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一种治疗心肌缺血再灌注损伤的多肽药物

阅读：341发布：2020-05-13

专利汇可以提供一种治疗心肌缺血再灌注损伤的多肽药物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种可用于治疗心肌缺血再灌注损伤的多肽药物，该多肽是p38α拮抗肽PT5的一种突变体。本发明的p38α拮抗肽PT5突变体PT5‑4可以抑制TAB1与p38α的相互作用，从而抑制由于TAB1与p38α相互作用导致的细胞凋亡，因此本发明的p38α拮抗肽PT5突变体可作为治疗心肌缺血再灌注损伤的候选药物，具有广泛的临床应用价值。，下面是一种治疗心肌缺血再灌注损伤的多肽药物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种p38α拮抗肽突变体，其特征在于，所述突变体命名为PT5-4，所述PT5-4的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述的突变体的DNA分子。
3.一种重组载体，其特征在于，所述载体包括权利要求2所述的DNA分子。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是病毒载体或非病毒载体。
5.包含权利要求3或4所述的重组载体的宿主细胞。
6.权利要求1所述的突变体、权利要求2所述的DNA分子、权利要求3或4所述的重组载体、或权利要求5所述的宿主细胞在制备抑制TAB1/p38α相互作用的药物中的应用。
7.权利要求1所述的突变体、权利要求2所述的DNA分子、权利要求3或4所述的重组载体、或权利要求5所述的宿主细胞在制备治疗TAB1/p38α相互作用导致的疾病的药物中的应用。
8.权利要求1所述的突变体、权利要求2所述的DNA分子、权利要求3或4所述的重组载体、或权利要求5所述的宿主细胞在制备治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1所述的突变体。

说明书全文

一种治疗心肌缺血再灌注损伤的多肽药物

技术领域

[0001] 本发明属于蛋白质工程领域，涉及一种治疗心肌缺血再灌注损伤的多肽药物，具体涉及p38α拮抗肽突变体PT5-4及其在制备治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。

背景技术

[0002] 缺血性心脏病是导致人类死亡的主要原因，在治疗上，早期成功恢复心肌再灌注是改善临床转归的最有效方法。但缺血心肌恢复血流的过程可造成损伤，这一现象称为心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury,MI/RI)。。I/R将会带来一些不良效应，例如氧化应激，细胞内钙超载等，这些不良反应会导致心肌细胞凋亡。细胞凋亡是缺血再灌注组织损伤功能丧失的重要原因，它是一个很复杂的过程，其详细的触发机制尚不完全明确。

[0003] 研究表明，在缺血再灌注过程中TAB1与p38α相互作用以及TAB1介导的p38α旁路活化在其中起关键作用。细胞内存在有许多能与TAB1和p38α发生相互作用的分子，我们希望获得能够特异性的阻断TAB1/p38α结合的能力，而不会对TAB1、p38α与其他蛋白质的相互作用产生影响的p38α拮抗肽。目前，能够有效降低心肌缺血再灌注损伤的干预策略和治疗药物还非常有限。因此本发明的进行可以为心肌缺血再灌注损伤的治疗提供一种具有临床应用价值的候选药物。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种p38α拮抗肽突变体PT5-4。经GST-pull实验和Kinase assay实验证明：PT5突变体PT5-4对于TAB1与p38α相互作用的抑制能力更强，但是同时PT5突变体PT5-4并不影响p38α经典活化途径中MKK6/p38α的相互作用。所述的“相互作用的抑制”包括结合抑制以及自身磷酸化的抑制。

[0005] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

[0006] 本发明提供了一种p38α拮抗肽突变体，所述突变体命名为PT5-4，所述PT5-4的氨基酸序列为以下组中的任意一个：

[0007] (1)如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；

[0008] (2)在SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸所得功能相同或相似的氨基酸序列。

[0009] 优选地，所述PT5-4的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

[0010] 通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

[0011] 本发明的p38α拮抗肽突变体PT5-4也包括对SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的多肽仍然能够保留p38α拮抗肽突变体PT5-4的生物学活性即可。在此类修饰中突变的氨基酸数目是3个或者更少。

[0012] 本发明还提供了一种编码上述突变体的DNA分子。

[0013] 本发明提供了一种重组载体，所述载体包括前面所述的DNA分子。

[0014] 所述重组载体可以是病毒载体或者非病毒载体。

[0015] 非病毒载体包括但不限于线性核酸、质粒、噬菌粒、粘粒(cosmid)、RNA载体。

[0016] 本发明的病毒载体包括但不限于腺病毒载体(adenoviral vectors)、腺相关病毒载体(adeno-associated viral vectors)、反转录病毒载体(retroviral vectors)、单纯疱疹病毒载体(herpes simplex virus-based vectors)、慢病毒载体(lentiviral vectors)。

