本发明涉及新的抗癌化合物，尤其是涉及用于核素活化治疗，例如 中子俘获治疗的新化合物。

在核素活化治疗中，核素被活化并经历核裂变，导致能够破坏活细 胞的高度电离辐射的发射。当使用中子活化核素时，该方法称作中子俘 获治疗。1936年美国科学家Locker首次描述了治疗癌症的中子俘获治 疗(NCT)的原理。实质上，当非电离的慢中子照射NCT元素(例如稳 定核素硼-10)时产生裂变反应，导致7至9μm范围的高度电离辐射的 发射。1951年，治疗了第一例患者并且从那以后在临床上成功证明了该 原理，尽管迄今难以找到有效的NCT药物。

硼中子俘获治疗是需要中子和药物的空间和时间重叠的双峰 (bimodal)治疗。为达到生物效应，需要慢中子和携带硼的试剂之间 的相互作用。10B和中子的BNCT反应可以用下列反应式总结：

10B+1nth→7Li+α粒子(4He)+2.4MeV

2.4MeV能量被Li+和He2+离子吸收作为动能。这两个颗粒具有足 够的能量以产生最大范围为9μm的强离子化轨道。由此损害被限制在 肿瘤细胞的直径，即10μm内。因此，仅含有10B的细胞被破坏，而不 含有10B的(健康)细胞保留完整。10B核素稳定并且无放射性，其原子核 对慢中子具有很大的中子吸收横截面，即比氢大2700倍。这转化为超 过构成生命组织的元素，例如氢、氧和碳的能力几千倍的吸收中子的能 力。

BNCT可用于治疗正常用放射疗法治疗的癌症，例如淋巴瘤和皮肤 癌，以及脑部、胸部、肺、头部和颈部、骨、前列腺、胰腺和子宫颈癌 症。此外，当计划手术切除肿瘤时，BNCT也可以用于帮助降低肿瘤的 大小和减少相关的正常组织损失。

BNCT已经由选择性″原位″放射疗法的潜在益处所驱动，作为常规 X射线放射疗法的潜在替代方法。全世界已经有超过500名患者接受了 脑部和皮肤肿瘤的实验性BNCT治疗。主要地，两个实验性化合物4- 二羟基硼基苯丙氨酸(BPA)和巯基十一氢十二硼烷钠(BSH)已经用于 临床试验。

在常规放射疗法中，生物效应传遍整个照射面积，而用BNCT，它 特异性针对含有携带10B分子的那些细胞。放射疗法需要相对高的辐射 剂量以产生达到生物效应的破坏性电离经迹。这是治疗有效性中的一个 限制因素。放射疗法受到包括电子(β-粒子)或光子(X射线和γ射线)的低 LET(线性能量传递)辐射束的固有性质的限制。用BNCT产生短程高能 量α和7Li粒子。这些粒子是强电离化并显示出更大更有效的破坏性倾 向的高LET粒子。因此，产生等效放射疗法生物效应所需的BNCT剂 量比相对的放射疗法剂量小很多。

因此，与放射疗法相反，BNCT通过药物的特异性而提供了靶组织 选择性。仅在局部有10B的地方，即肿瘤组织内产生致命辐射。治疗过 程可以在2-4天内完成。慢中子是非电离的。BNCT也能够破坏正常不 能清楚区分的扩散肿瘤。

BNCT不依赖于肿瘤中的含氧量，因为很多含氧量低，并且在癌症 治疗受到解剖学上损害的地方也可以使用。可以在4-8cm和以上的深 度治疗深层肿瘤。

患者需要的BNCT次数比常规放射疗法要少，因为它可以在2-4天 时间给予数次，而相反，常规放射疗法在六周时间需要给予30次。

在这种二元系统中，每个成分可以独立于另一个进行操作。给予10B试剂和中子辐射之间的间隔可以调节至最佳时间以提供正常组织和肿 瘤组织之间最高的差异10B浓度。类似地，可以校准中子束使得照射领 域限于肿瘤部位，并且具有一些残留10B浓度的正常组织可以被排除在 治疗体积之外。

然而，为了获得作为″原位″细胞放射疗法的NCT的潜在益处，有 许多先决条件。中子必须在如此能量范围内，其中仅NCT核素，例如 10B原子能够经历裂变反应。NCT试剂也必须选择性地聚集于靶组织。 例如，普遍认为15-35μg/g肿瘤组织(折合109硼原子)是使用来自每秒每 平方厘米能流109个中子的核反应堆的中子束的有效BNCT必需的10B量。

然而，需要给予高浓度含硼药物以达到每个肿瘤细胞109个硼原子。 为了说明这点，表1总结了已经成为很多临床前和临床研究主题的三个 BNCT化合物。BPA和BSH处于临床使用中，第三个是临床前开发中 的实验化合物。

