一种放射核素131I-单克隆抗体标记物的制备方法
阅读：854发布：2023-01-17
专利汇可以提供一种放射核素131I-单克隆抗体标记物的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种放射核素131I-单克隆 抗体 标记物的制备方法，以及通过该方法获得的放射核素131I-单克隆抗体标记物在制备用于诊断和/或 治疗 肿瘤 的产品中的用途。本发明的方法，在单克隆抗体进行标记之前先采用精 氨 酸缓冲液对单克隆抗体进行预处理，之后再结合常规的标记方法。通过本发明的方法能获得高放射比度、高放射化学纯度、较高免疫结合活性的放射核素131I-单克隆抗体标记物。，下面是一种放射核素131I-单克隆抗体标记物的制备方法专利的具体信息内容。
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1.一种放射核素 I-单克隆抗体标记物的制备方法，其特征在于在单克隆抗体进行标记之前，先采用精氨酸缓冲液对单克隆抗体进行预处理，包括步骤：用精氨酸缓冲液接触单克隆抗体；去除精氨酸缓冲液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述的精氨酸缓冲液的精氨酸浓度为
0.2-0.5mol/L；pH值3.0-5.0；精氨酸缓冲液和单克隆抗体接触时间为0.5-4小时。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述的单克隆抗体为哺乳动物细胞表达生产的单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其中所述的哺乳动物细胞表达生产的单克隆抗体偏碱性。
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5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法获得的放射核素 I-单克隆抗体标记物在制备用于诊断和/或治疗肿瘤的产品中的用途。
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一种放射核素 I-单克隆抗体标记物的制备方法
技术领域
[0002] 抗肿瘤单克隆抗体因其特异性好，结合能力强的优势，可以用于放射免疫导向治疗中作为载体运载起杀伤作用的放射核素，将抗体分子标记的放射核素在患者体内有效地运载至肿瘤局部，杀伤肿瘤，起到治疗肿瘤的重要作用。目前已经有多种特异的抗肿瘤单克隆抗体供我们悬选择，包括抗CD20抗体、抗癌胚抗原（CEA）抗体、抗表皮生长因子受体家族3 14 131 125
成员2（HER2）抗体等。而目前常用的放射性同位素有 H、C、 I和 I等，其中放射性碘
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放出γ-射线，较易获得较高效率而精确的测量，同时放射性碘的半衰期较短，尤其是 I的半衰期只有8.05天，标记物可以短时间的衰变使放射性降低以便后期处理，因而在治疗
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人体疾病方面及某些情况下的放射显像诊断方面，放射性 I有很大优势。
成员2（HER2）抗体等。而目前常用的放射性同位素有 H、C、 I和 I等，其中放射性碘
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放出γ-射线，较易获得较高效率而精确的测量，同时放射性碘的半衰期较短，尤其是 I的半衰期只有8.05天，标记物可以短时间的衰变使放射性降低以便后期处理，因而在治疗
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人体疾病方面及某些情况下的放射显像诊断方面，放射性 I有很大优势。
[0003] 制备高放射比度、高放射化学纯度与免疫结合活性好的放射核素 131I-单克隆抗体标记物对于肿瘤的放射免疫导向治疗来说，无疑具有非常重要的意义。具有高度肿瘤特异性和体内靶向肿瘤特性的抗肿瘤单克隆抗体（以下简称为单抗），在标记可有效杀伤肿瘤131 131