[0017] 如本文中所使用，术语“载体”应理解为意指包含了能够并入到宿主细胞中并与宿主细胞基因组重组并整合到宿主细胞基因组中，或作为游离体自主复制的核苷酸序列的任何核酸。此类载体包括线性核酸、质粒、噬菌粒、粘粒(cosmid)、RNA载体、病毒载体等。

[0018] 在本发明中适用的载体包括但不限于：表达载体、克隆载体，例如适用于原核(如大肠杆菌等细菌)、低等真核细胞(如酵母)、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞中的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。在表达载体中，除了含有复制起点外，还可含有标记基因和其他翻译控制元件。

[0019] 本发明还提供了包含上述重组载体的宿主细胞。

[0020] 进一步，宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞：真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

[0021] 本发明还提供了前面所述的PT5-4突变体在制备抑制TAB1/p38α相互作用的药物中的应用。

[0022] 本发明还提供了编码PT5-4突变体的DNA分子在制备抑制TAB1/p38α相互作用的药物中的应用。

[0023] 本发明还提供了包含编码PT5-4突变体的DNA分子的重组载体在制备抑制TAB1/p38α相互作用的药物中的应用。

[0024] 本发明还提供了包含前面所述的重组载体的宿主细胞在制备抑制TAB1/p38α相互作用的药物中的应用。

[0025] 本发明还提供了前面所述的PT5-4突变体在制备治疗TAB1/p38α相互作用导致的疾病的药物中的应用。

[0026] 本发明还提供了编码PT5-4突变体的DNA分子在制备治疗TAB1/p38α相互作用导致的疾病的药物中的应用。

[0027] 本发明还提供了包含编码PT5-4突变体的DNA分子的重组载体在制备治疗TAB1/p38α相互作用导致的疾病的药物中的应用。

[0028] 本发明还提供了包含前面所述的重组载体的宿主细胞在制备治疗TAB1/p38α相互作用导致的疾病的药物中的应用。

[0029] 本发明还提供了前面所述的PT5-4突变体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。

[0030] 本发明还提供了编码PT5-4突变体的DNA分子在制备治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。

[0031] 本发明还提供了包含编码PT5-4突变体的DNA分子的重组载体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。

[0032] 本发明还提供了包含前面所述的重组载体的宿主细胞在制备治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。

[0033] 本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含前面所述的PT5-4突变体、编码PT5-4突变体的DNA分子、包含编码PT5-4突变体的DNA分子的重组载体、或包含前面所述的重组载体的宿主细胞。

[0034] 进一步，本发明的所述药物组合物还包含一种或多种对本领域技术人员而言为公知的其它药学上可接受的成分，该成分包括但不限于药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂、缓冲剂、pH调节剂、防腐剂、抗氧化剂、抑菌剂、稳定剂、悬浮剂、增溶剂、表面活性剂(例如润湿剂)、着色剂和致等渗(isotonicizing)溶质(即其使制剂与目标患者的血液或其它相关的体液等渗)。适当的载体、稀释剂、赋形剂等可以在标准药学书籍中找到。参见，例如药物添加剂手册(Handbookof Pharmaceutical Additives)，第二版(编者M.Ash和I.Ash)，2001(SynapseInformation Resources，Inc.，Endicott，New York，USA)；Remington′sPharmaceutical Science，第18版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，
1990；以及药物赋形剂手册(Handbook ofPharmaceutical Excipients)，第二版，1994。

[0035] 文中使用的术语“药学上可接受的”涉及化合物、成分、材料、组合物、剂型等，它们在医学判断的合理范围内，适于与上述患者(例如人类)的组织接触，并未带来过度的不希望的毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，并有合理的益处/风险比。每种载体、稀释剂、赋形剂等还必须就与组合物的其它成分可配伍的意义而言是“可接受的”。

[0036] 本发明的药物组合物可以通过常规途径给药，包括但不局限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。

[0037] 根据药物组合物的施用形式，可将药物组合物制备成相应的各种剂型，所述剂型包括但不限于药物组合物被制备为胃肠外、经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

