年龄相关疾病和病症的基因治疗方法
专利汇可以提供年龄相关疾病和病症的基因治疗方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供 基因 治疗 方法，用于通过调控与年龄相关 疾病 或病症关联的一种或多种功能性蛋白来治疗或 预防 年龄相关疾病或病症。，下面是年龄相关疾病和病症的基因治疗方法专利的具体信息内容。
1.一种病毒载体，包含：
第一核酸序列，所述第一核酸序列包含能够表达哺乳动物蛋白或抑制剂mRNA产物的基因，其中所述基因选自表1，并且所述第一核酸序列与第一调控序列操作性连接，用于在哺乳动物细胞中表达产物。
2.如权利要求1所述的病毒载体，其中第一调控序列包括第一启动子，其中第一启动子是组成型启动子或诱导型启动子。
3.如权利要求1或2所述的病毒载体，其中第一调控序列包括选自以下的第一启动子：
heFla启动子、CAGGS(巨细胞病毒、鸡β-肌动蛋白内含子、兔β-珠蛋白基因的剪接受体)、CMV、shEf1a(截短的hEf1a)、AAT启动子、甲状腺激素结合球蛋白启动子、白蛋白启动子、甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、肝控制区(HCR)-ApoCII混合启动子、CASI、HCR-hAAT混合启动子和与小鼠白蛋白基因增强子(Ealb)元件和载脂蛋白E启动子组合的AAT启动子。
4.如权利要求1至4中任一项所述的病毒载体，其中所述基因是FGF21、Klotho或
sTGFbR2-FC。
5.如权利要求1至4中任一项所述的病毒载体，其中第一核酸序列序列与第一3'非翻译区操作性连接，用于RNA在哺乳动物细胞中的稳定性和表达。
6.如权利要求5所述的病毒载体，其中第一3'非翻译区包含第一组织特异性miRNA结合序列，以调控融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达。
7.如权利要求6所述的病毒载体，其中第一组织特异性miRNA结合序列包含第一
mir122a组织特异性miRNA结合序列，以阻止在肝细胞中表达。
8.如权利要求5至7中任一项所述的病毒载体，其中第一3'非翻译区包含选自以下的聚腺苷酸化信号：WPRE，WPRE3，SV40后聚腺苷酸化信号(截短的SEQ ID：114)，HBG聚腺苷酸化信号，兔β珠蛋白聚A，牛bgpA和ETC聚腺苷酸化信号或它们的混合体。
9.如权利要求1-8中任一项所述的病毒载体，其中所述病毒载体是细小病毒载体。
10.如权利要求9所述的病毒载体，其中所述细小病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。
11.如权利要求10所述的病毒载体，其中AAV载体选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV2.5、或AAVrh10.XX(其中xx代表不同的已知变体)病毒载体。
12.如权利要求10-11中任一项所述的病毒载体，其中所述病毒载体按AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV2.5、或AAVrh10.XX(其中xx代表不同的已知变体)或它们的组合而血清分型。
13.AAV载体，所述AAV载体选自表3的AAV载体。
14.一种治疗年龄相关疾病或病症的方法，包括给予治疗有效量的一种或多种如权利要求1至12中任一项所述的病毒载体，或一种或多种如权利要求13所述的AAV载体。
15.如权利要求14所述的方法，包括给予选自表1的多种病毒载体，或选自表3的多种AAV载体。
16.一种病毒载体，包含：
第一核酸序列，所述第一核酸序列编码哺乳动物可溶性转化生长因子β受体II(sTGFβ-R2)蛋白或其片段和Ig Fc结构域的融合蛋白，所述sTGFβ-R2蛋白或其片段具有受体细胞外结构域，
其中所述融合蛋白能够结合TGFβ1，并且第一核酸序列与第一调控序列操作性连接，用于在哺乳动物细胞中表达融合蛋白。
17.如权利要求16所述的病毒载体，其中哺乳动物sTGFβ-R2蛋白是人sTGFβ-R2蛋白。
18.如权利要求16所述的病毒载体，其中哺乳动物sTGFβ-R2蛋白是犬sTGFβ-R2蛋白。
19.如权利要求16所述的病毒载体，其中哺乳动物sTGFβ-R2蛋白选自人、犬、猫、牛、绵羊、山羊、马、鼠和猪sTGFβ-R2蛋白。
20.如权利要求16所述的病毒载体，其中编码的哺乳动物sTGFβ-R2蛋白与对应于SEQ ID NO：17、11、10、5的哺乳动物sTGFβ-R2蛋白的氨基酸序列(以及猫、牛、绵羊、山羊、马、鼠和猪)具有至少90％的序列相同性。
21.如权利要求16-20中任一项所述的病毒载体，其中Ig Fc选自人、犬、猫、牛、绵羊、山羊、马、鼠和猪Ig Fc。
22.如权利要求21所述的病毒载体，其中Ig Fc是选自IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4的IgG的Fc。
23.如权利要求21所述的病毒载体，其中所述Ig Fc与SEQ ID NO：20、27所示的Ig Fc的氨基酸序列具有至少90％的序列相同性。
24.如权利要求16-23中任一项所述的病毒载体，其中第一调控序列包括用于在肝细胞中表达融合蛋白的第一肝组织特异性启动子。
25.如权利要求16-24中任一项所述的病毒载体，其中第一调控序列包括第一启动子，其中第一启动子是组成型启动子或诱导型启动子。
26.如权利要求16-24所述的病毒载体，其中第一调控序列包括选自以下的第一启动子：heF1a启动子，AAT启动子，甲状腺激素结合球蛋白启动子，白蛋白启动子，甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子的，肝控制区(HCR)-ApoCII混合启动子，HCR-hAAT混合启动子和与小鼠白蛋白基因增强子(Ealb)元件和载脂蛋白E启动子组合的AAT启动子。
27.如权利要求16-26的病毒载体，其中第一调控序列包括组成型启动子。
28.如权利要求16至27中任一项所述的病毒载体，其中第一核酸序列序列与第一个3'非翻译区操作性连接，用于RNA在哺乳动物细胞中的稳定性和表达。
29.如权利要求28所述的病毒载体，其中第一3'非翻译区包含第一组织特异性miRNA结合序列，以调控融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达。
30.如权利要求29所述的病毒载体，其中第一组织特异性miRNA结合序列包括第一
mir122a组织特异性miRNA结合序列，以阻止在肝细胞中表达。
31.如权利要求28至30中任一项所述的病毒载体，其中第一3'非翻译区包含选自以下的聚腺苷酸化信号：WPRE3，SV40后聚腺苷酸化信号(截短的SEQ ID：113和114)，HBG聚腺苷酸化信号和ETC聚腺苷酸化信号或它们的混合体。
32.如权利要求16或31中任一项所述的病毒载体，所述病毒载体还包含编码哺乳动物核因子(红系细胞衍生的2)样2(Nrf2)蛋白的第二核酸，其中第二核酸序列与第二调控序列操作性连接，用于在所述哺乳动物细胞中表达Nrf2蛋白。
33.如权利要求32所述的病毒载体，其中哺乳动物sTGFβ-R2蛋白和哺乳动物Nrf2蛋白属于相同的哺乳动物物种。
34.如权利要求33所述的病毒载体，其中哺乳动物物种选自人、犬、猫、牛、绵羊、山羊、马、鼠和猪。
35.如权利要求32-34中任一项所述的病毒载体，其中第二调控序列包括用于在肝细胞中表达Nrf2蛋白的第二肝组织特异性启动子。
36.如权利要求32-35中任一项所述的病毒载体，其中第二调控序列包括第二启动子，其中第二启动子是组成型启动子或诱导型启动子。
37.如权利要求32-36中任一项所述的病毒载体，其中第二调控序列包括选自以下的第二启动子：heF1a启动子，AAT启动子，甲状腺激素结合球蛋白启动子，白蛋白启动子，甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子的，肝控制区(HCR)-ApoCII混合启动子，HCR-hAAT混合启动子和与小鼠白蛋白基因增强子(Ealb)元件和载脂蛋白E启动子组合的AAT启动子。
38.如权利要求32-37中任一项所述的病毒载体，其中第二调控序列包括组成型启动子。
39.如权利要求32至38中任一项所述的病毒载体，其中第二核酸序列序列与第二3'非翻译区操作性连接，调控RNA在哺乳动物细胞中的稳定性和表达。
40.如权利要求32-39中任一项所述的病毒载体，其中第二3'非翻译区包含第二组织特异性miRNA结合序列，以调控哺乳动物细胞中Nrf2蛋白的表达。
41.如权利要求40所述的病毒载体，其中第二组织特异性miRNA结合序列包括第二
mir122a组织特异性miRNA结合序列，以阻止在肝细胞中表达。
42.如权利要求32至39中任一项所述的病毒载体，其中第二3'非翻译区包含选自以下的第二聚腺苷酸化信号：WPRE3，SV40后聚腺苷酸化信号(截短的SEQ ID：114)，HBG聚腺苷酸化信号和ETC聚腺苷酸化信号或它们的混合体。
43.如权利要求32所述的病毒载体，其中编码Nrf2蛋白的第二核酸与第一调控序列操作性连接以表达编码融合蛋白和Nrf2蛋白的多顺反子mRNA转录物，其中第二调控序列包含操作性连接的IRES或2A序列，用于由多顺反子转录物表达Nrf2蛋白。
44.如权利要求16-44中任一项所述的病毒载体，其中所述病毒载体是细小病毒载体。
45.如权利要求44所述的病毒载体，其中所述病毒载体是腺相关(AAV)病毒载体。
46.如权利要求45所述的病毒载体，其中AAV载体选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV2.5、和AAVrh10.XX(其中xx代表不同的已知变体)病毒载体。
47.如权利要求45-47中任一项所述的病毒载体，其中所述病毒载体按AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV2.5、和AAVrh10.XX(其中xx代表不同的已知变体)或它们的组合而血清分型。
48.包含第一病毒载体和第二病毒载体的组合物，其中
第一病毒载体包含第一核酸序列，所述第一核酸序列编码哺乳动物可溶性转化生长因子β受体II(sTGFβ-R2)蛋白或其片段和Ig Fc结构域的融合蛋白，所述sTGFβ-R2蛋白或其片段具有受体细胞外结构域，其中所述融合蛋白能够结合TGFβ1，并且第一核酸序列与合适的调控序列操作性连接，用于在哺乳动物细胞中表达，并且第一病毒载体任选地包含第一抑制剂序列，以抑制第一核酸序列在非靶组织中的表达；和
第二病毒载体包含第二核酸序列，所述第二核酸序列编码哺乳动物核因子(红系细胞衍生的2)样2(Nrf2)蛋白，其中第二核酸序列与第二调控序列操作性连接以在哺乳动物细胞中表达，并且第二病毒载体任选地包含第二抑制剂序列以抑制第二核酸序列在非靶组织中的表达。
49.一种减少哺乳动物中纤维化组织发育的方法，包括给予哺乳动物治疗有效量的权利要求16-47中任一项所述的病毒载体或权利要求48所述的组合物。
50.一种治疗哺乳动物心脏、肝、肺或肾的纤维化的方法，包括给予哺乳动物治疗有效量的权利要求1至47中任一项所述的病毒载体或权利要求48所述的组合物。
51.一种病毒载体，其包含编码哺乳动物脂连蛋白的第一核酸序列，其中第一核酸序列与调控序列操作性连接，用于在哺乳动物细胞中表达脂连蛋白，并且所述病毒载体任选地包含抑制剂序列以抑制第一核酸序列在非靶组织中的表达。
52.如权利要求51所述的病毒载体，其中编码的哺乳动物脂连蛋白与对应于SEQ ID NO：34人脂连蛋白的氨基酸序列具有至少90％的序列相同性。
53.如权利要求51-52中任一项所述的病毒载体，还包含编码哺乳动物谷胱甘肽S-转移酶κ1(DsbA-L；GSTK1)蛋白的第二核酸序列，其中第二核酸与第二调控序列操作性连接，用于在哺乳动物细胞中表达GSTK1蛋白。
54.如权利要求53所述的病毒载体，其中编码的哺乳动物GSTK1蛋白与对应于人GSTK1蛋白的氨基酸序列具有至少90％的序列相同性。
55.如权利要求51-54中任一项所述的病毒载体，其中所述病毒载体包括AAV载体。
56.如权利要求55所述的病毒载体，其中所述AAV载体是自身互补的AAV载体。
57.如权利要求51-56中任一项所述的病毒载体，其中AAV载体选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV2.5、和AAVrh10.XX(其中xx代表不同的已知变体)病毒载体。
58.包含第一病毒载体和第二病毒载体的组合物，其中
第一病毒载体包含编码哺乳动物脂连蛋白的第一核酸序列，其中第一核酸序列与调控序列操作性连接，用于在哺乳动物细胞中表达脂连蛋白，并且所述病毒载体任选地包含抑制剂序列以抑制第一核酸序列在非靶组织中的表达，和
第二病毒载体包含第二核酸序列，所述第二核酸序列编码哺乳动物谷胱甘肽S-转移酶κ1(DsbA-L；GSTK1)蛋白，其中第二核酸序列与第二调控序列操作性连接以在哺乳动物细胞中表达GSTK1蛋白，并且第二病毒载体任选地包含第二抑制剂序列以抑制第二核酸序列在非靶组织中的表达。
59.如权利要求58所述的组合物，其中第一病毒载体是第一自身互补的AAV，第二种病毒载体是第二自身互补的AAV载体。
60.如权利要求58-59中任一项所述的组合物，其中第一病毒载体包括选自以下的AAV载体：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV2.5、和AAVrh10.XX(其中xx代表不同的已知变体)病毒载体。
61.如权利要求58-60中任一项所述的组合物，其中第二病毒载体包括选自以下的AAV载体：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV2.5、和AAVrh10.XX(其中xx代表不同的已知变体)病毒载体。
62.一种治疗与年龄有关的疾病或病症的方法，包括给予治疗有效量的权利要求51至
57中任一项所述的病毒载体或权利要求58至61中任一项所述的组合物。