表1 化合物 肿瘤绝对 浓度(μg/g)  肿瘤∶血液  的比率  肿瘤∶CNS  的比率  剂量 BPA(处于临床试验) 16.5  2.2∶1.0  1.7∶1.0  900-1200mg/kg  (30mg/ml) BSH(处于临床试验) 6.9  0.7∶1.0  3.0∶1.0  - CuTCPH(临床前开发) 114.0  570∶1.0  57∶1.0  200mg/kg(6mg/ml)

然而，上述化合物需要以极高浓度给予，例如，BPA的30mg/ml 静脉内溶液，要达到每公斤1200mg。这是生病患者的主要忧虑和缺点， 因为需要在几小时内给予几升药物以达到贫乏肿瘤与血液的差异3∶1。 结果病人招致心血管休克。为了达到肿瘤与血液的这个差异，1、2、4、 6和8小时的灌输方案是必需的。BPA和BSH对肿瘤也没有选择性。 CuTCHP具有较高的肿瘤与血液的比率，但是需要给予200mg/kg的剂 量，同样该剂量极高而且100-1000ml液体中需要大约15g化合物。无 疑需要克服这些缺点的新化合物。然而，在研究与开发努力50年之后， 仅仅两个次优选的化合物(BPA和BSH)进入了临床试验。

因此，本发明提供了具有通式P-(L-NAT)n的偶联物，其中

P代表具有5-6,000kDa分子量的N-羟丙基甲基丙烯酰胺-甲基丙烯 酸酯共聚物；

NAT代表核素活化治疗剂；

L代表能够将该聚合物与中子俘获治疗剂连接起来的接头部分；和

n代表1-1,000的整数。

因此，本发明提供了与以前可利用的化合物相比肿瘤寻靶改善的偶 联物。

本发明也提供了含有如上定义的偶联物的药物组合物。

本发明进一步提供了如上定义的偶联物制备治疗癌症的药物的用 途，以及如上定义的偶联物治疗癌症的用途。优选地，本发明涉及实体 瘤，例如脑部、胸部、头部和颈部、前列腺、肺、骨、胰腺和肝脏、和 结肠癌的治疗。此外，本发明提供了治疗癌症的方法，包括给患者施用 如上定义的偶联物，随后在肿瘤部位活化该NAT试剂。

本发明的化合物是溶于适于肠胃外给药的水性介质的大分子。聚合 物-NAT偶联物具有与200-500Da的常规药物相比超过5kDa的分子量。 这些化合物自己单独不具有任何抗肿瘤活性，但是在活化源，如中子存 在下，发生NAT反应，产生毒性的高LET粒子(α粒子和锂离子)。

聚合物-NAT偶联物含有三个组分，即聚合物、NAT试剂和接头。

该聚合物是生物相容性的(如非免疫原性和非血栓形成性，即不干 扰血小板和凝血因子)，典型地是水溶性天然或合成聚合物。该偶联物 具有大于0.1mg/ml，更优选1-100mg/ml，最优选10-50mg/ml的水溶性。 该聚合物是制药学上惰性的。

要求该聚合物具有0.1至24小时，优选0.2至12小时，特别优选 1-6小时的血液-血浆半衰期。需要该分子具有足够半衰期以通过胞饮作 用进入细胞。胞饮作用是一个慢过程，由此细胞外液(含有药物分子)被 摄入细胞质。

该分子的分子量和形状(如线性或球形)将决定肾滤过率。该聚合物 的分子量是5-6,000kDa，优选5-100，更优选10-70，更优选15-45，最 优选20-40kDa。

该聚合物是水溶性的，优选具有大于0.1mg/ml，更优选大于 50mg/ml，最优选大于100mg/ml的水溶性。这些溶解度是必需的，这 样当偶联了NAT活化剂(正常具有很差水溶性的那些)时，对该化合物溶 解度的总体影响通常可以忽略。水溶性也使得需要给予患者的药物溶液 体积显著减少。它也取消了药物配制中潜在毒性助溶剂的需要。

然而，水溶性低的聚合物(溶解度低于0.1mg/ml)也有用，但是需要 使用药物赋形剂，例如油类、表面活性剂和/或乳化剂，以产生足够浓 度的液体可注射系统。

为了提高聚合物的稳定性和增加半衰期，可以引入未遭受酶催降解 的氨基酸或人工糖来修饰该聚合物。

该共聚物中两个单体的量可以变化。羟丙基甲基丙烯酰胺与甲基丙 烯酸酯的比率优选从100∶1至1∶1，最优选20∶1至1∶1。

NAT活性核素应该能够经历核裂变以产生具有破坏肿瘤细胞的足 够能量，但是细胞损坏限制在肿瘤细胞直径(即10μm)内的颗粒。这 种核素是本领域已知的，实例是6Li、10B、22Na、58Co、113Cd、126I、 135Xe、148mPm、149Sm、151Eu、155Gd、157Gd、164Dy、184Os、199Hg、 230Pa、235U和241Pu。更优选该核素是6Li、10B、22Na、58Co、113Cd、 126I、135Xe、148mPm、149Sm、151Eu、155Gd、157Gd、164Dy或184Os。 典型地，特别的元素用NAT活性核素加富。NAT活性核素通过携带 NAT活性核素的化合物与聚合物连接。这些化合物是本领域已知的并 示例如下：