的放射核素 I之后，在患者体内可以有效地将放射核素 I携带运载至肿瘤局部，从而有效地杀伤肿瘤，起到治疗肿瘤的作用，并可能用于某些情况下显像肿瘤。然而，想要有效地
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将放射核素 I携带运载至肿瘤局部，除了要求放射核素 I-单克隆抗体标记物具备高比
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度、高纯度等必要的药学特征外，最重要的就是要求放射核素 I-单克隆抗体标记物在标记后仍然保持良好的免疫结合活性，这样才能在体内有效地与肿瘤细胞结合， 从而将放射
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核素 I携带运载至肿瘤局部。
的放射核素 I之后，在患者体内可以有效地将放射核素 I携带运载至肿瘤局部，从而有效地杀伤肿瘤，起到治疗肿瘤的作用，并可能用于某些情况下显像肿瘤。然而，想要有效地
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将放射核素 I携带运载至肿瘤局部，除了要求放射核素 I-单克隆抗体标记物具备高比
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度、高纯度等必要的药学特征外，最重要的就是要求放射核素 I-单克隆抗体标记物在标记后仍然保持良好的免疫结合活性，这样才能在体内有效地与肿瘤细胞结合， 从而将放射
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核素 I携带运载至肿瘤局部。
[0004] 按照现有业界公知的相关技术方法，采用适当的方法标记单克隆抗体，很容易获131
得高比放射性的放射核素 I-单克隆抗体标记物。常用的标记方法有：氯胺T法、乳过氧化物酶法（LPO）、Iodogen碘化法、酰化试剂（Bolton和Hunter试剂）法、NBS（溴代琥珀酰亚胺）法等。标记产物的纯化也应尽量采用温和的方法，避免在纯化操作中已受潜在损伤的蛋白质，再经标记反应时所受的损伤后活性显著降低。
得高比放射性的放射核素 I-单克隆抗体标记物。常用的标记方法有：氯胺T法、乳过氧化物酶法（LPO）、Iodogen碘化法、酰化试剂（Bolton和Hunter试剂）法、NBS（溴代琥珀酰亚胺）法等。标记产物的纯化也应尽量采用温和的方法，避免在纯化操作中已受潜在损伤的蛋白质，再经标记反应时所受的损伤后活性显著降低。
[0005] 氯胺T法标记效率高、重复性好、试剂便宜易得，是目前使用最多的碘标记方法。乳过氧化物酶法（LPO）反应温和，对抗原、抗体免疫活性影响小，已被广泛应用。缺点是标记率较低，一般为20～40%。Iodogen碘化法具有标记率高、反应体积小（3ml水平）、可用低
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浓度的 I原料、对多肽激素和蛋白质的免疫活性损失小、稳定等优点，系常规的碘化方法之一。酰化试剂（Bolton和Hunter试剂）法避免了蛋白质与氧化剂的接触，又避免了与放射性碘原子的直接接触，可防止碘源中有害物质对蛋白质的损伤，适用于标记缺乏酪氨酸的蛋白质或酪氨酸在活性中心，引入碘原子后会引起蛋白质的失活。其缺点是标记技术比较复杂，需要接触较多的放射性，经二步反应，碘标记率比较低。一般认为此法不宜标记短肽，而适于分子量大于1万的蛋白质。NBS法是近年来发展起来并已广泛应用的一种新的方
131 - 131 2
法，该方法采用NBS作为氧化剂使碘离子（ I）氧化成分子状态的碘分子（ I），而碘原子
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在0价或+1价态就能直接取代单抗分子上的酪氨酸残基上羟基邻位的氢原子，从而使 I通过取代反应共价结合在单抗的抗体分子上。其特点是标记过程温和，相对的标记损伤小，产物无毒，易于纯化。