[0038] 供治疗的受试者为经历心肌缺血再灌注损伤的患者，受试者包括但不限于哺乳动物。就治疗目的而言，“哺乳动物”指归类为哺乳动物的任何动物，包括人，家养和农用动物，以及动物园动物(zoo animal)、运动动物(sports animal)和宠物，如狗、马、猫、母牛等。优选地，所述哺乳动物是人。

[0039] 应了解，用于任何特定受试者的治疗剂量水平和剂量频率可以变化，并且将取决于多种因素，包括所用药物组合物的活性；该药物组合物的代谢稳定性和作用时间长度；受试者的物种、年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用的模式和时间；排泄速率和清除率；药物组合；及特定病状的严重程度。

[0040] 本发明的药物组合物可以单独使用，或与可用于治疗心肌缺血再灌注损伤的其它适合的治疗剂组合使用。或者与其他治疗心肌缺血损伤手术方法一起使用。

[0041] 本文所用的“进行治疗”或“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：

[0042] (i)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；

[0043] (ii)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者

[0044] (iii)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。

[0045] 文中在治疗病症中所用的术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。

[0046] 本发明所述的“TAB1/p38α相互作用”表示TAB1与p38α相结合和/或TAB1介导p38α的自身磷酸化。

[0047] 本发明所述的“TAB1/p38α相互作用导致的疾病”表示该疾病的发生与TAB1/p38α相互作用相关，TAB1/p38相互作用是疾病发生的一个因素或者全部因素。

[0048] TAB1/p38α相互作用导致的疾病包括但不限于心肌缺血再灌注损伤。

[0049] 本发明的优点和有益效果：

[0050] 本发明首次发现了p38α拮抗肽突变体PT5-4，其序列如SEQ ID NO.6所示，与PT5相比，该突变体对于TAB1/p38α的结合抑制能力更强，且对TAB1介导的p38α自身磷酸化抑制能力更强。附图说明

[0051] 图1显示pGEX-KG-TAB1和pET-32a-p38α质粒双酶切鉴定图；

[0052] 图2显示GST-TAB1融合蛋白考马斯亮蓝染色图；

[0053] 图3显示His-p38α融合蛋白考马斯亮蓝染色图；

[0054] 图4显示利用GST-pull down和免疫印迹研究PT5突变体对TAB1/p38α结合的影响；

[0055] 图5显示图4所示的免疫印迹实验结果的半定量分析图；

[0056] 图6显示利用GST-pull down和免疫印迹研究PT5突变体对MKK6/p38α结合的影响；

[0057] 图7显示图6所示的免疫印迹实验结果的半定量分析图；

[0058] 图8显示利用体外激酶活性分析和免疫印迹研究TAB1蛋白对p38α磷酸化的影响；

[0059] 图9显示利用体外激酶活性分析和免疫印迹研究PT5突变体对TAB1介导的p38α自我磷酸化的影响；

[0060] 图10显示图9所示的免疫印迹实验结果的半定量分析图；

[0061] 图11显示体外激酶活性分析和免疫印迹研究PT5突变体对MKK6介导的p38α磷酸化的影响；

[0062] 图12显示图11所示的免疫印迹实验结果的半定量分析图。

具体实施方式

[0063] 以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。

[0064] 实施例1 pGEX-KG-TAB1和pET-32a-p38α原核表达载体的构建

[0065] 1、方法

[0066] 1.1 CaCl2法制备菌株JM109感受态

[0067] (1)将菌株JM109(军事医学科学院基础研究所分子免疫室保存)涂布在无抗LB平板上，37℃培养过夜，以活化菌株；

[0068] (2)从LB平板上挑取单菌落接种于5ml LB培养基中，37℃培养过夜，按1：100～1：50的比例接种于100ml无抗LB培养液中，37℃振荡2～3h至OD600nm≈0.5；

[0069] (3)将培养液转入离心管中，冰上放置10min，离心10min以收集菌液；

[0070] (4)弃上清，用高压预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮菌株，冰上放置15～30min后，4℃，4000rpm离心10min；

[0071] (5)弃上清，加入4ml预冷的含15％甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮菌株，冰上放置5min后，100μl/管分装，-70℃可保存半年。

[0072] 1.2 引物的设计合成

[0073] pET-32a载体带有6×His标签和硫氧环蛋白的编码序列，pGEX-KG载体5’端带有编码GST蛋白的序列，便于用于蛋白的纯化和检测。根据美国国家生物技术信息(National Center of Biotechnology Information，NCBI)网站基因文库中TAB1和p38α的序列，自行设计带有酶切位点的5’端和3’端的寡核苷酸引物，以扩增DNA片段。TAB1上游引物序列如SEQ ID NO.9所示,TAB1下游引物序列如SEQ ID NO.10所示，p38α上游引物序列如SEQ ID NO.11所示，p38α下游引物序列如SEQ ID NO.12所示，引物设计信息见表1。