硼化氨基酸和肽，如二羟硼基苯丙氨酸(BPA)，见Soloway Chem. Rev.(1998)Vol 98，No.4，1531-1534页和Snyder，HR等人，J.Am. Chem.Soc.(1958)80，835；

修饰的碳硼烷笼，例如[B10H10]2-(十氢十硼烷根)和[B12H12]2-(十二氢 十二硼烷根)，如C2B12H12，见Hawthorn，M F等人，J.Am.Chem.Soc. (1959)81，5519和Grimes，R.N.″Carboranes″，Academic Press NY (1970)；

巯基硼烷根，如巯基十一氢十二硼烷根(B12H11SH2-)(BSH)，二钠盐 的结构显示如下，它也可以是二聚体(BSSB)形式，见Soloway，A.H.等 人J.Med.Chem.(1967)10，714；

卟啉和酞菁，如BOPP和LTCP(NiTCP、CuTCP、NiTCPH和 CuTCPH)，其中卟啉携带四个碳硼烷笼，见Ozawa，T.Pro.Am.Ass. for Cancer March 1998，39，p586和Miura，M.，Radiation Research (2001)155，603-610(见下面的结构)；

含硼核酸前体，如硼化和含碳硼烷的嘧啶和嘌呤，如5-(二羟基硼 基)尿嘧啶、5-碳硼烷基尿嘧啶，见Liao，T.K J.Am.Chem.Soc. (1964)86，1869，Schinazi，R.F.J.Org.Chem.Soc.(1985)50，841，和 Nemoto，H.J.Chem.Soc.Chem.Commun.(1994)577；和

叶酸(Foliates)、生长因子、激素、辐射敏化物、磷酸根(酯) 类、膦酸根(酯)类、氨基磷酸酯类、环状硫脲衍生物、胺类、丙嗪类、 乙内酰脲类或巴比妥酸盐(酯)类，见Soloway Chem.Rev.(1998)Vol 98，No.4，1545-1550页。

多种亲脂的碳硼烷基四苯基卟啉的结构。

R也可以代表卤素，优选Br或Cl，或硝基(NO)。

其它核素可以以相同方式掺入。例如，本领域已知BNCT和 GdNCT化合物组合，其中Gd核素和碳硼烷笼在相同分子上，见Soloway (1998)Chem.Rev.Vol 98，No.4，1519页。

NAT试剂应该优选构成聚合物-NAT偶联物总质量的1-30％，优选 5-10％。

使用已知的技术活化NAT试剂，例如用电磁辐射照射(如X射线、 光、微波、γ射线)或用中子或用超声、质子、碳离子、介子治疗、电子 束疗法、反质子治疗、光子治疗、光动力治疗。在中子的情况下，该技 术称作中子俘获治疗，并且该试剂称作中子俘获治疗(NCT)剂。

该接头可以是连接聚合物和NCT剂并且不影响聚合物-NAT偶联 物的体内溶解度或毒性性质的任何基团。这种接头包括饱和或不饱和的 直链或支链C1-15烷基(其任选由羰基、酰胺、羟基或卤素取代)，例 如甲基、乙基、丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、1-甲基丁基和甲基戊 基；和肽，优选长度为1-10个氨基酸，其中氨基酸可以进一步被氨基、 硫基、羧基、羧酰胺或咪唑基取代。优选的肽是Gly-Gly、Gly-Phe-Gly、 Gly-Phe-Phe、Gly-Leu-Gly、Gly-Val-Ala、Gly-Phe-Ala、Gly-Leu-Phe、 Gly-Leu-Ala、Ala-Val-Ala、Gly-Phe-Leu-Gly、Gly-Phe-Phe-Leu、 Gly-Leu-Leu-Gly、Gly-Phe-Tyr-Ala、Gly-Phe-Gly-Phe、 Ala-Gly-Val-Phe、Gly-Phe-Phe-Gly、Gly-Phe-Leu-Gly-Phe和 Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-Phe。特别优选的肽是Gly-Gly和 Gly-Phe-Leu-Gly。

一些肽接头可以用溶酶体酶降解，使得NAT化合物在肿瘤细胞内 释放。

用本领域技术人员熟知的常规合成法将接头与聚合物和NAT剂连 接起来。下列键提供了NAT剂与聚合物连接的合适方法：酰胺键、酯 键、酰肼键、尿烷(氨基甲酸酯)键、碳酸酯键、亚胺(席夫碱)键、硫醚 键、偶氮键或碳-碳键。可供选择地，NAT剂可以直接与聚合物本身连 接，即接头是共价键。