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浓度的 I原料、对多肽激素和蛋白质的免疫活性损失小、稳定等优点，系常规的碘化方法之一。酰化试剂（Bolton和Hunter试剂）法避免了蛋白质与氧化剂的接触，又避免了与放射性碘原子的直接接触，可防止碘源中有害物质对蛋白质的损伤，适用于标记缺乏酪氨酸的蛋白质或酪氨酸在活性中心，引入碘原子后会引起蛋白质的失活。其缺点是标记技术比较复杂，需要接触较多的放射性，经二步反应，碘标记率比较低。一般认为此法不宜标记短肽，而适于分子量大于1万的蛋白质。NBS法是近年来发展起来并已广泛应用的一种新的方
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法，该方法采用NBS作为氧化剂使碘离子（ I）氧化成分子状态的碘分子（ I），而碘原子
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在0价或+1价态就能直接取代单抗分子上的酪氨酸残基上羟基邻位的氢原子，从而使 I通过取代反应共价结合在单抗的抗体分子上。其特点是标记过程温和，相对的标记损伤小，产物无毒，易于纯化。
[0006] 然而，在实际应用中，尤其是针对采用真核哺乳动物细胞表达生产的偏碱性的单抗药物来说（真核哺乳动物细胞表达生产的单抗往往其抗体分子的表面特性不是非常均一，例如，表达产物中往往存在多种糖基化状态不同的分子），却经常发现对于有些单抗采用现有技术时，无论怎样优化放射标记的条件和参数，例如反应投料比例，仍然无法获得保持良好的特异免疫反应活性的高放射比度、高放射化学纯度标记物，其活性往往非常显著地下降（例如，仅剩余标记前免疫结合活性的20%-30%），这严重制约了标记物作为放射免疫导向药物治疗 肿瘤的疗效和应用价值。
[0007] 因此，需要发展新的标记方法来制备高放射比度、高放射化学纯度与免疫结合活131
性好的放射核素 I-单克隆抗体标记物。虽然研究者已经对优化常规标记法的碘化剂用量、或抗体浓度、反应时间、放射核素和抗体的投料配比等参数进行了大量研究，但尚未有研究者报道制备高免疫结合活性的标记产物需要进行抗体的精氨酸缓冲液预处理。 发明内容
性好的放射核素 I-单克隆抗体标记物。虽然研究者已经对优化常规标记法的碘化剂用量、或抗体浓度、反应时间、放射核素和抗体的投料配比等参数进行了大量研究，但尚未有研究者报道制备高免疫结合活性的标记产物需要进行抗体的精氨酸缓冲液预处理。 发明内容
[0008] 首先，本发明提供了一种制备高放射比度、高放射化学纯度、较高的免疫结合活性131
的放射核素 I-单克隆抗体标记物新的方法。
的放射核素 I-单克隆抗体标记物新的方法。
[0009] 同时，本发明进一步提供了采用上述这种新方法所获得的放射核素131I-单克隆抗体标记物在制备用于诊断和/或治疗肿瘤的产品中的用途。
[0010] 因此，本发明主要涉及了以下几个方面：
[0011] 第一方面，本发明涉及一种放射核素131I-单克隆抗体标记物的制备方法。 [0012] 该方法特征在于在用常规方法进行标记之前加入了一步关键的预处理步骤。具体来说，该方法特征在于在单克隆抗体进行标记反应之前，先采用精氨酸缓冲液对单克隆抗体进行预处理。
[0013] 在一些具体的实施方式中，预处理步骤包括：用精氨酸缓冲液接触单克隆抗体；去除精氨酸缓冲液。经过这样的预处理之后，即可按照常规的标记方法进行标记。 [0014] 在优选的实施方式中，所述的精氨酸缓冲液的精氨酸浓度为0.2-0.5mol/L；pH值
3.0-5.0；精氨酸缓冲液和单克隆抗体接触时间为0.5-4小时。
3.0-5.0；精氨酸缓冲液和单克隆抗体接触时间为0.5-4小时。
[0015] 在一些具体的实施方式中，本领域技术人员可以采用公知的方法去除精氨酸缓冲液。在优选的实施方式中，采用常规的缓冲液置换装置去除精氨酸缓冲液，置换为常规法所用的标记缓冲液。
[0016] 本发明所采用的常规标记方法包括但不限于氯胺T法、乳过氧化物酶法、Iodogen碘化法、Bolton和Hunter试剂法、NBS法。
[0017] 在一些具体的实施方式中，本发明所采用的常规标记方法为NBS 法，包括步骤：131
加入适量NBS和高活度的放射核素 I对抗体进行标记反应，之后加入其它高浓度蛋白终止反应，纯化，获得标记产物。
加入适量NBS和高活度的放射核素 I对抗体进行标记反应，之后加入其它高浓度蛋白终止反应，纯化，获得标记产物。
