麦冬中的两个新化合物、制备方法和药物用途
阅读：334发布：2023-01-19
专利汇可以提供麦冬中的两个新化合物、制备方法和药物用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及从麦冬中药的两个新化合物及其制备方法，是从麦冬的粗提取中经过反复萃取、柱层析、薄层层析的方法所得，化学名称分别为：化合物1为6β-羟基-3β,5-环-(25R)-螺甾-1β-亚 硫酸 ；化合物2为1α,11β-双羟基-杜松烷-5- 酮 基-11-O-α-L-呋喃糖基-(1→6)-β-D- 葡萄糖 。活性实验证明上述两个新化合物对人微血管内皮细胞管腔形成具有一定的促进作用，可用于制备 预防 和 治疗 偏头痛，心肌缺血等 疾病 的药物。，下面是麦冬中的两个新化合物、制备方法和药物用途专利的具体信息内容。
1.一种麦冬中具人微血管内皮细胞管腔形成促进作用的新化合物1，化学名称为
6β-羟基-3β,5-环-(25R)-螺甾-1β- 亚硫。
2.一种麦冬中具人微血管内皮细胞管腔形成促进作用的新化合物2，化学名称为
1α,11β-双羟基-杜松烷-5-酮基-11-O-α-L-呋喃糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖。
3.一种如权利要求1所述的麦冬中具人微血管内皮细胞管腔形成促进作用的新化合物1和新化合物2的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取麦冬须根，用溶剂提取，回收提取液，得到稠浸膏；
（2）将稠浸膏经过大孔树脂、正相和反相以及凝胶色谱层析分离，得到目标化合物。
4.根据如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：提取溶剂可以是水、乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、丙酮、石油醚、氯仿、乙酸乙酯等溶剂以及任意比例混合的醇水溶剂。
5.根据如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：用于色谱层析分离的材料可以是大孔树脂、硅胶、氧化铝、硅烷键合硅胶、含有氰基或氨基的硅烷键合硅胶。
6.如权利要求1所述的化合物1在制备预防和治疗偏头痛，心肌缺血等疾病的药物方面的用途。
7.如权利要求1所述的化合物1在制备预防和治疗偏头痛，心肌缺血等疾病的保健食品方面的用途。
8.如权利要求2所述的化合物2在制备预防和治疗偏头痛，心肌缺血等疾病的药物方面的用途。
9.如权利要求2所述的化合物2在制备预防和治疗偏头痛，心肌缺血等疾病的保健食品方面的用途。
麦冬中的两个新化合物、制备方法和药物用途
[0001]
技术领域
[0002] 本发明涉及中药化学及医药技术领域，具体涉及从麦冬 （Ophiopogon japonicus (Thund.) Ker-Gaw1）中得到的两个新化合物、制备方法和药物用途。
背景技术
[0003] 麦冬通过保护血管内皮细胞来完成养阴行血之功效。
[0004] 麦冬为临床滋养阴液的常用之品，是养阴生津的代表药物之一。麦冬，百合科植物麦冬Ophiogon japonicus (Thumb.)Ker-Gawl.的干燥块根。主要含多种糖甙：麦门冬皂苷B、D，23，24二羟基罗斯考皂，麦冬甙元-3-O-a-L-吡喃鼠李糖基（1-2）-β-D-吡喃葡萄糖甙，甲基麦冬黄烷酮A、B，麦冬黄烷酮A、B，6-醛基异麦冬黄烷酮A、B，麦冬甙元，丙三醇以及β-谷甾醇、豆甾醇。另含挥发油，从中分得长叶烯、a-广藿香烯、β-广藿香烯、香附子烯、愈创奥烯、a-律草烯、樟脑、芳樟醇等成分。麦冬始载于《神农本草经》，味甘、微苦，性微寒，归肺、胃、心经。具有养阴生津、润肺清心的功效。
[0005] 前期研究发现养阴代表中药“麦冬”的有效部位群、组分、成分，具有不同程度的保护血管内皮细胞的作用，其中正丁醇部位的药效作用更为显著，以标准品麦冬皂苷D为对照进行高效液相分析发现，其中含有麦冬皂苷D成分。
发明内容
[0006] 本发明涉及两个新化合物的结构及其在制备偏头痛症，心肌缺血以及其他心、脑血管相关疾病的药物中的运用，属于医药领域。
[0007] 本发明目的在于提供两个从麦冬中得到的新化合物。
[0008] 本发明的另一目的在于提供提取、分离本发明新化合物的方法。
