病中血红素的毒性效应。
7.根据权利要求6所述的重组血液结合素分子，其中所述疾病包括镰状细胞病。
8.根据权利要求6所述的重组血液结合素分子，其中所述疾病包括β-地中海贫血。
9.一种制备重组血液结合素分子的方法，所述重组血液结合素分子含有占总聚糖约百分之2至约百分之30百分比范围的中性聚糖，其中所述百分比范围是使用荧光探针2-氨基苯甲酸标记后通过HPLC测得，所述方法包括：
(a)将包含重组血液结合素核酸序列的核酸插入CHO细胞；以及
(b)从所述CHO细胞表达所述重组血液结合素分子，其中所述重组血液结合素的中性聚糖百分比是用荧光探针2-氨基苯甲酸标记后通过HPLC测得的约百分之2至约百分之30的范围。
10.根据权利要求9所述的制备重组血液结合素分子的方法，其中所述CHO细胞包括CHO-K1细胞。
11.根据权利要求1所述的用于治疗性治疗的重组血液结合素分子，其中所述中性聚糖用荧光探针2-氨基苯甲酸标记后通过HPLC测得占总聚糖的百分比小于百分之30。
12.根据权利要求1所述的用于治疗性治疗的重组血液结合素分子，其中所述中性聚糖用荧光探针2-氨基苯甲酸标记后通过HPLC测得占总聚糖的百分比小于百分之20。
13.根据权利要求1所述的用于治疗性治疗的重组血液结合素分子，其中所述中性聚糖用荧光探针2-氨基苯甲酸标记后通过HPLC测得占总聚糖的百分比小于百分之10。
14.一种治疗性治疗的方法，其包括向对象施用重组血液结合素分子，所述重组血液结合素分子具有占总聚糖约百分之2至约百分之30百分比范围的中性聚糖，所述百分比范围是用荧光探针2-氨基苯甲酸标记后通过HPLC测得。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述重组血液结合素分子以足够结合游离血红素的半衰期在血液中循环。
16.一种重组血液结合素分子，所述重组血液结合素分子与SEQ ID NO:1具有90％或更高的同源性，其中在使用荧光探针2-氨基苯甲酸标记后通过HPLC测得中性聚糖占总聚糖的百分比范围为约百分之2至约百分之30。
17.根据权利要求1或16所述的重组血液结合素分子，其中所述分子用于治疗选自下组的疾病：镰状细胞病、β-地中海贫血、缺血再灌注、红细胞生成性原卟啉症、迟发性皮肤卟啉症、疟疾、类风湿性关节炎、与炎症相关的贫血、血色素沉着症、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、溶血性尿毒症综合征(HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、先兆子痫、败血症、急性出血和与血液或血液代用品输血相关的并发症以及与器官移植相关的器官保存。
18.一种用于从细胞输出血红素的方法，所述方法包括将所述细胞与权利要求1或16所述的重组血液结合素分子接触。
19.一种治疗与游离血红素的毒性相关的病症的方法，所述方法包括向需要其的对象施用治疗有效量的权利要求1或16所述的重组血液结合素分子。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述病症选自：镰状细胞病、β-地中海贫血、红细胞生成性原卟啉症、迟发性皮肤卟啉症、缺血再灌注和疟疾。
21.一种治疗与细胞内血红素过量相关的病症的方法，所述方法包括向需要其的对象施用治疗有效量的根据权利要求1或16所述的重组血液结合素分子。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述病症选自下组：类风湿性关节炎、与炎症相关的贫血以及其中铁沉积在巨噬细胞中的状况。
使用血液结合素的组合物和治疗方法
背景技术
[0003] 血红素在生物有机体内具有多种功能。其是血红素蛋白如细胞色素、DNA合成酶、肌红蛋白和血红蛋白的关键组成。然而，较高水平的游离血红素可能是有毒的，并且失控的游离血红素能够导致多种疾病和病症。