[0018] 在一些具体的实施方式中，所述单克隆抗体是哺乳动物细胞表达生产的单克隆抗体。在一个优选实施方案中，哺乳动物细胞表达生产的单克隆抗体偏碱性。 [0019] 第二方面，本发明涉及采用第一方面所述方法获得的放射核素131I-单克隆抗体标记物在制备用于诊断和/或治疗肿瘤的产品中的用途。附图说明
[0020] 图1显示采用常规标记法制备3种单克隆抗体的放射核素131I-单克隆抗体标记产物的免疫结合活性测定结果，其中A：抗癌胚抗原抗体、B：抗HER2抗体、以及C：抗EGFR抗体。
[0021] 图2显示采用本发明的方法制备3种单克隆抗体的放射核素131I-单克隆抗体标记产物的免疫结合活性测定结果，其中A：抗癌胚抗原抗体、B：抗HER2抗体、以及C：抗EGFR抗体。
具体实施方式
[0022] 本发明所涉及的制备高放射比度、高放射化学纯度、较高的免疫结合活性的放射131
核素 I-单克隆抗体标记物的新方法，按照本说明书的描述，很容易在制备多种放射核素
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I-单克隆抗体标记物的过程中实现。
核素 I-单克隆抗体标记物的新方法，按照本说明书的描述，很容易在制备多种放射核素
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I-单克隆抗体标记物的过程中实现。
[0023] 如下将以NBS为例，详细说明本发明的实施。在常规NBS法的基础上，通过在加入NBS反应前对所要标记的单克隆抗体进行一步关键的预处理，从而使得对于某些采用真核哺乳动物细胞表达生产的偏碱性的单克隆抗体的标记产物的免疫结合活性较常规NBS标记方法大大提高，以满足标记产物进一步用于临床诊断和治疗的要求。
[0024] 首先，按照常规NBS法标记程序要点，在优化常规NBS法标记过程各参数的基础上131
（具体的，包含了NBS及抗体反应浓度、放射核素 I和抗体的投料比例、NBS加入量、NBS反应时间、反应温度、终止反应用蛋白加入量、产物稀释比例），建立优化的某特定抗体的常规NBS法标记具体操作程序。
（具体的，包含了NBS及抗体反应浓度、放射核素 I和抗体的投料比例、NBS加入量、NBS反应时间、反应温度、终止反应用蛋白加入量、产物稀释比例），建立优化的某特定抗体的常规NBS法标记具体操作程序。
[0025] 接着，采用快速置换缓冲液的适当方法，业界公知的这类方法包含了脱盐柱置换法、快速透析法等，用精氨酸缓冲液接触待标记的单克隆抗体，处理适当的时间，精氨酸缓冲液的精氨酸浓度为0.2-0.5mol/L，pH值3.0-5.0，精氨酸缓冲液和单克隆抗体接触时间为0.5-4小时；再采用快速置换缓冲液的适当方法将精氨酸缓冲液置换为常规NBS法标记缓冲液，通常为磷酸盐缓冲液；再采用已优化常规NBS法标记的具体操作程序进行标记，具131
体的步骤包含：加入适量NBS和高活度的放射核素 I混匀进行标记反应，在适当时间后加入其它高浓度蛋白终止反应，脱盐柱纯化，获得标记产物。
体的步骤包含：加入适量NBS和高活度的放射核素 I混匀进行标记反应，在适当时间后加入其它高浓度蛋白终止反应，脱盐柱纯化，获得标记产物。
[0026] 本发明涉及的制备高放射比度、高放射化学纯度、较高的免疫结合活性的放射核131
素 I-单克隆抗体标记物的方法在制备用于诊断和/或治疗肿瘤的放射标记药物中的用途很容易通过适当优化标记反应所用的脱盐柱等器具和简单放大反应的规模来实现。 [0027] 下面将结合具体实施例演示如何实现本发明所述的方法和用途。
素 I-单克隆抗体标记物的方法在制备用于诊断和/或治疗肿瘤的放射标记药物中的用途很容易通过适当优化标记反应所用的脱盐柱等器具和简单放大反应的规模来实现。 [0027] 下面将结合具体实施例演示如何实现本发明所述的方法和用途。
[0028] 定义