可以使用氨基(-NH2)和羧基(COOH)制得酰胺键。后者应该转换成 更具活性的中间体，例如酸性氯化物(COCl)或使用偶联剂，例如羰基二 咪唑(CDI)或二环己基碳二亚胺(DCC)。氨基的其它底物是酸酐类和酯 类。酯键可以由羟基(OH)和上述活化的羧酸类和酸酐类得到。酰肼键可 以由酰卤(例如上面的酸性氯化物)和肼(NH2NHR)得到。氨基甲酸酯键 可以由碳酰氯(ClCOCl)得到，或优选地，氯甲酸三氯甲酯(CCl3OCOCl)， 它可以用醇和胺处理。碳酸酯键也可以由碳酰氯或氯甲酸三氯甲酯得 到，它可以用两个醇基处理。亚胺(或席夫碱)可以通过醛(RCHO)或酮 (RCOR)和胺类之间缩合来得到。醛可容易地通过伯醇氧化得到，酮可 以由仲醇氧化得到。硫醚可以先通过基团(例如醇)转变成好的离去基 团(例如甲苯磺酸根、甲磺酸根、triflate或卤化物)，并用硫醇盐(RS-) 处理(用RS取代离去基团)而得到。见例如Schacht E(1987)：Illum L， Davis SS(编)″Polymers in drug delivery″，Wright，Bristol，pl31。

典型地，接头在甲基丙烯酸酯单体上连接于聚合物，优选通过酰胺 键。不具有悬吊NAT剂(或任何其它药物活化剂)的甲基丙烯酸酯单体仍 然可以具有接头，其可用加帽化合物，例如2-氨基-1-丙醇加帽。

对于有效治疗计划和BNCT剂量计算，重要的是知道药物在肿瘤中 的位置和浓度。因此，在临床设置作为部分治疗计划中，为了计算临床 中子剂量，重要的是知道NAT剂在肿瘤物质中的位置和量。例如，大 分子可以携带用诊断技术(如PET、SPECT、MRI)可以成像的金属。 例如亲脂的碳硼烷基四苯基卟啉(LCTP)能够携带金属离子。所述金属 可以选自钒(V)、锰(Mn)、铁(Fe)、钌(Ru)、锝(Tc)、铬(Cr)；铂(Pt)、 钴(Co)、镍(Ni)、铜(Cu)、锌(Zn)、锗(Ge)、铟(In)、锡(Sn)、钇(Y)、金 (Au)、钡(Ba)、钨(W)、钆(Gd)和镓(Ga)。最优选的金属是铜和镍。

正电子发射层析成象(PET)也可以用于提供聚合物-NAT偶联物在 肿瘤中的位置和浓度的指示。在PET中，放射性核素例如18F(大约2 小时的半衰期)或11C(20分钟半衰期)是优选的。单一氟原子可以掺入聚 合物主链或理想地在接头链中的氨基酸，优选Phe中。这为能够定制个 性化聚合物-NAT偶联物药物剂量的诊断和治疗计划提供了很有效的手 段。氟原子的存在提供了在使用熟知的PET图像化学来诊断时一种用 放射性核素18F取代F的方法。

下面描述述一些本发明优选的聚合物-NAT偶联物的实例。

优选地，聚合物是N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)和甲基丙烯 酸的共聚物；接头是肽，例如Gly-Phe-Leu-Gly；NAT剂选自邻碳硼烷 丙氨酸B10C2H2-CH2CHCO2NH2、碳硼烷butamine B10C2H2-(CH2)3CHCO2NH2、BPA(对二羟硼基苯丙氨酸)、B12H11SH(BSH)(巯基十一氢十二硼烷根)，硼化卟啉，BSH-谷胱甘肽二硫化物和 水溶性四羰苯基卟啉(如NiTCP)。

特别优选的偶联物是：

HPMA-co-MA-Gly-Phe-Leu-Gly-BSH

HPMA-co-MA-Gly-BPA-Leu-Gly-BPA

HPMA-co-MA-Gly-BPA-Leu-Gly-Gly-BPA

HPMA-co-MA-Gly-Phe-Leu-Gly-碳硼烷butamine(B10C2H11(CH2)3CHCO2NH2)

HPMA-co-MA-Gly-BPA-Leu-Gly-碳硼烷butamine(B10C2H11-(CH2)3CHCO2NH2)