[0009] 本发明的另一目的是上述新化合物在制备偏头痛症，心肌缺血等疾病的药物方面的用途。
[0010] 本发明的目的通过下列技术措施实现。
[0012] 新化合物1和2从麦冬中分离得到，其方法包括以下步骤：（1）取麦冬须根，用溶剂提取，回收提取液，得到稠浸膏。
[0013] （2）将稠浸膏经过大孔树脂、正相和反相以及凝胶色谱层析分离，得到目标化合物。
[0014] 提取溶剂可以是水、乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、丙酮、石油醚、氯仿、乙酸乙酯等溶剂以及任意比例混合的醇水溶剂，优选5%—100%的含水甲醇或乙醇。提取方法可以是煎煮、回流、冷浸、渗漉、微波提取或超声提取，优选是回流和超声提取。
[0015] 提取液浓缩后可通过极性或非极性大孔吸附树脂，用水洗去杂质，用含水低于95%的甲醇或乙醇进行洗脱，将含有目标化合物1和2的洗脱液进行浓缩，得到精制液。也可以用正相和反相硅胶，优选反相硅胶，用洗脱液洗脱，收集含有目标化合物1和2的浓缩，分别得到精制液。
[0016] 浓缩后的精制液分别可在硅胶、氧化铝等正相吸附材料中进行色谱分离，也可在硅烷键合硅胶、含有氰基或氨基的硅烷键合硅胶等反相材料中进行色谱分离，收集含有目标化合物的洗脱液，洗脱液重结晶或蒸干溶剂后分别得到新化合物1和2。
[0017] 发明人发现化合物1和2对人微血管内皮细胞管腔形成具有一定的促进作用。
附图说明
[0019] 实施例1. 新化合物1（6β-羟基-3β,5-环-(25R)-螺甾-1β- 亚硫酸）的制备。
[0020] 干燥麦冬须根粉末4kg，用95%的含水乙醇提取三次,每次10升,合并提取液,提取液过滤,滤液减压回收溶剂,得稠浸膏200g。 稠浸膏用D101柱层析进行分离,分别用水、20%和40%含水乙醇进行洗脱，40%含水乙醇洗脱液减压回收溶剂，得稠浸膏35g。该稠浸膏用正相硅胶柱层析分离、梯度洗脱，洗脱剂为氯仿-甲醇-水，根据薄层层析情况分成5个部分（fr.A-fr.E）。fr.B(2.6g)进行反复硅胶和凝胶柱层析分离得到化合物6β-羟基-3β,5-环-(25R)-螺甾-1β- 亚硫酸，经液相检测其纯度达到99%。
[0021] 实施例2. 新化合物1（6β-羟基-3β,5-环-(25R)-螺甾-1β- 亚硫酸）结构鉴定。
[0022] 该化合物为白色无定型粉末，Liebermann-Burchard反应呈阳性提示该化合物是甾体结构。
[0023] IR显示有羟基（3496 cm-1）, S-O基团（1210 cm-1），25（R）螺甾（985, 920, 900,855 cm-1 (intensity: 920<900)）。
[0024] 高分辨质谱给出分子式C27H42O7S, M-1：509.2579，根据分子式计算出该分子的不饱和度为7。
[0025] 1H NMR给出2个角甲基，2个甲基，3个连氧次甲基，1个连氧亚甲基，分别为（δ ppm）: 0.78 (3H, s), 1.62 (3H, s), 1.0 (3H, d, J = 6.8 Hz) ; 0.56 (3H, d, J =5.6 Hz), 5.12 (1H, d, J = 6.0), 3.37 (1H, m), 4.48 (1H, dd, J = 7.2, 14.8),3.39
13
(1H, m), 3.46 (1H, m) 提示该化合物含吲哚和苯乙稀基团。 C NMR谱给出27个碳，其中有4个甲基，1个连氧亚甲基，3个连氧次甲基，1个化学位移为δ 109.0的季碳，该碳可能是螺甾中的缩醛碳。上述波谱提示该化合物有25（R）的螺甾骨架，而且其碳谱和化合物sapognin 6β-methoxy-3β,5-cyclo-(25S)-spirostan-1β-ol(nolinogenin)的碳谱较类似（两个化合物的碳谱参见表1），进一步比对发现除25位碳的立体结构一个为R构型，一个为S构型外，A环和B环1位和6位的取代基不同，本化合物分别为亚硫酸基和甲氧
1 1
基。H-H COSY和HMBC谱能够证实上述推测（参见图2）。通过NOESY谱（参见图2）能够推断出1-亚硫酸基、3-氢、6-羟基的相对构型是β位，综上所述该分子结构推断为6β-羟基-3β,5–环-(25R)–螺甾-1β–亚硫酸。
13