[0004] 在具有加速溶血的疾病中，如镰状细胞病(SCD)和β-地中海贫血(BThall)，与正常对照相比血红素水平升高。升高的血红素水平是由于裂解的红细胞释放血红蛋白所致，其在轻度氧化后释放出血红素部分。游离的血红蛋白和血红素清除一氧化氮并催化具有细胞毒性的活性氧中间体形成以及在细胞中诱导促炎性应答。肝脏在辅助调节血红素水平方面起着至关重要的作用。肝脏与各种蛋白(包括FLVCR)联合作用，将过量的血色素运出到胆汁和粪便中。在正常个体中，有两种蛋白触珠蛋白和血液结合素分别清除游离的血红蛋白和血红素，并因而降低相关的细胞毒性和促炎性作用。
[0005] 血液结合素是一种基于血浆的糖蛋白，其防止出现与溶血性和感染性疾病相关的血红素介导的细胞毒性。这种蛋白在一些临床环境中变得严重耗竭，例如镰状细胞病(SCD)和地中海贫血。血液亲和素具有已知最高的与血红素的结合亲和性(据报道为Kd<1pM)。而且，除了降低游离血红素的毒性作用外，血液结合素能够降低游离血红蛋白的负面效应，据推测是由于其能够清除相关的毒性血红素。在溶血性疾病中，触珠蛋白和血液结合素两者变得严重耗竭，留下血红蛋白和血红素任意发挥其负面效应。血液结合素还能够作为血红素清除剂，以减轻在溶血性疾病中游离血红素的毒性作用。例如，人血浆来源的血液结合素在SCD和Bthall小鼠模型中已显示出降低细胞毒性和促炎性作用并改善血管功能。血液结合素已显示出结合并螯合血管内的血红素并降低其相关毒性。
[0006] 人血浆来源的血液结合素是全唾液酸化的血浆糖蛋白，其具有7天的循环半衰期。在与血红素结合后，在血液结合素中发生构象改变，这增加了其在肝细胞中对LRP受体的亲和力，导致该复合物从循环中迅速移除(T1/2＝7小时)。血液结合素被N和O-连接的碳水化合物广泛地糖基化。N-连接聚糖上半乳糖残基适当唾液酸化可以对体内蛋白的清除性质具有显著影响。唾液酸化不足可以通过肝细胞上的去唾液酸糖蛋白受体导致更迅速的清除，从而使其在有机会发挥治疗效果之前将其从循环中移除。当争取高表达水平，其中糖基化和唾液酸化途径可能无法跟上蛋白质产生的速率时，这对于重组蛋白可能特别有问题。
[0007] 蛋白的生物利用度是影响或减轻特定疾病或其相关症状的关键因素。而且，对于治疗性治疗的另一限制因素是使用血液结合素似乎需要施用较高水平的蛋白。这可能是由于在加速溶血的疾病中看到的高周转速率所致。当来源于血浆的血液结合素可能作为临床开发的来源时，其具有固有的风险，如将疾病(例如HCV、HIV)传播给患者的可能性。重组血液结合素生产工艺的改进能够提高使用商业上可行的方法制备此类蛋白的可能性。
[0008] 仍需要用于治疗性治疗和从生物有机体的细胞和血浆中除去血红素的有效组合物和方法。而且，从细胞和血浆中输出血红素以降低过量血红素的毒性并防止与这些失衡有关的各种生物病症是必要的。发明内容
[0009] 提供了用于治疗性治疗的组合物和方法，所述组合物和方法包括具有充分唾液酸化和/或足够低水平或缺乏中性聚糖以使得其充分循环以便从生物有机体除去游离血红素的重组血液结合素分子。
[0010] 在一些实施方式中，提供了用于治疗性治疗的重组血液结合素分子，所述重组血液结合素分子包含在使用荧光探针2-氨基苯甲酸标记后通过HPLC测得的中性聚糖占总聚糖的百分数在从约百分之2至约百分之30的范围。在至少一个实施方式中，重组血液结合素分子可以由CHO细胞表达，如CHO-K1细胞。在至少一个实施方式中，重组血液结合素分子可以包含哺乳动物血液结合素分子。
[0011] 在至少一个实施方式中，用于治疗性治疗的重组血液结合素分子包含在使用荧光探针2-氨基苯甲酸标记后通过HPLC测得的中性聚糖的百分数在从约百分之2至约百分之30的范围，单唾液酸化聚糖的百分数在从约百分之2至约百分之40的范围以及二/三唾液酸化聚糖的百分数在从约百分之20至约百分之90的范围。在至少一个实施方式中，血液结合素分子用于治疗疾病中血红素的毒性效应，如镰状细胞病或β-地中海贫血。
[0012] 在至少一个实施方式中，所述血液结合素分子包含在使用荧光探针2-氨基苯甲酸标记后通过HPLC测得所述中性聚糖占总聚糖的百分数小于百分之30。在至少一个实施方式中，在使用荧光探针2-氨基苯甲酸标记后通过HPLC测得所述中性聚糖占总聚糖的百分数小于百分之20，或小于百分之10。