63.一种治疗年龄相关疾病或病症的方法，包括给予对象治疗有效量的一种或多种合适的病毒表达载体，其中所述一种或多种病毒载体在对象中表达有效量的一种或多种异源功能蛋白，所述异源功能蛋白选自：脂连蛋白，Adra1a(mut)、AMPK、Atg5、BubR1、mCat、Cebpβ、Cisd2d、FGF21、GDF15(hNAG)、HAS2(nmr)、人源化FoxP2、Klotho、Mt1、NEU1、NGF、Nrf2、NUDT1、Par4 SAC结构域、Pck1、sIGF1r-Fc、Sirt1、Sirt6、TERT、TFAM、TFEB、sTGFbR2-Fc、BMP2、BMP4、Sema3a和Txn1。
64.一种治疗年龄相关疾病或病症的方法，包括给予有效量的一种或多种合适的病毒表达载体以在对象中表达有效量的一种或多种异源抑制剂RNA序列，所述异源抑制剂RNA序列抑制选自以下的一种或多种内源蛋白质的表达：ADcy5、Agtr1a、Akt1、Cebpα、Coq7、Ctf1、Dgat1、Ikbkb、Insr、mTOR、nf-kb、Pappa、PACKS、PDE4b、Prkar2b、Rps6kb1(S6K1)、Slc13a1、Slc13a5(INDY)，和Ubd。
65.一种治疗与年龄有关的疾病或病症的方法，包括给予有效量的一种或多种合适的病毒表达载体，用以
在对象中表达有效量的一种或多种选自以下的异源功能蛋白：脂连蛋白，Adra1a
(mut)、AMPK、Atg5、BubR1、mCat、Cebpβ、Cisd2d、FGF21、GDF15(hNAG)、HAS2(nmr)、人源化FoxP2、Klotho、Mt1、NEU1、NGF、Nrf2、NUDT1、Par4 SAC结构域、Pck1、sIGF1r-Fc、Sirt1、Sirt6、TERT、TFAM、TFEB、sTGFbR2-Fc、BMP2、BMP4、Sema3a和Txn1；
在对象中表达有效量的一种或多种异源抑制剂RNA序列，所述异源抑制剂RNA序列抑制一种或多种选自以下的内源蛋白的表达：ADcy5、Agtr1a、Akt1、Cebpα、Coq7、Ctf1、Dgat1、Ikbkb、Insr、mTOR、nf-kb、Pappa、PACKS、PDE4b、Prkar2b、Rps6kb1(S6K1)、Slc13a1、Slc13a5(INDY)，和Ubd。
66.一种治疗哺乳动物的与年龄有关的疾病或病症的方法，包括给予有效量的一种或多种合适的病毒表达载体，用以
在哺乳动物中表达一种或多种选自以下的异源功能蛋白：脂连蛋白、AMPK、Cebpβ、FGF21、GDF15(hNAG)、Pck1、Sirt1、PCSK9、BMP2、BMP4、Sema3a和UCP1，或
在哺乳动物中表达一种或多种异源抑制剂RNA序列，所述异源抑制剂RNA序列抑制一种或多种选自以下的内源蛋白的表达：Cebpα、Dgat1、Insr、mTOR、Prkar2b、Slc13a1、Slc13a5(INDY)和Ubd。
67.一种治疗哺乳动物的与年龄有关的疾病或病症的方法，包括给予有效量的一种或多种合适的病毒表达载体，用以
在哺乳动物中表达一种或多种选自FGF21、GDF15(hNAG)、Klotho、sIGF1r-Fc、BMP2、BMP4、Sema3a和Sirt6的异源功能蛋白；和
在哺乳动物中表达一种或多种异源抑制剂RNA序列，所述异源抑制剂RNA序列抑制一种或多种选自Akt1、mTOR、Pappa、Rps6kb1和(S6K1)的内源蛋白的表达。
68.一种治疗哺乳动物的与年龄有关的疾病或病症的方法，包括给予有效量的一种或多种合适的病毒表达载体，用以
在哺乳动物中表达一种或多种选自Atg5、Cisd2d和TFEB的异源功能蛋白；和
在哺乳动物中表达一种或多种异源抑制剂RNA序列，所述异源抑制剂RNA序列抑制一种或多种选自Akt1和mTOR的内源蛋白的表达。
69.一种治疗哺乳动物的与年龄有关的疾病或病症的方法，包括给予有效量的一种或多种合适的病毒表达载体，用以
在哺乳动物中表达一种或多种选自Klotho、Nrf2、Sirt1、sTGFbR2-Fc和Txn1的异源功能蛋白；和
在哺乳动物中表达一种或多种异源抑制剂RNA序列，所述异源抑制剂RNA序列抑制内源Ctf1蛋白的表达。
70.一种治疗哺乳动物的与年龄有关的疾病或病症的方法，包括给予有效量的一种或多种合适的病毒表达载体，用以
在哺乳动物中表达一种或多种选自BubR1、HAS2(nmr)、NUDT1、Par4 SAC结构域和TERT的异源功能蛋白；和
在哺乳动物中表达一种或多种抑制剂RNA序列，所述异源抑制剂RNA序列抑制一种或多种选自Coq7和Ctf1的内源蛋白的表达。
71.一种治疗哺乳动物的与年龄有关的疾病或病症的方法，包括给予有效量的一种或多种合适的病毒表达载体，用以
在哺乳动物中表达一种或多种选自以下的异源功能蛋白：mCat、Cisd2d、Mt1、Nrf2、Pck1、Sirt6和TFAM；和
表达一种或多种抑制剂RNA序列，所述抑制剂RNA序列抑制一种或多种选自以下的内源蛋白的表达：ADcy5、Agtr1a、Coq7和Slc13a1。
72.一种治疗哺乳动物的与年龄有关的疾病或病症的方法，包括给予一种或多种合适的病毒表达载体，用以
在哺乳动物中表达一种或多种选自以下的异源功能蛋白：Adra1a(mut)、人源化FoxP2、NEU1、NGF和NUDT1；和
表达一种或多种抑制剂RNA序列，所述抑制剂RNA序列抑制一种或多种选自Ikbkb和PDE4b的内源蛋白的表达。
73.一种治疗哺乳动物的年龄相关疾病或病症的方法，包括给予一种或多种合适的病毒表达载体以在哺乳动物中表达选自FGF21、BMP2、BMP4和SEM3A的一种或多种异源功能蛋白。
74.一种治疗哺乳动物的年龄相关疾病或病症的方法，包括给予一种或多种合适的病毒表达载体以在哺乳动物中表达选自GDF15、TERT、BubR1、Agtra1a、Adcy5、Coq7、Slc13a1和Ikbkb的一种或多种异源功能蛋白。
75.一种治疗哺乳动物的年龄相关疾病或病症的方法，包括给予一种或多种合适的病毒表达载体以在哺乳动物中表达选自BubR1、Cis2d、Txn1、FGF21、BubR1、Agtr1a、ikbkb、mTOR、Nudt1、Slc13a5、pappa、Coq7、Sdcy5、Agtr1a和Ctf1/akt1的一种或多种异源功能蛋白。
76.一种治疗哺乳动物的年龄相关疾病或病症的方法，包括给予一种或多种合适的病毒表达载体以在哺乳动物中表达选自BubR1、Cis2d、Txn1、FGF21、BubR1、Agtr1a、ikbkb、mTOR、Nudt1、Slc13a5、pappa、Coq7、Sdcy5、Agtr1a和Ctf1/akt1的一种或多种异源功能蛋白。
77.一种治疗哺乳动物肥胖症和II型糖尿病的方法，包括给予一种或多种合适的病毒表达载体以在哺乳动物中表达选自FGF21、Nrf2、sTGFbR2-Fc、HAS2、Nudt1、TERT、BubR1、Par4、Ubd、Dgat1、Ctf1、Coq7 Adcy5、Agtr1a和mTOR的一种或多种异源功能蛋白。
78.一种治疗哺乳动物肥胖症和II型糖尿病的方法，包括给予一种或多种合适的病毒表达载体以在哺乳动物中表达选自Atg5、Nudt1、Adra1a(mut)、NGF、NEU1、人源化foxP2、TFEB、PDE4b、mTOR、Slc13a5、Slc13a5、Coq7、Akt1、ikbkb和Slc13a1的一种或多种异源功能蛋白。
79.一种治疗哺乳动物肥胖症和II型糖尿病的方法，包括给予一种或多种合适的病毒表达载体以在哺乳动物中表达选自klotho、GDF15(hNAG)、sIGF1r-Fc、Mt1、Adra1a(mut)、Nrf2、Rps6kb1、PCsk9、Prkar2b、Dgat、Ctf1、Coq7、papa和ikbkb的一种或多种异源功能蛋白。
80.一种治疗哺乳动物肥胖症和II型糖尿病的方法，包括给予一种或多种合适的病毒表达载体以在哺乳动物中表达选自Atg5、Cebpa、pb、Ctf1、akt1、Pck1、脂连蛋白、PcsK9、Nrf2、Cisd2、papa、Dgat、Ctf1、Coq7和mTOR的一种或多种异源功能蛋白。
81.一种治疗哺乳动物肥胖症和II型糖尿病的方法，包括给予一种或多种合适的病毒表达载体以在哺乳动物中表达选自FGF21、GDF15、klotho、Adra1a(mut)、Sirt6、Bubr1、Par4、Coq7、Adcy5、Agtr1a、Agtr1a、ikbkb、mTOR、Slc13a1、papa、Ctf1、Ctf1和Slc13a5的一种或多种异源功能蛋白。
82.一种治疗哺乳动物肥胖症和II型糖尿病的方法，包括给予一种或多种合适的病毒表达载体以在哺乳动物中表达选自FGF21、GDF15、klotho、TERT、sIGF1r-Fc、Bubr1、Par4、Rps6kb1、PCSk9、Adcy5、Coq7、Agtr1a、ikbkb、mTOR和Slc13a1的一种或多种异源功能蛋白。
83.一种治疗哺乳动物肥胖症和II型糖尿病的方法，包括给予一种或多种合适的病毒表达载体以在哺乳动物中表达选自klotho、Txn1、Nrf2、TFEB、sTGFbr2-Fc、Nudt1、mt1、Atg5、Bubr1、Par4、Ctf1、Coq7和ikbkb的一种或多种异源功能蛋白。
84.一种治疗哺乳动物肥胖症和II型糖尿病的方法，包括给予一种或多种合适的病毒表达载体以在哺乳动物中表达选自FGF21、sIGF1r-Fc、klotho、sTGFbr2-Fc、GDF15、HAS2、Mt1、Txn1、Nrf2、mCAT、Adra1a(mut)、TFEB、Bubr1、Par4、Atg5、Cisd2、Nudt1、Sirt1、Sirt6、mTOR、slc13a5、pappa、ikbkb、adcy5、agtr1a和akt1的一种或多种异源功能蛋白。
85.一种治疗哺乳动物肥胖症和II型糖尿病的方法，包括给予一种或多种合适的病毒表达载体以在哺乳动物中表达选自TFEB、Atg5、klotho、UCP1、Cebpβ、miCebpa、脂连蛋白、Mt1、Txn1、Nrf2、mCAT、TERT、Bubr1、Par4、TFAM、Cisd2、Nudt1、Neu1、NGF、Sirt6、Dgat、prkar2b、insr、ubd、Coq7、Ctf1、mTOR和Slc13a5的一种或多种异源功能蛋白。
86.一种治疗哺乳动物肥胖症和II型糖尿病的方法，包括给予一种或多种合适的病毒表达载体以在哺乳动物中表达选自sTGFbR2-FC和Nrf2的一种或多种异源功能蛋白。
87.一种治疗哺乳动物肥胖症和II型糖尿病的方法，包括给予一种或多种合适的病毒表达载体以在哺乳动物中表达选自FGF21、TERT、BubR1、Agtra1a、Adcy5、Coq7、Slc13a1、Ikbkb、Klotho、GDF15、CTF1、mTOR、Slc13a5、Pappa、Pcsk9和Rps6kb1的一种或多种异源功能蛋白。
88.一种治疗哺乳动物肥胖症和II型糖尿病的方法，包括给予一种或多种合适的病毒表达载体以在哺乳动物中表达选自FGF21、GDF15、Klotho、Adra1a(mut)、Sirt6、BubR1、Agtra1a、Adcy5、Akt1、MCAT、Slc13a1、Ikbkb、Ctf1、mTOR、Coq7和Slc13a5的一种或多种异源功能蛋白。
89.一种治疗哺乳动物肥胖症和II型糖尿病的方法，包括给予一种或多种合适的病毒表达载体以在哺乳动物中表达选自Txn1、Sirt6、Mt1、TFEB、Pck1、脂连蛋白、Cisd2、Nudt1、Atg5、Ctf1、Ikbkb和Coq7的一种或多种异源功能蛋白。
90.一种治疗哺乳动物肥胖症和II型糖尿病的方法，包括给予一种或多种合适的病毒表达载体以在哺乳动物中表达一种或多种选自Fgf21、Nrf2、sTGFbR2-FC、Has2、NudT1、TERT、BubR1、Dgat1、Pappa、Ctf1、mTOR、Coq7、Slc13a5、Agtra1a、Adcy5和Akt1的异源功能蛋白。
91.一种治疗哺乳动物肥胖症和II型糖尿病的方法，包括给予一种或多种合适的病毒表达载体以在哺乳动物中表达选自Ctf1、Coq7、Agtra1a、Adcy5、mTOR、Cisd2、MCAT、FGF21、GDF15、Klotho、Slc13a1、Ikbkb、Txn1和Sirt6的一种或多种异源功能蛋白。
92.一种治疗哺乳动物肥胖症和II型糖尿病的方法，包括给予一种或多种合适的病毒表达载体以在哺乳动物中表达选自Klotho、GDF15、Neu1、Mt1、Adra1a、hFoxP2、PCSK9、Rps6kb1、Ctf1、Ikbkb、Coq7、Slc13a1、mTOR和NudT1的一种或多种异源功能蛋白。
93.一种治疗哺乳动物肥胖症和II型糖尿病的方法，包括给予一种或多种合适的病毒表达载体以在哺乳动物中表达选自Atg5、Ctf1、Akt1、BubR1、Pck1、脂连蛋白、TERT、Nrf2、Cisd2、Dgat1、Pappa、Ctf1、mTOR、Coq7和Slc13a5的一种或多种异源功能蛋白。
94.一种治疗哺乳动物以调节肥胖和血糖的方法，包括给予一种或多种合适的病毒表达载体以在哺乳动物中表达选自FGF21、BMP2、BMP4和SEM3A的一种或多种异源功能蛋白。
95.一种治疗哺乳动物的年龄相关疾病或病症的方法，包括给予一种或多种合适的病毒表达载体以在哺乳动物中表达选自GDF15、脂连蛋白、ZAG和NRF2的一种或多种异源功能蛋白。
96.一种病毒载体，包含：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14种核酸序列，各核酸编码相应的功能蛋白，其中核酸序列操作性连接调控序列用于在哺乳动物中表达。
97.一种病毒载体，包含：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14种核酸序列，各核酸编码相应的抑制性RNA序列，其中核酸序列操作性连接调控序列用于在哺乳动物中表达。
98.一种包含盒的病毒载体，所述盒包含第一核酸序列和第二核酸序列，第一核酸序列与编码哺乳动物可溶性转化生长因子β受体II蛋白的核酸序列具有至少90％同源性并且包含所述受体的胞外部分，第二核酸序列与编码Fc(可结晶片段)结构域的核酸序列具有至少
90％同源性，其中第一和第二核酸序列的表达产生哺乳动物可溶性转化生长因子β受体II蛋白和Fc的融合蛋白，和
其中第一核酸序列和第二核酸序列与合适的启动子操作性连接以在哺乳动物细胞中表达，和