[0029] 如本文所用，术语“单克隆抗体”是指得自一群基本同源的抗体的抗体，即包含除了可能以很小量存在的天然发生的突变之外是相同的各个抗体。单克隆抗体是针对单一靶位点的高度特异性的抗体。另外，与常规的（多克隆）抗体制备物（其典型包括针对不同决定簇（表位）的不同抗体）相反，每个单克隆抗体均针对靶上的一个单一决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的优势是可以通过杂交瘤培养、重组的哺乳动物细胞生产而获得，不被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示抗体得自基本上同质的抗体群的这一特征，而不是指需要通过任何特殊方法产生该抗体。例如，本发明使用的单克隆抗体可以通过使用熟知的技术分离自噬菌体抗体文库。根据本发明使用的亲代单克隆抗体可以通过由Kohler和Milstein,Nature256,495(1975)首先描述的杂交瘤方法产生，或者可以通过重组方法产生。单克隆抗体的等电点通常的pH6-9之间，偏碱性的单克隆抗体通常是指等电点在pH8-9的单克隆抗体。
[0030] 如本文所用，针对抗体与其结合配偶体例如抗原之间的相互作用而提及的术语“免疫结合活性”，免疫结合是指所述相互作用依赖于结 合配偶体上特定结构的存在，例如抗原决定簇或表位的存在。换句话说，甚至当所述结合配偶体存在于其它分子或生物体的混合物中时，所述抗体也优先结合或识别所述结合配偶体。所述结合可以由共价或非共价相互作用或者这两种作用介导。而术语“免疫结合活性”是指免疫特异性结合抗原或其片段及非免疫特异性结合其它抗原的抗体分子的数量比例，可根据例如放射性免疫分析（RIA）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、细胞结合试验或者本领域已知的其它测定法确定。 [0031] 术语“诊断和/或治疗肿瘤的产品”是指用以体内显像肿瘤和/或治愈肿瘤或阻止或者至少延迟肿瘤进展的放射核素标记的抗体；适当时诊断和/或治疗肿瘤的产品还可以包括药学可接受的载体，其中药学可接受的载体包括但不限于稀释剂、缓冲液、赋形剂、防腐剂、抑菌剂、抗氧化剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、稳定剂中的一种或几种，这样的载体是本领域技术人已熟知的，并且可由本领域技术人员根据放射核素标记抗体的性质和给药途经进行适应性调整。并且这种标记抗体可以满足一般放射性药物的质量要求，例如放射化学纯度、放射性浓度、无菌试验、内毒素试验、免疫反应性符合一定的标准，可以作为人用药物使用。需要诊断治疗的对象包括已经患有癌症以及需要防止癌症的对象。从癌症部分或全部痊愈的对象也需要诊断治疗。预防包括抑制或减慢癌症进展或者抑制或降低与癌症相关的一种或多种症状的发生、发展或进展。
[0032] 在本说明书中，术语“包含”是指包含所述的要素、整数或步骤，或者要素、整数或步骤组，但不排除任何其它要素、整数或步骤，或者其它要素、整数或步骤组。 [0033] 除非另有指明，在本说明书上下文中，术语“标记抗体”、“标记物”、“单克隆抗体标记物”或“标记产物”是可互换的，均涉及标记有放射性核素的单克隆抗体。 [0034] 本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限定。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。
[0035] 实施例
[0036] 实施例1采用常规NBS法规模化制备3种单克隆抗体的放射核素131I-单克隆抗体标记物及标记产物免疫结合活性的测定
[0037] 采用常规NBS法规模化制备放射核素131I-单克隆抗体标记物，经过优化，具体的操作步骤为：
[0038] 1.标记前在无菌操作条件下：将0.4ml的0.1M pH7.4的磷酸缓冲溶液加到5mg（1ml）的单抗中，混匀；用0.1M pH7.4的磷酸缓冲溶液1.0ml溶解2.0mg的NBS；用25ml的0.01M pH7.2的磷酸盐缓冲溶液平衡PD-10脱盐纯化柱（GE公司）；将平衡后PD-10纯化柱加入0.1ml的20%的人血白蛋白预饱和PD-10纯化柱。
[0039] 2.标记中在无菌操作条件下：取约3.7GBq的Na131I溶液（体积不超过1.0ml，质量符合医用标准）加入到步骤1处理好的单抗缓冲溶液中；抽取溶解好的NBS30μl加入到上述的Na131I-单抗缓冲溶液中，轻轻振摇混匀60s，然后立即加入0.15ml20%的人血白蛋白（HSA），混匀，标记反应完成。
