[0002]本发明涉及良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia)的治 疗和预防，应用于医学领域和相关领域，包括化学领域、医学化学领 域、和分子生物学领域。

[0003]良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia(BPH))，一种前 列腺上皮细胞异常生长并且阻塞尿流的疾病，折磨着美国超过1千万 的成年男性，和遍及世界上其它地区的另外的数百万成年男性。直到 相对近期，外科干预(surgical intervention)是该疾病的唯一治疗方法， 并且甚至在今天，手术是最后手段的治疗；当其它治疗不是有效的， 或者停止有效时，几乎不可避免地依赖于手术。前列腺手术和其恢复 是痛苦的，并且，手术本身可能不是有效的，并且构成了产生严重副 作用的风险。对于近期的综述，参见Barry，2001(完整的引用提供在 下文中)。

[0004]目前，仅两类药物是可以应用于BPH症状的治疗。一类药物包 括抑制睾酮的活性形式(双氢睾酮或者DHT)的产生的化合物。应用 此类中的药物能引起男性的性欲丧失、和肌肉块丧失、以及音调的丧 失，并且与高度前列腺癌(high grade prostate cancer)的发生率增加相 关。另外，这种疗法受限于首次给予该药物和患者的前列腺大小明显 降低之间的非常长的延迟(数月)。目前被用于BPH的第二类药物， 即α-肾上腺素能阻断剂，通过松弛平滑肌起作用，从而允许尿液更通 畅地通过尿道。虽然此类药物比第一类药物更加迅速地减轻症状，但 是它不减少前列腺的大小，或者防止前列腺变得更大，这能够导致最 终的外科干预。

[0005]因此，存在着对能够治疗BPH的基础疾病状态而没有严重的副 作用的药物的明显的、未满足的需求。本发明满足了这种需求。发明概述

[0006]本发明提供了方法和组合物，用于在人类对象中治疗BPH，通 过向该对象给予氯尼达明(lonidamine)或者一种氯尼达明的类似物实 施。也提供了对BPH治疗有用的药物组合物，包括缓释制剂(sustained release formulations)。在一种实施方案中，该制剂是经口被给予的，允 许该化合物的治疗有效剂量的每日一次服用方式。附图简述

[0007]图1显示了氯尼达明(I，R＝Cl)、托尼达明(tolnidamine)(I， R＝CH3)、AF-2364(II)和AF-2785(III)的结构。

[0008]图2显示了在常氧和缺氧的情况下，和氯尼达明存在以及不存 在时，LNCaP细胞中的HIF-1α的表达。图2A显示了采用细胞核提取 物进行的分析结果。图2B和2C显示了采用全细胞提取物的分析结果。 [0009]图3显示了在常氧和缺氧的情况下，和氯尼达明存在以及不存 在时，PC-3细胞中的HIF-1α的表达。图3A显示了应用细胞核提取物 的分析。图3B和3C显示了应用全细胞提取物的分析。[00010]图4显示了在LNCaP细胞(图4A)和PC-3细胞(图4B)中， 氯尼达明诱导的细胞凋亡(或编程性细胞死亡，apoptosis)。
[00011]图5显示了在前列腺上皮细胞中，氯尼达明诱导的细胞凋亡。
[00012]图6显示了在前列腺上皮细胞中(图6A)和前列腺基质细胞中 (图6B)，氯尼达明诱导的凋亡。
[00013]图7显示了0-600μM的氯尼达明对HIE-1α和其它蛋白质的表 达的影响，以得自在缺氧环境下培养的LNCaP细胞的全细胞提取物进 行测定。
[00014]图8显示了0-600μM的氯尼达明对HIF-1α和其它蛋白质的表 达的影响，以得自在缺氧环境下培养的LNCaP细胞的细胞核提取物进 行测定。
发明详述
1.定义
[00015]提供下面的定义，以帮助读者。如果没有其它限定，在此应用 的所有技术术语、符号和其他的科学或医学术语或专有名词，意图具 有化学和医学领域的技术人员所普遍理解的含义。在一些情形中，具 有被普遍理解的含义的术语，在此被定义，用于明晰和/或用于方便参 考，并且此处的这种定义所包含的内容，不应该一定被解释为，与此 领域中被普遍理解的该术语的定义相比，代表了一种实质上的不同。
[00016]如在此被应用，“治疗”一种状态或者一个患者(“treating”a condition or patient)是指，采取步骤以获得有益的或者希望的结果，包 括临床结果。对于本发明的目的，有益的或者希望的临床结果包括， 但不限于，BPH的一个或者多个症状的缓解或者改善，疾病程度的减 轻，疾病进程的延迟或者减慢，疾病状态的改善、缓和或者稳定，和 在下面描述的其它有益的结果。
[00017]如在此被应用，一个症状或者多个症状的“减轻”(“reduction” of a symptom or symptoms)(和此短语的语法上的同等成分)意味着， 该一个症状(多个症状)的严重程度或者发生频率的降低，或者该一 个症状(多个症状)的消除。
[00018]如在此被应用，向对象“给予”药物或者药物的“给予” (“administering”or“administration of”a drug to a subject)(和此 短语的语法上的同等成分)，既包括直接给予，包含自给予，又包括间 接给予，包含开药的行为。例如，如在此被应用，医生指示患者自给 予药物和/或提供给患者药物处方，是向该患者给予药物。
[00019]如在此被应用，BPH的“表现(manifestation)”是指患有BPH 的对象的症状、体征、解剖状态(例如，前列腺的大小)、生理状态(例 如，PSA水平)或者报告(例如，AUASI评分)特征。
[00020]如在此被应用，药物的“治疗有效量”(a“therapeutically effective amount”of a drug)是指药物的量，当以此向患有BPH的受试者给予 时，将具有意图的治疗效果，例如，在该受试者中，BPH的一个表现 或者多个表现的缓解、改善、减轻或者消除。通过一个剂量的给予， 全部的治疗效果不一定发生，全部的治疗效果可以在一系列剂量给予 之后仅发生。因此，治疗有效量可以经一次或者多次给药行为而被给 予。
[00021]如在此被应用，药物的“预防有效量”(a“prophylactically effective amount”of a drug)是指药物的量，当以此向受试者给予时， 将具有意图的预防效果，例如，防止或者延迟疾病或者症状的发生(或 者再发生)，或者减小疾病或者症状发生(或者再发生)的可能性。通 过一个剂量的给予，全部的预防效果不一定发生，全部的预防效果可 以仅发生在一系列剂量给予之后。因此，预防有效量可以经一次或者 多次给药被给予。
[00022]如在此被应用，“TID”和“QD”具有其通常的意义，分别为“每 日三次(three timese a day)”和“每日一次(once daily)”。
[00023]如在此被应用，“烷基(alkyl)”是指单价的、由烷(碳氢化合 物)衍生的基，含有从1至15个碳原子。它可以是直链的、支链的或 者是环状的，可以是未被取代的或者被取代基团取代的，取代基团包 括但不限于羟基、卤化物、烷氧基和腈。可以被应用的烷氧基基团包 括但不限于甲氧基。例证性的直链或者支链的烷基基团包括甲基、乙 基、丙基、异丙基、丁基和叔丁基(t-butyl)。
[00024]如在此被应用，“芳基(aryl)”是指含有一个或者多个的单环芳 香系统或者稠合环芳香系统的部分。这样的部分包括含有一个或者多 个的单环芳香系统或者双环稠合环芳香系统的任何部分，包括，但不 限于苯基和萘基。芳基基团可以是未被取代的，或者是用取代基团取 代的，正如被针对特定的取代芳基所列出的取代基团所取代。
[00025]如在此被应用，“杂芳基(heteroaryl)”是指具有5个或者6个 环原子的单环芳香基团，或者具有8个至10个原子的稠合环双环芳香 基团，在其中，环原子是C、O、S、SO、SO2或者N，并且环原子中 的至少一个是杂原子，即O、S、SO、SO2或者N。杂芳基基团可以是 未被取代的，或者对于特殊的取代的杂芳基，是被如所列出的取代基 团取代的。单环的芳香族杂芳基基团的例子包括但不限于吡啶基。双 环稠合环的杂芳基基团的例子包括但不限于吲哚基、吡咯并嘧啶基 (pyrrolopyrymidinyl)、中氮茚基、吡唑啉吡啶基、三吡咯啉吡啶基、吡 唑啉嘧啶基、三吡咯啉嘧啶基、吡咯并三嗪基、吡唑啉三嗪基、三吡 咯啉三嗪基、吡唑啉四嗪基、六氮杂茚基和七氮杂茚基。如无另外说 明，杂原子在环中的排列可以是任何排列，其被组成环原子的键合特 性所允许。
[00026]如在此被应用，术语“杂环烷基(heterocycloalkyl)”和“杂环基 (heterocyclyl)”是指单环环烷基基团或者稠合环多环环烷基基团，其中 的至少一部分不是芳香族的，并且在其中，在环状系统中，碳原子的 一个或者多个被选自O、S、SO、SO2或者N的杂原子所替代。杂环基 基团的例子包括但不限于，哌啶基、吗啉基、吡咯烷基、四氢呋喃基、 四氢咪唑并[4，5-c]吡啶基、咪唑啉基、哌嗪基、吡咯烷-2-酮基，和哌 啶-2-酮基。
[00027]如在此被应用，“环烷基(cycloalkyl)”是指单环基团或者稠合环 多环基团，其至少一部分不是芳香族的；并且在其中，环原子是碳。
[00028]如在此被应用“杂环烯基(heterocycloalkenyl)”是指单环基团或 者稠合环多环基团，其中碳环原子中的一个或者多个被杂原子替代， 环系统至少部分地不是芳香族的，并且环系统含有至少一个碳-碳双键。
2.良性前列腺增生和氯尼达明以及氯尼达明类似物的效果
[00029]本发明提供了在良性前列腺增生(BPH)的治疗中有用的组合 物和方法。具体地，本发明涉及氯尼达明(lonidamine(LND))的应用， 用于BPH的治疗或者预防。此外，本发明涉及氯尼达明类似物的应用， 用于BPH的治疗或者预防。为了有助于理解本发明，对BPH(也称为 良性前列腺增生)和氯尼达明及其生物活性类似物的性质的简短讨论， 被提供如下。