(1H, m), 3.46 (1H, m) 提示该化合物含吲哚和苯乙稀基团。 C NMR谱给出27个碳，其中有4个甲基，1个连氧亚甲基，3个连氧次甲基，1个化学位移为δ 109.0的季碳，该碳可能是螺甾中的缩醛碳。上述波谱提示该化合物有25（R）的螺甾骨架，而且其碳谱和化合物sapognin 6β-methoxy-3β,5-cyclo-(25S)-spirostan-1β-ol(nolinogenin)的碳谱较类似（两个化合物的碳谱参见表1），进一步比对发现除25位碳的立体结构一个为R构型，一个为S构型外，A环和B环1位和6位的取代基不同，本化合物分别为亚硫酸基和甲氧
1 1
基。H-H COSY和HMBC谱能够证实上述推测（参见图2）。通过NOESY谱（参见图2）能够推断出1-亚硫酸基、3-氢、6-羟基的相对构型是β位，综上所述该分子结构推断为6β-羟基-3β,5–环-(25R)–螺甾-1β–亚硫酸。
[0026] 该化合物氢谱全归属为：1H-NMR (400 MHz, C5D5N):δ 5.12(1H, d, J=6.0, H-1), 2.37(1H, m, H-2β), 2.52(1H, d, J=14.8, H-2α), 0.98(1H, m, H-3),0.50(1H, dd, J=4.0, 7.6, H-4β) , 1.31(1H, d, J=4.0, H-4α), 3.37(1H, m, H-6),
1.09(1H, m, H-7β), 1.92(1H, m, H-7α), 1.42(1H, m, H-8), 0.72(1H, overlap, H-9), 1.53(1H, m, H-11β), 1.81(1H, m, H-11α), 0.98(1H, m, H-12β), 1.54(1H, m, H-12α), 1.09(1H, m, H-14), 1.50(1H, m, H-15β), 1.57(1H, m, H-15α),
4.48(1H, dd, J=7.2, 14.8, H-16), 1.74(1H, dd, J=6.4, 14.8, H-17), 0.78(3H, s, H-18), 1.62(3H, s, H-19), 1.81(1H, d, J=6.4, H-20), 1.0(3H, d, J=6.8, H-21),
2.0(2H, m, H-23), 1.42(2H, m, H-24), 2.38(1H, m, H-25), 3.39(1H, m, H-26β),
3.46(1H, m, H-26α), 0.56(3H, d, J=5.6, H-27)。
1.09(1H, m, H-7β), 1.92(1H, m, H-7α), 1.42(1H, m, H-8), 0.72(1H, overlap, H-9), 1.53(1H, m, H-11β), 1.81(1H, m, H-11α), 0.98(1H, m, H-12β), 1.54(1H, m, H-12α), 1.09(1H, m, H-14), 1.50(1H, m, H-15β), 1.57(1H, m, H-15α),
4.48(1H, dd, J=7.2, 14.8, H-16), 1.74(1H, dd, J=6.4, 14.8, H-17), 0.78(3H, s, H-18), 1.62(3H, s, H-19), 1.81(1H, d, J=6.4, H-20), 1.0(3H, d, J=6.8, H-21),
2.0(2H, m, H-23), 1.42(2H, m, H-24), 2.38(1H, m, H-25), 3.39(1H, m, H-26β),
3.46(1H, m, H-26α), 0.56(3H, d, J=5.6, H-27)。
[0027] 表1. 6β-羟基-3β,5–环-(25R)–螺甾-1β–亚硫酸，Nolinogenin的13C化学位移 (C5D5N,δ, ppm. 0-TMS).Catom Ophiogenin（1） Nolinogenin
1 84.5 77.6
2 38.3 36.4
3 21.1 21.2
4 17.3 17.5
5 49.3 49.3
6 72.8 82.9
7 34.3 35.7
8 30.4 30.7
9 49.7 49.8
10 39.7 36.3
11 23.3 23.4
12 40.3 40.5
13 40.8 41.0
14 56.4 56.6
15 32.0 32.2
16 80.9 81.3
17 62.9 63.0
18 16.6 16.8