[0013] 在其他实施方式中，提供了与SEQ ID NO:1具有90％或更高同源性的重组血液结合素分子，其中在使用荧光探针2-氨基苯甲酸标记后通过HPLC测得的中性聚糖占总聚糖的百分数在从约百分之2至约百分之30的范围。
[0014] 还提供了制备重组血液结合素分子的方法。在一些实施方式中，制备具有使用荧光探针2-氨基苯甲酸标记后通过HPLC测得的中性聚糖占总聚糖的百分数在从约百分之2至约百分之30范围的重组血液结合素分子的方法包括将适宜的插入物和载体插入CHO细胞中；以及从该CHO细胞表达重组血液结合素分子，其中使用荧光探针2-氨基苯甲酸标记后通过HPLC测得重组血液结合素的中性聚糖百分数在从约百分之2至约百分之30的范围。在该方法的至少一个实施方式中，CHO细胞包括CHO-K1细胞。
[0015] 在其他实施方式中，还提供了使用血液结合素的治疗性治疗的方法。在一些实施方式中，治疗方法包括向对象施用重组血液结合素分子，所述重组血液结合素分子具有使用荧光探针2-氨基苯甲酸标记后通过HPLC测得的中性聚糖占总聚糖的百分数在从约百分之2至约百分之30的范围。在至少一个实施方式中，重组血液结合素分子以足以结合游离血红素的半衰期在血液中循环。
[0016] 在本公开的另一个方面，重组血液结合素分子用于减少血管内和/或细胞内的血红素以治疗选自下组的疾病：镰状细胞病、β-地中海贫血、缺血再灌注、红细胞生成性原卟啉症、迟发性皮肤卟啉症、疟疾、类风湿性关节炎、与炎症相关的贫血、血色素沉着症、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、溶血性尿毒症综合征(HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、先兆子痫、败血症、急性出血和与血液或血液代用品输血相关的并发症以及与器官移植相关的器官保存。
[0017] 在本公开的另一个方面，重组血液结合素分子用于从细胞输出血红素的方法中，所述方法包括将细胞与重组血液结合素分子结合，所述重组血液结合素分子包含使用荧光探针2-氨基苯甲酸标记后通过HPLC测得的中性聚糖占总聚糖的百分数在从约百分之2至约百分之30的范围。在至少一个实施方式中，重组血液结合素分子用于治疗与游离血红素的毒性相关的病症的方法中，所述方法包括向需要其的对象施用有效量的重组血液结合素分子，所述重组血液结合素分子包含使用荧光探针2-氨基苯甲酸标记后通过HPLC测得的中性聚糖占总聚糖的百分数在从约百分之2至约百分之30的范围。优选地，病症选自：镰状细胞病、β-地中海贫血、红细胞生成性原卟啉症、迟发性皮肤卟啉症、缺血再灌注和疟疾。
[0018] 在至少一个实施方式中，重组血液结合素分子用于在治疗与血管内或细胞内血红素过量相关的病症的方法中，所述方法包括向需要其的对象施用有效量的重组血液结合素分子，所述血液结合素分子包含使用荧光探针2-氨基苯甲酸标记后通过HPLC测得的中性聚糖占总聚糖的百分数在从约百分之2至约百分之30的范围。优选地，病症选自：镰状细胞病、β-地中海贫血、类风湿性关节炎、与炎症相关的贫血以及其中血红素沉积在细胞中的其他状况。
[0022] 图2显示了使用来自来源于不同高表达CHOK1和CHO-S的血液结合素的条件培养基测定的抑制血红素依赖性过氧化物的EC50。使用市售的血红素依赖性过氧化物酶测定法进行测定。
[0023] 图3显示了总结聚糖分析的流程图。
[0024] 图4显示了来自筛选的克隆子集的唾液酸化N-聚糖MALDI分析。
[0025] 图5显示了来自筛选的克隆子集的中性N-聚糖MALDI分子。
[0026] 图6显示了针对不同CHOK1和CHOS克隆的基于2AA分析的中性聚糖％。
[0027] 图7是显示来源于CHOK1克隆对比CHO-S的血液结合素的中性聚糖％的图。
[0028] 图8显示了中性聚糖％对CHOK1克隆表达水平的曲线。所选择的克隆为圆形。CHOK1-76克隆以箭头指出。
[0029] 图9显示了对用于药代动力学分析的来源于血浆的(pd-HPX)、两个批次CHOK1克隆76(CHOK1批次A和B)以及来源于CHOS的血液结合素进行的中性N-聚糖MALDI分析。