[00030]BPH涉及前列腺中的细胞的过度生长(增生)，导致前列腺的 增大，并且导致下尿道症状和疾病。前列腺含有分泌上皮细胞，位于 结缔组织和平滑肌的基质中(对于前列腺解剖的更详细描述，参见 Barry，2003)，并且BPH涉及上皮成分的增生。在正常的前列腺中， 分泌性的上皮成分是显著的，原因在于，与其它正常组织相比，该组 织中的锌的水平是非常高的。高的锌水平的一个后果是，通过涉及m- 顺乌头酸酶(线粒体-顺乌头酸酶，m-aconitase)的锌抑制机制，在分 泌上皮中，经由三羧酸循环(TCA)和氧化磷酸化的能量生成被明显 地降低，致使此组织与其它器官和组织相比，更多地依赖糖酵解作为 能量来源。TCA循环中的一个关键酶，m-顺乌头酸酶的锌抑制作用， 导致前列腺上皮细胞中的TCA循环的至少实质上的降低，或者一个近 乎完全的阻断。m-顺乌头酸酶的基于锌的抑制作用的另一个生理后果 是使柠檬酸偏离TCA循环，这使前列腺能够分泌大量的柠檬酸入精液 中，柠檬酸被精子作为能量来源而应用。参见，一般地，Costello，1999； Costello et al.，2000；Costello and Franklin，2000。 [00031]由于体内的其它正常细胞不积累达到抑制柠檬酸代谢的水平的 锌，前列腺上皮细胞是唯一地依赖于糖酵解(无氧代谢)的。本发明 部分地涉及发现这些细胞对药物氯尼达明的敏感性，这允许给予氯尼 达明，如在此所描述的，以便在人类中治疗或者预防BPH。氯尼达明 是1-(2，4-二氯苯基)-1H-吲哚-3-羧酸的通称，并且在医学文献中也已 经被称为1-[(2，4-二氯苯基)甲基]-1H-吲哚-3-羧酸，AF1890， diclondazolic acid(DICA)和DoridaminaTM。参见图1。氯尼达明首先被 确定为抗精子生成剂(antispermatogenic agent)，并随后在欧洲的几个 国家，被用于治疗乳腺癌、宫颈癌、肺癌和前列腺癌。参见Silvestrini， 1981；Gatto et al.，2002。氯尼达明在抗精子发生和癌症中的作用机制 可能没有被完全了解。然而，已经提议，氯尼达明的抗癌性质至少部 分是由于氯尼达明介导的线粒体膜的崩解导致线粒体结合的己糖激酶 活性降低，以及干扰通过糖酵解途径和氧化磷酸化途径进行的ATP产 生。参见，Floridi et al.，1981，Fanciulli et al.，1996，和本文中编号为 15-22的参考文献；和Gatto，2002。也参见Kaplan，2000。对于良性前 列腺增生中氯尼达明的效应，不意图受限于特殊机理，据信氯尼达明 抑制前列腺上皮细胞中的糖酵解和/或损害业已降低的线粒体功能，从 而，相对于体内的其它正常细胞，使这些细胞发生能量饥饿。不意图 受限于特殊机理，认为，由于能量的缺乏，足够的增生性上皮细胞被 破坏，或者要不然由于细胞大小被减少以致减少了前列腺的大小，从 而缓解了疾状和它的临床后果。
[00032]因此，向被诊断为BPH或者显示了BPH症状的人类患者给予 氯尼达明，提供了下述益处，如一个或者多个症状的严重程度或者发 生频率的减少，前列腺的大小或者增大速率的减少，可察觉的生活质 量的提高，和BPH的其它表现向更正常状态的转变。进一步地，向需 要预防BPH的人类受试者给予氯尼达明，提供了下述益处，如在受试 者中，BPH的出现、再出现或者进展的可能性的降低。更进一步地， 向人类受试者给予氯尼达明的类似物，对于BPH的治疗和预防，也是 相似地有效的。在另一种实施方案中，向人类受试者给予氯尼达明或 者其类似物，如在此描述的，在急性尿潴留的治疗中可以是有效的。 本发明的这些方面和其它方面，在下面更详细地被描述。下面的第3 节，描述了一些氯尼达明类似物，用于BPH的治疗和预防。第4节涉 及氯尼达明及其类似物的合成和形式。第5节描述了患者群，对该患 者群，氯尼达明和氯尼达明类似物的给予提供了益处。第6节描述了 氯尼达明给予的方法(例如，施用的剂量、途径、给药方案和持续时 间)。第7节描述了联合疗法，在其中，氯尼达明或者一种类似物的给 予是与另一种药物或者疗法联合应用的。第8节描述了示范性的剂量 形式。第9节提供了氯尼达明的应用和效果的实施例。仅仅是为了方 便的目的，以下的描述按小节进行组织；在任何一个编制的小节中， 所见的公开内容是适用于本发明的任何一个方面的。
3.氯尼达明类似物
[00033]如在上面所记载的，除了氯尼达明，与氯尼达明相关的各种各 样化合物，对于BPH的治疗和预防，是有用的。有用的化合物通常是 在结构上与氯尼达明相似的，或者是氯尼达明的生物等排物 (bioisosteres)，或者是氯尼达明的药效基团(pharmacophores)，如在 下面所描述的，并且具有与氯尼达明的生物活性相似的生物活性，也 如在下面所讨论的。这类化合物可以被称为“生物活性的氯尼达明类 似物(bioactive lonidamine analogs)”，“氯尼达明类似物(lonidamine analogs)”，或者，在一些情况下，简单地被称为“类似物(analogs)”。
[00034] 氯尼达明类似物的结构特性。部分地，基于氯尼达明和已知具 有与氯尼达明的药学活性相似的药学活性的相关化合物的结构，一定 的氯尼达明类似物，包括由本发明所提供的新颖类似物，适合应用在 BPH的治疗(treatment)或者预防(prophalaxis)中，是通过下式描述 的，

其中R1，R2，X，Y，n和 被定义如下：
[00035]R1代表-COOH，或者-COOH基团的衍生物或者生物等排物。 R1通常选自式-COOH的酸性基团；式-CONR3R4的酰胺，其中R3和 R4可以独立地是烷基或者氢，优选为氢；式-CONHNR6R7的酰肼，其 中R6和R7通常是-H或者-CH3；式-COOR5的取代酯，R5是一个在给 药后容易在受试者中被水解的残基，并且通常是直链或者支链的烷基 基团，被一个或者多个羟基基团取代，更经常地，是直链或者支链的 甲基、乙基、或者丙基基团，被一个或者多个羟基基团取代，进一步 更经常地，是乙基基团，被一个羟基基团取代，或者是直链或者支链 的丙基基团，被两个羟基基团取代，以及最经常地，是-CH2CH2OH、 -CH2CH(OH)CH2OH，或者-CH2(CH2OH)2。R1也可以是式-COO-的羧酸 盐阴离子，在此情况下，氯尼达明或者氯尼达明类似物将与抗衡离子 Z+结合，其中Z+是药学上可接受的阳离子。
[00036]R2代表被取代的或者未被取代的芳基基团或者杂芳基基团。通 常地，R2是取代的芳基基团，更经常地，是取代的苯基基团，进一步 更经常地，是被一个、两个或者三个取代基取代的苯基基团，所述取 代基独立地选自卤取代基和烷基取代基，特别地是-Cl、-Br、-I、CF3和 -CH3取代基。当R2是取代的苯基基团时，R2通常是-Cl、-Br、-I、CF3 或者-CH3，单基取代的苯基，在2、3、或者4位被取代；二氯、二溴、 二甲基、或者氯和甲基双基取代的苯基，在位2和3位，或者2位和4 位被取代；或者2，4，5三氯苯基。当R2是取代的苯基基团时，R2更经 常是2，4-二氯苯基或者4-氯-2-甲基苯基。
[00037]X代表直链或者支链，饱和的或者未饱和的烃连接基团。当X 是饱和的烃连接基团时，X通常是直链的连接基团，且通常地，X具 有式-(CH2)p-，p等于1、2或者3。当X是饱和的烃连接基团时，X最 经常地是亚甲基基团，-(CH2)-。当X是未饱和的烃连接基团时，X经 常是直链的连接基团，最经常地是-(CH＝CH)-。
[00038]Y代表式-CHR7-所示的部分，其中R7是氢或者直链的烷基基团 或者支链的烷基基团，更经常地，R7是氢或者直链的烷基基团，更进 一步经常地，R7是氢、甲基、乙基或者正丙基，更进一步经常地，R7 是氢或者甲基，和最经常地，R7是氢(即，Y最经常地是-CH2-)。
[00039]n是0，或者最经常地，是1。
[00040] 是核心环系统(core ring system)，通常可以是芳 基、杂芳基、环烷基或者杂环基环系统。Ar核心环系统通常含有2个 稠合的环。稠合的环通常可以是4-、5-、6-、7-，或者8-元环，更经常 是5-或者6-元环。核心环最经常地是稠合的5-元环和稠合的6-元环。 稠合的环原子通常可以是任何原子，经常是碳原子或者杂原子，更经 常地是碳和氮族原子，和更进一步经常地，是碳和氮。核心环系统中 的碳原子的数目通常是7。核心环系统通常含有2个杂原子，其中优选 的杂原子是氮。通常地，稠合环中的一个或者更多个可以是芳香族的。 当核心环系统是稠合的5元环和稠合的6元环时，核心环系统在两个 稠合环上通常均是芳香族的。稠合的5元环和稠合的6元环系统最通 常是吲哚。
[00041]更具体地，根据本发明的方法应用的氯尼达明类似物，和由本 发明提供的一些新颖的类似物，包括如下结构式所示的类似物：

其中R1，R2，X，Y，和n通常如上所述，或者，在一种优选的型式中，
R2是-Cl，-Br，-I或者-CH3，单基取代的苯基，在2、3、或 者4位被取代；二氯，二溴，二甲基，或者氯和甲基双基取代的苯基， 在2位和3位被取代，和在2位和4位被取代；或者2，4，5三氯苯基；
Y是-(CH2)-；和
n是0，和R1是-COOH，-CONH2，-CONHNH2，-CONHN(CH3)2， -CH2CH2OH，-CH2CH(OH)CH2OH，或者CH2(CH2OH)2；或者
n是1，R1是-COOH，和X是-CH＝CH-。
[00042]在一种实施方案中，氯尼达明类似物是1，3-取代的吲哚，如1- 卤代苯基-1H-吲哚。在另一种实施方案中，氯尼达明类似物是3-取代 的1-苯基-1H-吲哚。在另一种实施方案中，氯尼达明类似物是1-取代- 吲哚-3-羧酸，如1-卤代苯基-1H-吲哚-3-羧酸。
[00043] 生物等排物  另外，可以在本发明的治疗方法中应用的氯尼达 明类似物，包括在此描述的氯尼达明和类似物的生物等排物和药效基 团。生物电子等排原理是预测化合物的生物活性的有用工具，其基于 下列前提：具有相似大小、形状和电子密度的化合物能够具有相似的 生物活性。为了形成给定分子的生物等排物，人们用针对一个原子或 者基团的已知生物等排替换物，替换该一个或者多个的原子或者基团。 已知的生物等排替换物包括，例如，-F、-OH、-NH2、-Cl、和-CH3的 可互换性；-Br和-i-C3H7的可互换性；-I和-t-C4H9的可互换性；-O-、 -S-、-NH-、-CH2、和-Se-的可互换性；-N＝、-CH＝、和-P＝(在环状的 或者非环状的部分中)的可互换性；苯基和吡啶基基团的可互换性； -C＝C-和-S-的可互换性(例如，苯和噻吩)；芳香族的氮(R1-N(R3)-R2) 对不饱和的碳(R1-C(＝R3)-R2)的可互换性；和-CO-、-SO-、和-SO2-的可 互换性。这些例子不是限制生物等排等价物的范围，本领域的技术人 员将能够确定在此领域中已知的其它生物等排替换物。参见，例如， Patani and La Voie，1996；和Burger，1991。
[00044] 药效基团。除了此处描述的氯尼达明类似物，可以应用在本 发明的方法中的氯尼达明类似物，通常可以是上面描述的氯尼达明和 氯尼达明类似物的任意药效基团。经常地，可以进行一个已知分子的 结合能力的合理定量预测，是基于该分子中的少量原子或者功能基团 的空间排列而进行。此排列被称为一个药效基团，并且一旦分子中的 一个药效基团或者多个药效基团被鉴定，此信息可以用于鉴定含有相 同或者相似药效基团的其它分子。此方法对药物化学领域中的普通技 术人员来说是熟知的，并且，由于此申请中所描述的结构信息鉴别出 了有关BPH治疗的氯尼达明和氯尼达明类似物的药效基团，本领域的 技术人员可以鉴定其它含有药效基团的LND类似物，也因此用于治疗 BPH中。一个进行相关药效基团搜索的可以获得的程序的例子是3D 药效基团程序(3D Pharmacophore search)，来自the Chemical Computing Group(参见http：//www.chemcomp.com/fdept/prodinfo.htm)。