HPMA-co-MA-Gly-Phe-Leu Gly-CuTCPH

HPMA-co-MA-Gly-Phe-Leu-Gly-CuTCPHBr

本发明的聚合物-NAT偶联物选择性地靶向于肿瘤并利用了许多肿 瘤性质。例如，肿瘤具有负渗透压，因为没有淋巴引流，导致聚合物-NAT 偶联物的截留(所谓的增强的渗透率保持(EPR)效应)。因此绝大多数小 化合物通过扩散进入肿瘤，并倾向于留在肿瘤床层，通过缝隙连接在细 胞之间移动。化合物正常地是通过胞吞作用进入细胞质而进入细胞并终 止在溶酶体隔室。聚合物-NAT偶联物靶向于细胞膜、细胞质的细胞器 (如线粒体、内质网或高尔基体)和/或细胞核。较接近细胞核和细胞 器的聚合物-NAT偶联物增加由NAT剂裂变产生的电离颗粒(如α和锂 离子)造成的不可逆的DNA或细胞破坏的可能性。

也可以修饰聚合物-NAT偶联物的聚合物成分以靶向于身体的特定 区域。例如，肝细胞上的脱唾液酸糖蛋白受体可以识别半乳糖和N-乙 酰半乳糖胺。因此，这些成分掺入聚合物使得本发明的聚合物-NAT偶 联物导向于肝脏。

半乳糖可以被掺入具有保护羟基的HPMA单体。例如，合成1，2，3，4- 二-O-异亚丙基-6-O-甲基丙烯酰基-α-D-吡喃半乳糖，然后与HPMA共 聚合，随后用甲酸除去保护基-异亚丙基。见Chytry，V.等人，New Polymer Material(1987)1，21。使用具有以对硝基吡啶酯终止的侧链的 反应性HPMA共聚物前体连接N-乙酰化半乳糖胺。它们被在DMSO中 室温和压力下用半乳糖胺氨解。

此外，通过将正电荷(如使用甲基丙烯酰氧基乙基三甲基氯化铵)或 疏水性共聚单体(如使用N-[2-(4-羟基苯乙基)]丙烯酰胺或N-甲基丙烯 酰基酪氨酰胺)掺入聚合物可以提高聚合物-NAT偶联物的非特异性吸 收。

NAT需要聚合物-NAT偶联物以0.1-100mg/kg体重，优选 0.1-50mg/kg体重，特别优选1-30mg/kg体重的剂量给予。该剂量应该 给每克湿肿瘤组织输送至少10μg/g的活性核素，如10B原子，优选至 少25μg/g，更优选至少80μg/g，更优选至少160μg/g和最优选200μg/g 以上。

意外地，本发明的聚合物-NAT偶联物提供了与已知NAT剂相比明 显减少的全身毒性，由此可以给予较高剂量，导致肿瘤细胞内部更高浓 度的NAT剂。由于聚合物-NAT偶联物内的NAT剂不能与生物环境相 互作用因此毒性降低。此外，由于肿瘤长时期保留聚合物-NAT偶联物， 即数小时至数天，不需要多重剂量，因此扩大了临床治疗窗口。

除了NAT剂之外，其它药物或它们的预期前体药物也可以掺入本 发明的聚合物-NAT剂，由此提供增加的抗癌症活性。也就是说，具有 通式P-(L-NAT)n(L-化疗剂)m的聚合物-NAT偶联物，其中P、L、NAT 和n具有如上定义的相同意思，L可以是相同或不同的，m是1-1000 的整数，优选1-500，更优选1-100，最优选1-20。这种化疗剂可以包括 例如下列任何一个：5-(azurudub-1-基)-4-二羟基氨基-2-硝基苯甲酰胺、 苯二胺芥、苯甲酸芥、更昔洛韦三磷酸、腺嘌呤阿拉伯糖核苷三磷酸 (araATP)、过氧化氢、氰化物、过氧化物、氨甲喋呤、丝裂霉素醇、依 托泊甙、palytoxion、苯丙氨酸氮芥、5-(吖丙啶-1-基)-4-羟氨基-2-硝基 苯甲酰胺、放线菌素D、丝裂霉素C、紫杉烷类(例如紫杉酚和泰索帝)、 拓扑异构酶(topoisomerage)抑制剂(例如喜树碱和托泊替康环磷酰胺、 亚硝脲氮芥、5-氟尿嘧啶、cytrabine、巯嘌呤、蒽环霉素、柔红霉素、 阿霉素、表柔比星、长春花生物碱类、长春灭瘟碱、长春花新碱、更生 霉素、丝裂霉素C、左旋天冬酰氨酶、G-CSF、顺铂和卡铂。

这种类型的优选偶联物是HPMA-co-MA-[Gly-Phe-Leu-Gly-BSH) (Gly-Phe-Leu-Gly-Y)]，其中Y是抗癌剂，例如：

HPMA-co-MA[(Gly-Phe-Leu-Gly-BSH)(Gly-Phe-Leu-Gly阿霉素)]

HPMA-co-MA[(Gly-Phe-Leu-Gly-BSH)(Gly-Phe-Leu-Gly玫瑰树碱)]