[0030] 图10显示了对用于药代动力学分析的来源于血浆的(pd-HPX)、两个批次CHOK1克隆76(CHOK1批次A和B)以及来源于CHOS的血液结合素进行的唾液酸化N-聚糖MALDI分析。
[0031] 图11显示了对用于药代动力学分析的来源于血浆的(pd-HPX)、两个批次CHOK1克隆76(CHOK1批次A和B)以及来源于CHOS的血液结合素进行的显示中性聚糖％的2AA分析。
[0032] 图12显示了对来自生物反应器培养的在第7、11和14天收集的来源于CHOK1克隆76的血液结合素纯化蛋白进行的显示中性、单唾液酸化以及二和三唾液酸化N-聚糖％的2AA分析。
[0033] 图13显示了在Sprague-Dawley大鼠中的来源于重组(r-HPX)和血浆(pd-HPX)的血液结合素的药代动力学分析。
具体实施方式
[0034] 本公开提供了使用血液结合素和/或重组血液结合素的组合物和治疗方法。可以将该组合物和方法施予具有一种或多种疾病或症状的对象。在特定情况下，疾病可能与升高的血红素水平相关。
[0035] 出于解释本说明书的目的，将适用下述定义。除非明确地有一定相反意义的意图(例如在最初使用该术语的文件中)，否则在以下所述的任何定义与任何其他文件包括通过引用并入本申请的任何文件中的词语用法有相抵触的情况下，出于解释本说明书及其相关权利要求的目的，应以下述的定义为准。
[0036] 只要适宜，单数使用的术语也将包括复数形式且反之亦然。除非另有说明或者“一个或多个”的用法是明显不适宜的，否则本申请中“一个”的用法指“一个或多个”。除非另有说明，“或”的用法指“和/或”。“包含”(comprise、comprises、comprising)、“包括”(include、includes、including)的用法可以互换使用并且不受显示。术语“如”(such as)也并非旨在限制。例如，术语“包括”(including)应指“包括，但不限于”。
[0037] 如在本申请中所使用的，术语“约”指所提供的单位值的+/-10％。如在本申请中所使用的，术语“基本上”指显示有关特征或性质的总计或大约程度的定性状况。生物领域的普通技术人员将理解，生物和化学现象很少有(即使有)达到或避免绝对结果，因为有很多影响生物和化学组分和材料的测试、生产和储存的变量，以及因为在生物和化学组分和材料的测试、生产和储存中所用的仪器和设备中存在固有误差。因此，在本申请中使用术语基本上以捕捉很多生物和化学现象中固有的可能缺乏的完整性。
[0038] 如在本申请中所使用的术语“血液结合素”或“来源于血浆的血液结合素”或“HPx”或“pd-HPX”指血液结合素的任意变体、同种型和/或物种同源物，所述血液结合素的形式是由细胞天然表达的并且存在于血浆中并且与重组血液结合素不同。
[0039] 如在本申请中所使用的术语“重组血液结合素”或“rHPx”指血液结合素的任意变体、同种型和/或物种同源物，所述血液结合素的形式是由细胞表达的并且不同于来源于血浆的血液结合素。
[0040] 术语“治疗有效量”指血液结合素或蛋白组合物的量是在体内有效除去过量血红素所需的，或者另外对需要其的对象在体内产生可测量的益处的。精确的量将取决于多种因素，包括但不限于治疗组合物的组分和生理特性、意向患者人群、个体患者考虑等，并且能够容易地由本领域技术人员确定。
[0041] 有很多因素限制了使用血液结合素作为治疗性治疗的分子或组合物的能力。
[0042] 限制血液结合素用于治疗性治疗用途的第一个因素是需要施用较高水平的蛋白。这可能是由于在加速溶血的疾病中看到的高周转速率所致。现有方法通过从血浆中提取、纯化和浓缩蛋白来获得血液结合素。这是一个产生有限蛋白的耗时且繁琐的过程。
[0043] 限制来源于血浆的血液结合蛋白用途的第二个因素是涉及疾病传播所产生的可能问题。例如，来源于血浆的血液结合素能够用作临床开发来源的同时，这些组合物具有固有的风险，如可能将疾病(例如HCV、HIV)传播给患者。另外，来源于血浆的样品和组合物包括具有各种导致疾病的病毒和细菌的可能性。存在在扩大生产之前未将这些病原除去和/或过滤的潜在风险。