[00045]特别有价值的一种氯尼达明类似物是托尼达明(tolnidamine) (1-(4-氯-2-甲基苯基)-1H-吲哚-3-羧酸，AF1923)；参见Ansari et al.， 1998；Corsi et al.，1976。托尼达明(TND)与氯尼达明不同，在于在 苯基基团的2位上存在甲基取代基，而不是氯取代基。具有生物活性 的其它氯尼达明类似物，已经在下列出版物中被描述：美国专利 3,895,026号，题目是“Substituted 1-Benzyl-1H-Indazole-3-Carboxylic Acids and Derivatives Thereof；”Corsi et al.，1976， “1-Halobenzyl-1H-Indazole-3-Carboxylic Acids.A New Class of Antispermatogenic Agents，”Journal of Medicinal Chemistry 19：778-83； Silvestrini，1981，“Basic and Applied Research n the Study of Indazole Carboxylic Acids，”Chemotherapy 27：9-20；Lobl et al.，1981，“Effects of Lonidamine(AF 1890)and its analogues on follicle-stimulating hormone， luteinizing hormone，testosterone and rat androgen binding protein concentrations in the rat and rhesus monkey，”Chemotherapy 27：61-76；美 国专利6,001,865号，题目是“3-Substituted 1-Benzyl-1H-Indazole Derivatives As Antifertility Agents”；和Cheng et al.，2001，“Two new male contraceptives exert their effects by depleting germ cells prematurely from the testis，”Biol Reprod.65：449-61，其描述了AF-2364和AF-2785和 其它化合物(参见图1)。
[00046] 氯尼达明类似物的功能特性。适合于在本发明中应用的氯尼 达明类似物是这些物质，当向人类、非人类灵长动物、或者其它哺乳 动物给予时，干扰前列腺上皮细胞的细胞能量代谢。正如在药学技术 中的通常所见，不是一个化合物(例如，氯尼达明)的每一结构类似 物都具有药理学活性。通过常规筛选类似物是否具有母体化合物的活 性，可以鉴定活性形式。可以应用各种分析和实验，以评定氯尼达明 类似物的药理学活性，包括体外分析，如本文的下文和其它地方所描 述的那些体外分析，人类、非人类灵长动物和其它哺乳动物的前列腺 功能(包括柠檬酸产生和ATP产生)的体内分析，人类、非人类的灵 长动物和其它哺乳动物的前列腺大小的体内分析，和/或临床研究。
[00047] 细胞系中的细胞凋亡研究。如在实施例3中所显示，在源自 人类前列腺细胞的细胞系中，氯尼达明诱导了细胞凋亡。与PC3细胞 (ATCC NO.CLR-1435)相比，在LNCaP细胞(ATCC NO.CLR-1740) 中的凋亡诱导明显更多，这与产生柠檬酸的前列腺细胞对代谢抑制物 如氯尼达明的易感性(susceptibility)一致，其中PC3细胞是一种氧化 柠檬酸的前列腺衍生细胞系，LNCaP细胞是一种产生柠檬酸的前列腺 衍生细胞系。在本发明的一些实施方案中，其中一种氯尼达明类似物 被用于BPH或者其表现的治疗或者预防，一种具有相似的凋亡诱导活 性的类似物被选择出来。因此，在本发明的一些实施方案中，一种氯 尼达明的类似物被给予以治疗BPH，所述类似物在柠檬酸-产生的前列 腺细胞如LNCaP细胞中诱导细胞凋亡(提高caspase-3(半胱氨酸蛋白 酶-3)的活性)。在本发明的一些实施方案中，一种氯尼达明的类似物 被给予以治疗BPH，所述类似物在LNCaP细胞中诱导凋亡的程度，较 在PC3细胞中显著增大。在本发明的一些实施方案中，在LNCaP细胞 中由氯尼达明类似物诱导的凋亡，比在PC3细胞中的诱导凋亡，大至 少大约2倍(以及，有时是大至少大约3倍，大至少大约4倍，或者 大至少大约10倍)；在分析时，类似物的浓度是如此浓度，即在两种 细胞系中的凋亡水平的差异是最大的(只要在分析中应用的类似物的 浓度是不大于1mM)。
[00048] 原代细胞培养物中的细胞凋亡分析。如在实施例3中所示， 氯尼达明在人前列腺上皮细胞的原代培养物中诱导了细胞凋亡。在前 列腺上皮细胞的原代培养物中的凋亡诱导，较在人前列腺基质细胞的 原代培养物中的凋亡诱导显著的大，这与柠檬酸产生细胞对代谢抑制 物如氯尼达明的敏感性一致。在本发明的、应用一种氯尼达明类似物 经过给予用于BPH或者其表现的治疗或者预防的一些实施方案中，选 择出一种具有与氯尼达明相似的凋亡诱导活性的氯尼达明类似物。因 此，在本发明的一些实施方案中，给予一种在前列腺上皮细胞中诱导 凋亡的氯尼达明类似物，以治疗BPH。在本发明的一些实施方案中， 应用一种氯尼达明类似物，其在前列腺上皮细胞的原代培养物中诱导 凋亡的程度，与在人前列腺基质细胞的原代培养物中相比，达到了明 显更大的程度。在本发明的一些实施方案中，氯尼达明类似物在基质 细胞中不显著地诱导凋亡。在本发明的一些实施方案中，与在基质细 胞中相比，在上皮细胞中通过氯尼达明类似物的调亡诱导至少大2倍 (和，有时，至少是大4倍，有时至少是大10倍，以及，有时至少是 大20倍)；当在类似物该浓度下分析时，在两种细胞系中的凋亡水平 的差异是最大的(只要在该分析中应用的类似物的浓度是不大于1 mM)。
[00049] HIF-1α表达分析  如在实施例2中所示，在缺氧条件下培养的 细胞中，在浓度为200微摩尔时，氯尼达明使HIF-1α表达/积累(在 细胞核组分中测定)降低几乎2倍；并且，在更高的氯尼达明浓度下， 氯尼达明使HIF-α表达/积累降低多于5倍(即，大于10倍)。因此， 在本发明的一些实施方案中，与氯尼达明不存在时的培养相比，在缺 氧条件下培养的LNCaP细胞中，能量消散剂(energolytic agent)使HIF-1 α的表达(防止HIF-1α的积累)降低至少大约2倍，至少大约5倍， 或者至少大约10倍。
[00050]在对应于实施例2的附图中，氯尼达明对前列腺细胞中的HIF-1 α表达的影响，看起来在LNCaP细胞比在PC3细胞中更明显，其中细 胞是在缺氧条件下培养的(氧水平＜0.1％)。根据本发明的、对BPH 治疗有用的一些氯尼达明类似物，可能具有相似的效应。
[00051]这些实验的结果不是明确地建立通过氯尼达明抑制HIF-1α的 机制或者特异性。氯尼达明对HIF-1α水平的影响可以全部地，或者部 分地归因于蛋白质合成的普通抑制，由Floridi et al.，1985所描述的一 个氯尼达明活性。氯尼达明对HIF-1α水平的影响也可以全部地，或者 部分地归因于氯尼达明对线粒体的氧利用的影响。Hagen et al.2003， 报道HIF-1α是组成型合成的，但在氧存在下被降解。在缺氧情况下， 通过氯尼达明引起的线粒体呼吸作用抑制减少了线粒体的氧消耗，是 可能的。反过来，这可能应该导致氧依赖酶，脯氨酰水解酶的活性增 加，该酶在HIF-1α降解通路中起作用。
[00052] 己糖激酶活性  如上面所讨论，和不意图受限于具体的机制， 氯尼达明对前列腺的效应可能受到调节，至少部分地，由其对分泌型 上皮细胞中的线粒体和线粒体己糖激酶的作用而调节。因此，本发明 中有用的一些氯尼达明类似物具有己糖激酶抑制活性，与氯尼达明的 抑制活性同样强，或者较氯尼达明更强。对己糖激酶活性的分析在此 领域中是已知的。参见Fanciulli et al.，1996，和Floridi et al.，1981。
[00053] 抗精子生成的活性  同样地，据信，氯尼达明的抗精子生成活 性，至少部分地，是由于生殖细胞中的能量消散效应(energolytic effects)。在本发明中有用的一些氯尼达明类似物，具有抗精子发生的 活性，与氯尼达明的抗精子发生活性同样强，或者较氯尼达明强。对 抗精子发生活性的分析，在此领域中是已知的。参见Grima et al.， 2001；Lohiya et al.，1991。
[00054]除了体外分析，能量消散剂可以在体内被评价，用于本发明所 述方法中的用途。作为例子并且不受限制，合适的分析包括前列腺功 能和活性的测定。
[00055] 前列腺功能的体内测定  一种化合物对前列腺功能的影响，和， 具体地，对呼吸作用的影响，可以通过给予该化合物之后，监测前列 腺组织新陈代谢而予以评定。在本发明中有用的一些氯尼达明类似物 将会可检测地减少动物(包含人类，非人类的灵长动物，或者其它哺 乳动物)前列腺的ATP、柠檬酸、和/或乳酸的产生。采用磁共振光谱 学(magnetic response spectroscopy(MRS))或者其它方法，ATP、柠檬 酸、和/或乳酸水平可以在体内被直接监测和/或间接监测。对于可以用 于此目的的MRS分析，例如，参见，Narayan and Kurhanewicz，1992； Kurhanewicz et al.，1991；Thomas et al.，1990。
[00056] 前列腺大小的体内分析。应用标准方法(例如，用于人类的超 声照相法或者直肠指诊检查，和，用于动物的超声照相法和/或器官重 量比较)，在给予一种化合物后，可以评定该化合物对前列腺大小的影 响。分析可以在人类，或者，更经常地在健康的非人类动物或者在BPH 的猴子、狗、大鼠、或者其它动物模型中操作(参见Jeyaraj et al.，2000； Lee et al.，1998；Mariotti et al.，1982)。在此类分析和动物模型中，在本 发明中有用的一些氯尼达明类似物会可检测地减少前列腺大小。
[00057] 临床试验。临床试验，如在下文的实施例中所描述的关于氯尼 达明的临床实验，可以被用来评定氯尼达明类似物的治疗效果。
[00058]可以将前述任意分析中的一个有价值的氯尼达明类似物的活 性，与氯尼达明的活性进行比较，以提供适合该化合物的服药时间表 的指导，和其它信息。通常地，与氯尼达明相比，每毫克具有更强的 生物学活性的氯尼达明类似物是特别有价值的。
4.氯尼达明和氯尼达明类似物的合成和形式