[0074] 表1引物设计

[0075]引物名称序列(5’-3’) 酶切位点
TAB1上游引物 CCTCTAGACATGGCGGCGCAGAGGAGGAGC Xba I
TAB1下游引物 CCCAAGCTTTCACTACGGTGCTGTCACCACGCTCTG Hind III
p38α上游引物 CCGGATCCATGTCGCAGGAGAGGCCCACG BamH I
p38α下游引物 CCCAAGCTTTCATCAGGACTCCATTTCTTCTTGGTC Hind III

[0076] 1.3 pGEX-KG-TAB1和pET-32a-p38α重组质粒的构建

[0077] (1)TAB1和p38αDNA片段的扩增

[0078] 以pCDNA3.1(+)-XPRESS-TAB1和pCDNA3.1(+)-FLAG-p38α质粒为模版进行PCR(质粒来源参考博士毕业论文《接头蛋白TAB1和GNB2L1调节p38α的结构基础》作者：王庆阳第36-38页)。

[0079] PCR反应体系(总体积为30μl)：模版1μl；2×Taq MasterMix酶15μl；5’端引物(10μM)1μl；3’端引物(10μM)1μl；DMSO 0.5μl；去离子水11.5μl。

[0080] PCR反应条件：①95℃预变性5min；②94℃变性30s；③58℃退火45s；④72℃延伸1.5min；⑤到②循环25次；⑥72℃5min。

[0081] (2)琼脂糖凝胶电泳的分离与回收

[0082] 配制1.2％的琼脂糖凝胶，将全部PCR产物和DL2000marker加入孔道中，200mA恒流分离目的条带，当Taq酶中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段的距离时，在紫外灯(波长310nm)下观察，并切下目的条带，按琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自TIANGEN公司)说明书操作步骤回收目的DNA片段。

[0083] (3)将PCR扩增的目的片段和载体分别进行双酶切

[0084] 酶切体系为：

[0085] 胶回收片段(总体积为20μl)：10×Cutsmart Buffer 2μl；BamHⅠ/XbaⅠ1μl；HindⅢ1μl；胶回收片段16μl；100×BSA 0.2μl；

[0086] 载体(总体积为20μl)：10×Cutsmart Buffer 2μl、BamHⅠ/XbaⅠ1μl；HindⅢ1μl；载体2μl；100×BSA 0.2μl；去离子水14μl。

[0087] 37℃水浴过夜。

[0088] (4)回收有粘性末端的目的片段和载体片段

[0089] 加入4μl 6×Loading Buffer(购自TIANGEN公司)，琼脂糖凝胶电泳获得目的基因片段。方法同前所述。

[0090] (5)TAB1/p38α目的片段与pGEX-KG/pET-32a载体片段连接

[0091] 反应体系(总体积15μl)：目的片段11.5μl；载体1.5μl；T4连接酶缓冲液1.5μl；T4连接酶1μl；

[0092] 16℃反应2h。

[0093] (6)转化

[0094] 1)LB固体培养皿(含氨苄)放37℃孵箱中预热；

[0095] 2)从-70℃冰箱中取出4管JM109感受态菌株，迅速插入冰中；

[0096] 3)吸取10μl连接体系加入100μl感受态中，轻轻吹打混匀；

[0097] 4)冰上放置30min，同时调水浴锅至42℃；

[0098] 5)42℃水浴锅中热休克90s，然后立即置冰上冷却2min；

[0099] 6)每管中加入500μl无抗的LB液体培养基，37℃摇床上震荡45min，转速150rpm；

[0100] 7)6000rpm离心1min，弃部分上清，剩余约100μl LB，重悬细菌，混匀后均匀涂布在含氨苄的LB固体培养基上。待液体被吸收后，将平皿倒置放入37℃孵箱中过夜培养；

[0101] (7)菌落PCR鉴定

[0102] 挑取单克隆菌落，至5ml含氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃过夜培养。过夜培养的菌液取出50μl，离心后去上清，生理盐水100μl重悬，沸水煮10min，离心后取2μl作为模板进行PCR，进行PCR鉴定，PCR条件和步骤同前所述。