其中病毒载体包含位于盒侧翼的一个或多个ITR序列，和
其中病毒载体任选地包含抑制剂以阻止第一和第二核酸序列在非靶组织中表达。
99.如权利要求1所述的病毒载体，其中所述盒包含与编码哺乳动物Nrf2蛋白的核酸序列具有至少90％同源性的第三核酸序列，其中第三核酸序列与合适的启动子操作性连接，用于在哺乳动物细胞中表达。
100.如权利要求1所述的病毒载体，其中所述病毒载体是细小病毒的病毒颗粒。
101.如权利要求1所述的病毒载体，其中所述病毒载体是腺相关病毒。
102.如权利要求1所述的病毒载体，其中所述病毒载体是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9 AAV10、AAV11、AAV12的成员。
103.如权利要求1所述的病毒载体，其中所述病毒载体包含腺相关病毒的一个或多个部分，所述腺相关病毒选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。
104.如权利要求1所述的病毒载体，其中所述启动子是肝组织特异性启动子。
105.如权利要求1所述的病毒载体，其中哺乳动物可溶性转化生长因子β受体II蛋白是人可溶性转化生长因子β受体II蛋白。
106.如权利要求1所述的病毒载体，其中哺乳动物可溶性转化生长因子β受体II蛋白是犬可溶性转化生长因子β受体II蛋白。
107.如权利要求1所述的病毒载体，其中哺乳动物可溶性转化生长因子β受体II蛋白选自人、犬、猫、牛、绵羊、山羊、马、鼠和猪可溶性转化生长因子β受体II蛋白。
108.如权利要求1所述的病毒载体，其中Fc选自人、犬、猫、牛、绵羊、山羊、马、鼠和猪Fc或其亚型，包括Igg2a，Igg2b，Igg3或Igg4。
109.如权利要求1所述的病毒载体，其中所述合适的启动子是组成型启动子或诱导性启动子或选自：heF1a启动子，AAT启动子，甲状腺激素结合球蛋白启动子，白蛋白启动子，甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子，肝控制区(HCR)-ApoCII混合启动子，HCR-hAAT混合启动子和与小鼠白蛋白基因增强子(Ealb)元件和载脂蛋白E启动子组合的AAT启动子。
110.如权利要求1所述的病毒载体，其中ITR选自AAV2 ITR、AAV1ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、AAV11 ITR和AAV12 ITR。
111.如权利要求1所述的病毒载体，其中第一和第二核酸序列与3'非翻译区操作性连接，用于RNA在哺乳动物细胞中的稳定性和表达。
112.如权利要求1所述的病毒载体，其中第一和第二核酸序列与包含组织特异性miRNA结合序列的3'非翻译区操作性连接，以调控哺乳动物细胞中的表达。
113.如权利要求1所述的病毒载体，其中第一和第二核酸序列与包含mir122a组织特异性miRNA结合序列的3'非翻译区操作性连接，以阻止肝细胞中的表达。
114.如权利要求1所述的病毒载体，其中第一和第二核酸序列与包含聚腺苷酸化信号的3'非翻译区操作性连接。
115.如权利要求1所述的病毒载体，其中第一和第二核酸序列与3'非翻译区操作性连接，所述3'非翻译区包含选自以下的聚腺苷酸化信号：WPRE、WPRE3、SV40聚腺苷酸化信号、HBG聚腺苷酸化信号和ETC聚腺苷酸化信号或它们的混合体。
116.如权利要求1所述的病毒载体，其中所述基因是Klotho或sTGFRbR2-FC。
117.第一病毒载体和第二病毒载体的组合，其中第一病毒载体包含盒，所述盒包含第一核酸序列和第二核酸序列，第一核酸序列与编码哺乳动物可溶性转化生长因子β受体II蛋白的核酸序列具有至少90％同源性，第二核酸序列与编码Fc(可结晶片段)结构域的核酸序列具有至少90％同源性，其中第一和第二核酸序列的表达产生哺乳动物可溶性转化生长因子β受体II蛋白和Fc的融合蛋白，和
其中第一核酸序列和第二核酸序列与合适的启动子操作性连接以在哺乳动物细胞中表达，和
其中病毒载体包含位于盒侧翼的一个或多个ITR序列，和
其中病毒载体任选地包含抑制剂以阻止第一和第二核酸序列在非靶组织中表达，
其中第二病毒载体包含与编码哺乳动物Nrf2蛋白的核酸序列具有至少90％同源性的第三核酸序列，所述第三核酸序列与合适的启动子操作性连接，用于在哺乳动物细胞中表达，和
其中第二病毒载体包含位于盒侧翼的一个或多个ITR序列，和
其中第二病毒载体任选地包含抑制剂以阻止第三核酸序列在非靶组织中表达。
118.一种减少哺乳动物中纤维化组织发育的方法，包括给予哺乳动物具有盒的病毒载体，所述盒包含第一核酸序列和第二核酸序列，第一核酸序列与编码哺乳动物可溶性转化生长因子β受体II蛋白的核酸序列具有至少90％同源性，第二核酸序列与编码Fc(可结晶片段)结构域的核酸序列具有至少90％同源性，其中第一和第二核酸序列的表达产生哺乳动物可溶性转化生长因子β受体II蛋白和Fc的融合蛋白，和
其中第一核酸序列和第二核酸序列与合适的启动子操作性连接以在哺乳动物细胞中表达，和
其中病毒载体包含位于盒侧翼的一个或多个ITR序列，和
其中病毒载体任选地包含抑制剂以阻止第一和第二核酸序列在非靶组织中表达，
其中所述病毒载体被引入细胞中，并且哺乳动物可溶性转化生长因子β受体II蛋白和Fc的融合由所述细胞产生并与转化生长因子β1结合以抑制转化生长因子β1的活性。
119.一种治疗哺乳动物心脏、肝、肺或肾的纤维化的方法，包括给予哺乳动物具有盒的病毒载体，所述盒包含第一核酸序列和第二核酸序列，第一核酸序列与编码哺乳动物可溶性转化生长因子β受体II蛋白的核酸序列具有至少90％同源性，第二核酸序列与编码Fc(可结晶片段)结构域的核酸序列具有至少90％同源性，其中第一和第二核酸序列的表达产生哺乳动物可溶性转化生长因子β受体II蛋白和Fc的融合蛋白，和
其中第一核酸序列和第二核酸序列与合适的启动子操作性连接以在哺乳动物细胞中表达，和
其中病毒载体包含位于盒侧翼的一个或多个ITR序列，和
其中病毒载体任选地包含抑制剂以阻止第一和第二核酸序列在非靶组织中表达，
其中所述病毒载体被引入动物心脏、肝、肺或肾细胞中，并且哺乳动物可溶性转化生长因子β受体II蛋白和Fc的融合由所述细胞产生并与转化生长因子β1结合以抑制转化生长因子β1的活性。
120.一种包含盒的病毒载体，所述盒包含与编码哺乳动物脂连蛋白的核酸序列具有至少90％同源性的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列的表达产生脂连蛋白，并且其中第一核酸序列与合适启动子操作性连接，用于在哺乳动物细胞中表达，和
其中病毒载体包含位于盒侧翼的一个或多个ITR序列，和
其中病毒载体任选地包含抑制剂以阻止第一核酸序列在非靶组织中表达。
121.如权利要求1所述的病毒载体，其中所述载体是自我互补的AAV。
122.如权利要求1所述的方法，其中所述病毒的盒包含编码DsbA-L(GSTK1)的第二核酸序列。
123.第一病毒载体和第二病毒载体的组合，其中第一病毒载体包含盒，所述盒包含与编码哺乳动物脂连蛋白的核酸序列具有至少90％同源性的第一核酸序列，其中第一核酸序列的表达产生脂连蛋白，并且
其中第一核酸序列与合适启动子操作性连接，用于在哺乳动物细胞中表达，和
其中第一病毒载体包含位于盒侧翼的一个或多个ITR序列，和
其中第一病毒载体任选地包含抑制剂以阻止第一核酸序列在非靶组织中表达，和
其中第二病毒载体包含盒，所述盒包含与编码DsbA-L(GSTK1)的核酸序列具有至少
90％同源性的第二核酸序列，
其中第二核酸序列与合适启动子操作性连接，用于在哺乳动物细胞中表达，和
其中第二病毒载体包含位于盒侧翼的一个或多个ITR序列，和
其中第二病毒载体任选地包含抑制剂以阻止第二核酸序列在非靶组织中表达。
124.如权利要求1所述的方法，其中第一病毒载体是第一自身互补的AAV，第二病毒载体是第二自身互补的AAV。
125.一种治疗与年龄有关疾病或病症的方法，包括给予包含一个或多个盒的一种或多种病毒载体，所述盒包含一种或多种核酸序列，所述核酸序列在由已引入有所述一种或多种病毒载体的细胞表达时表达一种或多种功能性蛋白，所述功能性蛋白与选自以下的一种或多种核酸序列关联：脂连蛋白、Adra1a(mut)、AMPK、Atg5、BubR1、mCat、Cebpβ、Cisd2d、FGF21、GDF15(hNAG)、HAS2(nmr)、人源化FoxP2、Klotho、Mt1、NEU1、NGF、Nrf2、NUDT1、Par4 SAC结构域、Pck1、sIGF1r-Fc、Sirt1、Sirt6、TERT、TFAM、TFEB、sTGFbR2-Fc、BMP2、BMP4、Sema3a和Txn1。
126.一种治疗与年龄有关疾病或病症的方法，包括给予包含一个或多个盒的一种或多种病毒载体，所述盒包含一种或多种核酸序列，所述核酸序列在由已引入有所述一种或多种病毒载体的细胞表达时表达一种或多种抑制剂RNA序列，所述抑制剂RNA序列抑制功能性蛋白的表达，所述功能性蛋白与选自以下的一种或多种核酸序列关联：ADcy5、Agtr1a、Akt1、Cebpα、Coq7、Ctf1、Dgat1、Ikbkb、Insr、mTOR、nf-kb、Pappa、PACKS、PDE4b、Prkar2b、Rps6kb1(S6K1)、Slc13a1、Slc13a5(INDY)和Ubd。
127.一种治疗与年龄有关疾病或病症的方法，包括给予包含一个或多个盒的一种或多种病毒载体，所述盒包含一种或多种核酸序列，所述核酸序列在由已引入有所述一种或多种病毒载体的细胞表达时
表达一种或多种功能性蛋白，所述功能性蛋白与选自以下的一种或多种核酸序列关联：脂连蛋白，Adra1a(mut)、AMPK、Atg5、BubR1、mCat、Cebpα、Cisd2d、FGF21、GDF15(hNAG)、HAS2(nmr)、人源化FoxP2、Klotho、Mt1、NEU1、NGF、Nrf2、NUDT1、Par4 SAC结构域、Pck1、sIGF1r-Fc、Sirt1、Sirt6、TERT、TFAM、TFEB、sTGFbR2-Fc、BMP2、BMP4、Sema3a和Txn1，或表达一种或多种抑制剂RNA序列，所述抑制剂RNA序列抑制功能性蛋白的表达，所述功能性蛋白与选自以下的一种或多种核酸序列关联：ADcy5、Agtr1a、Akt1、Cebpα、Coq7、Ctf1、Dgat1、Ikbkb、Insr、mTOR、nf-kb、Pappa、PACKS、PDE4b、Prkar2b、Rps6kb1(S6K1)、Slc13a1、Slc13a5(INDY)和Ubd。
128.一种治疗动物的方法，包括给予包含一个或多个盒的一种或多种病毒载体，所述盒包含一种或多种核酸序列，所述核酸序列在由已引入有所述一种或多种病毒载体的细胞表达时
表达一种或多种功能性蛋白，所述功能性蛋白与选自以下的一种或多种核酸序列关联：脂连蛋白、AMPK、Cebpβ、FGF21、GDF15(hNAG)、Pck1、Sirt1、PCSK9、BMP2、BMP4、Sema3a和UCP1，或
表达一种或多种抑制剂RNA序列，所述抑制剂RNA序列抑制功能性蛋白的表达，所述功能性蛋白与选自以下的一种或多种核酸序列关联：Cebpα、Dgat1、Insr、mTOR、Prkar2b、Slc13a1、Slc13a5(INDY)和Ubd。
129.一种治疗动物的方法，包括给予包含一个或多个盒的一种或多种病毒载体，所述盒包含一种或多种核酸序列，所述核酸序列在由已引入有所述一种或多种病毒载体的细胞表达时
表达一种或多种功能性蛋白，所述功能性蛋白与选自以下的一种或多种核酸序列关联：FGF21、GDF15(hNAG)、Klotho、sIGF1r-Fc、BMP2、BMP4、Sema3a和Sirt6，或表达一种或多种抑制剂RNA序列，所述抑制剂RNA序列抑制功能性蛋白的表达，所述功能性蛋白与选自Akt1、mTOR、Pappa、Rps6kb1和(S6K1)的一种或多种核酸序列关联。
130.一种治疗动物的方法，包括给予包含一个或多个盒的一种或多种病毒载体，所述盒包含一种或多种核酸序列，所述核酸序列在由已引入有所述一种或多种病毒载体的细胞表达时
表达一种或多种功能性蛋白，所述功能性蛋白与选自Atg5、Cisd2d和TFEB的一种或多种核酸序列关联，或
表达一种或多种抑制剂RNA序列，所述抑制剂RNA序列抑制功能性蛋白的表达，所述功能性蛋白与选自Akt1和mTOR的一种或多种核酸序列关联。
131.一种治疗动物的方法，包括给予包含一个或多个盒的一种或多种病毒载体，所述盒包含一种或多种核酸序列，所述核酸序列在由已引入有所述一种或多种病毒载体的细胞表达时
表达一种或多种功能性蛋白，所述功能性蛋白与选自Klotho、Nrf2、Sirt1、sTGFbR2-Fc和Txn1的一种或多种核酸序列关联，或
表达一种或多种抑制剂RNA序列，所述抑制剂RNA序列抑制功能性蛋白的表达，所述功能性蛋白与选自Ctf1的一个或多个核酸序列关联。
132.一种治疗动物的方法，包括给予包含一个或多个盒的一种或多种病毒载体，所述盒包含一种或多种核酸序列，所述核酸序列在由已引入有所述一种或多种病毒载体的细胞表达时
表达一种或多种功能性蛋白，所述功能性蛋白与选自BubR1、HAS2(nmr),NUDT1、Par4 SAC结构域和TERT的一种或多种核酸序列关联，或
表达一种或多种抑制剂RNA序列，所述抑制剂RNA序列抑制功能性蛋白的表达，所述功能性蛋白与选自Coq7和Ctf1的一种或多种核酸序列关联。
133.一种治疗动物的方法，包括给予包含一个或多个盒的一种或多种病毒载体，所述盒包含一种或多种核酸序列，所述核酸序列在由已引入有所述一种或多种病毒载体的细胞表达时
表达一种或多种功能性蛋白，所述功能性蛋白与选自mCat、Cisd2d、Mt1、Nrf2、Pck1、Sirt6和TFAM的一种或多种核酸序列关联，或
表达一种或多种抑制剂RNA序列，所述抑制剂RNA序列抑制功能性蛋白的表达，所述功能性蛋白与选自ADcy5、Agtr1a、Coq7和Slc13a1的一种或多种核酸序列关联。
134.一种治疗动物的方法，包括给予包含一个或多个盒的一种或多种病毒载体，所述盒包含一种或多种核酸序列，所述核酸序列在由已引入有所述一种或多种病毒载体的细胞表达时
表达一种或多种功能性蛋白，所述功能性蛋白与选自Adra1a(mut)、人源化FoxP2、NEU1、NGF和NUDT的一种或多种核酸序列关联，或