[00059]可以通过熟知的合成方法，制备氯尼达明以及氯尼达明类似物 和衍生物。氯尼达明的合成在美国专利3,895,026号和德国专利 2,310,031号中被描述。代表性的氯尼达明类似物，包括托尼达明(TND)， 在此领域中被描述(参见，例如，Corsi et al.，1976，“1-Halobenzyl-1 H-Indazole-3-Carboxylic Acids.A New Class of Antispermatogenic Agents”，Journal of Medicinal Chemistry 19：778-83；Chenget al.，2001， “Two new male contraceptives exert their effects by depleting germ cells prematurely from the testis”Biol Reprod.65：449-61；Silvestrini，1981， “Basic and Applied Research in the Study of Indazole Carboxylic Acids” Chemotherapy 27：9-20；Lobl et al.，1981，““Effects of Lonidamine(AF 1890)and its analogues on follicle-stimulating hormone，luteinizing hormone，testosterone and rat androgen binding protein concentrations in the rat and rhesus monkey””Chemotherapy 27：61-76；U.S.Patent Nos. 3,895,026 and 6,001,865).)。当然，应该理解到，在本发明的实践中有 用的氯尼达明类似物不限于在本公开或者引用的参考文献中提供了具 体结构的类似物，并且上面描述的化合物是提供用以例证性地说明本 发明，而不是限制本发明。在本发明的方法中有用的氯尼达明类似物， 不限于那些现在在此描述的类似物，或者那些在药学和专利文献的其 它地方描述的类似物，这也是清楚的。普通的技术操作人员，在被本 公开内容指导后，可以应用医学化学的常规方法，合成适合于根据本 发明应用的新的类似物。
[00060]在一些实施方案中，以药学上可接受的盐的形式提供了氯尼达 明或者一种氯尼达明的类似物。药学上可接受的盐(pharmaceutically acceptable salts)包括，用酸加成盐，以及用碱加成的盐。用碱加成的 盐是，例如，碱金属盐或者碱土金属盐如钠盐、钾盐、钙盐或者镁盐， 或者铵盐如带有氨或者合适的有机胺的那些盐，诸如二乙胺、二-(2-羟 乙基)-胺、或者三-(2-羟乙基)-胺。用于形成酸加成盐的合适的酸，例如， 是无机酸，例如氢氯酸、氢溴酸、硫酸或磷酸，或者是有机酸，例如 有机磺酸，诸如苯磺酸、4-甲苯磺酸或者甲烷磺酸，和有机羧酸，诸如 乙酸、乳酸、棕榈酸、硬脂酸、苹果酸、马来酸、延胡索酸、酒石酸、 抗坏血酸或者柠檬酸。
[00061]给予氯尼达明和其类似物的酯、酰胺、和药物前体衍生物，也 是在本发明的实践中(对于从感兴趣的化合物中制备这种衍生物的一 般信息，参见美国专利6,146,658号)，如给予多晶型物形式、对映异 构体形式、互变异构体形式、溶剂化物、水合物，和类似物。
5.给予氯尼达明提供了益处的患者
[00062]本发明提供了向遭受BPH折磨的或者对BPH易感的雄性给予 氯尼达明，这种给予在治疗上是有效的。相应地，在本发明的一个方 面中，向需要BPH治疗的受试者给予氯尼达明或者一种氯尼达明类似 物。在一种实施方案中，需要治疗的受试者是一位人类男性，其不患 有癌症。如在此所应用，“需要治疗的受试者(a subject in need of treatment for BPH)”是一位诊断患有BPH的男人。BPH是应用本领域 中已知的方法和标准来诊断的。最普通的检验是直肠指诊检查，在该 检查中，医生确定前列腺是否为正常大小和硬度。其它的诊断分析包 括尿流速率测验，排尿后残留尿体积的测定(例如，通过腹部的颤动， 残余尿的引流，X-射线尿路造影术(X-ray urogramography)，或者超声 照相法)，American Urologic Association Symptom Index(AUASI；Barry et al.，1992)或者International Prostate Symptom Score(IPSS；Barry et al.， 2001)中的中度症状或者严重症状评分，和在此领域中已知的其它测试。
[00063]对BPH治疗的希望的临床结果，包括但不限于：BPH的一个或 者多个症状的缓解或者改善(参见下面)；前列腺大小的减少(参见下 面)；与开始治疗之前的基线测量值相比，AUASI或者IPSS评分发生 减少(例如，减少3分或者更多，诸如减少5分或者更多)，AUASI 或者IPSS评分小于8；血清PSA的减少，减少至少大约20％，如减少 至少大约40％，血清PSA小于4，如小于2；尿动力学参数的改善， 和其它的希望的结果，这些结果被治疗医生认可作为表示受试者的 BPH的严重程度降低的标志。对治疗反应的评价可以在首次给予该药 物后的任何时间进行。例如，在开始治疗后的大约30天、大约60天、 或者大约90天时，进行评价。替代地，可以在开始治疗后的大约6个 月、12个月、18个月、24个月或者更多月时进行评价。另外地，可以 在一段治疗结束后的少于大约30天、大约30天、大约60天、或者大 约90天时进行评价。
[00064]在一个相关的方面，向展现出BPH相关症状的人类受试者给予 氯尼达明或者一种氯尼达明类似物，以减少该症状的发生频率和严重 程度。如在此所应用，“BPH相关症状(a symptom associated with BPH)”是指下列症状中的任何一个或者多个：(1)尿急；(2)尿液的尿末 滴沥；(3)尿频；(4)夜尿；(5)减/慢尿流；(6)不充分排空感；(7)尿中断； (8)尿变形；(9)排尿困难；(10)血尿；(11)急性尿潴留；(12)尿路感染； (13)尿失禁。根据本发明的方法给予氯尼达明或者氯尼达明类似物，典 型地引起这些症状中的一个或者多个的严重程度的降低、或者消除； 通常地，或者引起所有这些症状的严重程度的降低，或者消除；并且 常常，引起所有这些症状的消除。
[00065]在另一个相关的方面，给予氯尼达明或者一种氯尼达明类似物， 以减小需要此种减少的人类受试者的前列腺的大小。如在此所应用， “需要降低前列腺的大小的受试者(a subject in need of reduction of prostate size)”是具有增大的前列腺的男性，增大的前列腺是以下列方 法确定的：(1)成像(例如，超声照相法，磁共振成像)或者(2)直接或 者间接由前列腺压迫尿道引起的一个或者多个体征或者症状(例如， 包括此处讨论的BPH症状)。血清PSA(前列腺特异性抗原(prostate specific antigen))的减少，也是前列腺体积减少的一个有用代表。尽管 在个体间不同，增大的前列腺在大小上经常超过30克、40克或者50 克。前列腺大小的减少程度，将从受试者到受试者而变化，由于一些 因素，包括在治疗起始时的增大程度，但是会典型地减少为至少大约 10％体积，更经常地减少至少大约25％体积，有时减少至少大约40％ 体积，有时减少至少大约50％体积，和有时观察到前列腺大小的甚至 超过50％的减少。这种减少可以通过成像或者其它方法被测定。在一 些情形中，血清PSA也可以作为前列腺体积的有用替代，予以应用。
[00066]在一个相关的方面，向血清PSA水平大于2ng/ml的受试者给 予氯尼达明或者一种氯尼达明类似物。PSA仅由前列腺的上皮细胞分 泌。对于患有BPH的男人，较高的PSA水平提示出，与具有较低PSA 水平的男人相比，在上皮细胞增殖与间质细胞增殖间存在一个相对较 高的比值。本发明提供了一些诊断方法，适合于应用于确定对氯尼达 明或者一种类似物的治疗积极地起响应的患者。因此，氯尼达明治疗 可以对PSA水平大于2ng/ml的受试者提供治疗益处。从而，可以从 患有BPH的男性人群中选出预期根据本发明的治疗显著受益的受试 者，是通过鉴定血清PSA值大于2ng/ml的受试者。在本发明的一种 实施方案中，受试者具有大于大约4ng/ml的PSA水平。由于较高的 PSA水平也与前列腺癌相关，并且也许更密切地与前列腺癌相关，而 不是与BPH相关。在一种实施方案中，被选择用于氯尼达明或者一种 类似物治疗的受试者，具有小于大约10ng/ml的PSA水平。
[00067]在本发明的一个方面，向会受益于BPH预防的受试者，给予氯 尼达明或者一种氯尼达明类似物。在一个例子中，“会受益于BPH预 防的受试者(a subject who would benefit from prophylaxis of BPH)”是 男性，以前经手术治疗、经尿道微波热疗、经尿道针消融术、经尿道 电气化术、激光治疗、气囊扩张术、前列腺尿道支架、药物治疗、或 者其它治疗而治疗BPH，并且目前未被诊断患有BPH或者表现BPH 症状。在另一种实施方案中，会受益于BPH预防的受试者是男性，由 于年龄关系而处于发生BPH的增加风险中(例如，大于40岁、大于 50岁、大于60岁、或者大于70岁的男性)。在另一种实施方案中，会 受益于BPH预防的受试者是男性，其无症状，或者具有十分轻微的症 状，以致于不可以明确地下BPH的诊断，但其具有升高的血清PSA水 平(例如，PSA＞2ng/ml，或者，在一些情况下，＞4ng/ml)。
[00068]因此，在一些情况下，根据本发明方法给予氯尼达明的受试者 是以前已经接受BPH治疗的男性，而在其它情况下，受试者是以前没 有接受BPH治疗的男性。类似地，应该清楚的是，在此节中谈及给予 氯尼达明的任何内容，相等地，适用于给予生物活性氯尼达明类似物。
[00069]在本发明的一种实施方案中，需要治疗或者预防BPH的受试 者，既不是也同时处于癌症治疗中，或者也不是患有癌症的。在一种 相关的实施方案中，需要治疗或者预防BPH的受试者不曾被诊断为患 有癌症。在一种实施方案中，需要治疗或者预防BPH的受试者不患有 癌症。在一种实施方案中，需要BPH治疗的受试者患有一种不是前列 腺癌的癌症，但是不患有前列腺癌。如此处所应用，“癌症(cancer)” 具有其普通的医学意义，并且指恶性肿瘤(包括头部癌症、颈部癌症、 前列腺癌和胸部癌，白血病和淋巴瘤)，通常以无性系形成能力 (clonality)、自主性(autonomy)、退行发育(anaplasia)、和转移 (metastasis)为特征(参见Mendelsohn，1991)。
[00070]在一种实施方案中，本发明提供了一种在患者中治疗BPH的方 法，通过向该患者给予氯尼达明实施。在一种相关的实施方案中，本 发明提供了一种治疗BPH的方法，包括(a)向诊断为BPH的患者给予 氯尼达明和(b)确定在所述的患者中，BPH的一个表现或者多个表现是 否被降低。在一种实施方案中，本发明提供了一种用于治疗BPH的方 法，通过(a)在一个患者中诊断出BPH，(b)向该患者给予氯尼达明，和 (c)确定在所述的患者中，BPH的一个表现或者多个表现是否被降低。 在一种实施方案中，本发明提供了一种在患者中治疗BPH的方法，通 过向该患者给予氯尼达明类似物实施。在一种相关的实施方案中，本 发明提供了一种治疗BPH的方法，包括(a)向诊断患有BPH的患者给 予氯尼达明类似物，和(b)确定在所述的患者中，BPH的一个表现或者 多个表现是否被降低。在一种实施方案中，本发明提供了一种治疗BPH 的方法，通过(a)在一个患者中诊断BPH，(b)向该患者给予氯尼达明 类似物，和(c)确定在所述的患者中，BPH的一个表现或者多个表现是 否被降低。在前述的实施方案中，任选地，受试者未被诊断为癌症， 或者处于癌症的治疗中；任选地，具有小于2ng/ml或者等于2ng/ml 的PSA，任选地具有大于2ng/ml和小于10ng/ml的PSA。