[0103] 反应体系为：

[0104] 菌液上清2μl；2×Taq MasterMix酶10μl；5’端引物(10μM)1μl；3’端引物(10μM)1μl；DMSO 0.5μl；去离子水5.5μl。

[0105] (8)选取3个阳性克隆送公司测序。

[0106] 挑取阳性克隆送北京天一辉远公司测序。

[0107] 1.4 重组pGEX-KG-TAB1和pET-32a-p38α质粒的扩增

[0108] 对测序正确的质粒按无内毒素质粒中提试剂盒说明书(购自康为世纪公司)的步骤中提质粒，用于下一步的实验。

[0109] 2、结果

[0110] 2.1 双酶切鉴定

[0111] pGEX-KG-TAB1和pET-32a-p38α质粒分别用XbaⅠ/HindⅢ和BamH/HindⅢ进行双酶切，pGEX-KG空载体为5.0Kbp，TAB1为1514bp；pET-32a空载体为5.9Kbp，p38α为1197bp。从图1可以看出，酶切后条带大小与目的片段大小相符，结果说明目的片段TAB1和p38α成功插入载体中。

[0112] 2.2 序列比对结果

[0113] pGEX-KG-TAB1和pET-32a-p38α重组质粒送北京天一辉远公司测序，测序结果与TAB1和p38α序列进行比对，均为100％匹配，测序结果证明两个质粒构建成功。

[0114] 实施例2 融合蛋白的纯化

[0115] 1、常用试剂的配制

[0116] 1)NETN Lysis Buffer：2mM PMSF，5mM Benzamidine，1mM DTT，1mM Aprotinin，1mM Leupeptine，去离子水定容。

[0117] 2)NETN Buffer：20mM Tris-HCl(pH8.0)，100mM NaCl，1mM EDTA，0.5％NP-40，临用前加入1％PMSF，去离子水定容。

[0118] 3)纯化蛋白洗脱缓冲液(GST Elution Buffer)：50mM Tris-HCl(pH8.0)，20mM Glutathione，去离子水定容。

[0119] 4)Tris-甘氨酸电泳缓冲液：25mmol/L Tris碱，250mmol/L甘氨酸(电泳级)，0.1％SDS，可配成5×贮存液备用。

[0120] 5)考马斯亮蓝染液(1L)：考马斯亮蓝R2502.0g，考马斯亮蓝G2500.5g，甲醇50ml，乙醇425ml，冰醋酸100ml，双蒸水定容至1L。

[0121] 6)考染脱色液(1L)：冰醋酸100ml，乙醇200ml，双蒸水700ml。

[0122] 其他常用试剂的配制同前所述。

[0123] 2、GST融合蛋白纯化方法

[0124] 2.1 收集菌液并裂解菌体

[0125] (1)将第一部分构建成功的pGEX-KG-TAB1重组载体转化至感受态Rosetta中；

[0126] (2)挑取单克隆菌落转移至5ml氨苄抗性的LB培养基中，37℃过夜震荡；

[0127] (3)将菌液转移至200ml氨苄抗性的LB培养液中；

[0128] (4)摇菌至OD600nm≈0.4，加入IPTG(终浓度0.2mM)16℃诱导过夜；

[0129] (5)5000rpm离心10min收集菌液，用10ml NETN Lysis Buffer重悬，加入1ml混有溶菌酶的NETN Buffer，置冰上30～60min；

[0130] (6)冰上超声破碎菌体。

[0131] 2.2 GSH beads结合

[0132] (1)将混有菌体的裂解液转移到离心管中，4℃1000rpm离心1h，期间，将GSH beads(购自sigma)用PBS溶液置冰上溶胀30min，然后加1ml NETN Buffer，6000rpm离心30s以清洗beads，重复2次；