表达一种或多种抑制剂RNA序列，所述抑制剂RNA序列抑制功能性蛋白的表达，所述功能性蛋白与选自Ikbkb和PDE4b的一种或多种核酸序列关联。
135.一种病毒载体，包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14种核酸序列，各核酸序列编码相应的功能性蛋白，其中核酸序列与启动子序列操作性连接。
136.一种病毒载体，包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14种核酸序列，各核酸序列编码抑制性RNA序列，其中核酸序列与启动子序列操作性连接。
137.一种治疗动物的方法，包括给予包含一个或多个盒的一种或多种病毒载体，所述盒包含一种或多种核酸序列，所述核酸序列在由已引入有所述一种或多种病毒载体的细胞表达时
表达一种或多种功能性蛋白，所述功能性蛋白与选自FGF21、BMP2、BMP4和SEM3A的一种或多种核酸序列关联。
138.一种治疗动物的方法，包括给予包含一个或多个盒的一种或多种病毒载体，所述盒包含一种或多种核酸序列，所述核酸序列在由已引入有所述一种或多种病毒载体的细胞表达时
表达一种或多种功能性蛋白，所述功能性蛋白与选自GDF15、脂连蛋白、ZAG和NRF2的一种或多种核酸序列关联。
139.一种将外来DNA整合到真核细胞的基因组核酸序列中的方法，包括
向所述真核细胞提供一种或多种引导RNA序列，所述一种或多种引导RNA序列与一种或多种相应靶核酸序列互补；
向所述真核细胞提供能够表达哺乳动物蛋白质或抑制剂mRNA产物的一种或多种供体核酸序列，其中所述一种或多种供体核酸序列选自：脂连蛋白、Adra1a(mut)、AMPK、Atg5、BubR1、mCat、Cebpβ、Cisd2d、FGF21、GDF15(hNAG)、HAS2(nmr)、人源化FoxP2、Klotho、Mt1、NEU1、NGF、Nrf2、NUDT1、Par4 SAC结构域、Pck1、sIGF1r-Fc、Sirt1、Sirt6、TERT、TFAM、TFEB、sTGFbR2-Fc、BMP2、BMP4、Sema3a、Txn1、ADcy5、Agtr1a、Akt1、Cebpα、Coq7、Ctf1、Dgat1、Ikbkb、Insr、mTOR、nf-kb、Pappa、PACKS、PDE4b、Prkar2b、Rps6kb1(S6K1)、Slc13a1、Slc13a5(INDY)和Ubd或它们的任何组合、亚组合或分组，
向所述真核细胞提供Cas9酶，所述Cas9酶与所述一种或多种引导RNA序列相互作用并以位点特异性方式切割所述一种或多种相应靶核酸序列，
其中所述一种或多种引导RNA序列与互补的一种或多种相应靶核酸序列结合，并且所述Cas9酶以位点特异性方式切割所述一种或多种靶核酸序列；并且
其中所述一种或多种供体序列被整合到基因组核酸序列中并被表达。
140.如权利要求139所述的方法，其中所述一种或多种供体核酸序列通过同源重组整合到基因组核酸序列中。
141.如权利要求139所述的方法，其中通过向细胞中引入编码所述一种或多种引导RNA序列的一种或多种核酸，向所述真核细胞提供所述一种或多种引导RNA序列，
其中通过向细胞引入编码Cas9酶的核酸，向所述细胞提供所述Cas9酶，和
其中所述细胞表达所述一种或多种引导RNA序列和所述Cas9蛋白。
142.如权利要求139所述的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
143.如权利要求139所述的方法，其中所述真核细胞是人细胞。
144.如权利要求16所述的病毒载体，其中所述分泌信号选自已知的哺乳动物分泌信号，以就所需表达来调控表达。
145.如权利要求16所述的病毒载体，还包含编码Klotho的第二核酸和/或编码FGF21的第三核酸，其中第二或第三核酸序列与第二或第三调控序列操作性连接，用于在哺乳动物细胞中表达Klotho或FGF21蛋白。
146.如权利要求145所述的病毒载体，其中哺乳动物sTGFβ-R2蛋白和哺乳动物Klotho或FGF21蛋白属于相同的哺乳动物物种。
147.如权利要求146所述的病毒载体，其中哺乳动物物种选自人、犬、猫、牛、绵羊、山羊、马、鼠和猪。
148.如权利要求145所述的病毒载体，其中第二或第三调控序列包括第二肝组织特异性启动子，用于在肝细胞中表达Klotho或FGF21蛋白。
149.如权利要求145所述的病毒载体，其中第二或第三调控序列包括第二或第三启动子，其中第二或第三启动子是组成型启动子或诱导型启动子。
150.如权利要求145所述的病毒载体，其中第二或第三调控序列包括选自以下的第二或第三启动子：heF1a启动子，AAT启动子，甲状腺激素结合球蛋白启动子，白蛋白启动子，甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子，肝控制区(HCR)-ApoCII混合启动子，HCR-hAAT混合启动子和与小鼠白蛋白基因增强子(Ealb)元件和载脂蛋白E启动子组合的AAT启动子。
151.如权利要求145所述的病毒载体，其中第二或第三调控序列包括组成型启动子。
152.如权利要求145所述的病毒载体，其中第二或第三核酸序列与第二3'非翻译区操作性连接，调节RNA在哺乳动物细胞中的稳定性和表达。
153.如权利要求145所述的病毒载体，其中第二或第三3'非翻译区包含第二或第三组织特异性miRNA结合序列，以调节哺乳动物细胞中Klotho或FGF21蛋白的表达。
154.如权利要求153所述的病毒载体，其中第二或第三组织特异性miRNA结合序列包括第二或第三mir122a组织特异性miRNA结合序列，以阻止在肝细胞中表达。
155.如权利要求145所述的病毒载体，其中第二或第三3'非翻译区包含选自以下的第二或第三聚腺苷酸化信号：WPRE3，SV40后聚腺苷酸化信号(截短的SEQ ID：114)，HBG聚腺苷酸化信号和ETC聚腺苷酸化信号或它们的混合体。
156.如权利要求145所述的病毒载体，其中编码Klotho或FGF21蛋白的第二或第三核酸与第一调控序列操作性连接以表达编码融合蛋白和Klotho和/或FGF21蛋白的多顺反子mRNA转录物，其中第二或第三调控序列包含操作性连接的IRES或2A序列，用于由多顺反子转录物表达Klotho和/或FGF21蛋白。
157.如权利要求145所述的病毒载体，其中所述病毒载体是细小病毒载体。
158.如权利要求157所述的病毒载体，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。
159.如权利要求158所述的病毒载体，其中AAV载体选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV2.5、和AAVrh10.XX(其中xx代表不同的已知变体)病毒载体。
160.如权利要求158所述的病毒载体，其中所述病毒载体按AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV2.5、和AAVrh10.XX(其中xx代表不同的已知变体)或它们的组合而血清分型。
161.包含第一病毒载体和第二病毒载体的组合物，其中
第一病毒载体包含第一核酸序列，所述第一核酸序列编码哺乳动物可溶性转化生长因子β受体II(sTGFβ-R2)蛋白或其片段和Ig Fc结构域的融合蛋白，所述sTGFβ-R2蛋白或其片段具有受体细胞外结构域，其中所述融合蛋白能够结合TGFβ1，并且第一核酸序列与合适的调控序列操作性连接，用于在哺乳动物细胞中表达，并且第一病毒载体任选地包含第一抑制剂序列，以抑制第一核酸序列在非靶组织中的表达；和
第二病毒载体包含第二核酸序列，所述第二核酸序列编码Klotho或FGF21蛋白，其中第二核酸序列与第二调控序列操作性连接以在哺乳动物细胞中表达，并且第二病毒载体任选地包含第二抑制剂序列以抑制第二核酸序列在非靶组织中的表达。
162.一种减少哺乳动物中纤维化组织发育的方法，包括给予哺乳动物治疗有效量的权利要求161所述的组合物的病毒载体。
163.一种治疗哺乳动物心脏、肝、肺或肾的纤维化的方法，包括给予哺乳动物治疗有效量的权利要求161所述的组合物的病毒载体。
164.一种病毒载体，包含：
编码FGF21蛋白的第一核酸序列，其中第一核酸序列与第一调控序列操作性连接，用于在哺乳动物细胞中表达FGF21蛋白。
165.如权利要求164所述的病毒载体，还包含编码Klotho的第二核酸，其中第二核酸序列与第二调控序列操作性连接，用于在哺乳动物细胞中表达Klotho蛋白。
166.如权利要求165所述的病毒载体，其中FGF21和Klotho蛋白属于相同的哺乳动物物种。
167.如权利要求166所述的病毒载体，其中哺乳动物物种选自人、犬、猫、牛、绵羊、山羊、马、鼠和猪。
168.如权利要求164所述的病毒载体，其中第二调控序列包括第二肝组织特异性启动子，用于在肝细胞中表达Klotho蛋白。
169.如权利要求164所述的病毒载体，其中第二调控序列包括第二启动子，其中第二启动子是组成型启动子或诱导型启动子。
170.如权利要求164所述的病毒载体，其中第二调控序列包括选自以下的第二启动子：
heF1a启动子，AAT启动子，甲状腺激素结合球蛋白启动子，白蛋白启动子，甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子，肝控制区(HCR)-ApoCII混合启动子，HCR-hAAT混合启动子和与小鼠白蛋白基因增强子(Ealb)元件和载脂蛋白E启动子组合的AAT启动子。
171.如权利要求164所述的病毒载体，其中第二调控序列包括组成型启动子。
172.如权利要求164所述的病毒载体，其中第二核酸序列与第二3'非翻译区操作性连接，调节RNA在哺乳动物细胞中的稳定性和表达。
173.如权利要求164所述的病毒载体，其中第二3'非翻译区包含第二组织特异性miRNA结合序列，以调控Klotho蛋白在哺乳动物细胞中的表达。
174.如权利要求173所述的病毒载体，其中第二组织特异性miRNA结合序列包括第二mir122a组织特异性miRNA结合序列，以阻止在肝细胞中表达。
175.如权利要求164所述的病毒载体，其中第二3'非翻译区包含选自以下的第二聚腺苷酸化信号：WPRE3，SV40后聚腺苷酸化信号(截短的SEQ ID：114)，HBG聚腺苷酸化信号和ETC聚腺苷酸化信号或它们的混合体。
176.如权利要求164所述的病毒载体，其中编码Klotho蛋白的第二核酸与第一调控序列操作性连接以表达编码FGF21蛋白和Klotho蛋白的多顺反子mRNA转录物，其中第二调控序列包含操作性连接的IRES或2A序列，用于从多顺反子转录物表达Klotho蛋白。
177.如权利要求164所述的病毒载体，其中所述病毒载体是细小病毒载体。
178.如权利要求164所述的病毒载体，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。
179.如权利要求178所述的病毒载体，其中AAV载体选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV2.5、和AAVrh10.XX(其中xx代表不同的已知变体)病毒载体。
180.如权利要求178所述的病毒载体，其中所述病毒载体按AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV2.5、和AAVrh10.XX(其中xx代表不同的已知变体)或它们的组合而血清分型。
181.包含第一病毒载体和第二病毒载体的组合物，其中
第一病毒载体包含编码FGF21蛋白或其片段的第一核酸序列，其中第一核酸序列与合适的调控序列操作性连接，用于在哺乳动物细胞中表达，并且第一病毒载体任选地包含第一抑制剂序列，以抑制第一核酸序列在非靶组织中的表达；和
第二病毒载体包含第二核酸序列，所述第二核酸序列编码Klotho蛋白，其中第二核酸序列与第二调控序列操作性连接以在哺乳动物细胞中表达，并且第二病毒载体任选地包含第二抑制剂序列以抑制第二核酸序列在非靶组织中的表达。
182.一种减少哺乳动物中纤维化组织发育的方法，包括给予哺乳动物治疗有效量的权利要求181所述的组合物的病毒载体。
183.一种治疗哺乳动物心脏、肝、肺或肾的纤维化的方法，包括给予哺乳动物治疗有效量的权利要求181所述的组合物的病毒载体。
184.第一病毒载体和第二病毒载体的组合，其中第一病毒载体包含盒，所述盒包含第一核酸序列和第二核酸序列，第一核酸序列与编码哺乳动物可溶性转化生长因子β受体II蛋白的核酸序列具有至少90％同源性，第二核酸序列与编码Fc(可结晶片段)结构域的核酸序列具有至少90％同源性，其中第一和第二核酸序列的表达产生哺乳动物可溶性转化生长因子β受体II蛋白和Fc的融合蛋白，和
其中第一核酸序列和第二核酸序列与合适的启动子操作性连接以在哺乳动物细胞中表达，和
其中病毒载体包含位于盒侧翼的一个或多个ITR序列，和
其中病毒载体任选地包含抑制剂以阻止第一和第二核酸序列在非靶组织中表达，
其中第二病毒载体包含与编码Klotho或FGF21蛋白的核酸序列具有至少90％同源性的第三核酸序列，所述第三核酸序列与合适的启动子操作性连接，用于在哺乳动物细胞中表达，和
其中第二病毒载体包含位于盒侧翼的一个或多个ITR序列，并且第二病毒载体任选地包含抑制剂以阻止第三核酸序列在非靶组织中表达。
185.第一病毒载体和第二病毒载体的组合，其中第一病毒载体包含盒，所述盒包含与编码FGF21蛋白的核酸序列具有至少90％同源性的第一核酸序列，并且
其中第一核酸序列与合适启动子操作性连接，用于在哺乳动物细胞中表达，和
其中病毒载体包含位于盒侧翼的一个或多个ITR序列，和
其中病毒载体任选地包含抑制剂以阻止第一核酸序列在非靶组织中表达，
其中第二病毒载体包含与编码Klotho蛋白的核酸序列具有至少90％同源性的第二核酸序列，所述第二核酸序列与合适的启动子操作性连接，用于在哺乳动物细胞中表达，和其中第二病毒载体包含位于盒侧翼的一个或多个ITR序列，并且第二病毒载体任选地包含抑制剂以阻止第三核酸序列在非靶组织中表达。
年龄相关疾病和病症的基因治疗方法
的。
性降低。迄今为止测试的衰老干预措施包括环境操纵，如热量限制(CR)，小分子药物如雷帕霉素，以及通过创造转基因动物如Ames和Snell矮小鼠实现的遗传操纵。虽然这些实验已经使人们更加了解衰老所涉及的机制，但它们并不适合转化至衰老的人类和宠物群体。热量