19 15.0 15.1
20 42.4 42.5
21 14.9 14.9
22 109.0 109.8
23 32.0 26.4
24 29.0 26.2
25 29.9 27.6
26 66.7 65.1
27 17.1 16.3
6-OCH3 56.6
实施例3. 新化合物2（1α,11β-双羟基-杜松烷-5-酮基-11-O-α-L-呋喃糖
基-(1→6)-β-D-葡萄糖）的制备。
1 84.5 77.6
2 38.3 36.4
3 21.1 21.2
4 17.3 17.5
5 49.3 49.3
6 72.8 82.9
7 34.3 35.7
8 30.4 30.7
9 49.7 49.8
10 39.7 36.3
11 23.3 23.4
12 40.3 40.5
13 40.8 41.0
14 56.4 56.6
15 32.0 32.2
16 80.9 81.3
17 62.9 63.0
18 16.6 16.8
19 15.0 15.1
20 42.4 42.5
21 14.9 14.9
22 109.0 109.8
23 32.0 26.4
24 29.0 26.2
25 29.9 27.6
26 66.7 65.1
27 17.1 16.3
6-OCH3 56.6
实施例3. 新化合物2（1α,11β-双羟基-杜松烷-5-酮基-11-O-α-L-呋喃糖
基-(1→6)-β-D-葡萄糖）的制备。
[0028] 干燥麦冬须根粉末4kg用95%的含水乙醇提取三次,每次10升,合并提取液,提取液过滤,滤液减压回收溶剂,得稠浸膏200g, 稠浸膏用D101柱层析进行分离,分别用水、20%和40%含水乙醇进行洗脱，40%含水乙醇洗脱液减压回收溶剂，得稠浸膏35g。该稠浸膏用正相硅胶柱层析分离、梯度洗脱，洗脱剂为氯仿-甲醇-水，根据薄层层析情况分成5个部分（fr.A-fr.E）。fr.B(2.6g)进行反复硅胶和凝胶柱层析分离得到化合物
1α,11β-双羟基-杜松烷-5-酮基-11-O-α-L-呋喃糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖，经液相检测其纯度达到99%。
1α,11β-双羟基-杜松烷-5-酮基-11-O-α-L-呋喃糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖，经液相检测其纯度达到99%。
[0029] 实施例4. 新化合物2（1α,11β-双羟基-杜松烷-5-酮基-11-O-α-L-呋喃糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖）的结构鉴定。
[0030] 该化合物为白色无定型粉末。IR显示有羟基（3496 cm-1）,酮基团（1717 cm-1）。
[0031] 高分辨质谱给出分子式C26 H44 O12, [M+Na]+：571.2752，根据分子式计算出该分子的不饱和度为5。
[0032] 1H NMR给出2个单峰甲基，2个双峰甲基，2个异头氢，分别为（δ ppm）：1.43(3H, s)，1.31(3H, s), 1.15 (d, J = 7.2 Hz), 1.1(d, J = 6.0 Hz), 4.79 (1H, d, J = 7.213
Hz), 5.76 (1H, d, J = 1.6 Hz). C NMR谱给出26个碳,δ60-86 ppm之间有11个碳，δ 110.2 和97.8有2个连氧次甲基（异头碳），以上NMR谱暗示该化合物是倍半萜双糖苷。
它的苷元碳谱和化合物5-oxo-cadinaneol-1α,11β-diol (ketol)的类似，提示它的苷元结构和ketol结构一样，水解该化合物得到苷元，碳谱和ketol的碳谱几乎一致（三者碳谱参见表2），证实了该推测。该化合物的C-11(δ 81.3)和ketol的C-11(δ 71.4)比较，化学位移向低场移动Δδ9.9，提示糖链接在11位上，HMBC谱（参见图3）显示异头氢(δ
4.79)和C-11(δ 81.3)有关联，证实了该推测。
Hz), 5.76 (1H, d, J = 1.6 Hz). C NMR谱给出26个碳,δ60-86 ppm之间有11个碳，δ 110.2 和97.8有2个连氧次甲基（异头碳），以上NMR谱暗示该化合物是倍半萜双糖苷。