[0133] (2)裂解的上清转移至另一个离心管，加入500μl GSH-beads，4℃摇晃令其吸附蛋白1h。2500rpm，离心30s后弃上清；

[0134] (3)用20ml冰冷的NETN Buffer(加1％的PMSF)洗beads 3次，3200rpm离心1min弃上清(最后一次尽量去除所有上清)；

[0135] 2.3 洗脱

[0136] 加入500ul新鲜配制的GST Elution Buffer，4℃轻摇20min后2500rpm离心30s，收集上清，重复1次。

[0137] 2.4 浓缩

[0138] 将上清加入超滤管，用无菌PBS置换溶剂。用Loading tip枪尖分装到高压过的EP管中，20μl/管，-80℃保存。

[0139] 2.5 检测蛋白纯度

[0140] (1)将纯化的融合蛋白分别以不同的上样量进行SDS-PAGE；

[0141] (2)用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色以检测蛋白纯度。

[0142] 3、His融合蛋白纯化方法

[0143] 3.1 收集菌液并裂解菌体方法同前。

[0144] 收集细菌后，与前面的区别为用10ml PBS结合缓冲液(20mM的磷酸盐缓冲液，含500mM NaCl)重悬细菌。

[0145] 3.2 固定Ni2+离子亲和色谱法

[0146] (1)结合菌体裂解后10000rpm离心30min，取上清过镍柱，检测A280，直至A280值小于0.01

[0147] (2)洗脱用10mM的洗脱缓冲液(结合缓冲液加10mM咪唑)洗柱子，流速为1-2ml/min，1ml/管收集洗脱液，监测A280；为了得到更好的His融合蛋白，分别用50mM，100mM，150mM不同浓度咪唑的洗脱缓冲液分阶段洗柱子，监测A280；

[0148] (3)超滤合并洗脱液，4℃，6000rpm离心，超滤浓缩；测蛋白浓度并进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色确定条带。

[0149] 4、结果

[0150] TAB1蛋白分子量为56KDa，GST标签分子量为26KDa，故GST融合蛋白的分子量应为82KDa。由图2可知，蛋白条带大致正确，表明GST融合蛋白纯化分离成功，用于下一部分的实验。

[0151] p38α分子量大小为38KDa，His标签分子量为28KDa，故His融合蛋白的分子量应为66KDa。由图3可知，蛋白条带大致正确，表明His融合蛋白纯化分离成功，用于下一部分的实验。

[0152] 实施例3 p38α拮抗肽突变体对TAB1/p38α相互结合的阻断作用

[0153] 1、p38α拮抗肽突变体

[0154] PT1、PT5、PT5-1、PT5-4、PT5-3、PT5-4、PT5-5、PT5-6由Chinese Peptide Company合成，肽的纯度均为95％以上。其中PT1是无功能的对照肽，实验中作为阴性对照；PT5是先前工作获得的p38α拮抗肽，在实验中作为阳性对照。PT5-1～PT5-6为设计的PT5的突变体。所有的肽均使用无菌注射用水按1mg/ml溶解，50μl/管分装保存于-20℃，避免反复冻融。

[0155] PT5-1突变体为Gln3-Ala3,PT5-2突变体为Ser6Asn7-Ala6Ala7,PT5-3突变体为Val5Asn7-Ala5Ala7,PT5-4突变体为Lys9Ser10-Ala9Ala10,PT5-5突变体为Thr11Asp12-Ala11Ala12,PT5-6突变体为Glu13Gln14-Ala13Ala14，氨基酸序列如下：

[0156] PT1：Ser-Ser-Ala-Gln-Ser-Thr-Ser-Arg-Ser-Ser-Val-Thr-Tyr-Ser-Ser(SEQ ID NO.1)；

[0157] PT5：Gln-Gly-Gln-Val-Val-Ser-Asn-Gly-Lys-Ser-Thr-Asp-Glu-Gln-Ser(SEQ ID NO.2)；

[0158] PT5突变体:

[0159] PT5-1：Gln-Gly-Ala-Val-Val-Ser-Asn-Gly-Lys-Ser-Thr-Asp-Glu-Gln-Ser(SEQ ID NO.3)；

[0160] PT5-2：Gln-Gly-Gln-Val-Val-Ala-Ala-Gly-Lys-Ser-Thr-Asp-Glu-Gln-Ser(SEQ ID NO.4)；

[0161] PT5-3：Gln-Gly-Gln-Val-Ala-Ser-Ala-Gly-Lys-Ser-Thr-Asp-Glu-Gln-Ser(SEQ ID NO.5)；

[0162] PT5-4：Gln-Gly-Gln-Val-Val-Ser-Asn-Gly-Ala-Ala-Thr-Asp-Glu-Gln-Ser(SEQ ID NO.6)；

[0163] PT5-5：Gln-Gly-Gln-Val-Val-Ser-Asn-Gly-Lys-Ser-Ala-Ala-Glu-Gln-Ser(SEQ ID NO.7)；

[0164] PT5-6：Gln-Gly-Gln-Val-Val-Ser-Asn-Gly-Lys-Ser-Thr-Asp-Ala-Ala-Ser(SEQ ID NO.8)。