限制要求严格遵守饮食限制，迄今为止的证据表明这不是治疗的可能途径。雷帕霉素具有
免疫调节作用，可增加对某些病原体的易感性。而且创造转基因动物并不适用于所有现存
的生物。在Bernardes de Jesus B.等人，(2012)EMBO Mol Med.4(8):691-704中描述了将
hTERT经AAV递送到抗癌遗传背景小鼠中。
发明内容
型的方法。本公开内容提供了对基因的鉴定，所述基因与可能与衰老关联的某些疾病和病
症相关。本公开内容提供对这些基因的调控，通过增加与基因相关的蛋白质或减少与基因
相关的蛋白质来实现。本公开内容提供了通过引入在细胞内表达的功能性蛋白质的编码核
酸来增加与基因相关的功能性蛋白质。所述表达导致功能性蛋白质的量增加，所述功能性
蛋白质可以是细胞内的或分泌的，从而提供治疗效果或预防效果。本发明提供了基因的抑
制，从而通过引入编码抑制性RNA的核酸来减少与基因相关的功能性蛋白，所述抑制性RNA
在表达时与基因或信使RNA结合以抑制功能性蛋白质的表达。本公开提供了功能性蛋白质
的抑制，从而通过引入编码蛋白质抑制剂(例如可溶性受体蛋白质)的核酸来降低功能性蛋
白质的活性，所述蛋白质抑制剂在表达时与功能性蛋白质结合。本公开内容提供了使用靶
向动物细胞的遗传构建体的基因治疗方法，以及使用载体(例如病毒载体)对此类遗传构建
体的递送。本公开内容提供了使用靶向动物细胞的遗传构建体的基因治疗方法，以及使用
诸如脂质体、合成或天然存在的聚合物、电穿孔、涂覆或未涂覆的纳米颗粒递送、扩散粒子递送、激光介导转染(光穿孔或光转染)等方法对此类遗传构建体的递送。参见例如Kim,
T.K.等,(2010)Analytical and Bioanalytical Chemistry.397(8):3173-3178。本公开内
容提供了使用靶向动物细胞的遗传构建体的基因治疗方法以及对这种遗传构建体的递送，
其中所述遗传构建体已经从原始DNA加工成miRNA，shRNA，RNAi，或mRNA(其中mRNA由5'帽和
3'聚A或等同物组成)。根据另外的方面，使用本领域技术人员已知的5'帽类似物或本领域
技术人员已知的3'聚A类似物将RNA靶向核糖体用于翻译。对于本文所述的基因治疗方法，
本公开内容提供了基因或基因产物或编码该基因的DNA或对应于该基因的mRNA或对应于该
基因的经加工的初-mRNA或miRNA在本文所述的基因治疗方法中的用途，只要基因或基因产
物或编码该基因的DNA或对应于该基因的mRNA或对应于该基因的经加工的初-mRNA或miRNA
被改变或调控以在本文所述的治疗或预防方法中提供细胞效应。
因或基因产物或编码该基因的DNA或对应于该基因的mRNA或对应于该基因的经加工的初-
mRNA或miRNA提供了使包括人和其他哺乳动物在内的生物体恢复活力的方法。本公开提供
了基因治疗方法，其中将一个或多个或多种核酸(例如基因)递送至动物中的一种或多种靶
细胞。本公开内容使用单一载体向细胞递送多种核酸，所述核酸包括驱动其表达的单一启
动子。表达一个或多个或多种核酸以产生一种或多种相应的蛋白质，并且一种或多种蛋白
质改变生物体的病症。本公开提供了组合疗法，其中不同细胞类型被动物中的一个或多个
或多种核酸靶向。
开内容提供了使用病毒载体(例如腺相关病毒(“AAV”))的基因治疗。腺相关病毒将外源基因插入细胞中，并且由外源基因编码的蛋白质将会表达。以这种方式，蛋白质，无论是功能性蛋白质、抑制性RNA还是抑制性蛋白质，都会改变细胞和/或携带细胞的生物体。
鉴定为与年龄相关疾病或病症有关。确定基因与特定组织类型相关或不相关，从而可以确
定使用所需方法对基因的适当调控。另外，与特定组织类型相关的基因可受益于使用特定
载体的调控，所述特定载体向特定组织类型细胞递送核酸，抑制性RNA或抑制性蛋白质以调控特定组织类型细胞内蛋白质的量或活性。组织特异性启动子可用于表达核酸。
附图说明
具体实施方式
体给予或组合入单一病毒载体，例如AAV，以治疗或预防与衰老相关的疾病或病症和年龄相关生理衰退。
制下时，该序列可以翻译成编码的多肽。基因可包含数个操作性连接的片段，例如启动子，
5'前导序列，编码序列和3'非翻译序列，例如聚腺苷酸化位点。嵌合或重组基因是通常在自然界中不存在的基因，例如这样的基因，该基因中(例如)启动子与部分或全部的转录DNA区域天然无关联。“基因的表达”是指其中基因转录成RNA和/或翻译为功能性蛋白质的过程。
转导的细胞中。“宿主细胞”或“靶细胞”是指发生核酸递送的细胞。
在个体中引起所需响应的能力而不同。可调节剂量方案以提供最佳治疗响应。治疗有效量
也是细小病毒的病毒颗粒或药物组合物的治疗有益效果胜过毒性或有害效果的量。
在自然界中不存在的方式组合和并置。核酸构建体通常是“载体”，即用于将外源产生的DNA递送到宿主细胞中的核酸分子。一种类型的核酸构建体是“表达盒”或“表达载体”。这些术语是指能够在宿主细胞或与这些序列相容的宿主生物中实现基因表达的核苷酸序列。表达
盒或表达载体通常至少包括合适的转录调控序列和任选的3'转录终止信号。还可以存在实
现表达所必需或有帮助的其他因子，例如表达增强子元件。核酸构建体也可以是载体，其通过作为RNA而不是DNA操作来指导蛋白质的表达或抑制。在增加靶蛋白表达的情况下，该核
酸构建体可以是mRNA或类似物，其中细胞或更具体地核糖体将识别并产生许多拷贝的蛋白
质。在抑制靶序列表达的情况下，RNA可以是通过阻止核糖体产生蛋白质而起作用的形式，这可以通过RNAi或shRNA或miRNA或初-miRNA的机制来完成。人们还可以通过布尔逻辑来想
象，如果抑制靶序列的已知阻遏物，则反过来实际上通过抑制实现靶序列的增加，并且本领域技术人员可以对靶蛋白进行抽象，从而通过递送mRNA(或类似物)或shRNA(或类似物)实
现的“倒位”或“暗示”的组合可以产生靶序列的调控。这也可以通过载体来完成，所述载体提供必须在AAV中表达的DNA。
(pA)，其指导聚A尾的添加，即mRNA的3'末端的腺嘌呤残基串，其可称为聚A序列。它还可以设计用于增强mRNA稳定性。影响转录和翻译稳定性的表达控制序列，例如启动子，以及影响翻译的序列，例如适用于昆虫细胞的Kozak序列，是本领域技术人员熟知的。表达控制序列可具有调控与其操作性连接的核苷酸序列的性质，从而实现较低的表达水平或较高的表达
水平。
酶的天然位置发挥其功能。还可以向其他蛋白质添加靶向信号，使其靶向细胞的其他部分
或甚至从细胞分泌。在一些蛋白质的情况下，更好的已知形式可以取代天然序列以增强效
果，例如将TGFbR2的人或小鼠分泌信号与狗形式的蛋白质融合。
用以调控来自启动子的转录量的任何其他核苷酸序列，包括例如衰减子或增强子，以及沉
默子。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中有活性的启动子。“诱导型”启动子是，例如，由应用化学诱导剂在生理上或发育上调控的启动子。“组织特异性”启动子仅在特定类型的组织或细胞中有活性。本公开内容提供了核酸构建体与哺乳动物细
胞相容的表达控制序列(例如启动子)的操作性连接。许多这样的启动子是本领域已知的
(参见Sambrook和Russell，2001，同上)。公开了在许多细胞类型中广泛表达的组成型启动子，例如CMV和hEf1α启动子。还公开了全长hEf1α的变体，其较短但仍提供有效的组成型表达。公开了可诱导的，组织特异性的，细胞类型特异性的或细胞周期特异性的启动子。在公开的实施方式中，编码胆色素原脱氨酶的核苷酸序列与肝特异性启动子操作性连接。肝特
异性启动子特别优选与非红细胞脱氨酶结合使用。优选地，在本公开的构建体中，用于肝特异性表达的表达控制序列(例如)选自α-抗胰蛋白酶(AAT)启动子，甲状腺激素结合球蛋白
启动子，白蛋白启动子，甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子，肝脏控制区(HCR)-ApoCII混合启动子，HCR-hAAT混合启动子，与小鼠白蛋白基因增强子(Ealb)元件和载脂蛋白E启动子组合的AAT启动子。其他示例包括用于肿瘤选择性的E2F启动子，特别是神经细胞肿瘤选择性
表达(Parr等，(1997)Nat.Med.3:1145-9)或用于单核血细胞的IL-2启动子(Hagenbaugh等，(1997)J Exp Med；185:2101-10)。
置数，将该匹配位置数除以比较窗口中位置的总数，得到的结果乘以100产生序列相同性百分比。本领域技术人员理解，有许多已建立的算法可用于比对两个序列。可通过Smith和
Waterman,(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch,
(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性搜索法、通过计算机执行这些算法(GAP、
BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过目测(参见例如，《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，F.M.Ausubel等编，《新编实验指南》(Current
Protocols)，Greene出版公司和约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons)(1995增刊))进行最
优序列比对以便比较。
Nucleic Acids Res.3389-3402。进行BLAST分析的软件可从国家生物技术信息中心
(National Center for Biotechnology Information)公开获得。此算法包括：首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，与数据库序列中长度相同的字比
对时它们能匹配或满足一些正值的阈值评分T。T称为相邻字评分阈值(Altschul等，同上)。
这些初始相邻字命中(word hit)用作启动搜索的种子，以便找到含有它们的较长HSP。然
后，沿各个序列在两个方向上延伸该字命中，直到提高累积的比对评分。就核苷酸序列而
言，采用参数M(一对匹配残基的奖励评分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积评分。就氨基酸序列而言，用评分矩阵计算累积评分。出现以下情况时中止字命中在各个方向上的延伸：累积比对评分比其最大获得值降低X；由于一个或多个负评分残基比对的累
积，累积评分变为零或零以下；或者达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用的默认值如下：字长(W)11，期望值(E)
10，M＝5，N＝-4，和比较两条链。对氨基酸序列而言，BLASTP程序使用的默认值为：字长3，期望值(E)10，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，(1989)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)。
用以下默认ClustalW参数实现缓慢/准确的成对最佳比对–缺口罚分：10；缺口延伸罚分：
0.10；蛋白质重量矩阵：Gonnet系列；DNA重量矩阵：IUB；切换慢速/快速成对比对＝慢速或完全对齐。
的基因的一种或多种组合与年龄相关疾病或病症和/或影响生物寿命相关。所述基因疗法
靶向的基因或基因产物涉及多种细胞作用，例如代谢活性，胰岛素样生长因子活性途径(即IGF1/GH/mTOR轴)，线粒体功能，炎症/纤维化，自噬，神经功能，基因组稳定性等。作为示例而非限制，基因治疗可以基于过表达功能性蛋白质或其突变体形式的核酸或基因中的一种
或多种；调控另一种靶基因/蛋白质的功能性蛋白质的表达；表达多核苷酸，如抑制性RNA，以调控靶基因的表达；和原位修饰靶基因的基因编辑系统的表达。此类核酸可以是“合成核苷酸序列”，其在本文中理解为意指核苷酸序列并非天然如此，而是通过人为干预设计、工程化和/或构建。因此，术语“合成”不一定意味着专门和/或完全通过化学合成获得序列。相反，尽管合成序列的一部分可以在一个阶段通过化学合成获得，但是包含本发明的合成序
列的分子通常将从生物来源获得，例如(培养的，例如重组的)细胞。
抑制或最终减弱靶基因的基因产物的表达。
97％，至少98％或至少99％同源的核酸序列。同样地，本公开考虑了本文所述的氨基酸序列和与其至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少
99％同源的氨基酸序列，使得蛋白质至少全部或部分保留功能或活性。应理解，技术人员可以容易地设计与本文鉴定的或本领域已知的核酸序列不同的核酸序列，以基于遗传密码的
简并性编码已知蛋白质。因此，应理解，本文中特定核酸序列的鉴定不是限制性的。
11、12、13、14、15 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、
36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53个或所有核酸的组合，其中所述组合具有预期的治疗效果，特别是关于治疗或预防与年龄相关疾病或病症。应理解，本领域技术人员可容易地设想核酸的组合和亚组合用于治疗方法。
表达如上表1所述的基因产物。
单独的基因递送载体中，例如基于预期的靶组织，如下面进一步所述。
果的方式改变功能性蛋白质的水平。因此，本公开内容还考虑了载体，特别是病毒载体，更特别是用于表1中列出的每个基因和相应核酸的AAV载体。这些病毒载体的细节描述如下。
代谢、IGF1或GH信号传导、蛋白质合成或自噬、炎症、纤维化或免疫应答、基因组稳定性、癌症、线粒体适宜数或功能、氧化或神经功能等。
病症或疾病的用途。
sTGFbR2-FC。
不稳定性)的用途。
特别是那些与衰老有关的生物过程。因此，本公开内容包括使用表1中列出的或在上表2或
表3中的不同组中鉴定的基因和相应核酸的每种可能组合的基因治疗方法。用于(i)治疗或
预防代谢病症或疾病，(ii)IGF1/GH活性相关病症或疾病，(iii)与蛋白质合成和自噬相关