[0044] 限制血液结合素作为治疗剂的用途的第三个因素涉及无法以有效的生产方法在高水平表达蛋白的同时保持蛋白类以似于体内或天然存在的蛋白发挥功能和/或操作所必需的固有性质。已报道来源于游离血浆的血液结合素具有7天的血浆半衰期。在与血红素结合后，血液结合素的构象改变，使其与肝细胞上LRP的亲和力增加，导致更加迅速从循环移除(T1/2＝7小时)。来源于血浆的血液结合素广泛糖基化，其含有5个N-连接的糖基化位点和1个或2个O连接的糖基化位点。对于来源于血浆的血液结合素而言，在末端半乳糖碳水化合物上的N-连接的碳水化合物完全唾液酸化，以防止其在肝脏中被去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)识别和移除。在重组生产的血液结合素中N-连接的碳水化合物上末端半乳糖的不完全唾液酸化预期将产生更加迅速从循环中除去的蛋白。由于不适宜的唾液酸化的血液结合素通过ASGPR的清除将更加迅速，与血红素结合无关，这预计将导致血液结合素分子具有降低的治疗效能。由2AA分析确定的中性N-聚糖(基于总N-聚糖)的百分数与唾液酸化的程度成反比并且因此中性聚糖百分数降低的组合物具有增加的唾液酸化水平。在本申请中，我们描述了高水平生产充分唾液酸化的血液结合素的表达系统，发现唾液酸化对清除性质的负面影响，并且显示出具有低于30％、低于25％、低于20％、低于15％和低于10％的中性N-聚糖百分数的血液结合素是用于治疗患者对有用的组合物。因此，本组合物和方法提供了无法由pd-HPX分子和其他组合物获得的预料不到的益处。
[0045] 例如，重组血液结合素生产方法的改进能够提高使用商业上可行的方法生产这种蛋白的可能性。然而，使用一般表达系统导致血液结合素或组合物不充分的唾液酸化。而且，因此，降低中性聚糖在分子中相对于总聚糖的存在水平以改进血液结合素分子的总体组成和在体内的循环次数可能是所需要的。由肝脏接触和除去电荷为中性的分子和/或组合物。因此，其在血流中的循环时间将较短并且其清除将较少被与游离血红素形成的复合物所驱动。而且，还应注意的是，治疗分子或组合物必需与来源于血浆的或野生型的血液结合素具有足够相似的特征以便紧密结合在血流中游离的血红素。因此本组合物和方法提供了无法由pd-HPX分子和组合物获得的预料不到的益处。
[0046] 因此，N-连接的聚糖上半乳糖残基的适宜唾液酸化对体内蛋白的清除性质具有显著影响。不充分的唾液酸化可以导致通过肝细胞上的去唾液酸糖蛋白受体更加迅速地清除。当争取高表达水平时，这对于重组蛋白可能特别有问题。天然存在的和重组血液结合素广泛地糖基化，其具有N-连接的和O-连接的碳水化合物。使用分析方法如2AA分析能够确定中性聚糖的百分数。这样确定的中性N-聚糖百分数将与唾液酸化的程度成反比。在单一碳水化合物链上存在具有一个以上的未唾液酸化半乳糖的聚糖结构，预计其对ASGPR应具有最高的亲和性且最快被清除。
[0047] 在重组血液结合素的生产中，生产未充分唾液酸化材料的细胞导致产生血液结合素的快速清除形式。而相反的是，我们已经发现当在产生具有更高唾液酸化程度材料的细胞中表达材料时观察到清除率降低。在生产充分唾液酸化材料的细胞中表达结合生产具有低于30％、低于25％、低于20％、低于15％和低于10％的中性N-聚糖百分率的重组血液结合素的纯化方法将对于患者的治疗更加有用。
[0048] 可以使用多种方法以进一步降低血液结合素分子或组合物中的中性聚糖水平并增加唾液酸化水平。这些方法包括使用各种定义的细胞系、加入特定赋形剂或营养物质改良培养基、使用抑制剂包括但不限于金属或其衍生物以阻断从N-聚糖中除去唾液酸的唾液酸酶以及将突变引入多肽序列以工程化加入或移除各种氨基酸以便影响N-糖基化类型和唾液酸化程度。我们已经发现可以使用具有增加的将唾液酸加入N-聚糖倾向的细胞系以及可以使用从具有增加的将唾液酸加入N-聚糖倾向的转染细胞群中选择克隆。使用编码已知影响唾液酸化过程的蛋白的DNA对细胞的修饰包括但不限于唾液酸转运体、唾液酸转移酶、唾液酸抑制剂或siRNA以及等同的技术。