[00071]在另一方面，本发明提供了一种方法，需要(a)广告氯尼达明或 者一种氯尼达明类似物的用途，用于治疗BPH，和(b)向个体出售氯尼 达明或者一种氯尼达明类似物，以用于BPH的治疗用途。在一种实施 方案中，该广告提及了一个商标，这标志了一种氯尼达明产品，并且 在步骤(b)中出售的氯尼达明是由这一同样商标区分出来的。应该理解 到，氯尼达明被出售给的个体包括法人(公司)和类似个体，并且“向 个体出售氯尼达明用于BPH的治疗用途”包括向，例如，医疗机构出 售氯尼达明，以向患者销售用于治疗BPH。
[00072]在另一种实施方案中，本发明提供了在人类中治疗急性尿潴留 的方法，通过向该人给予氯尼达明或者一种氯尼达明的类似物而实施。 由于急性尿潴留可以是BPH的一个症状，本发明的此实施方案适用于 任何个体，所述的个体在首次给予氯尼达明或氯尼达明类似物时患有 急性尿潴留，但未曾被诊断为患有BPH。
6.给予的剂量、途径、时间表和持续时间
[00073]根据本发明，各种途径和剂量时间适合于氯尼达明和氯尼达明 类似物的给予。
[00074]一种向患者输送氯尼达明和氯尼达明类似物的优选方式，是经 口腔输送。经口给予的优选剂量形式，是丸剂、片剂、胶囊、囊片、 和类似物，特别是配制成用于缓释型。用于经口给予的其它适合形式 包括，含片剂(troches)、酏剂(elixirs)、悬浮液、糖浆、速释片(wafers)、 锭剂和类似物。也预期了其它的给予方式，包括肠道外给予、喷雾吸 入、经皮、直肠、前列腺内注射(例如，包含氯尼达明的微颗粒)和 其它路径。氯尼达明和氯尼达明类似物可以被制剂成合适的剂量单位 制剂，其含有常规的无毒的药学上可接受的载体、辅药和赋形剂，适 用于给予的每一路径。在一种实施方案中，剂量形式是在意大利以商 标名为Doridamina出售的150mg单位剂量形式。
[00075]氯尼达明和氯尼达明类似物给予的剂量、时间表和持续时间， 将取决于各种因素，包括受试者的年龄、体重和健康状况；BPH症状 的严重程度，如果有的话；还包括受试者的医疗史，联合治疗，治疗 目标(例如，治疗或者预防)，给予药物的方式，所应用的制剂，患者 对药物的反应，和类似因素。用于例证性地说明而不是限制，用于氯 尼达明和氯尼达明类似物给药的三种普通种类的剂量制度可以被描述 为：高剂量给药、低剂量给药、和中间剂量给药。在欧洲的少数几个 国家已经批准了氯尼达明用于治疗一些特殊类型的癌症，作为参考， 用于这些特殊类型的癌症治疗的标准氯尼达明剂量是150mg，每日三 次，口服，持续大约30天。
[00076] 低剂量给药。低剂量给药被预期用于BPH的治疗和预防。氯 尼达明或者一种氯尼达明类似物的示范性的低剂量包括，不是限制性 的，每天1-300mg范围内的剂量(每日总剂量)，更经常地在1-300mg/ 日的范围内，或者有时在5-70mg/日的范围内。其它代表性的低剂量 范围包括，1-25mg/日、20-45mg/日、40-65mg/日、40-70mg/日、50-100 mg/日、50-200mg/日，和50-300mg/日。在一种实施方案中，低剂量 是150mg，每日一次经口服用；Doridamina单位剂量形式可以被应用 于本实施方案中。在另一种实施方案中，低剂量是75mg，每日两次经 口被给予；通过将Doridamina单位剂量形式分成两个相等的部分，可 以被应用于本实施方案中。
[00077]如被记载的，在此推荐的每日剂量可以被分为，例如，每日2 次、3次、或者4次服用。在一种实施方案中，药物被制剂为用于每日 一次给予。在一种实施方案中，药物被制剂为以每日少于一次而施用。 在另一种实施方案中，应用该药物的一种改良的释放形式。
[00078]氯尼达明低剂量给予可以是每日一次，隔日一次，5日应用，2 日停用，和由给予的医生确定的其它时间表给予。
[00079]本发明的低剂量时间安排的一个优势是，此剂量可以被持续给 予数周至数月，同时限制或者消除了不必要的、虽然常常是轻微的、 被报道氯尼达明的较高剂量所致的副作用(主要是肌痛和睾丸疼痛)。
[00080]低剂量时间安排可以被用于治疗或者预防。在一种实施方案中， 低剂量形式被用于，在较高起始剂量、启动剂量或者加载剂量之后， 作为维持剂量。
[00081]高剂量给药。在另一种实施方案中，根据本发明方法，通过向 BPH患者给予较高剂量的氯尼达明或者一种氯尼达明的类似物(与低 剂量相比，常常持续较短时期)，来治疗BPH。代表性的高剂量包括， 不是限制性的，每日总剂量大于0.5g，如在0.5-5g/日、0.5-3g/日、0.5-1 g/日和1-3g/日范围内的剂量，或者更高的剂量。每日剂量可以被分为， 例如，每日2次、3次、或者4次给予。在一种实施方案中，药物被制 剂为用于每日一次给予，或者少于每日一次给予。在另一种实施方案 中，应用该药物的一种改良释放形式。作为另一选择，高剂量可以一 次性、每周一次、每两周一次、或者每月一次(例如，0.5-5g/给予) 的基础上被给予，或者以由给予医生所确定的其它时间表被给予。
[00082]高剂量时间安排可以被用于治疗或者预防。在一种实施方案中， 高剂量与用于BPH的手术治疗或者非药物治疗联合施用，或者在用于 BPH的手术治疗或者非药物治疗之后施用。
[00083] 中间剂量给药。在另一种实施方案中，根据本发明方法，通过 向BPH患者以中间剂量给予氯尼达明或者一种氯尼达明的类似物，治 疗BPH，所述的中间剂量处于高剂量和低剂量之间。代表性的中间剂 量的例子包括，没有限制，大于300mg/日并且小于500mg/日的剂量， 如在＞300-400或者400＜500(例如，450mg/日)的范围内的剂量。 每日剂量可以被分为，例如，每日2次、3次、或者4次给予。在一种 实施方案中，药物被制剂为用于每日一次给予，或者少于每日一次给 予。在一种实施方案中，该药物的改良释放形式被应用。作为另一选 择，此中间剂量可以在一次、每周一次、每两周一次、或者每月一次 (例如，300-500mg/给予)的基础上被给予，或者以由给予的医生确 定的其它时间表被给予。在一种实施方案中，每日剂量是，氯尼达明 或者一种氯尼达明的类似物150mg，每日服用三次。
[00084]中间剂量时间安排可以被用于治疗患或者预防。在一种实施方 案中，一种中间剂量与用于BPH的手术治疗或者非药物治疗联合给予， 或者在用于BPH的手术治疗或者非药物治疗之后给予。
[00085]应该认识到，这些剂量时间安排是用于例证性说明，而不是用 于限制，并且在治疗过程中剂量时间表可以改变，例如，根据患者对 治疗的反应或者一种具有与氯尼达明显著不同的活性/剂量曲线的氯尼 达明类似物的应用。
[00086] 持续时间。在治疗和预防应用中，氯尼达明或者氯尼达明类 似物可以被单一一次给予，或者可以在长达几个月或者几年的期间内 多次给予。在本发明的一种实施方案中，向有症状的(例如，正经历 排尿困难)BPH患者给予氯尼达明或者一种类似物，仅仅至症状减轻 或者消失，并且其后停止治疗，除非或者直到症状重新出现。当症状 重新出现时，氯尼达明或者氯尼达明类似物被重新开始给予。在另一 种实施方案中，治疗在症状消失之后继续，或者治疗减少至可接受的 目标水平，至少持续一段时间，如一周、两周、一个月或者几个月。 在另一种实施方案中，向有症状的受试者给予药物，以防止症状的发 展或者再发生(例如，预防性地给药)。
7.联合治疗(treatment combinations)
[00087]氯尼达明和氯尼达明类似物可以与其它药剂或者过程疗法 (procedures)联合，施用于BPH患者，所述的其它药剂或者方法试图 治疗BPH，改善BPH的症状，加强氯尼达明或者氯尼达明类似物的效 应，或者提供其它治疗的益处。“联合应用(in combination with)”药 剂(agent)的给予包括，平行给予(在一段时期内，向患者给予两种 药剂，如隔日中，给予氯尼达明和坦索罗辛(tamsulosin)，持续1个月)； 共同给予(其中，在大约相同时间给予药剂，例如，在彼此间的大约 几分钟至几小时之内)，和共制剂(其中，药剂被组合或者混合为单一 剂量形式，适于经口或者肠道外给予)。与氯尼达明或者氯尼达明类似 物联合给予的代表性药剂的例子，包括但不限于，锌、α-阻断剂、5- α-还原酶抑制剂、和植物提取物。用于与氯尼达明或者氯尼达明类似 物联合给予的其它药剂，包括其它代谢抑制物，包括但不限于其它己 糖激酶抑制剂和糖酵解的其它抑制剂，包括但不限于2-脱氧-D-葡萄糖 和HIF-1α的一种直接抑制剂或者间接抑制剂。
[00088] 锌：如上面所讨论，前列腺的分泌性上皮细胞中的高锌浓度抑 制m-顺乌头酸酶，这增加了该组织对用于能量生成的糖酵解的依赖性。 根据本发明的方法，在一些患者中，共同给予锌(例如，氯化锌、葡 萄糖酸锌、硫酸锌、醋酸锌、天门冬氨酸锌(zinc aspatate)、柠檬酸锌、 甘油酸锌、氧化锌、吡啶甲酸锌(zinc picolinate)、等等)和本发明的 一种药物组合物可能是有益的，以最大化治疗的效能。举例而言，并 且不作为限制，可以给予15-300mg/日的锌用于此目的，典型地，给 予30-50mg/日的锌。
[00089] α-肾上腺素能阻断剂。α-阻断剂缓解BPH的一些症状，不 治疗基础疾病。这些试剂通过松弛膀胱颈部的肌肉和前列腺中的肌肉， 减轻尿道的压力而起作用。代表性的α-阻断剂包括多沙唑嗪doxazosin (Cardura)、特拉唑嗪terazosin(Hytrin)、坦索罗辛tamsulosin(Flomax)、 阿夫唑嗪alfuzosin(Xatral)，和哌唑嗪prazosin(Hypovase)。在本发明的 一种实施方案中，将一种α-阻断剂与氯尼达明或者一种氯尼达明类似 物联合给予，以治疗BPH。在另一种实施方案中，与氯尼达明(或者 一种氯尼达明类似物)联合，将α-阻断剂以较“标准”剂量(不存在 氯尼达明给予时，被指出用于受试者的剂量)低的剂量(用量)或者更 低的频率(例如，隔天，而不是每天)被给予。
[00090] 5-α-还原酶抑制剂。5-α-还原酶抑制剂抑制睾酮向双氢睾酮 2的转变(DHT)，双氢睾酮2是一种有助于前列腺增大的雄激素。代 表性的5-α-还原酶抑制剂是非那利得finasteride(Proscar)。在本发明的 一种实施方案中，将5-α-还原酶抑制剂与氯尼达明联合给予，以治疗 BPH。在另一种实施方案中，将5-α-还原酶抑制剂以较“标准”剂量 (不存在氯尼达明给予时，被指出用于受试者的剂量)低的剂量(用 量)或者低的频率(例如，隔天，而不是每天)，与氯尼达明(或者一 种氯尼达明类似物)联合给予。
[00091] 糖酵解功能抑制剂和线粒体功能抑制剂。也可以将糖酵解的抑 制剂如2-脱氧-D-葡萄糖和抑制葡萄糖运输的化合物，线粒体功能抑制 剂，线粒体毒剂，和己糖激酶抑制剂如3-溴丙酮酸及它的类似物，与 氯尼达明或者一种氯尼达明类似物联合给予，以治疗BPH。这样的抑 制剂在此领域是已知的，并且包括那些下述文献描述的抑制剂：PCT 专利出版物WO 01/82926，公开于2001年11月8日；美国专利 6,670,330、6,218,435、5,824,665、5,652,273、和5,643,883号；美国 专利申请出版物20030072814、20020077300、和20020035071号；和 美国专利出版物序列号10/＿＿(2004年1月9日提交；律师案卷编号 (attorney docket number)54492-2000400)，题目是“Treatment Of Cancer With 2-Deoxyglucose.”。这些抑制剂可以和氯尼达明或者一种氯尼达明 类似物联合给予，以达到BPH治疗中的治疗益处。