的病症或疾病，(iv)炎症，纤维化，免疫状况或疾病，(v)DNA损伤，基因组不稳定或癌症，(vi)与线粒体功能或氧化损伤相关的病症或疾病；和(vii)神经病症或疾病的基因疗法的
基因和相应核酸的组可以组合或亚组合使用以治疗多种疾病或病症，特别是与衰老有关的
多种疾病或病症。举例来说，用于治疗或预防神经疾病或病症(vii)的基因和相应核酸的组的组合或亚组合可与用于治疗或预防与线粒体功能相关的疾病或病症(即氧化损伤组，即
组(iv))的基因和相应核酸的组的组合或亚组合一起使用。其他此类示例性组合包括，作为示例而非限制，前述组(i)至(vii)的2、3、4、5、6或全部7个的组合。
以掺入相关核酸用于基因治疗。在一些实施方式中，组织特异性递送基于合适的病毒载体
和病毒包装系统的选择。病毒载体可以掺入合适的启动子和其他转录调控因子，其允许基
因产物在靶向的组织中表达。病毒包装系统可以使用用于包装病毒载体的病毒组分的宿主
细胞范围特异性，以便将基因治疗载体递送至靶向的组织。在AAV载体和衣壳设计的背景
下，AAV血清型(天然存在的或合成的衍生物)可用于操纵基因治疗应用的趋向性范围，如下文进一步详细描述的。例如，神经元靶向的基因可以使用设计用于穿过血脑屏障的病毒衣
壳，例如AAV9，而肝靶向的基因可以使用AAV8，其不会以相同的程度穿过血脑屏障但是在肝脏和肌肉中积累。
性基因治疗核酸，被靶向的细胞或组织，AAV血清型或对靶组织具有适当趋向性的血清型组合，在特定细胞或靶组织中起作用以调控表达的示例性启动子，给药途径和基因大小：A＝脂肪组织，M＝肌肉组织，B＝脑组织，L＝肝组织，E＝整个生物体的全身递送，N＝非脑组织，H＝心脏组织。表4还表明基因产物是表达蛋白还是抑制剂RNA。在一些实施方式中，用于基因治疗的核酸包括表达抑制剂元件，其在表达时抑制或减弱基因产物在一个或多个非靶组
织中的表达，也称为脱靶向(参见，例如，Broderick等，(2011)Gene Ther.18(2):1104-
1110，通过引用并入本文)。在表4中，示例性抑制剂元件是在表达的mRNA的3'UTR处的miRNA的序列，使得mRNA(或其他转录的RNA，例如初-miRNA/shRNA)在指定的非靶组织(例如肝脏)中沉默。用于在非靶组织中脱靶向表达的各种miRNA包括用于在肝细胞中沉默表达的
miRNA-122，用于在神经元细胞中沉默表达的miRNA-124，以及用于在造血细胞中沉默表达
的miRNA-142。本领域已知的用于抑制特定细胞和组织中的表达的其他miRNA可以由本领域
技术人员用于本发明的基因治疗应用中。这种沉默性miRNA靶向序列中的一种或组合可用
于抑制或减弱基因治疗构建体在一种或多种非靶细胞和组织中的不希望的表达，其中非靶
组织可彼此不同。
WPRE3是土拨鼠肝炎转录后调控元件的截短形式；并且SV40是SV40聚腺苷酸化位点的截短
形式(PMCID:PMC3975461)。本公开内容涉及具有特定AAV血清型的重组AAV病毒颗粒和针对
表4中实施方式1-53中每一个的特定载体元件。可以使用适当的AAV辅助病毒提供特异于重
组病毒颗粒血清型的AAV衣壳蛋白。参见，例如，Yuan等，2011,Hum Gene Ther.22(5):613-
24，通过引用并入本文。hEf1a还可以指hEf1a启动子的截短形式，其长231bp并且以SEQ ID NO：18引用。
如果表达蛋白质，可以具有单独的翻译调控元件，从而表达分开的RNA。在一些实施方式中，单一RNA可以以顺反子形式表达，其中基因产物由单一RNA表达。因此，在一些实施方式中，基因治疗载体可具有多顺反子元件，例如内部核糖体进入位点(IRES)或2A序列(PMCID:
PMC3084703)，用于诱导核糖体跳跃，因为它们可能需要表达来自单一RNA的不同基因治疗
产物。
的每种单独载体的量可以基于载体设计、待递送的核酸序列、递送至靶组织的效率、给药方式和预期治疗效果等来确定。在各种实施方式中，可以从每个对象的最大病毒剂量通过每
个单独载体的有效性来评估同时给予的每种病毒载体的最佳比例。本领域技术人员可基于
本公开确定合适的比例和剂量。
上所述的多种病毒给予哺乳动物。因此，本公开内容提供了给予多种病毒的方法，所述病毒包括一个或多个或多种基因、抑制性RNA或抑制性蛋白质，其示例和组合在下文提供，特别是用于治疗或预防与衰老相关的疾病或病症。
Dgat1，病毒9包括Ctf1和Coq7，病毒10包括Adcy5，Agtr1a和mTOR。
Agtr1a，病毒8包括Agtr1a，ikbkb和mTOR，病毒9包括Slc13a1，pappa和Ctf1，病毒10包括Ctf1，Slc13a5(AAV9)。
生miRNA，其从细胞核输出到细胞质，在那里它沉默靶RNA的表达。示例性发夹环结构各自包括约70个核苷酸。每个发夹的两侧都是有效加工所必需的序列。
Nature 425(6956):415–9(2003)；Gregory RI.等,(2006)Methods Mol.Biol.342:33–47。
在该复合物中，DGCR8通过从由距离发夹碱基约11个核苷酸处切割RNA(一个螺旋dsRNA转变
为茎)来定向Drosha的催化性RNA酶III结构域以从初-miRNA释放发夹。参见Han,J等,
(2004)Genes&Development 18(24):3016–27；Han,J.等(2006)Cell 125(5):887–901。得到的产物在其3'末端具有两个核苷酸的突出端；它具有3'羟基和5'磷酸基团。它通常被称为
前-miRNA(前体-miRNA)。已经鉴定了对于有效加工重要的前-miRNA下游的序列基序。
Conrad,T.等,Cell Reports 9(2):542–554；Auyeung,V.等,(2013)Cell 152(4):844–858；
Ali,P.S.等,(2012)FEBS Letters 586(22):3986–90。
28(2):328–36。
34；Ohman M.(2007)Biochimie 89(10):1171–6。最常见的是，作为作用于RNA(ADAR)的称为腺苷脱氨酶的酶催化腺苷肌苷(A至I)转换。RNA编辑可以阻止核加工(例如，初-miR-142，导致核糖核酸酶Tudor-SN降解)并改变下游过程，包括细胞质miRNA加工和靶特异性(例如，通过改变中枢神经系统中miR-376的种子区域)。参见Kawahara Y,等,(2008)Nucleic Acids
Res.36(16):5270–80.
苷酸突出端。输出蛋白-5介导的向细胞质的转运是能量依赖性的，使用与Ran蛋白结合的
GTP。参见Murchison E.P.等,(2004)Curr.Opin.Cell Biol.16(3):223–9。
3'末端相互作用。参见Park,J.E.等,(2011)Nature 475(7355):201–5，并切除连接3'和5'臂的环，产生长度约22个核苷酸的不完全miRNA：miRNA*双链体。参见Lund E.等,(2006)
Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.71:59–66。总发夹长度和环尺寸影响切酶加工的效
率。miRNA:miRNA*配对的不完美性质也影响切割。参见Lund E.等,(2006)Cold Spring
Harb.Symp.Quant.Biol.71:59–66；Ji X(2008)Current Topics in Microbiology and
Immunology 320:99–116。一些富含G的前-miRNA可能会采用G-四联体结构作为规范茎环结构的替代品。例如，人前-miRNA 92b采用G-四链体结构，其对细胞质中切酶介导的切割具有抗性。参见Mirihana A.等,(2015)Chem.Biol.22:262–272。尽管双链体的任一链可能潜在地充当功能性miRNA，但通常仅将一条链并入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，其中miRNA及其mRNA靶标相互作用。
并且包括具有核酸酶活性的天然产生的DNA结合蛋白，例如在II型CRISPR系统中存在的
Cas9蛋白。这种Cas9蛋白和II型CRISPR系统在本领域中充分记载。参见Makarova等，Nature Reviews,Microbiology，第9卷，2011年6月，第467-477页，包括所有补充信息，通过引用全文纳入本文。这种RNA引导的DNA结合蛋白可包括附着于其上的一个或多个核定位信号，以
促进RNA引导的DNA结合蛋白转移到核酸酶中。
607；Gasiunas,G.等,(2012)Proc Natl Acad Sci USA 109,E2579-2586；Jinek,M.等
(2012)Science 337,816-821；Sapranauskas,R.等,(2011)Nucleic Acids Res 39:9275-
9282；和Bhaya,D.等,(2011)Ann Rev Gen 45:273-297。最近的酿脓链球菌(S.pyogenes)II型CRISPR系统的体外重建证明与正常反式编码tracrRNA融合的crRNA(“CRISPR RNA”)(“反式-作用CRISPR RNA”)足够引导Cas9蛋白序列特异性切割匹配crRNA的靶DNA序列。表达与
靶位点同源的gRNA导致Cas9招募以及靶DNA降解。参见H.Deveau等,(2008)J Bact 190,
1390。其他有用的Cas蛋白来自嗜热链球菌(S.thermophilis)或金黄色葡萄球菌
(S.aureus)。
HNH结构域和切割非互补链的RuvC-样结构域。参见Jinek等,(2012)Science 337,816-821,
其全部内容通过引用并入本文。已知Cas9蛋白存在于许多II型CRISPR系统中，包括如
Makarova等，Nature Reviews,Microbiology,卷9,2011年6月,第467-477页所述的下述内
容：海沼甲烷球菌C7；白喉棒状杆菌；棒状杆菌效率蛋白(efficien)YS-314；谷氨酸棒状杆菌ATCC13032Kitasato；谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032Bielefeld；谷氨酸棒状杆菌R；克氏棒杆菌(Corynebacterium kroppenstedtii)DSM 44385；脓肿分枝杆菌ATCC 19977；皮诺卡菌IFM10152；平红球菌PR4；约氏红球菌(Rhodococcus jostii)RHA1；混浊红球菌B4
uid36573；嗜酸纤维素分解菌11B；氯酚节杆菌A6；黄色生工菌(Kribbella flavida)DSM
17836 uid43465；弯曲高温单孢菌DSM 43183；齿双歧杆菌Bdl；长双歧杆菌DJO10A；贺氏史雷克氏菌(Slackia heliofrinireducens)DSM 20476；海洋普西芬尼菌(Persephonella
marina)EX HI；脆弱拟杆菌NCTC 9434；黄褐二氧化碳嗜纤维菌DSM 7271；黄杆菌ΠP0286；
粘蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)ATCC BAA 835；卡氏花弯菌(Roseiflexus
castenholzii)DSM 13941；花弯菌RSI；集胞藻PCC6803；细小迷踪菌(Elusimicrobium
minutum)Pei191；未培养的白蚁组1细菌系统型Rs D17；产琥珀酸丝状杆菌S85；蜡状芽孢杆菌ATCC 10987；英诺克李斯特菌(Listeria innocua)；干酪乳杆菌；鼠李糖乳杆菌GG；唾液乳杆菌UCC118；无乳链球菌A909；无乳链球菌NEM316；无乳链球菌2603；似马停乳链球菌
(Streptococcus dysgalactiae equisimilis)GGS 124；兽瘟马链球菌(Streptococcus
equi zooepidemicus)MGCS10565；解没食子酸链球菌(Streptococcus gallolyticus)
UCN34uid46061；格氏链球菌查利斯变种(Streptococcus gordonii Challis subst)CHI；
变形链球菌NN2025uid46353；变形链球菌；化脓性链球菌M1GAS；化脓性链球菌MGAS5005；化脓性链球菌MGAS2096；化脓性链球菌MGAS9429；化脓性链球菌MGAS10270；化脓性链球菌
MGAS6180；化脓性链球菌MGAS315；化脓性链球菌SSI-1；化脓性链球菌MGAS 10750；化脓性链球菌NZ131；嗜热链球菌CNRZ1066；嗜热链球菌LMD-9；嗜热链球菌LMG 18311；肉毒杆菌A3Loch Maree；肉毒杆菌B Eklund 17B；肉毒杆菌Ba4 657；肉毒杆菌F朗格兰岛；解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)H10；大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)ATCC 29328；直肠短杆菌ATCC 33656；鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)；运动支原体(Mycoplasma mobile)163K；穿透支原体(Mycoplasma penetrans)；滑液囊支原体(Mycoplasma
synoviae)53；念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)DSM 12112；慢生根瘤菌
(Bradyrhizobium)BTAi1；汉堡包硝化细菌(Nitrobacter hamburgensis)X14；沼泽红假单
孢菌(Rhodopseudomonas palustris)BisB18；沼泽红假单孢菌(Rhodopseudomonas
palustris)BisB5；食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)DS-1；海洋玫瑰杆菌(Dinoroseobacter shibae)DFL 12；固氮葡萄糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter
diazotrophicus)Pal 5FAPERJ；固氮葡萄糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter
diazotrophicus)Pal 5JGI；固氮螺菌(Azospirillum)B510uid46085；深红红螺菌
(Rhodospirillum rubrum)ATCC 11170；迪氏菌(Diaphorobacter)TPSY uid29975；赤子爱
胜蚓生菌(Verminephrobacter eiseniae)EF01-2；脑膜炎奈瑟氏球菌053442；脑膜炎奈瑟
氏球菌α14；脑膜炎奈瑟氏球菌Z2491；需盐脱硫弧菌(Desulfovibrio salexigens)DSM
2638；空肠弯曲杆菌德莱亚种(Campylobacter jejuni doylei)269 97；空肠弯曲菌
(Campylobacter jejuni)81116；空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)；海鸥弯曲杆菌
(Campylobacter lari)RM2100；肝螺杆菌；产琥珀酸沃林氏菌(Wolinella succinogenes)；
奥湖甲苯单胞菌(Tolumonas auensis)DSM 9187；大西洋假交替单胞菌
(Pseudoalteromonas atlantica)T6c；皮氏希瓦氏菌(Shewanella pealeana)ATCC
700345；巴黎嗜肺军团菌(Legionella pneumophila Paris)；琥珀酸放线杆菌
(Actinobacillus succinogenes)130Z；多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)；土拉
弗朗西斯菌新变种(Francisella tularensis novicida)U112；土拉弗朗西斯菌全北区亚
种(Francisella tularensis holarctica)；土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)
FSC 198；土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)；土拉弗朗西斯菌(Francisella
tularensis)WY96-3418；和牙密螺旋体(Treponema denticola)ATCC 35405。在文献中，本领域技术人员可将Cas9蛋白称为Csn1。Deltcheva等,(2011)Nature 471,602-607中提供了
示例性化脓性链球菌(S.pyogenes)Cas9蛋白质序列，其全文通过引用并入本文。
Nature 482,331所述，其各自通过引用整体并入本文。
示出核酸酶活性的一个或多个多肽序列，即核酸酶结构域，使得DNA结合蛋白上没有显示出核酸酶活性的一个或多个多肽序列，即核酸酶结构域。基于本发明，灭活核酸酶活性的其他修饰将对于本领域技术人员而言是显而易见的。因此，无核酸酶活性的DNA结合蛋白包括经修饰以灭活核酸酶活性或去除一个或多个多肽序列以灭活核酸酶活性的多肽序列。无核酸
酶活性的DNA结合蛋白保留了结合至DNA的能力，即使核酸酶活性已经被灭活。因此，DNA结合蛋白包括DNA结合所需的一个或多个多肽序列，但是可缺少显示核酸酶活性的一个或多
个或全部核酸酶序列。因此，DNA结合蛋白包括DNA结合所需的一个或多个多肽序列，但是可具有显示灭活的核酸酶活性的一个或多个或全部核酸酶序列。参见Jinek等,(2012)
Science 337,816-821。缺乏核酸酶活性的Cas9蛋白被称为无核酸酶活性(nuclease-null)
的Cas9(“Cas9Nuc”)并且表现出降低或消除的核酸酶活性，或在检测水平内不存在或基本上不存在核酸酶活性。根据该方面，使用已知测定法检测Cas9Nuc的核酸酶活性可能是不可检测的，即低于已知测定的检测水平。
80％，90％，95％，98％或99％同源性并且是DNA结合蛋白(例如RNA引导的DNA结合蛋白)的蛋白质序列。
示例性CRISPR系统包括化脓性链球菌(S.pyogenes)Cas9核酸酶(Sp.Cas9)，其，从II型
CRISPR相关系统分离的具有极高的亲和力(参见Sternberg,S.H.,等,(2014)Nature 507,
62-67，其通过引用整体并入本文)的可编程DNA结合蛋白(参见Garneau,J.E.等,(2010)
Nature 468,67-71和Jinek,M.等,(2012)Science 337,816-821，其各自通过引用整体并入
本文)。各种Cas蛋白是本领域技术人员已知的，包括CasI(Cas3)、Cas IA(Cas8a)、CasIB
(Cas8b)、CasIC(Cas8c)、CasID(Cas10d)、CasIE(Cse1)、CasIF(Csy1)、CasIU、CasII(Cas9)、CasIIA(Csn2)、CasIIB(Cas4)、CasIIC、CasIII(Cas10)、CasIIIA(Csm2)、CasIIIB(Cmr5)、CasIIIC、CasIIID、CasIV(Csf1)、CasIVA、CasIVB、CasV(Cpf1)、C2c2和C2c1等。
1491；Shalem,O.等,(2014)Science 343,84-87；Wang,T.等,(2014)Science 343:80-84；
Nissim,L.等,(2014)Molecular Cell 54:698-710；Ryan,O.W.等,(2014)eLife 3；
Gilbert,L.A.等,(2014)Cell 159(3):647-61；and Citorik,R.J.等,(2014)Nature
Biotechnol.32:1141–1145，其各自都通过引用整体并入本文)，引导通常以所谓sgRNA(单引导RNA)呈递，其中两个天然Cas9RNA辅因子(gRNA和tracrRNA)通过工程化的环或接头而
融合。
白。
tracr配对序列和tracr序列中的一种或多种。术语间隔序列是本领域技术人员所理解的，
可包括与靶核酸序列具有足够互补性的任何多核苷酸以与靶核酸序列杂交并且将CRISPR
复合物与靶序列直接序列特异性结合。引导RNA可以由与tracr配对序列(可以称为crRNA)
共价连接的间隔序列和单独的tracr序列形成，其中tracr配对序列与tracr序列的一部分
杂交。根据某些方面，tracr配对序列和tracr序列通过例如接头序列通过共价键连接或联
接，该构建体可以称为tracr配对序列和tracr序列的融合体。本文提及的接头序列是核苷
酸序列，在本文中称为核酸序列，其连接tracr配对序列和tracr序列。因此，引导RNA可以是双组分物质(即，一起杂交的分开的crRNA和tracr RNA)或单分子物质(即crRNA-tracr RNA
融合体，通常称为sgRNA)。
个核苷酸。
引导的DNA调控。根据本发明的一个方面，一个或多个转录调控蛋白或结构域(这类术语互
换使用)接合或连接至核酸酶缺陷型Cas9或者一种或多种引导RNA(gRNA)。转录调控结构域
对应于被靶向的基因座。因此，本公开内容的多方面包括通过将转录调控结构域融合、连接或接合至Cas9N或至gRNA而将这些结构域定位于靶向的基因座的方法和材料。
Cas9N蛋白将转录调控结构域提供至靶线粒体DNA的位点。根据一个方法，提供了在细胞内
与转录调控结构域融合的突变体Cas9N，其伴随一种或多种引导RNA。具有与其融合的转录
调控结构域的突变体Cas9N在靶线粒体DNA处或附近结合。一种或多种引导RNA在靶线粒体
DNA处或附近结合。转录调控结构域调控靶线粒体核酸序列的表达。根据一个具体方面，突变体Cas9N-VP64融合体与靶向启动子附近的gRNA靶向序列组合时激活报告构建体的转录，
从而显示RNA引导的转录激活。
达。根据一个具体方面，突变体Cas9N蛋白和与转录调控结构域融合的gRNA激活报道构建体的转录，从而显示RNA引导的转录激活。
gRNA系统(具有完整切割或dCas9，与VP16、RAB、HDAC、甲基转移酶等融合或不融合，或者能够募集具有“间谍捕获器”或MS2募集结构域或类似物的类似的激活子或抑制子)可用于增
加或减少本文提供的靶基因的表达，以组合用于治疗或预防效果。
结合或以其他方式共定位。基于本发明，本领域技术人员将能易于鉴定或设计引导RNA和
Cas9蛋白，其共定位至包括靶核酸。本领域技术人员将能够进一步鉴定转录调控蛋白或结
构域，其同样与靶核酸共定位。
胞，哺乳动物细胞，动物细胞，人细胞等。此外，细胞包括其中调控功能性蛋白质的生产将是有益的或期望的任何细胞。此类细胞可包括缺乏特定蛋白质表达并导致疾病或有害病症的
细胞。这些疾病或有害病症是本领域技术人员容易知道的。根据本公开，负责表达特定蛋白质的核酸可以通过本文描述的方法而被转录激活子靶向，导致靶核酸的上调和特定蛋白质
的相应表达。以这种方式，本文描述的方法提供治疗性治疗。此类细胞可包括过表达特定蛋白质的细胞，或者其中期望特定蛋白质的产生减少的细胞，导致疾病或有害病症。这些疾病或有害病症是本领域技术人员容易知道的。根据本公开，负责表达特定蛋白质的核酸可以
通过本文描述的方法而被转录抑制子或阻遏物靶向，导致靶核酸的下调和特定蛋白质的相
应表达。以这种方式，本文描述的方法提供治疗性治疗。
核酸给予对象而递送至对象，例如全身给予对象，例如通过静脉内给予或注射，腹膜内给予或注射，肌内给予或注射，颅内给予或注射，眼内给予或注射，皮下给予或注射。
象的方法(例如使用腺相关病毒)，其各自通过引用整体并入本文。
非附加体哺乳动物载体)整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。并且，某些载体能够引导与其操作性连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。用于重组DNA技术中的常见表达载体通常是质粒形式。重组表达载体可包含本发明的核酸序
列，该核酸序列具有适于所述核酸在宿主细胞中表达的形式，这意味着该重组表达载体包
括一种或多种调控元件，基于待用于表达的宿主细胞对其进行选择，其被操作性连接至待
表达的核酸序列。在重组表达载体内，“操作性连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以允许该核苷酸序列表达(例如在体外转录/翻译系统中，或者，当载体被导入宿主细胞时在宿主
细胞中)的方式与调控元件连接。
946,787；和4,897,355，其通过引用并入本文。脂质转染试剂市售可得(例如，TransfectamTM和LipofectinTM)。适于多核苷酸的高效受体-识别脂质转染的阳离子和中性脂质包括
Felgner、WO 91/17424、WO 91/16024的那些。可以递送至细胞(例如，体外或离体给予)或靶组织(例如，体内给予)。术语天然包括蛋白质、酶或引导RNA物质本身，而不包括编码该物质的核酸。
毒基因组)用作在哺乳动物细胞中引入和/或表达编码胆色素原脱氨酶的核苷酸序列的载
体。细小病毒科的病毒是小DNA动物病毒。细小病毒科可分为两个亚科：感染脊椎动物的细小病毒亚科和感染昆虫的浓核病毒亚科。细小病毒亚科的成员在本文中称为细小病毒并且
包括腺伴随病毒(Dependovirus)属。从其属的名称可以推断，腺伴随病毒属的成员是独特
的，因为它们通常需要与辅助病毒如腺病毒或疱疹病毒共感染以在细胞培养物中产生感
染。腺伴随病毒属包括通常感染人类(例如，血清型1、2、3A、3B、4、5和6)或灵长类动物(例如血清型1和4)的AAV，以及感染其他温血动物(例如，牛、犬、马和绵羊腺相关病毒)的相关病毒。关于细小病毒和细小病毒科的其他成员的进一步信息在Kenneth 1.Berns,"细小病毒
科：《病毒及其复制》(Parvoviridae:The Viruses and Their Replication)"病毒学领域第69章(1996年第三版)中有描述。为方便起见，本文通过参考AAV进一步例示和描述了本发明。然而，应理解，本发明不限于AAV，而是同样可以应用于其他细小病毒。
构(VP)蛋白的独特编码核苷酸序列的侧翼。VP蛋白(VP1，-2和-3)形成衣壳。末端145nt是自身互补的并且被组织成可以形成能量稳定的分子内双链体，该双链体形成T形发夹。这些发夹结构作为病毒DNA复制的起点，用作细胞DNA聚合酶复合物的引物。在哺乳动物细胞中野
生型(wt)AAV感染后，Rep基因(即Rep78和Rep52)分别由P5启动子和P19启动子表达，并且两种Rep蛋白在病毒基因组的复制中具有功能。Rep ORF中的剪接事件导致实际上表达四种
Rep蛋白(即Rep78，Rep68，Rep52和Rep40)。然而，已经显示哺乳动物细胞中编码Rep78和
Rep52蛋白的未剪接mRNA足以产生AAV载体。同样在昆虫细胞中，Rep78和Rep52蛋白质足以
产生AAV载体。
核酸构建体中时(例如在染色体中或在另一种载体中，例如用于克隆或转染的质粒或杆状
病毒)，则rAAV载体通常被称为“前载体”，其在存在AAV包装功能和必要的辅助功能的情况下，可以通过复制和封装而被“拯救”。因此，在另一方面，本发明涉及核酸构建体，其包含编码如上文所定义的胆色素原脱氨酶的核苷酸序列，其中所述核酸构建体是重组细小病毒或
AAV载体，因此包含至少一种细小病毒或AAV ITR。优选地，在核酸构建体中，编码胆色素原脱氨酶的核苷酸序列的两侧是细小病毒或AAV ITR。
纤维细胞的AAV转导显著地比类似的鼠细胞更有效(Jennings等,(2001)Arthritis Res，3:
1)，并且AAV的细胞的嗜性(tropicity)在血清型之间不同。参见例如Davidson等(2000)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:3428-3432),讨论了AAV2，AAV4和AAV5在哺乳动物CNS细胞趋
向性和转导效率方面的差异；Goncalves，(2005)Virol J.2(1)：43，其讨论了修饰AAV趋向性的方法。在一些实施方式中，对于肝细胞的转导，优选具有AAV1、AAV8和AAV5衣壳蛋白的rAAV病毒颗粒(Nathwani等,(2007)Blood 109(4):1414-1421；Kitajima等,(2006)