[0049] 使用重组生产蛋白的补充疗法是一项挑战，至少部分是由于需要较高水平的蛋白。而且，血液结合素具有与正确折叠结合的广泛的翻译后修饰，其可能会差异化影响和改变这种蛋白的个别性质。本申请的发明涉及血液结合素的产生和使用和/或使用重组血液结合素治疗疾病。
[0050] 重组血液结合素分子可以具有与SEQ ID NO:1具有90％或更高同源性的序列。序列中的偏差可能是由如缺失、添加、取代或插入的因素导致，无论其是天然存在的还是由定向诱变或者其他合成或重组技术引入的。而且，同源性指在各核酸分子或由其编码的蛋白之间具有功能和/或结构上的等同性。在至少一个实施方式中，与SEQ ID NO:1同源的核酸分子与SEQ ID NO:1具有相同的生物功能。医药用途
[0052] 血液结合素在血红素病症的治疗中具有治疗用途，所述病症包括涉及过量游离血管血红素的病症和涉及过量细胞内血红素的病症。游离血红素毒性病症包括镰状细胞病、β-地中海贫血、缺血性再灌注、红细胞生成性原卟啉症、迟发性皮肤卟啉症和疟疾。过量游离血红素能够通过催化活性氧物质的形成导致器官、组织和细胞损伤或功能障碍。与过量细胞内血红素相关的病症包括类风湿性关节炎、与炎症相关的贫血以及铁在巨噬细胞中沉积且不能再循环至红细胞的其他状况。能从血液结合素的治疗用途获益的具有过量铁/铁负载的其他疾病包括：血色素沉着症、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症或继发现象(例如溶血性尿毒症综合征(HUS))、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、先兆子痫、败血症以及其他感染和/或炎性疾病、急性出血和与血液或血液代用品输血相关的并发症以及与器官移植相关的器官保存。在任何其中具有广泛的细胞裂解特别是红细胞裂解的疾病中将具有潜在的益处。与释放较高量肌球蛋白的广泛肌肉破坏相关的疾病也将从血液结合素给药中获益。
[0053] 可以通过向需要其的对象施用治疗有效量的血液结合素治疗此类病症。血液结合素分子和组合物还在罕见疾病如SCD的治疗中具有治疗用途。因此，还提供了用于治疗SCD和其他相关疾病的方法。
[0054] 可以将血液结合素制剂以供胃肠外施用(例如通过注射，例如推注或连续输注)并且其可以以单位剂型存在于安瓿、预充式注射器、小量输注或加入防腐剂的多剂量容器中。组合物可以采取此类形式如混悬剂或溶液，且可以含有配制剂如混悬剂、稳定剂和/或分散剂。如在本申请中所使用的，术语“胃肠外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内施用。
[0055] 可以将血液结合素蛋白用作单一疗法或者与其他用于血红素病症的疗法合用。可以以某一剂量和频率向患有血红素缺陷的对象胃肠外施用药物组合物，该剂量和频率能够随着疾病的严重程度而改变，或者在预防性治疗的情况下，能够随着铁缺乏的严重程度而改变。
[0056] 可以以推注或通过连续或间歇性输注向有需要的患者施用组合物。例如，血液结合素蛋白的推注施用通常可以通过输注30分钟至3小时的一段时间施用。施用频率将取决于状况的严重程度。频率的范围可以从每日一次或两次至每两周至每六个月一次。此外，可以通过皮下注射向患者施用组合物。例如，可以通过皮下注射每日、每周、每两周或每月向患者施用1至8000mg剂量的血液结合素。
[0057] 实施例1
[0058] 重组血液结合素的表达、纯化和分析
[0059] 证明了使用DNA2.0优化的血液结合素cDNA序列(SEQ ID NO:3)和天然血液结合素信号序列在CHO细胞中高水平的表达。将鉴定高表达克隆的类似方法用于CHOS和CHOK1细胞。用于CHOK1克隆的方法如下：使用含有密码子优化的血液结合素cDNA的表达载体转染CHOK1细胞。通过限制稀释克隆在96孔板中选择总计300个CHPK1克隆。使用市售的血液结合素ELISA试剂盒(ALPCO,41-HMPHU-E01)测定来自克隆的条件培养基。