它的苷元碳谱和化合物5-oxo-cadinaneol-1α,11β-diol (ketol)的类似，提示它的苷元结构和ketol结构一样，水解该化合物得到苷元，碳谱和ketol的碳谱几乎一致（三者碳谱参见表2），证实了该推测。该化合物的C-11(δ 81.3)和ketol的C-11(δ 71.4)比较，化学位移向低场移动Δδ9.9，提示糖链接在11位上，HMBC谱（参见图3）显示异头氢(δ
4.79)和C-11(δ 81.3)有关联，证实了该推测。
[0033] 水 解 该 化 合 物 得 到 双 糖 混 合 物，和 标 准 糖D-glucopyranose 和L-Arabinofuranose乙酰化后进行气相比对，显示保留时间一致。综合考虑O-glycosylation效应，以及和α-L-arabinofuranosyl和β-D-glycopyranosyl的碳谱比对，显示该糖链是由α-L-arabin ofuranosyl和6位取代的β-D-glycopyranosyl连接而成。双糖的连接顺序由HMBC谱确定：α-L-arabinofuranosyl的异头氢H-1' ' (δ 5.76)和α-L-arabinofuranosyl的6位碳C-6' (δ68.2)有关联，α-L-arabinofuranosyl的异头碳C-1' ' (δ110.2)和α-L-arabinofuranosyl的6位氢H-6' (δ4.16)也有关联，所以确定该化合物的结构是1α,11β-双羟基-杜松烷-5-酮基-11-O-α-L-呋喃糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖。
[0034] NOESY谱显示（参见图3）：4，10-甲基的相对构型是β位，C-1羟基的相对构型由pyridine-d5诱导试剂效应推断：以CDCl3为溶剂，该苷元的7α-H和 9α- H化学位移分别为[δ 2.27(1H, ddd, J = 2.8, 5.2, 10.0, H-7)] 和 [δ 1.24 (1H, ddd, J = 1.0,10.0, 12.4, H-9α)]，如果以C5D5N为溶剂，则它们去屏蔽移至δ 2.93 (ddd, J = 3.2,
12.0, 14.0) 和1.75 ( J = 4.0, 12.0, 16.4)，所以1-羟基是α位。所以该化合物为
1α,11β-双羟基-杜松烷-5-酮基-11-O-α-L-呋喃糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖。
12.0, 14.0) 和1.75 ( J = 4.0, 12.0, 16.4)，所以1-羟基是α位。所以该化合物为
1α,11β-双羟基-杜松烷-5-酮基-11-O-α-L-呋喃糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖。
[0035] 该化合物的氢谱全归属为：1H-NMR (400 MHz, C5D5N): 2.41(1H, m, H-2β),1.49(1H, m, H-2α), 2.06(1H, t, J=3.6, H-3β), 1.78(1H, m, H-3α), 3.02(1H, dd, J=6.4, 12.4, H-4), 2.87(1H, s, H-6), 3.01(1H, m, H-7), 1.08(1H, m, H-8β),
1.41(1H, m, H-8α), 1.78(1H, m, H-9α), 1.45(1H, m, H-9β), 1.87(1H, dd, J=2.4,
6.4, H-10), 1.43(3H, s, H-12), 1.31(3H, s, H-13), 1.15(3H, d, J=7.2, H-14),
1.10(3H, d, J=6.0, H-15), 4.79(1H, J=7.2, H-1'), 3.75(1H, t, J=8.8, H-2'),
4.19(1H, m, H-3'), 4.05(1H, m, H-4'), 4.08(1H, br s, H-5'), 4.75(1H, br s, H-6'), 4.16(1H, br s, H-6'), 5.76(1H, d, J=1.6, H-1''), 4.92(1H, dd, J=1.2,
5.2, H-2''), 4.87(1H, m, H-3''), 4.79(1H, m, H-4''), 4.34 ((1H, br s, H-5'') ,