[00092] 植物。锯齿矮棕榈(Saw Palmetto(锯棕榈(Serenoa repens))) 或者其提取物，或者非洲刺李(Pygeum Africanum)或者其提取物，可 以和氯尼达明或者氯尼达明类似物联合给予，以便追求BPH治疗中的 治疗益处。
[00093] 过程疗法(procedures)。此外，可以将氯尼达明或者一种氯 尼达明类似物和用于BPH治疗的过程疗法一起联合应用，或者在BPH 治疗的过程疗法之前给予，用于BPH治疗的过程疗法包括，手术(经 尿道前列腺切除术；经尿道前列腺切割术；或者开放式前列腺切除术)、 激光治疗、经尿道微波热疗、气囊扩张术、前列腺尿道支架放置、经 尿道针刺消融，前列腺的经尿道电汽化术，或者其它非药物治疗方法。
8.剂量形式(dosage forms)
[00094] 单位剂量形式。用于本发明方法的化合物被制剂为适合于治 疗性给予的组合物。在一种实施方案中，用单位剂量形式的氯尼达明 实践本发明的方法，单位剂量形式在意大利以Doridamina(由ACRAF 提供)销售。也提供了氯尼达明的新的剂量形式。例如，本发明提供 了一种氯尼达明的单位剂量药物制剂，其适合于经口给予(包括片剂、 胶囊、囊片、和药丸)，并包含，在各种实施方案中，一定量的氯尼达 明，在被1、5、10和50的下限(单位是mg)和10、20、40、50、 70和100的上限(其中，较高限的单位是mg，并且是大于下限的)所 限定的范围内，并且对于某些低剂量时间安排是特别方便的。在另一 种实施方案中，单位剂量形式包括一定量的药物，在被200、300、500 或者1000的下限(单位是mg)和500、1000、3000或者5000的上限 (其中，较高限是大于下限的)所限定的范围内，并且对于某些高剂 量时间安排是特别方便的。在又一种实施方案中，制剂含有在100mg 至200mg之间(例如150mg)的化合物，在200mg至5000mg之间， 在200mg至1000mg之间，或者在500mg至1000mg之间的化合物。 氯尼达明类似物可以被相似地配制成制剂。
[00095]除了氯尼达明和/或氯尼达明类似物，本发明的固体单位剂量形 式通常含有药学上可接受的载体。如在此所应用，“药学上可接受的载 体(pharmaceutically acceptable carrier)”是指固体或者液体填充剂、稀 释剂、或者封装物质，包括例如赋形剂、填充剂、粘合剂、和在药物 制备中常用的其它成分，包括但不限于，那些在下面描述的物质。用 于药物制剂的方法在此领域中通常是熟知的，并且此处的说明书是例 证性地说明，而不是限制性的。参见，例如，Ansel et al.，1999；Marshal， 1979。
[00096]适用于本发明制剂的亲水性粘合剂包括，乙烯基吡咯烷酮/醋酸 乙烯酯共聚物(copolyvidone(交联聚乙烯吡咯烷酮))，聚乙烯吡咯烷 酮、聚乙二醇、蔗糖、右旋糖、玉米糖浆、多糖(包括阿拉伯树胶(acacia)、 瓜耳胶(guar)、和藻酸盐)、明胶、和纤维素衍生物(包括羟丙基甲基 纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、和羧甲基纤维素钠)。
[00097]适用于本发明制剂中的水溶性稀释剂，包括糖(乳糖、蔗糖、 右旋糖)，多糖(葡萄糖结合剂(Dextrates)和麦芽糖糊精)，多元醇(甘露 醇、木糖醇、和山梨醇)，和环式糊精。适用于本发明制剂的非水溶性 稀释剂包括磷酸钙、硫酸钙、淀粉、改性淀粉、和微晶纤维素。
[00098]适用于本发明制剂的表面活性剂包括离子型表面活性剂和非离 子型表面活性剂，或者湿润剂如乙氧基化蓖麻油、聚乙二醇化甘油酯、 乙酰化单酸甘油酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、泊洛沙姆(聚氧乙烯聚氧 丙烯共聚物poloxamers)、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯衍 生物(derivefatives)、nonoglycerides或者其乙氧基化衍生物、十二烷 基硫酸钠、卵磷脂、酒精和磷脂。
[00099]适用于本发明制剂的崩解剂包括淀粉、粘土、纤维素、藻酸盐、 树胶、交联的聚合物(聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，羧甲基纤维素钠)、 羟基乙酸淀粉钠、低取代的羟丙基纤维素、和大豆聚糖。优选的崩解 剂包括改性纤维素树胶，如交联羧甲基纤维素钠。
[00100]适用于本发明制剂的润滑剂和助流剂包括云母、硬脂酸镁、硬 脂酸钙、硬脂酸、胶体二氧化硅、碳酸镁、氧化镁、硅酸钙、微晶纤 维素、淀粉、矿物油、蜡、山嵛酸甘油酯、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙 酸钠、氯化钠、十二烷基硫酸钠、硬脂基延胡索酸钠、和氢化植物油。 优选的润滑剂包括硬脂酸镁和云母和它们的组合。
[00101]片剂或者胶囊的总质量的优选范围，可以是从大约40mg至2g， 从大约100mg至1000mg，和从大约300mg至750mg(毫克)。
[00100] 缓释形式。此外，本发明提供了单位剂量形式，其为氯尼达 明或者一种氯尼达明类似物的缓释制剂，以允许每日一次(或者更少) 经口给药，这是一种有时经过多天给药而被患者优选的频率。本发明 的此缓释型制剂(包括片剂、胶囊、囊片和药丸)常常包含活性化合 物，在1mg至3g之间，对于各种各样的替换性实施方案，包括那些 上面描述的、用于常规的口服单位剂量的方案，例如药物的量被限制 在一个范围之中，被1、5、10和50的下限(单位是mg)和10、20、 40、50、70和100的上限(其中，较高限大于下限)所限定，并且对 于某些低剂量时间安排或者中等剂量时间安排是特别方便的。在另一 种实施方案中，单位剂量形式包括一定量的药物，在被200、300、500、 750或者1000的下限(单位是mg)和500、1000、2000、3000或者 5000的上限(其中，较高限大于下限)所限定的范围内，并且对于某 些高剂量时间安排是特别方便的。
[00101]在一种实施方案中，缓释型制剂(也称为“改良的”或者“受 控”释放形式)中的氯尼达明或者一种氯尼达明类似物，在给予后， 在大于6小时的期间被释放，例如，大于12小时。在一种实施方案中， 持续释放制剂允许每日一次给药，以获得与氯尼达明给药150mg、每 日三次获得的曲线在治疗上等价的药物动力学曲线。
[00102]用于可以根据此处的教导被改良以便在本发明中应用的其 它药物的缓释制剂的例子，在本领域中是熟知的，例如，描述在美国 专利5,968,551；5,266,331；4,970,075；5,549,912；5,478,577；5,472,712； 5,356,467；5,286,493；6,294,195；6,143,353；6,143,322；6,129,933； 6,103,261；6,077,533；5,958,459；和5,672,360号中。缓释制剂也在科 学文献，例如，在由A.Yacobi和E.Halperin-Walega编辑的ORAL SUSTAINED RELEASE FORMULATIONS：DESIGN AND EVALUATION，Pergamon Press，1988中被讨论，其描述了各种类型的 持续释放制剂形式和药物释放机制，例如单一单位(例如，基质片剂、 包衣片剂、胶囊)，多单位(例如，颗粒、珠、微胶囊)，惰性的基质， 不溶性的基质，亲水胶基质(例如，生物粘合剂，可蚀性，非可蚀性)， 和离子交换树脂缓释剂量形式。
[00103]在一种实施方案中，本发明提供了一种治疗BPH的方法， 通过向需要这种治疗的患者，每日一次给予一种缓释型片剂剂量，其 含有氯尼达明的每日治疗剂量，从大约1mg至2g，存在于亲水的基 质中。该基质可以，用于举例并且没有限制，选自羟丙基甲基纤维素 (大约20-40％的重量百分比)，乳糖(5-15％)，微晶纤维素(4-6％)， 和二氧化硅(1-5％)，二氧化硅具有的平均颗粒大小范围为从1-10微 米，常常范围为从2-5微米，和最经常范围为从大约2到3微米。
[00104]本发明的示例性的优选缓释制剂包括下表中的制剂A和B。
制剂                                  A        B
(重量百分比)
氯尼达明(粉碎的)                      53.8     53.8
HPMC(Methocel K15M，CR)               8        30
甲基纤维素(Methocel，K100L，CR)       18       0
Anydrous乳糖                          12.2     8.2
微晶纤维素(Avicel PH101)              5        5
二氧化硅(1-10微米，Syloid 244)        3        3
表的总计重量(以克表示)                1        1
[00105]本发明的缓释型制剂可以是压缩片剂的形式，其含有氯尼达 明和部分中和的pH依赖性粘合剂的紧密混合物，该粘合剂，在经过胃 (典型地～2)和小肠(典型地～5.5)的pH范围时，控制水相介质中 的药物溶解速度。
[00106]在药学领域中，许多已知为“肠溶”粘合剂和包衣剂的物质， 具有希望的pH溶解性质，适合于本发明的缓释制剂的用途。这包括邻 苯二甲酸衍生物，如乙烯基聚合物和共聚物的邻苯二甲酸衍生物、羟 烷基纤维素、烷基纤维素、醋酸纤维素、醋酸羟烷基纤维素、纤维素 醚、醋酸烷基纤维素，和其酯，和低级烷基丙烯酸和低级烷基丙烯酸 酯的聚合物和共聚物，和其部分酯。
[00107]优选的pH依赖性粘合剂物质是甲基丙烯酸共聚物。此共聚 物是商业上可得到的，从Rohm Pharma以粉末形式的EudragitTM L-100-55得到，或者以在水中的30％分散体的L30D-55得到。其它的 pH依赖性粘合剂物质，其可以单独应用或者联合应用，包括邻苯二甲 酸羟丙基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤 维素、邻苯二甲酸聚乙酸乙烯酯、邻苯二甲酸聚乙烯吡咯烷酮，和类 似物。一个或多个pH依赖性粘合剂在本发明的持续释放口服剂量形式 中出现，量的范围是从大约1至20重量百分数，或者从大约5至12 重量百分数，或者大约10％。
[00108]包含在本发明的缓释制剂中的pH依赖性粘合剂或者粘性增 强剂，包括如下物质，如羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤 维素、聚乙烯吡咯烷酮、中性的聚(甲基)丙烯酸酯，和类似物。pH 依赖性粘合剂的量的范围是从1至10重量百分数，或者从1至3重量 百分数，或者大约2％。