从最初的300个克隆中鉴定出21个高产者并且随后使用小规模分批补料表达法(50ml)使用来自GE Healthcare Life Sciences公司的ActiCHO培养基进行评估。使用包括离子交换层析(Q-Sepharose,GE Healthcare Life Sciences)或金属螯合层析(Ni-IMAC)后接体积排阻层析(SD200,GE Healthcare Life Sciences)的两步法纯化血液结合素(至>95％纯度)。使用SDS PAGE(4-12％BisTris)凝胶和分析体积排阻层析(SD200,10/300)评估纯化蛋白的纯度。还使用竞争性血红素结合测定(基于血红素依赖性过氧化物酶)分析纯化样品的血红素结合情况并且然后进行聚糖分析(方法概述如下)。在CHOK1和CHO-S这两个细胞系中达到了相似的最大蛋白表达水平(图1)。使用市售试剂盒确定血红素依赖性过氧化物测定的抑制的EC50。所有克隆以相似的效能抑制血红素依赖性过氧化物酶的活性(图2)。对纯化蛋白进行聚糖分析。将市售来源的纯化的来源于血浆的血液结合素(Athens Research Technologies)也包括在聚糖分析中作为对照。聚糖分析包括MALDI分析以鉴定中性和带电荷的N-聚糖结构，包括
2AA分析以鉴定中性聚糖％以及在一些情况下包括总唾液酸分析以确定总唾液酸含量(参见图3，进一步的细节见实施例2)。
2AA分析以鉴定中性聚糖％以及在一些情况下包括总唾液酸分析以确定总唾液酸含量(参见图3，进一步的细节见实施例2)。
[0060] 意外的是，对CHO-S和21CHOK1克隆的纯化血液结合素进行的Maldi和2AA聚糖分析显示了在聚糖性质上的显著差异(见图4、5和6)。MALDI唾液酸化的N-聚糖分析显示了与CHOK1克隆相比来源于CHO-S的血液结合素具有更加多样化的聚糖类型。而且，在来源于CHO-S的材料中存在的中性聚糖百分数与从来源于CHOK1的材料中获得的该结果(6.3％至24.6％)显著增加(47.8％)。中性聚糖百分数的减少情况与唾液酸化程度成反比。因此，根据这项分析可知来自CHOK1克隆的材料具有更高的唾液酸化程度。所有克隆的中性聚糖％如图7中的图表所示。根据中性N-聚糖的百分数和表达水平选择进行附加评估的克隆(图
8)。
8)。
[0061] 使用CHO-S克隆和CHOK1克隆76生产用于药代动力学研究的材料。显示这两个制备物(以及来源于Athens Research Plasma)中性和带电荷N-聚糖的MALID分析如图9和10所示。来自2AA分析的中性聚糖％数据如图11中所示。CHO-S生产的材料具有52％的中性聚糖和CHOK1-76(A批次)生产的材料具有10％的中性聚糖。根据2AA分析，从克隆CHOK1-76条件培养基纯化的第二批次血液结合素具有增加水平的中性聚糖百分数(19％)。汇总四个重组生产制备物和市售获得的来源于血浆的血液结合素的中性聚糖百分数的表如下表1所示。具有较低总中性N-聚糖百分数的制备物也具有较高水平的完全唾液酸化N-聚糖和降低水平的含有两个或多个不带电末端半乳糖部分的N-聚糖。
[0062] 表1
[0063] 对在药代动力学分析中使用的制备物的中性聚糖％(2AA)和Maldi带电N-聚糖分析汇总
[0064]
[0065] 在如下所示的药代动力学分析中对来自这些制备物的蛋白进行了评估。
[0066] 对CHOK1克隆76进一步的分析表明在使用来自生物反应器培养物的条件培养基纯化的蛋白中中性聚糖百分数的水平取决于所进行的培养时间的长度。我们使用在第7、11和14天时从克隆76获得的条件培养基孵育10L生物反应器(ActiCHOP培养基)。从在这些天收集的培养基中纯化血液结合素并且然后评估中性聚糖％。数据(图12)表明在生物反应器运行期间中性聚糖％呈时间依赖性增加。这可能是由于关键培养基成分的消耗或者在培养基中存在导致唾液酸随时间除去的唾液酸酶所致。可以通过使用改良的培养条件、在进料中加入培养基成分或将唾液酸酶抑制剂加入培养基中的组合对条件进行进一步优化以降低产品中的中性聚糖％。此外，还可以想到某些已知的方法或技术用于将能够增加唾液酸化的各种基因加入这些高产细胞中。这可以包括但不限于唾液酸转移酶和CMP-唾液酸转运蛋白。