4.22(1H, m, H-5'')。
1.41(1H, m, H-8α), 1.78(1H, m, H-9α), 1.45(1H, m, H-9β), 1.87(1H, dd, J=2.4,
6.4, H-10), 1.43(3H, s, H-12), 1.31(3H, s, H-13), 1.15(3H, d, J=7.2, H-14),
1.10(3H, d, J=6.0, H-15), 4.79(1H, J=7.2, H-1'), 3.75(1H, t, J=8.8, H-2'),
4.19(1H, m, H-3'), 4.05(1H, m, H-4'), 4.08(1H, br s, H-5'), 4.75(1H, br s, H-6'), 4.16(1H, br s, H-6'), 5.76(1H, d, J=1.6, H-1''), 4.92(1H, dd, J=1.2,
5.2, H-2''), 4.87(1H, m, H-3''), 4.79(1H, m, H-4''), 4.34 ((1H, br s, H-5'') ,
4.22(1H, m, H-5'')。
[0036] 表 2. 1α,11β- 双 羟 基 - 杜 松 烷 -5- 酮 基 -11-O-α-L- 呋 喃 糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖(C5D5N,δ, ppm. 0 - TMS), ketol(Me2SO-d6 δ, ppm. 0-TMS)13
和 Ophiopogonol (CDCl3,δ, ppm. 0-TMS)的 C化学位移
实施例5. 化合物1化合物2对人微血管内皮细胞管腔形成的影响。
和 Ophiopogonol (CDCl3,δ, ppm. 0-TMS)的 C化学位移
实施例5. 化合物1化合物2对人微血管内皮细胞管腔形成的影响。
[0037] 1、材料与方法1.1 内皮细胞的培养：无菌条件下取胎龄为37～40wk的新生儿脐带(长约30～
50cm)，排尽残血，剪去钳夹部分，投入灭菌保存液(0. 14mol/L NaCI~ 4mmol/L KCl、
15mmol/L Hepse、llmmol/L葡萄糖、pH7.3)中，40℃保存。然后用D-Hanks液(pH 7.3～
7.4)反复灌洗脐静脉，直至将余血冲洗干净。向静脉内注入0.25%的胰蛋白酶5～l0ml，在37℃下孵育l0min。收集脐静脉腔内的消化液，此后迅速注入适量(5ml)含20%小牛血清的培养液以终止酶消化作用并收集入刻度离心管中。收集细胞的全过程应在两分钟内完成。室温下l000rpm，离心10分钟，倒尽上清液，吸取1ml培养液于离心管中，吹打成悬液，用0.4%台酚蓝染色少量细胞悬液。计数活细胞在95%以上，再加入20%RPMI-1640培养
7 -1
基，调整细胞浓度为5×10mL ，将此浓度的原代HUVEC移入细胞培养瓶中进行培养。置于
5%CO2培养箱内培养。第1个24h更换培养液的1/2，以后每隔24h换液1次。根据相差显微镜下细胞呈单层鹅卵石样排列、免疫细胞化学法染色细胞第Ⅷ因子相关抗原呈阳性，确定培养细胞为内皮细胞。
50cm)，排尽残血，剪去钳夹部分，投入灭菌保存液(0. 14mol/L NaCI~ 4mmol/L KCl、
15mmol/L Hepse、llmmol/L葡萄糖、pH7.3)中，40℃保存。然后用D-Hanks液(pH 7.3～
7.4)反复灌洗脐静脉，直至将余血冲洗干净。向静脉内注入0.25%的胰蛋白酶5～l0ml，在37℃下孵育l0min。收集脐静脉腔内的消化液，此后迅速注入适量(5ml)含20%小牛血清的培养液以终止酶消化作用并收集入刻度离心管中。收集细胞的全过程应在两分钟内完成。室温下l000rpm，离心10分钟，倒尽上清液，吸取1ml培养液于离心管中，吹打成悬液，用0.4%台酚蓝染色少量细胞悬液。计数活细胞在95%以上，再加入20%RPMI-1640培养
7 -1
基，调整细胞浓度为5×10mL ，将此浓度的原代HUVEC移入细胞培养瓶中进行培养。置于
5%CO2培养箱内培养。第1个24h更换培养液的1/2，以后每隔24h换液1次。根据相差显微镜下细胞呈单层鹅卵石样排列、免疫细胞化学法染色细胞第Ⅷ因子相关抗原呈阳性，确定培养细胞为内皮细胞。