HPMA-co-MA[Gly-Phe-Leu-Gly-BSH)(Gly-Phe-Leu-Gly顺铂)]

本发明聚合物-NAT偶联物的特征是它们在肿瘤中构建，不需要与 该聚合物连接的寻靶部分。然而，聚合物-NAT偶联物(有或者没有活 性抗癌化疗剂)也可以含有与聚合物连接的寻靶部分。选择这些寻靶部 分以增加在期望的靶组织中该化合物的浓度。这种寻靶部分通过提供选 择性的单元显著改变偶联物的生物分布。这种寻靶部分包括(N-乙酰化) 半乳糖胺、(6-O-结合)半乳糖、(N-乙酰化)岩藻糖胺、促黑素细胞激素 和分泌素。

现在将通过很多实施例来说明本发明，它们描述了克服了当前的 BNCT剂缺点的新型聚合物-NAT偶联物。

实施例

聚合物从Polymer Laboratories Ltd.获得。分析证书从Butterworth 获得。

在以下的实施例1和2中，4-二羟硼基苯丙氨酸(BPA)与聚合物的 对硝基苯基酯基的反应导致具有对硝基苯酚置换的含硼聚合物的形成， 如以下反应流程所描述。

商购自Polymer Laboratories Ltd的聚(HPMA-co-MA-GG-ONp)具 有28,100的平均分子量，分子量分布宽泛，重均分子量/数均分子量 Mw/Mn＝1.31，产生x＝153，y＝17(MW＝27,624)的均值。聚 (HPMA-co-MA-GFLG-ONp)具有47,200的平均分子量(Mw/Mn＝1.53)。 从平均分子量，x和y的均值可以计算为x＝225，y＝25(MW＝ 47,131)。这些值已经用于计算应该添加多少硼取代的苯丙氨酸。

实施例1

聚(HPMA-co-MA-GG-F[4-B(OH)2])的克规模制备

聚(HPMA-co-MA-GG-ONp)粉末(1.1g，40.0μmol)和4-二羟硼基苯 丙氨酸(富含10B)(0.15g，740μmol)置于用隔膜封口并用氩填充的干燥烧 瓶中。添加无水DMSO(11mL)并搅拌混合物直到全部原料溶解产生混 浊的溶液。添加作为催化剂的三乙胺(4滴)使溶液变成黄色。在 20-22℃(油浴温度)氩气下搅拌溶液过夜。用二乙醚(200mL)稀释该溶 液，倒出溶剂，留下固体粘稠沉淀物。固体粘稠沉淀物与另外的二乙醚 部分研磨直到它不再粘稠。剩余溶剂在真空中(约0.4mmHg)，36℃蒸发 3小时。获得聚(HPMA-co-MA-GG-F[4-B(OH)2])的米色/浅黄色固体 (1.20g，104％)，1H NMR分析显示一些剩余二乙醚和DMSO的存在。

Butterworth Laboratories Ltd.进行硼分析。发现聚 (HPMA-co-MA-GG-F[4-B(OH)2])的硼含量是0.47％(预期是0.59％)。 值低可能是由于聚合物与4-二羟硼基苯丙氨酸的不完全反应和剩余溶 剂的存在。

实施例2

聚(HPMA-co-MA-GFLG-F[4-B(OH)2])的克规模制备

聚(HPMA-co-MA-GFLG-ONp)粉末(1.1g，23.3μmol)和4-二羟硼基 苯丙氨酸(富含10B)(0.13g，625μmol)置于用隔膜封口并用氩填充的干 燥烧瓶中。添加无水DMSO(11mL)并搅拌混合物直到全部原料溶解产 生混浊的溶液。添加作为催化剂的三乙胺(4滴)使溶液变成黄色。在 20-22℃(油浴温度)氩气下搅拌溶液过夜。用二乙醚(200mL)稀释该溶 液，倒出溶剂，留下固体粘稠沉淀物。固体粘稠沉淀物与另外的二乙醚 部分研磨直到它不再粘稠。剩余溶剂在真空中(约0.4mmHg)，36℃蒸发 3小时。获得终产物聚(HPMA-co-MA-GFLG-F[4-B(OH)2])的米色/浅黄 色固体(1.23g，102％)，1H NMR分析显示一些剩余二乙醚和DMSO的存 在。

Butterworth Laboratories Ltd.进行硼分析。发现该聚合物含有 0.40％硼(预期是0.48％)。这些稍低的值可能是由于聚合物与4-二羟硼 基苯丙氨酸的不完全反应和剩余溶剂的存在。