[0067] 实施例2
[0068] 聚糖分析
[0069] 2AA分析-在使用荧光探针2-氨基苯甲酸标记后通过HPLC对中性和唾液酸化的N-聚糖进行分析。通过使用糖苷酶F(Oxford Glycosystem)释放N-聚糖，随后使用2-氨基苯甲酸标记。在NH2P40-2D柱上对标记样品进行分析，使用在乙腈中的2％乙酸/1％四氢呋喃作为溶剂A和在水中的5％乙酸/1％四氢呋喃/3％三乙胺作为溶剂B，使用荧光检测(激发360nm，发射425nm)。
[0070] MALDI分析-对于确定聚糖的结构而言，通过使用糖苷酶F释放N-聚糖，随后进行MALDI-MS分析。对于中性聚糖分析而言，使用2,5-二羟基苯甲酸作为基质，同时使用2',4',6'-三羟基苯乙酮一水合物进行唾液酸化的聚糖分析。对于中性N-聚糖分析而言，数据采集参数如下：离子源1：20kV，离子源2：17kv，透镜9kv，反射镜1：26，反射镜2：14。对于唾液酸化的N-聚糖分析而言，数据采集参数如下：离子源1：20kv，离子源2：19kv，透镜：5kv。
[0071] 实施例3
[0072] PK研究
[0073] 在清醒的、雄性Sprague-Dawley大鼠中评估了重组的(来源于CHO-S和CHOK1的)和来源于血浆的(Athens Research Technologies)血液结合素的药代动力学和处置性质。重组的来源于CHO-K1的血液结合素经过聚糖修饰以降低中性聚糖百分数。重组的来源于CHO-S的血液结合素未经过聚糖修饰。将血液结合素以3mg/kg的剂量单次静脉给予股静脉。这项TM研究使用Culex 自动血液取样系统(Bioanalytical Systems,Inc.,Lafayette,IN)进行。
给药后，在预定时间点通过颈静脉将血液样品连续收集至含有5％柠檬酸钠作为抗凝剂的收集管中，直到72小时。随后，从这些样品中获得血浆并且在-80℃下保存直至进行分析。使用夹心ELISA法确定血浆中人血液结合蛋白的水平，使用抗人血液结合素抗体作为捕获抗体和HRP-抗人血液结合素抗体作为检测抗体测定大鼠血浆中人血液结合素的总量。
给药后，在预定时间点通过颈静脉将血液样品连续收集至含有5％柠檬酸钠作为抗凝剂的收集管中，直到72小时。随后，从这些样品中获得血浆并且在-80℃下保存直至进行分析。使用夹心ELISA法确定血浆中人血液结合蛋白的水平，使用抗人血液结合素抗体作为捕获抗体和HRP-抗人血液结合素抗体作为检测抗体测定大鼠血浆中人血液结合素的总量。
[0074] 各批次的中性聚糖百分数与在大鼠药代动力学分析中确定的清除性质具有明确的相关性(参见图13)。具有增加的中性聚糖(唾液酸化降低)的血液结合素制备物具有较快的α相和清除速率、增加的分布溶剂和降低的AUC(图13和表2)。据推测这是由于未充分唾液酸化的分子通过去唾液酸糖蛋白受体更迅速地清除。不当唾液酸化的材料通过去唾液酸糖蛋白受体的清除能够导致游离血液结合素在清除游离血红素之前从循环中迅速清除。具有提高的唾液酸化的血液结合素分子可以更加缓慢的清除直至其与血红素结合。在与血红素结合后，与LRP受体的亲和性增加，导致血液结合素-血红素复合物从循环中除去。通过降低通过去唾液酸糖蛋白受体的清除率能够改善血液结合素的体内效能。
[0075] 表2
[0076] 重组的和来源于血浆的血液结合素在Sprague-Dawley大鼠中的药代动力学参数[0077] CHOS CHOK1克隆76A CHOK1克隆76B pdHX
AUCnorm(kg.h/L) 40 142 237 280
Cl(mL/h/kg) 25 5.7 4.2 3.4
Vss(mL/kg) 690 230 170 130
T1/2(h) 28 36 33 33
AUCnorm(kg.h/L) 40 142 237 280
Cl(mL/h/kg) 25 5.7 4.2 3.4
Vss(mL/kg) 690 230 170 130
T1/2(h) 28 36 33 33
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