[0038] 1.2 实验细胞的培养：用1 ug/mL 氢化考的松、5％胎牛血清(FBS)、50 ug/mL庆大霉素及50ng/mL两性霉素的F12培养液，每两天换液一次，VIII 因子相关抗原间接免疫荧光染色鉴定。初代内皮细胞生长汇合后用0.5％胰蛋白酶消化传代，取第4～6代细胞进行实验。
[0039] 1.3 化合物1和化合物2的配制：取化合物1和化合物2各10mg加入10mL蒸馏水加热搅拌制成10mL混悬液，1500r/m离心去除沉淀再用0.22um微孔滤膜滤过除菌，4℃保存备用。药液在50℃减压蒸干，重新定溶在细胞培养液中，在加入细胞培养液前亦用0.22um微孔滤膜滤过。
[0040] 1.4 内皮细胞增殖的检测：内皮细胞以3×104个／孔接种于24孔培养板，第一天用含5％FBS的F12培养液，24小时后换成分别加有目标化合物药液和含0.25％牛血清白蛋白(BSA)的F12培养液接着培养3天，然后用胰蛋白酶消化下来在血球计数板上计数，比较分析目标化合物与生理盐水对内皮细胞增殖的作用。目标化合物分高(100uL／孔)、低(10 uL／孔)两个剂量组, 生理盐水对照设一个剂量组(100 uL／孔)，每组8个样本，每孔为1样本。
[0041] 1.5 管腔结构形成的检测：内皮细胞以4× 105个／孔接种于24孔培养板，用含0.25％BSA的F12培养液培养60分钟后，分别加入目标化合物药液或生理盐水(分组同
1.4), 接着培养3小时，此时，吸除培养液，在细胞上加入第二层胶原，待形成凝胶后再加入含0.25% BSA及化合物1和2药液或生理盐水的F12培养液培养过夜，次日，倒置显微镜下随机选取10个高倍视野(×100)计数血管芽数，显微摄影记录结果。
1.4), 接着培养3小时，此时，吸除培养液，在细胞上加入第二层胶原，待形成凝胶后再加入含0.25% BSA及化合物1和2药液或生理盐水的F12培养液培养过夜，次日，倒置显微镜下随机选取10个高倍视野(×100)计数血管芽数，显微摄影记录结果。
[0042] 1.6 统计分析：上述检测结果用X±S表示，各组间差异比较用单因素方差分析中的多重比较q检验。
[0043] 2、结果2.1化合物1和化合物2促进体外微血管内皮细胞增殖(参见表3)：化合物1和2
促进培养的微血管内皮细胞增殖，表现出一定的浓度依赖性趋势，其高剂量组(100uL，即
100ug/mL)的细胞数多于其低剂量组(10 uL，即10ug/mL)。即化合物1和化合物2的高剂量组有促内皮细胞增殖作用。
促进培养的微血管内皮细胞增殖，表现出一定的浓度依赖性趋势，其高剂量组(100uL，即
100ug/mL)的细胞数多于其低剂量组(10 uL，即10ug/mL)。即化合物1和化合物2的高剂量组有促内皮细胞增殖作用。
[0044] 2.2 化合物1和化合物2促进体外微血管内皮细胞形成：化合物1和化合物2促进培养的微血管内皮细胞形成管腔结构，也表现出一定的浓度依赖性趋势。计数各处理组管腔结构数目，进行统计分析，结果见表3。结果提示化合物1和化合物2可能通过促进微血管内皮细胞增殖作用，从而促进新生血新生血管形成。
[0045] 表3. 化合物1~2促新生血管生成效果 ( ± s，n = 6)No. Concentration(ug.mL-1) TubeLength(um) Tubebranchingpoints(point)Blankcontrol 0 19.10±1.16 9.23±1.47
1 10 18.60±1.38 8.44±1.07
100 8.94±0.86 4.10±0.16
2 10 30.69±4.15 12.71±1.95
100 41.02±5.76 18.33±2.86
以上药理实验结果表明：上述来自中药麦冬得两个新化合物具有促进人微血管内皮细胞管腔形成活性。
1 10 18.60±1.38 8.44±1.07
100 8.94±0.86 4.10±0.16
2 10 30.69±4.15 12.71±1.95
100 41.02±5.76 18.33±2.86
以上药理实验结果表明：上述来自中药麦冬得两个新化合物具有促进人微血管内皮细胞管腔形成活性。
[0047] 从目前积累的研究资料来看，上述来自中药麦冬得两个新化合物已经初步具备和微血管功能障碍有关的偏头痛和心肌缺血等心脑血管疾病的候选药的基本条件，所以，上述来自中药麦冬的两个新化合物可以制备微血管功能障碍有关的偏头痛和心肌缺血等心脑血管疾病的候选药。
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