实施例1和2中制备的聚合物-NAT偶联物的化学结构是：

实施例1和2的聚合物-NAT偶联物仅仅在它们的肽接头方面不同。 实施例1的聚合物-NAT偶联物具有肽接头Gly-Phe-Leu-Gly，它在细 胞的溶酶体隔室中被酶降解而释放BPA，而实施例2的聚合物-NAT偶 联物具有肽接头″Gly-Gly″，它不降解，保持整个分子完整。可生物降 解的聚合物能够将携带硼的分子释放到细胞质，并且具有扩散进入细胞 器中心和，最重要地，进入细胞核的机会。在BNAT中，携带硼的分子 与DNA越近，杀死细胞越有效。然而，对于非可降解聚合物-NAT偶 联物，该分子保持完整并且一旦它被内化就不能离开细胞。这允许通过 多剂量在细胞中建立很高浓度的硼化聚合物，否则由于硼化聚合物的全 身毒性这种方式或许不可能。

实施例3

聚(HPMA-co-MA-GG-F BSMel)(申请人代码PP403)的制备

使用商购巯基硼烷钠合成聚(HPMA-co-MA-GG-F BSMel)。“步骤 1”中，使用US 6,017,902中描述的程序，巯基硼烷钠首先转化为苯丙 氨酸衍生物、巯基硼烷钠苯丙氨酸氮芥(BSMel)。这个步骤之后是“步骤 2”，其中BSMel与聚(HPMA-co-MA-GG-ONp)发生反应产生聚 (HPMA-co-MA-GG-F BSMel)。

步骤1 BSMel的制备

巯基硼烷钠(0.95g，4.32mmol)溶于5％碳酸氢钠溶液(30mL)。添加 苯丙氨酸氮芥-浅黄色固体(0.22g，0.72mmol)并且在室温下搅拌该悬 浮液48小时。浅黄色固体苯丙氨酸氮芥完全溶解并且形成精细白色沉 淀。混合物冷却(约4℃)3小时，然后尼龙膜滤过。生成的固体经加热(约 100℃浴温度)溶于水(30mL)中。允许生成的溶液冷却至室温并过滤。通 过小心滴加浓盐酸将该溶液的pH调节至2.7，引起微细固体物沉淀。 在过夜(约4℃)冷却之后，过滤收集产物并用冷水洗涤。剩余溶剂在真 空中(约0.4mmHg)，约30℃蒸发5小时。获得浅黄褐色固体产物(0.19g， 65％)。

步骤2 BSMel聚合物的制备

聚(HPMA-co-MA-GG-ONp)粉末(1.1g，40.0μmol)置于用隔膜封口 并用氩填充的干燥烧瓶中。添加无水DMSO(11mL)并搅拌混合物直到 全部原料溶解。添加步骤1的BSMel(0.069g，169μmol)。当全部固体溶 解时，添加三乙胺(2滴)使溶液变为黄色。在20-22℃(油浴温度)氩气下 搅拌溶液过夜。添加3-氨基-1-丙醇(41μl，536μmol)，溶液搅拌另外3 小时。用二乙醚(200mL)稀释该溶液，倒出溶剂，留下粘稠沉淀物。黄 色固体粘稠与另外的二乙醚部分研磨直到它不再粘稠。剩余溶剂在真空 中蒸发。得到1.10g。

这种不能生物降解的携带硼的聚合物能够给每个硼载体输送12个 硼原子，每个聚合物分子有3-4之间个BSMel分子。因此，BSMel聚 合物能够给每个聚合物分子输送比实施例1和2的那些超过30-40倍的 更多硼。这提供了用相对低浓度的聚合物输送高浓度硼的很有效方法。

实施例4

聚(HPMA-co-MA-GFLG-BSMel)(PP404)的制备

聚(HPMA-co-MA-GFLG-ONp)粉末(1.1g，23.3μmol)置于用隔膜封 口并用氩填充的干燥烧瓶中。添加无水DMSO(11mL)并搅拌混合物直 到全部原料溶解。添加BSMel(0.062g，152μmol)。当全部固体溶解时， 添加三乙胺(2滴)使溶液变为黄色。在20-22℃(油浴温度)氩气下搅拌溶 液过夜。添加3-氨基-1-丙醇(35μl，456μmol)，溶液搅拌另外24小时。 用二乙醚(220mL)稀释该溶液，倒出溶剂，留下粘稠沉淀物。浅白色固 体与另外的二乙醚部分研磨直到它不再粘稠。剩余溶剂在真空中蒸发。 得到0.95g。

实施例5

聚(HPMA-co-MA-Gly-Phe-Leu-Gly-BSMel)-Gly-Phe-Leu-Gly-紫 杉醇(PP405)的制备

聚(HPMA-co-MA-GFLG-ONp)粉末(2.15g，45.6μmol)置于用隔膜 封口并用氩填充的干燥烧瓶中。添加无水DMSO(22mL)并搅拌混合物 直到全部原料溶解。添加BSMel(0.146g，366μmol)。当全部固体溶解时， 添加三乙胺(52μl，366μmol)使溶液变为黄色。在20-22℃(油浴温度)， 氩气下搅拌溶液5小时。添加紫杉醇(0.313g，366μmol)和4-二甲基氨基 吡啶催化剂(0.015g，123μmol)。在20-22℃搅拌过夜后，添加3-氨基 -1-丙醇(35μl，456μmol)，溶液搅拌另外4小时。该溶液缓慢倒入搅拌 的二乙醚(500mL)中，倒出溶剂，留下粘稠沉淀物。淡黄色固体与另外 的二乙醚部分研磨直到它不再粘稠。剩余溶剂在真空中蒸发。得到 2.44g(98％)。