[00109]在一些实施方案中，本发明的缓释制剂也含有一种或者多种 药学赋形剂，与下列物质均一混合：雷诺嗪ranolazine(Lonidamine氯 尼达明)和pH依赖性粘合剂，如非pH依赖性粘合剂或者膜形成剂、淀 粉、明胶、糖、羧甲基纤维素和类似物，以及其它有用的药学稀释剂 如乳糖、甘露醇、干淀粉、微晶纤维素、和类似物，表面活性剂如聚 氧乙烯山梨聚糖酯、山梨聚糖酯、和类似物；和着色剂和矫味剂。也 存在润滑剂如云母和硬脂酸镁，以及压片辅助物。
[00110]本发明的持续释放制剂包括商业上可以得到的、适用于此制 剂用途的任意物质，包括但不限于，纤维素、乙基纤维素、甲基纤维 素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维 素、羟丙基纤维素、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、邻苯二甲酸醋酸 纤维素、邻苯二甲酸醋聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚环氧乙烷、 聚乙二醇、玉米蛋白、藻酸盐、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、甲基 丙烯酸共聚物、交聚维酮Crospovidone、硅的气凝胶、预胶化淀粉、玉 米淀粉、交联羧甲纤维素钠、甘醇酸酯淀粉钠、小烛树蜡、固体石蜡、 巴西棕榈蜡、乙二醇褐煤蜡、白蜡、Eudragit(聚甲基丙烯酸酯)、Aquacoat (乙基纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素)、Carbopol(丙烯酸polyalken聚 醚共聚物)，和Macrogol(聚乙二醇)。
[00111]本发明的缓释型制剂包括控制其扩散的制剂，如那些制剂， 其应用到：
(a)一种贮存系统，其中药物被封装入聚合物膜胶囊中，并且通 过水穿过膜的扩散以溶解该药物，而后药物扩散出装置之外；
(b)一种整体式(基质)系统，其中药物在聚合物基质中被悬浮， 并且通过长的路径扩散出去；
(c)微胶囊和包衣颗粒系统，其中小至1微米的药物颗粒(或者 药物和聚合物的颗粒)被包被在聚合物膜中，包括如下实施方案，其 中由具有不同释放性质的聚合物包被颗粒，这些颗粒在一个胶囊中被 共同输送；
(d)溶剂-活化系统，包括(i)渗透压控制装置(例如，OROS)， 其中渗透剂和药物被包入半透膜胶囊中，由于渗透梯度，水被拉入装 置中，并且增加的压力通过激光钻孔将药物逐出装置；(ii)一种水凝 胶膨胀系统，其中药物在聚合物中被分散，和/或聚合物被包被在药物 颗粒上，并且聚合物和水接触时膨胀(在一些实施方案中，膨胀是pH 控制的，或者是酶促控制的)，允许药物扩散出该装置；(iii)一种多微 孔的膜系统，其中药物被封装入膜中，膜具有一种成分，该成分与水 接触时溶解(在一些实施方案中，溶解是受pH控制的，或者是受酶控 制的)，这样在膜上留下孔，药物通过该孔扩散；和(iv)一种蜡基质 系统，其中药物和一种附加的可溶成分分散于蜡中，如此，当水溶解 该成分时，允许药物从该系统扩散出来；和
(e)聚合物降解系统，包括(i)大块降解，其中药物分散于聚合 基质中，并且降解以随机方式发生于聚合物结构中，使药物释放；和 (ii)表面侵蚀，其中药物分散于聚合基质中，并且随着聚合物表面的 侵蚀而被输送。
[00112]在一个方面，本发明提供了一种治疗BPH的方法，通过给 予一个单位剂量的口服药物组合物，其为缓释型制剂，含有有效量的 氯尼达明，如上所描述，每日一次。
9.实施例
                      实施例1
                      临床试验
[00113]实施氯尼达明给药的II期随机剂量比较研究，其中给予氯尼 达明是用于有症状的良性前列腺增生的治疗。患者是50至80岁的男 性，患有BPH，由超声照相确认，血清PSA＞2，并且没有前列腺癌的 迹象。给予氯尼达明(150mg，片剂；Doridamina制剂)150mg，日 三次，口服(中间剂量)；或者日一次口服(低剂量)8周。接受日三 次剂量的患者服用化合物5天，和停用2天，以帮助依从本方案。
[00114]通过超声照相、尿流、AUASI评分、PSA、不利事件和血 清化学，评价患者的基线、第30天、第60天的前列腺体积，以确定 是否两个剂量中的一个提供了比另一个剂量显著增加的益处，并且测 定由此治疗获得的前列腺大小的减少。
                       实施例2
       氯尼达明降低前列腺上皮细胞中HIF-1α的表达
[00115]本实施例显示了在源自人类前列腺癌转移灶的两种细胞系 中，氯尼达明治疗对HIF-1α表达的作用。LNCaP是柠檬酸产生细胞 (ATTC No.CRL-1740)，而PC3是柠檬酸氧化细胞(ATTC No. CRL-1435)。参见Franklin et al；1995。细胞可以从美国典型培养物保 藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)P.O.Box 1549， Manassas，VA 20108 USA获得。
[00116]如图2和图3所示，氯尼达明治疗降低HIF-1α蛋白的水平， 是在细胞核提取制备物(NE)和全细胞提取制备物(WCE)中被检测 到的。抑制是剂量依赖性的，并且在常氧(仅PC3细胞)和缺氧(LNCaP 细胞和PC3细胞)情况下被观察到。在测试条件下，氯尼达明效应对 HIF-1α亚单位是特异的，并且，除了在800μM浓度下，在测试条件 下，对肌动蛋白、caspase 3、NF-κB、或者IκBα的蛋白水平没有可 检测到的抑制作用。然而，氯尼达明已经被报道，总体地抑制蛋白质 合成(参见Floridi et al.，见上文)，并且此处呈现的结果不应该被解释 为确定证据，证明氯尼达明是HIF-1α的一种特异性抑制剂，或者氯尼 达明在BPH治疗中的治疗学效应全部地，或部分地归因于它对任何细 胞种类中的HIF-1α积累的抑制作用。
[00117] 方法  以5×105个细胞的密度，将细胞铺板于一个培养皿 中，并且然后，在37℃培养箱中(5％CO2)维持2天。分析之前，用 预热的(37℃)RPMI-1640培养液(ATCC No.30-2001；10mM HEPES； 1mM丙酮酸钠；2mM L-谷氨酰胺；4500mg葡萄糖/L；1500mg碳 酸氢钠/L)将细胞清洗2次。或者在常氧下或者在缺氧下(氧水平＜0.1％ (，于37℃，在氯尼达明不存在或者以不同浓度存在时，用2ml培养 液温育细胞4小时。在温育末期，将培养皿置于冰上，并且用冷的PBS 缓冲液(4℃)迅速洗涤细胞2次。对于细胞核提取物，用缓冲液A(10 mM Tris，pH7.5；1.5mM MgCl2；10mM KCl和蛋白酶抑制剂)和缓冲 液C(0.5M NaCl；20mM Tris pH7.5；1.5mM MgCl2；20％甘油和蛋白 酶抑制剂)顺序地裂解细胞。用于本实验的蛋白酶抑制剂是五种蛋白酶 抑制剂的混合物(500mM AEBSF-HCl，1mg/ml抑肽酶Aprotinin，1mM E-64，500mM EDTA和1mM亮抑肽酶Leupeptin；Calbiochem NO 539131)。对于全细胞裂解物，用150mM NaCl；10mM Tris pH7.5；10 mM EDTA；1％ TritonX-100；0.5％脱氧胆酸盐；和蛋白酶抑制剂，裂 解细胞。应用Bio-Rad蛋白分析，测定蛋白浓度。将等量的蛋白加样 在SDS-PAGE凝胶上。样品转移至PVDF膜之后，用含有5％脱脂奶粉 的TBST封闭膜，4℃过夜。随后，用第一抗体(HIF-1α，HIF-1β， 和肌动蛋白)和碱性磷酸酶偶联的第二抗体温育膜，每次温育2小时。 为检测caspase 3、NF-κB、P65和IκBα的表达，用含有5％脱脂奶 粉的TBST封闭膜，室温1小时，并且通过与相应的抗体4℃过夜温育， 并且和碱性磷酸酶偶联的第二抗温育1小时，检测蛋白质。应用比色 底物，检测特异蛋白质，并且应用NIH成像系统，定量每种蛋白质的 强度。
[00118]在通常如上进行的分别实验中，在源自缺氧条件下培养的细 胞中，在LNCaP全细胞提取物(图7)或者细胞核提取物(图8)中， 0-600μM氯尼达明对HIF-1α和其它蛋白表达的影响被予以测定。
                         实施例3
         氯尼达明在柠檬酸产生细胞中诱导细胞凋亡
[00119]为了确定在采用氯尼达明处理的细胞中是否发生细胞凋亡， 评价了氯尼达明对产生柠檬酸的细胞(LNCaP)和氧化柠檬酸的细胞 (PC3)的影响。如在图4中所示，氯尼达明在柠檬酸产生细胞(LNCaP) 中诱导的caspase3活化，达到比在柠檬酸氧化细胞(PC3)中更大的 程度。caspase3的活化是一个时间依赖性过程(图5)。
[00120]也检测了氯尼达明，在前列腺上皮细胞(其积累柠檬酸)的 原代培养物或者前列腺基质细胞(其不积累柠檬酸)的原代培养物中， 的效应。如在图6中所示，氯尼达明，仅在前列腺上皮细胞中、以剂 量依赖方式，诱导细胞凋亡。与此相反，在用氯尼达明处理后，在前 列腺基质细胞中没有观察到细胞凋亡的诱导。
方法
[00121]免疫印迹：如在实施例2中所描述，实施免疫印迹。为了检 测caspase3的表达，用含有5％脱脂奶粉的TBST封闭膜，室温1小时， 并且，通过与caspase3抗体4℃过夜温育并且和碱性磷酸酶偶联的第 二抗体温育1小时，检测caspase3蛋白。应用比色底物，检测特异的 蛋白质，并且应用NIH成像系统定量每种蛋白的强度。
[00122]原代细胞培养物：人前列腺上皮细胞(Cambrex No.CC-2555) 的原代培养物，和人前列腺基质细胞(Cambrex No.CC-2508)的原代培 养物，是从Cambrex Bio Science Rockland，Inc.(191 Thomaston Street， Rockland，Maine 04841)获得的。
[00123]细胞凋亡分析：以2×104个细胞/孔的密度，将细胞铺板于 96孔板中，然后，在37℃培养箱中(5％CO2)维持16小时。将氯尼 达明以不同的浓度加入每个孔，然后，在37℃温育6小时。为评价 caspase3的活性，在存在或者不存在caspase3抑制剂(Promega No G5961)下，将均质缓冲液和caspase3底物(Promega No G7791；Promega Corporation，2800 Woods Hollow Road，Madison WI USA 53711)加入到 每个孔中。用荧光板读数器，在激发光485nm和发射光530nm下， 测定被切割底物的荧光强度。
10.引用的参考文献
Ansari et al.，1998，“Long-term sequelae of tolnidamine on male reproduction and general body metabolism in rabbits”Contraception 57：271-79.