[0040] 3.标记后在无菌操作条件下：将标记产物加入纯化柱（总体积约2.5ml）；待标记产物完全进入柱面后，以0.01M pH7.2的磷酸盐缓冲溶液为淋洗液，收集前3ml洗脱液；0.22μm无菌一次性针头式过滤器使用前用0.5ml的HSA饱和，再用0.22μm无菌一次性针头式过滤器将3ml洗脱液一并过滤至无菌小瓶中；再用1ml的0.01M pH7.2的磷酸盐缓冲溶液过滤冲洗所用过后的一次性针头式过滤器，洗液注入装有过滤后标记产物的小瓶中合并，混匀，即成为标记产物成品。
[0041] 实施例2采用精氨酸缓冲液预处理方法结合常规NBS法规模化制备3种单克隆抗131
体的放射核素 I-单克隆抗体标记物及标记产物免疫结合活性的测定
体的放射核素 I-单克隆抗体标记物及标记产物免疫结合活性的测定
[0042] 采用常规NBS法规模化制备放射核素131I-单克隆抗体标记物，经过优化，具体的操作步骤为：
[0043] 1.标记前在无菌操作条件下：采用25ml的含0.4M精氨酸50mMNaCl pH3.8的缓冲液预平衡PD-10脱盐纯化柱（GE公司），将约38.6mg/ml的抗体溶液2.5ml加入PD-10脱盐纯化柱，待抗体溶液完全 进入柱面后，以含0.4M精氨酸50mM NaCl pH3.8的缓冲液为洗脱液，收集前3ml洗脱液；4摄氏度下放置2-4小时；采用25ml的含0.4M精氨酸50mM NaCl pH3.8的缓冲液预平衡PD-10脱盐纯化柱（GE公司），将上述预处理后的抗体溶液2.5ml加入PD-10脱盐纯化柱，待抗体溶液完全进入柱面后，以0.01M pH7.4的磷酸缓冲溶液为洗脱液，收集前3ml洗脱液用于以后的标记反应。
[0044] 2.标记前在无菌操作条件下：用0.1M pH7.4的磷酸缓冲溶液1.0ml溶解2.0mg的NBS；用25ml的0.01M pH7.2的磷酸盐缓冲溶液平衡PD-10脱盐纯化柱（GE公司）；将平衡后PD-10纯化柱加入0.1ml的20%的人血白蛋白预饱和PD-10纯化柱。
[0045] 3.标记中在无菌操作条件下：取约3.7GBq的Na131I溶液（体积不超过1.0ml，质量符合医用标准）加入到步骤1处理好的单抗缓冲溶液中；抽取溶解好的NBS 30μl加入到上述的Na131I-单抗缓冲溶液中，轻轻振摇混匀60s，然后立即加入0.15ml20%的人血白蛋白（HSA），混匀，标记反应完成。
[0046] 4.标记后在无菌操作条件下：将标记产物加入纯化柱（总体积约2.5ml）；待标记产物完全进入柱面后，以0.01M pH7.2的磷酸盐缓冲溶液为淋洗液，收集前3ml洗脱液；0.22μm无菌一次性针头式过滤器使用前用0.5ml的HSA饱和，再用0.22μm无菌一次性针头式过滤器将3ml洗脱液一并过滤至无菌小瓶中；再用1ml的0.01M pH7.2的磷酸盐缓冲溶液过滤冲洗所用过后的一次性针头式过滤器，洗液注入装有过滤后标记产物的小瓶中合并，混匀，即成为标记产物成品。
[0047] 实施例3标记产物的免疫结合活性测定
[0048] 分别采用实施例1和实施例2中的制备方法，我们标记了3种均为重组真核哺乳动物细胞（具体为中国仓鼠卵巢细胞，CHO细胞）生产的抗肿瘤单克隆抗体，并采用表达相应抗原的细胞进行了标记产物的免疫结合活性测定，具体的测定方法步骤如下： [0049] PBS洗涤细胞2次，用1ml/瓶的2mM EDTA消化细胞，加入6ml的含血清的PBS，吹散成单个细胞状态。1000g离心5分钟收获细胞，弃沉淀，再用6ml的含血清的PBS洗涤细胞1次，用稀释液重悬至3520 万细胞/ml。采用稀释液倍比稀释出以下4个梯度：1760万细胞/ml、880万细胞/ml、440万细胞/ml、220万细胞/ml，每个梯度含2个平行管，每管含0.9ml的细胞悬液。另外取4管各加入0.9ml稀释液作为2个对照组。以上细胞悬液等均采用1.5ml进口微量离心管分装。在冰上预冷上述各管至4°C左右，再向各管中加入供试品标记抗体0.1ml（放射剂量为计数井测定的较精确的值，例如54000cpm，抗体的量大约控制在稀释后10-20ng/ml的终浓度），在4°C下颠倒混匀，孵育2小时。孵育后将对照组1的2管放置在一旁备用。用稀释液洗涤细胞4次，1000g离心5min收获细胞。收集每管的所有洗涤液分别混合，测定其cpm数。将洗涤后细胞用稀释液重悬至1ml，测定其cpm数。 [0050] 结果判断：计算每个梯度下特异结合的放射剂量/总放射剂量的值（Bs/Ta），以Bs/Ta的倒数Ta/Bs为纵坐标，以相应的细胞浓度（百万细胞/ml）的倒数为横坐标，制作曲