实施例6

聚(HPMA-co-MA-Gly-Phe-Leu-Gly-BSMel)Gly-Phe-Leu-Gly-阿 霉素(PP406)的制备

聚(HPMA-co-MA-GFLG-ONp)粉末(2.15g，45.6μmol)置于用隔膜 封口并用氩填充的干燥烧瓶中。添加无水DMSO(22mL)并搅拌混合物 直到全部原料溶解。添加BSMel(0.146g，366μmol)。当全部固体溶解时， 添加三乙胺(52μl，366μmol)。在20-22℃(油浴温度)，氩气下搅拌溶液5 小时。添加盐酸阿霉素(0.212g，366μmol)和三乙胺(52μl，366μmol)。在 20-22℃搅拌过夜后，添加3-氨基-1-丙醇(35μl，456μmol)，溶液搅拌另 外4小时。该溶液缓慢倒入搅拌的二乙醚(500mL)中，倒出溶剂，留下 粘稠沉淀物。红色固体与另外的二乙醚部分研磨直到它不再粘稠。剩余 溶剂在真空中蒸发。得到2.55g(105％)。

生物分布研究

使用带有EMT-6癌的雌性BALB/c小鼠(20-25g)。四只小鼠安放在 温度受控的房间的笼中并可以自由取食和水。小鼠供养在控制的明/暗 循环中，0700和1900小时之间光照。在所有研究中，用氯胺酮 (120mg/kg)和甲苯噻嗪(20mg/kg)维持麻醉。每日基础上监视动物的一般 健康。给动物实施安死术(根据需要，在麻醉下进行)。

实施例3和4中合成的两个硼化聚合物，即PP403和PP404通过 尾静脉注射给携带EMT-6肿瘤的小鼠。该化合物在含有50mg/ml (0.5mg硼/ml)的生理盐水溶液中注射。给予体积是0.01ml/gbw，通过输 送约5mg硼/kg的剂量快速灌注注射。

使用直流血浆原子发射光谱法(DCP-AES)测定组织样品中的硼浓 度，见Coderre，J.A.，Button，T.M.，Micca，P.L.Fisher，C.，Nawrocky， M.M.，和Liu，H.B.，Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.(1994) 30,643-652。

目视观察动物外观、活动水平和一般行为，表明无毒性证据(见 Miura，M.，Micca，P.L.，Fisher，C.D.，Gordon，C.R.，Heinrichs，J.C. 等人，Brit.J.Radiol.(1998)847，773-781)。在注射后6、24、48和72 小时对肿瘤、血液、脑和肝脏采样进行硼分析。每一时间采样点使用四 只小鼠(总共16只小鼠)。下表2详述了硼的生物分布数据。

肿瘤中来自PP403的硼浓度比来自PP404的大约高三倍，这可能 是由于PP403中非降解性接头。对于PP403，在所有时间点，肝脏∶肿 瘤的硼比率在2∶1和3∶1之间，而对于PP404，在4.5∶1和6∶1之 间。直到72小时时间点，使用PP403的肿瘤∶血液的硼比率小于1∶1， 对于PP404，直到48小时时间点时小于1∶1。绝对肿瘤硼浓度低，但是 给予硼剂量也低。与生物分布数据相比，在CRM中使用来自CuTCPH 的类似硼剂量，肿瘤吸收低大约2.3倍，但是肝脏吸收低大约5倍。

表2.  注射后时间(小时)  血液(μg/g)  肿瘤(μg/g)  肝脏(μg/g)  脑(μg/g))  PP403  6  13.8±0.5  3.5±0.2  10.4±0.5  0.3±0.1  24  5.7±0.1  3.1±0.3  7.4±0.4  0.2±0.1  48  4.2±0.5  2.9±0.1  7.7±0.4  0.1±0  72  2.1±0.2  2.3±0.2  6.9±0.2  0.1±0.1  PP404  6  3.0±0.3  1.3±0  7.6±0.3  0.1±0  24  1.2±0.1  1.1±0.1  5.0±0.5  0.2±0  48  0.7±0.0  0.8±0.1  4.9±0.2  0.1±0  72  0.5±0  0.9±0.1  5.4±0.4  0.1±0.1

表2显示了能够靶向于肿瘤并释放NAT剂的偶联物，其中有生物 可降解的接头。