Ansel et al.，1999，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems 7th ed.Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia：pp.1-562.
Barry et al.，1992，“Symptom index for benign prostatic hyperplasia”J Urol. 148：1549-57.
Barry et al.，2001，“Measuring the symptoms and health impact of benign prostatic hyperplasia and its treatments”BENIGN PROSTATIC HYPERPLASIA(5TH INTERNATIONAL CONSULTATION ON BPH).Health Publication，Ltd.
Barry et al.，2003，“Benign Prostatic Hyperplasic”in SCIENTIFIC AMERICAN MEDICINE，Dale and Federman Eds.，WebMD Inc.
Burger，1991，“Isosterism and Bioisosterism in Drug Design”A Prog.Drug Res.37：287-371.
Cheng et al.，2001，“Two new male contraceptives exert their effects by depleting germ cells prematurely from the testis”Biol Reprod.65：449-61.
Corsi et al.，1976，″1-Halobenzyl-1H-Indazole-3-Carboxylic Acids.A New Class of Antispermatogenic Agents″，Joumal of Medicinal Chemistry 19：778-83.
Costello & Franklin，2000，“The intermediary metabolism of the prostate：a key to understanding the pathogenesis and progression of prostate malignancy” Oncology 59：269-82
Costello et al.，1999，“Citrate in the diagnosis of prostate cancer”Prostate 38：237-45.
Costello et al.，2000，“Zinc causes a shift toward citrate at equilbrium of the m- aconitase reaction of prostate mitochondria”J.Inorganic Biochemistry 78：161-65.
Fanciulli et al.，1996，“Effect of the antitumor drug lonidamine on glucose metabolism of adriamycin-sensitive and-resistant human breast cancer cells” Oncology Research 3：111-120
Floridi et al.，1981，“Effect of Ionidamine on the energy metabolism of Ehrlich ascites turnor cells”Cancer Res.41：4661-6.
Franklin et al；1995，“Regulation of citrate metabolism by androgen in the LNCaP human prostate carcinoma cell line.”Endocrine 3：603-607
Gatto et al.，2002，“Recent studies on lonidamine，the lead compound of the antispermatogenic indazol-carboxylic acids”Contraception 65：277-78.
Grima et al.，2001；2001，“Reversible inhibition of spermatogenesis in rats using a new male contraceptive，1-(2，4-dichlorobenzyl)-indazole-3-carbohydrazide” Biol Reprod.64：1500-8.
Heywood et al.，“Toxicological studies on 1-substituted-indazole-3-carboxylic acids.”1981，Chemotherapy 27：91-97.
Jeyaraj et al.，2000，“Effects of long-term administration of androgens and estrogen on rhesus monkey prostate：possible induction of benign prostatic hyperplasia”J Androl.21：833-41.
Kaplan，2000“Correspondence re：M.Fanciulli et al.，Energy metabolism of human LoVo colon carcinoma cells：correlation to drug resistance and influence of lonidamine.”Clin Cancer Res.6：4166-7.
Kurhanewicz et al.，1991，“31P Spectroscopy of the human prostate gland in vivo using a transrectal probe”Magnetic Resonance in Medicine 22：404-13.
Kurhanewicz et al.，2000，Radiol Clin North Am 38：115-38.
Lee et al.，1998，“Chronology and urodynamic characterization of micturition in neurohormonally induced experimental prostate growth in the rat”Neurourol Urodyn.17：55-69.
Lobl et al.，1981，“Effects of Lonidamine(AF 1890)and its analogues on follicle-stimulating hormone，luteinizing hormone，testosterone and rat androgen binding protein concentrations in the rat and rhesus monkey”Chemotherapy 27：61- 76.
Lohiya et al.，1991，“Antispermatogenic effects of tolnidamine in langur (Presbytis entellus)”Contraception 43：485-96.
Mariotti et al.，1982，“Collagen and cellular proliferation in spontaneous canine benign prostatic hypertrophy”J Urol.127：795-7.
Marshall，1979.“Solid Oral Dosage Forms，”MODERN PHARMACEUTICS，Vol.7， (Banker and Rhodes，editors)，pp.359-427.
Mendelsohn，1991，“Principles of Neoplasia”in HARRISON’S PRINCIPLESOF INTERNAL MEDICINE，Wilson ed.，McGraw-Hill，New York，p.1576.
Narayan and Kurhanewicz，1992，″Magnetic resonance spectroscopy in prostate disease：diagnostic possibilities and future developments.″Prostate Suppl. 4：43-50.
Patani and LaVoie，1996，“Bioisosterism：A Rational Approach in Drug Design″Chem.Rev.96：3147-76.
Silvestrini et al.，1984，Prog.Med.Chem.21，G.P.Ellis and G.B.West，Eds. (Elsevier Science Publishers，Amsterdam)，p.111-35.
Silvestrini，1981，“Basic and Applied Research n the Study of Indazole Carboxylic Acids”Chemotherapy 27：9-20.
Thomas et al.，1990，“1H MR spectroscopy of normal and malignant human prostates in vivo.”Journal of Magnetic Resonance 87：610-19.
Yacobi and Halperin-Walega，1988，in Oral Sustained Release Formulations： Design and Evaluation，Pergamon Press
US 2003/0072814″Topical Pharmaceutical Composition for the Treatment of Warts″.
US 2002/0077300″Screening Method for Cancer Therapeutics and Stable Antitumor Drug″.
US 2002/0035071“Mimicking the Metabolic Effects of Caloric Restriction by Administration of Glucose Antimetabolites″.
US 3,895,026“Substituted 1-benzyl-1H-indazole-3-carboxylic Acids and derivatives thereof”.
US 4,970,075″Controlled Release Bases for Pharmaceuticals″.
US 5,266,331″Controlled Release Oxycodone Compositions″.
US 5,286,493″Stabilized Controlled Release Formulations Having Acrylic Polymer Coating″.
US 5,386,467″Controlled Release Coatings Derived From Aqueous Dispersions of Zein″.
US 5,472,712″Controlled Release Formulations Coated With Aqueous Dispersions of Ethylcellulose″.
US 5,478,577″Methods of Treating Pain by Administering 24 Hour Oral Opioid Formulations Exhibiting Rapid Rate of Initial Rise of Plasma Drug Level″.
US 5,549,912″Controlled Release Oxycodone Compositions″.
US 5,643,883″Glucose-6-Phosphate Uptake Inhibitors and Novel Uses Thereof″.
US 5,652,273″Reduction of Hair Growth″.
US 5,672,360″Method of Treating Pain by Administering 24 Hour Oral Opioid Formulations″.
US 5,824,665″Reduction of Hair Growth″.
US 5,958,459″Opioid Formulations Having Extended Controlled Released″.
US 5,968,551″Orally Administrable Opioid Formulations Having Extended Duration of Effect″.
US 6,001,865“3-substituted 1-benzyl-1H-indazole derivatives as antifertility agents”.
US 6,077,533″Powder-Layered Oral Dosage Forms″.
US 6,103,261″Opioid Formulations Having Extended Controlled Release″.
US 6,129,933″Stabilized Controlled Release Substrate Having a Coating Derived From an Aqueous Dispersion of Hydrophobic Polymer″.
US 6,143,322″Method of Treating Humans With Opioid Formulations Having Extended Controlled Release″.
US 6,143,353″Controlled Release Formulations Coated With Aqueous Dispersions of Acrylic Polymers″.
US 6,146,658“Prodrugs，their preparation and use as pharmaceuticals”.
US 6,218,435″Reduction of Hair Growth″.
US 6,294,195″Orally Administrable Opioid Formulations Having Extended Duration of Effect″.
US 6,670,330″Cancer Chemotherapy With 2-Deoxy-D-Glucose″.
WO 01/82926″Manipulation of Oxidative Phosphorylation for Hypersensitizing Tumor Cells to Glycolytic Inhibitors″.
[00124]尽管本发明已经参考具体的实施方案被详细描述，本领域的技 术人员将认识到，修饰和改进是在本发明的范围和精神之内，如在下 面的权利要求书中所说明。在此引用的所有出版物和专利文献(专利， 公开的专利申请，和未公开的专利申请)，并入此处作为参考，如同每 一这样的出版物或者文献被具体地和分别地指出作为参考文献并入此 处。出版物和专利文献的引用不是意图作出一种承认，承认任何这类 文献是相关的现有技术，这也不构成对这些文献的内容或者日期的任 何承认。本发明到此为止已经通过书面说明和实施例的方式被描述， 本领域的技术人员将认识到：本发明可以以各种各样实施方案进行实 践，并且前述的描述和实施例是用于例示性说明的目的，而不是限制 后面的权利要求。
                    相关申请的交叉参考

[0001]本申请要求下列美国临时申请的权益：美国临时申请60/496,163 号(2003年8月18日提出)，60/488,265号(2003年7月18日提出)， 60/472,907号(2003年5月22日提出)，60/460,012号(2003年4月2 日提出)，60/458,846号(2003年3月28日提出)，60/458,665号(2003 年3月28日提出)，60/458,663号(2003年3月28日提出)，60/442,344 号(2003年1月23日提出)，和60/441,110号(2003年1月17日提 出)，每一申请以其全部内容在此并入，作为参考，用于所有论题。