[0165] 注：标有下划线部位为突变位点。

[0166] 2、方法

[0167] 2.1 GST-pull down

[0168] (1)向NETN buffer中加入抑制因子，PMSF 1mM，Aprotinin 10μg/ml，DTT1mM，Na3VO41mM(抑制因子均购自Sigma公司)；

[0169] (2)His-p38α和GST-TAB1溶于含抑制因子的NETN buffer中；

[0170] (3)加入p38α拮抗肽使之终浓度为50μM，4℃混旋2h；

[0171] (4)加入GSH Sarpharose beads，4℃继续混旋1h；

[0172] (5)用含PMSF 1mM的NETN buffer洗beads 3次，每次NETN buffer 1ml，4℃混旋3min；

[0173] (6)最后一次洗完后吸净液体，向珠子中加入2×蛋白上样缓冲液(loadingbuffer)，沸水中煮10min后上样。

[0174] 2.2 免疫印迹方法

[0175] (1)常规SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；

[0176] (2)将胶中的蛋白转印到PVDF膜上，条件为60V，3h；；

[0177] (3)抗体杂交：

[0178] 1)将滤膜转移至封闭液中，室温孵育1h；

[0179] 2)加抗体(一抗)：将一抗用5％的BSA 1:1000稀释后浸润滤膜，封接于塑料膜内，放在缓动的平台上，室温孵育2h或4℃过夜；

[0180] 3)加HRP标记抗体(二抗)：将滤膜用TBST洗3次，每次10min。用封闭液按1：2000稀释二抗，浸润滤膜，放在缓动的转台上，室温孵育1h；

[0181] 4)将膜放入TBST溶液中洗涤三遍，每次在摇床上摇动10min。

[0182] (4)ECL显色。

[0183] 3、结果

[0184] 3.1 GST-pull down分析p38α拮抗肽突变体对TAB1/p38α相互结合的阻断作用[0185] GST-pull down分析人工化学合成的p38α拮抗肽突变体对TAB1/p38α相互结合的阻断作用，其中PT1作为无功能的对照肽。以对照肽PT1为阴性对照，以p38α拮抗肽PT5为阳性对照，根据不同的p38α拮抗肽突变体(PT5-1至PT5-6)对TAB1和p38α结合能力影响的强弱来确定拮抗肽中的关键氨基酸。

[0186] 与之前课题研究的结果相同，抑制肽PT5可以在50μM的剂量下对TAB1/p38α相互作用有明显的抑制作用。在相同的条件下，合成的拮抗肽突变体PT5-2和PT5-4对TAB1/p38α相互结合的阻断作用有放大作用，PT5-1，PT5-3，PT5-6的阻断效果跟PT5差别不大，而PT5-5氨基酸突变后反而失去对TAB1/p38α相互结合的阻断作用(图4)，PT5-5突变体为将第11、12位的苏氨酸和天冬氨酸用两个丙氨酸来替换，替换后丧失对TAB1/p38α相互结合的阻断作用，说明11、12位的苏氨酸和天冬氨酸对TAB1/p38α相互结合有重要作用，提示11、12位的苏氨酸和天冬氨酸可能为关键氨基酸。

[0187] 进行三次平行实验，对三次实验结果进行灰度扫描，His-p38α的灰度值与GST-TAB1的灰度值的比值进行半定量比较，更加直观的反应了不同PT5突变体突变之后对TAB1/p38α相互结合抑制作用的强弱(图5)，其中“**”表示与对照肽PT1相比P<0.01，“*”表示与PT5相比P<0.05。

[0188] 3.2 GST-pull down分析p38α拮抗肽突变体对MKK6/p38α相互结合的阻断[0189] 为了分析PT5突变体是否选择性的抑制TAB1/p38α相互结合而不会阻断经典活化途径，选择p38α上游激酶MKK6进行GST-pull down和免疫印迹分析。纯化的GST-MKK6和His-p38α混合后与不同的PT5突变体混合，观察PT5突变体对两者结合的影响。实验结果表明，PT5突变体不会影响经典途径中MKK6/p38α相互结合(图6)，提示PT5突变体的作用具有靶向TAB1/p38α的特异性。

[0190] 进行三次平行实验，对三次实验结果进行灰度扫描，His-p38α的灰度值与GST-MKK6的灰度值的比值进行半定量比较，更加直观的反应了PT5突变体突变之后对MKK6/p38α相互结合抑制作用的强弱(图7)。