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线图，做直线拟合，外推至无穷大（X=0），求出此时的Y值，计算供试品碘 标记抗CEA单克隆抗体的免疫结合活性（免疫比活性）=（1/Y）×100%。
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线图，做直线拟合，外推至无穷大（X=0），求出此时的Y值，计算供试品碘 标记抗CEA单克隆抗体的免疫结合活性（免疫比活性）=（1/Y）×100%。
[0051] 采用上述方法分别测定实施例1和实施例2中制备的3种放射核素131I-单克隆抗体标记产物，免疫结合活性的具体结果如下：
[0052] 表1.三种标记产物的免疫结合活性（实施例1，常规NBS方法）
[0053]抗体标记产物 抗癌胚抗原抗体 抗HER2抗体 抗EGFR抗体
免疫结合活性 29.11% 27.31% 40.82%
免疫结合活性 29.11% 27.31% 40.82%
[0054] 测定3种放射核素131I-单克隆抗体标记产物的免疫结合活性具体Ta/Bs-的细胞浓度曲线图及外推公式见说明书图1。
[0055] 表2.三种标记产物的免疫结合活性（实施例2，本发明方法）
[0056]抗体标记产物 抗癌胚抗原抗体 抗HER2抗体 抗EGFR抗体
免疫结合活性 74.31% 74.34% 75.94%
免疫结合活性 74.31% 74.34% 75.94%
[0057] 测定3种放射核素131I-单克隆抗体标记产物的免疫结合活性具体Ta/Bs-的细胞浓度曲线图及外推公式见说明书图2。
[0058] 实施例4采用本发明方法制备的3种单克隆抗体的放射核素131I-单克隆抗体标记产物一般放射性药物质量指标的测定
[0059] 采用如下本领域公知的具体方法，我们测定了上面实施例2中所有标记产物的相关质量指标：
[0060] 表3.测定项目、方法和要求
[0061]
[0062] 表4.测定结果
[0063]
[0064] 上述结果显示，采用本发明的方法制备的3种单克隆抗体的放射核素131I-单克隆抗体标记产物一般放射性药物质量指标均符合一般放射性药物的临床应用要求。 [0065] 结果和讨论
[0066] 在本发明的实例中，给出了3种不同单克隆抗体标记产物的产业化规模制备工艺方法和质量检定结果，合乎一般放射性药物要求。
[0067] 在掌握了优化的上述制备方法的具体操作程序的基础上，业内人员可以采用上述方法，很容易根据适合于工业化操作的缓冲夜置换、标记、纯化等实际操作步骤方案，通过常规的放大生产工艺研究，从 而设计出标记规模适用于诊断和/或治疗肿瘤的放射标记药物生产的工艺，生产出质量符合放射性药物要求的特定的放射核素131I-单克隆抗体标记药物，该药物由于具有较好的免疫结合活性和合格的放射性药物质量指标，可进一步用于临床体内诊断和治疗。
[0068] 尽管在具体实施方式中，以NBS法为示例阐述了本发明方法的实施。但是并不限于NBS法，本领域技术人员可以理解，常规标记方法均可以得益于本发明，常规标记方法包括但不限于氯胺T法、乳过氧化物酶法、Iodogen碘化法、Bolton和Hunter试剂法、NBS法。 [0069] 本发明所提供的方法，尽管不限于具体的理论，可以解释为通过精氨酸缓冲液的预处理，可能促使待标记的抗体分子形成几乎完全分散的单分子溶液，从而保证在此后短暂的高抗体浓度的标记过程中，即便因为抗体分子本身的表面缺陷（某些采用真核哺乳动物细胞表达生产的偏碱性的单克隆抗体往往就有部分分子具有表面缺陷）和/或高活度放射核素标记引起的新的抗体分子的损伤，也不会因此造成大量标记抗体聚合物的出现。而抗体聚合物的出现将可能导致液相的抗体分子与大颗粒形状的肿瘤细胞结合的动力学特性的改变，从而导致标记产物表现出免疫结合活性大大下降的现象。
[0070] 上述这种精氨酸缓冲液预处理的步骤，结合常规标记方法，就可能针对那些采用常规标记法难以获得高免疫结合活性放射核素标记产物的单克隆抗体，尤其是偏碱性的单克隆抗体，仍然可以制备获得高放射比度、高放射化学纯度、较高的免疫结合活性的放射核131
素 I-单克隆抗体标记物。
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