[0191] 实施例4 p38α拮抗肽突变体对TAB1介导的p38α自我磷酸化的影响

[0192] 1、常用试剂的配制

[0193] 6×激酶缓冲液：1mol/Lβ-glycerolphosphate 120μl，1mol/L MgCl2120μl，1mol/L HEPES 120μl，1mol/L DTT 10μl，1mol/L PNPP 120μl，100mM Na3VO42μl，去离子水508μl，4℃存放，半年内使用。

[0194] 2、激酶活性分析方法

[0195] (1)每份样品按以下配方配制：1×激酶缓冲液50μl，1mmol/l ATP 1～2μl，底物蛋白2μg，体外纯化的激酶2μg，PT5及PT5突变体使终浓度为50μM；

[0196] (2)将激酶反应混合液加入上述步骤的微量离心管中，30℃水浴中孵育1h，每5min轻弹混匀一次；

[0197] (3)每个样品加入上样缓冲液，沸水浴10min；

[0198] (4)进行常规SDS-PAGE和免疫印迹。

[0199] 3、结果

[0200] 3.1 体外激酶活性分析体系的验证与建立

[0201] 为了验证拮抗肽PT5及突变体是否通过阻断TAB1/p38α结合影响了p38α的自我磷酸化，首先要建立有效并且完善的体外激酶活性分析体系。该体系中，非放射性ATP提供底物磷酸化所需的磷酸基团，His-p38α为底物，GST-TAB1具有激酶的作用，如果该体系是完善的，那么His-p38α会在GST-TAB1作用下发生自我磷酸化，非放射性ATP上的磷酸基团转移到p38α第180位苏氨酸和第182位的酪氨酸，使p38α发生双位点的磷酸化。

[0202] 实验结果显示，在底物His-p38α都存在的条件下，没有加入磷酸基的供体非放射性ATP的情况下，His-p38α不能被磷酸化；加入GST标签蛋白而没有加GST-TAB1，His-p38α仅有少量非特异的磷酸化；分别加入1μg、2μg、4μg的GST-TAB1，His-p38α可被磷酸化并且磷酸化水平差别不大。以上结果综合表明，该条件下建立的体外激酶活性分析体系完善可行，该体系1μl GST-TAB1蛋白即可介导His-p38α磷酸化，该体系所建立的实验条件可用于下一步验证拮抗肽PT5及突变体对TAB1介导的p38α磷酸化的影响(图8)。

[0203] 3.2 p38α拮抗肽及突变体对TAB1介导的p38α自我磷酸化的影响

[0204] 通过探索建立了有效完善的体外激酶活性分析体系，在相同的条件下，分别加入对照肽PT1，效应拮抗肽PT5及PT5的六个突变体(PT5-1至PT5-6)。实验结果如图9所示，PT5能够阻断TAB1介导的p38α自我磷酸化，PT5-2和PT5-4发生突变后能够增强对TAB1介导的p38α自我磷酸化的阻断能力，突变体PT5-1、PT5-3和PT5-6氨基酸位点替换后，阻断TAB1介导的p38α自我磷酸化的能力与野生型PT5差别不大，突变体PT5-5则在突变后失去影响p38α自我磷酸化的作用。

[0205] 同样进行三次平行实验，对三次实验结果进行灰度扫描，磷酸化His-p38α的灰度值与His-p38α的灰度值的比值进行半定量比较，更加直观的反应了不同PT5突变体突变之后对TAB1介导的p38α自我磷酸化的抑制作用的强弱(图10),其中“**”表示与对照肽PT1相比P<0.01，“*”表示与PT5相比P<0.05。

[0206] 3.3 p38α拮抗肽及突变体对MKK6介导的p38α磷酸化的影响

[0207] MKK6/p38α的相互作用能够通过经典的MAPKs超家族成员活化方式导致p38α第180位的苏氨酸和第182位的酪氨酸发生双位点磷酸化。如果设计合成的拮抗肽及其突变体不能够阻断MKK6与p38α之间的相互作用，那么可以推测出拮抗肽及其突变体不会影响MKK6介导的p38α级联磷酸化。体外激酶活性分析实验表明，PT5及PT5的各突变体对p38α的经典活化途径没有影响，p38α的磷酸化水平没有区别(图11)。

[0208] 进行三次平行实验，对三次实验结果进行灰度扫描，His-p38α的灰度值与GST-TAB1的灰度值的比值进行半定量比较，更加直观的反应了PT5突变体突变之后对MKK6介导的p38α级联磷酸化抑制作用的强弱(图12)。

[0209] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

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