Atherosclerosis 186(1):65-73)，其中最优选具有AAV5衣壳蛋白的rAAV病毒颗粒。
型，每种血清型具有不同的组织类型的趋向性，参见Zincarelli,C.,等,(2008)Mol
Ther.16(6):1073-80)，其允许通过适当的假型化优先靶向特定组织。一些血清型，例如血清型8、9和rh10，转导哺乳动物体。参见Zincarelli,C.,等,(2008)Mol Ther.16(6):1073-
80,Inagaki,K.,等,(2006)Mol Ther.14(1):45-53；Keeler,A.M.,等,(2012)Mol Ther.20
(6):1131-8；Gray,S.J.等,(2011)Mol Ther.19(6):1058-69；Okada,H.,等,(2013)Mol
Ther Nucleic Acids.2:e95；和Foust,K.D.,等,(2009)Nat Biotechnol.27(1):59-65。已
经证明AAV9穿过许多病毒载体和生物物质都无法通过的血脑屏障(参见Foust,K.D.,等,
(2009)Nat Biotechnol.27(1):59-65；和Rahim,A.A.等,(2011)FASEB J.25(10):3505-
18)。某些AAV的有效载荷为4.7-5.0kb，包括病毒反向末端重复序列(ITR)，这是顺式病毒包装所必需。参见Wu,Z.等,(2010)Mol Ther.18(1):80-6；和Dong,J.Y.等,(1996)Hum Gene
Ther.7(17):2101-12；所有出版物通过引用并入本文。
力允许产生包含一种血清型(例如，AAV5)的衣壳蛋白和另一种AAV血清型的Rep和/或ITR序
列的假型rAAV颗粒(例如，AAV2)。这种假型rAAV颗粒是本发明的一部分。在本文中，假型
rAAV颗粒可以被称为“x/y”型，其中“x”表示ITR的来源，“y”表示衣壳的血清型，例如2/
5rAAV粒子具有来自AAV2的ITR和来自AAV5的衣壳。修饰的“AAV”序列也可以用于本公开的上下文中，例如，用于在昆虫细胞中产生rAAV载体。这种修饰序列例如包括与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV 10、AAV11、AAV12、AAV2.5、AAvDJ、AAVrh10.XX ITR、Rep或VP具有至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约
95％，或更多核苷酸和/或氨基酸序列相同性的序列(例如，具有约75％至约99％核苷酸序
列相同性的序列)，可代替野生型AAV ITR，Rep或VP序列。优选的腺病毒载体被修饰以降低宿主响应。参见例如Russell(2000)J.Gen.Virol.81:2573-2604；美国专利公开号
20080008690；和Zaldumbide等(2008)Gene Therapy 15(4):239-46；所有公开通过引用并
入本文。
引导核苷酸序列组成型表达的那些和仅在某些宿主细胞中引导核苷酸序列表达的那些(例
如，组织特异性调控序列)。组织特异性启动子可以主要在期望的目标组织中引导表达，目标组织例如肌肉，神经元，骨，皮肤，血液，特定器官(例如肝脏，胰腺)或特定细胞类型(例如淋巴细胞)。调控元件还可以以时间依赖性方式引导表达，例如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式，其可以或可以不是组织或细胞类型特异性的。在一些实施方式中，载体可包含一种或多种pol III启动子(例如1、2、3、4、5或更多种pol III启动子)、一种或多种pol II启动子(例如1、2、3、4、5或更多的pol II启动子)，一种或多种pol I启动子(例如1、2、3、
4、5或更多个pol I启动子)，或其组合。pol III启动子的实例包括但不限于U6和H1启动子。
pol II启动子的例子包括但不限于：逆转录病毒Rous肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选连有
RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选连有CMV增强子)[参见，例如：Boshart等，Cell，
41：521-530(1985)]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EFlα启动子和本文所述的Pol II。术语“调控元件”还包括增强子元件，例如WPRE；CMV增强子；HTLV-I的LTR中的R-U5'区段(Takebe,Y.(1988)Mol.Cell.Biol.8(1):
466-472)；SV40增强子；和兔β-球蛋白的外显子2和3之间的内含子序列(O'Hare K.等,
(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.78(3):1527-31)。本领域技术人员应理解，表达载体的设计可取决于如下因素，如待转化的宿主细胞的选择、所需的表达水平等。可以将载体引入宿主细胞中，从而产生转录物，蛋白质或肽，包括由本文所述的核酸编码的融合蛋白或肽(例如，成簇且规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)转录物，蛋白质，酶，其突变体形式，其融合蛋白等)。
信号来介导转录终止，所述信号触发从转录复合物释放mRNA的过程。这些过程包括mRNA二
级结构与募集的终止因子的复合物和/或间接活性的直接相互作用。转录复合物的释放释
放RNA聚合酶和相关的转录机制以开始新mRNA的转录。终止子序列包括本领域已知的并在
本文中鉴定和描述的序列。
Pharmacy)，Alfonso R.Gennaro(编辑)出版公司(1997)。示例性药物形式可以与无菌盐水，右旋糖溶液或缓冲溶液或其他药学上可接受的无菌流体组合。或者，可以使用固体运载体，例如微载体珠。
及通过使用表面活性剂。在许多情况下，组合物中可优选地包含等张剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。组合物中包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸盐和明胶可延长可注
射组合物的吸收。本公开的载体可以以时间释放制剂或控释制剂给予，例如在包含缓释聚
合物或其他运载体的组合物(包括植入物和微囊化递送系统)中，将保护化合物免于快速释
放。例如，可以使用可生物降解的，生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯，聚酐，聚乙醇酸，胶原，聚原酸酯，聚乳酸和聚乳酸、聚乙醇酸共聚物(PLG)。
至靶向的组织，例如心脏，肝脏，滑膜或鞘内给予至神经组织。在一些实施方式中，基因递送载体可经局部给予，例如通过导管给予。给药途径可以由本领域技术人员确定，考虑例如靶组织的性质、基因递送载体、预期的治疗效果和可以给予并由靶组织吸收的最大负荷。
佳治疗响应。
业判断而随时间调整特定剂量方案。本文所述的剂量范围仅是示例性的，并不限制医师可
以选择的剂量范围。
1x1012gc/kg，或1x1011至1x1014基因组拷贝(gc)/kg。
少或增加剂量。在一些实施方式中，基因递送载体可以每天，每周，每两周或每月给予。治疗持续时间可以是至少一周，1个月，2个月，3个月，6个月或8个月或更长时间。在一些实施方式中，治疗持续时间可长达1年或更长，2年或更长，3年或更长或无限期。
或本发明改善了老年人和年长的人中常见的疾病，包括心血管疾病，糖尿病，动脉粥样硬
化，肥胖，癌症，感染和神经系统疾病中的一种或多种。可以使用任何完善的衰老进展指标。
功能的下降；改善或减少神经肌肉协调的下降；和改善或减少免疫功能的下降。本文的基因治疗方法提供的年龄相关疾病的改善可以是与未治疗的群体相比，受影响的对象的症状减
轻或者群体中疾病或病症的发生率降低的结果。基因治疗具有治疗和/或预防各种年龄相
关病症和疾病的作用，如通过衰老的特定标志物和紊乱所评估的。因此，在另一方面，本发明涉及如上所述的基因治疗方法或核酸载体的用途，用于治疗或预防对象的至少一种选自
以下的病症或衰老标志物：心血管功能降低，骨质疏松症，关节病，葡萄糖耐受不良，胰岛素抵抗，记忆丧失，神经肌肉协调丧失，心血管疾病增加，心脏、循环或肺功能降低和寿命减少或其组合。
延长。在一些实施方式中，延长的寿命可以是最大寿命增加5％，10％，15％，20％或更多和/或平均寿命增加5％，10％，15％，20％或更多。
(例如家养动物，例如狗或猫)中长期调控TGFβ1的基因治疗方法，作为治疗或预防炎症、重塑或纤维化的方法。本公开内容提供了用于调控动物例如人或其他哺乳动物(例如家养动
物，例如狗或猫)中的TGFβ1的基因治疗方法，用于治疗心脏病变，例如增加的纤维化。本公开提供了通过基因治疗方法调控TGFβ1，包括通过例如腺相关载体将核酸递送至细胞。本公开提供了通过递送核酸来调控TGFβ1，所述核酸产生结合TGFβ1的可溶性循环蛋白，从而抑制其激活其内源途径的能力。可溶性循环蛋白可以是TGFβ受体2的细胞外结构域。本领域技术人员也可以从TGFβ受体1或3产生形式。如由注释软件和氨基酸的疏水性所预测的，可溶性TGFβ受体2蛋白在蛋白质的跨膜结构域被截短。
正向引物的粗体和斜体部分是Kozak序列。反向引物的
粗体和斜体部分匹配通过重叠PCR在C末端融合的小鼠igg结构域。
TCATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAGCTC(SEQ ID NO:2)用于扩增igg结构域。粗体和斜体部分匹配
TGFbR2的细胞外结构域用于重叠PCR。在第二轮PCR中，使用相等摩尔比的扩增段来合并两
部分，使用来自TGFbR2扩增的正向引物和来自igg扩增的反向引物。这产生了融合蛋白
sTGFbR2-Fc(igg2Ae)，总长度为1251个碱基对。其由独特的限制酶位点突出NotI和NheI连
接到AAV骨架中。
细胞在来自Thermo科学公司(伊利诺伊州罗克福德)的10层NuncTMCell FactoryTM系统中使
用PEI转染试剂按照制造商的说明以75％汇合共转染三份。转染后72小时分别收获细胞和
上清液。将细胞离心并用3次冷冻-解冻循环裂解，并用Benzonase(E1015-25KU，Sigma公司)孵育。然后通过在10,500xG下旋转20分钟澄清，并将上清液加入剩余的培养基上清液中。将所有物质通过0.2uM滤器过滤，然后使用实验室规模的TFF系统(EMD化学公司，新泽西州吉
布斯镇)浓缩至15ml。使用Pellicon XL 100kDa滤器并遵循制造商说明(EMD化学公司，新泽西州吉布斯镇)。通过在10,500×g和15℃下离心20分钟重新澄清浓缩的制剂，并将上清液
小心地移至新管中。根据Zolotukhin及其同事的方法形成六个碘克沙醇步进梯度。参见
Zolotukhin S.,(1999)Gene Ther.6:973-85，进行了如下修改：在含有10mM氯化镁和25mM
钾的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中密度越来越高的碘克沙醇(OptiPrep；Sigma-Aldrich公司，密苏里州圣路易斯)溶液在39ml Quick-Seal离心管(Beckman Instruments，Palo Alto，CA)
依次铺垫。梯度的步进是4ml的15％，9ml的25％，9ml的40％和5ml的54％碘克沙醇。然后将
14毫升澄清的原料覆盖在梯度上并密封管。将管在242,000×g下在VTi 50转子(Beckman仪
器公司)中于18℃离心70分钟，并通过在54％/40％界面水平插入的18号针收集40％梯度。
含有碘克沙醇的病毒使用Amicon15-Ultra进行渗滤，用最终制剂缓冲液(PBS-35mM NaCl)
洗涤5次，并浓缩至约1ml。
性载体基因组。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)评估梯度级分和最
终载体批次的纯度，并通过SYPRO红宝石染色(Invitrogen公司)和UV激发使蛋白质可视化。
下以使血管扩张，使静脉变大。然后使用25号针向小鼠注射多至200ul。RO注射在麻醉下进行。麻醉的小鼠通过施加轻微压力使眼睛膨胀并将针头滑到眼睛后面而准备，成年小鼠只
需150ul。
主动脉从肺动脉中分离出来，并将无菌的8.0聚丙烯结扎线从心脏基部约3mm处绕过它。将
钝化的27号针置于主动脉顶部，并将结扎线系在针周围。然后小心地从系连下面取出针。肋骨扩张器关闭，肺部再次充气。使用无菌缝合线(5-0Dexons和6-0Prolene缝合线分别关闭
肌肉和皮下层和皮肤)闭合肋骨，胸部肌肉组织和皮肤。外科医生将通过扩张肺部来最小化气胸，同时放置最后缝合线结束开胸术。假手术动物经历类似的过程而没有主动脉缩窄。密切监测动物直至从麻醉中完全恢复。一旦动物恢复知觉(并且能够保护其气道)，动物将被
拔管。持续密切监测动物，直至达到完全的神经意识。缝合线将在手术后10-14天移除。根据需要，在临床术后记录中记录外科手术的日期，时间和类型。ACC手术死亡率可能为30％。
心率和呼吸速率。超声图像通常在15分钟内获得并且不会导致动物疼痛。在手术过程中，密切监测动物的任何窘迫迹象，如果有任何迹象，立即终止手术并将动物放回笼中。
去知觉。在呼吸停止(几分钟)时，动物将接受第二次安乐死物理方法。
冲液中冷冻用于切片和分析。
AAV用于TGFβ1的长期永久性减少，这有利于减少心力衰竭并改善寿命，如图7中所示的存活曲线所示。可溶性受体蛋白结合TGFβ1以减少该途径的信号传导并减轻纤维化组织诱导和
炎症反应。如图2所示，给予带有编码转化生长因子受体II(TGFbRII)的可溶性受体蛋白的
核酸的AAV使血清TGFβ1降低多达95％，导致TGFβ1信号传导减少。
法。Nrf2是一种抗氧化蛋白，可以防止因受伤和炎症引起的氧化损伤。本公开内容提供了通过直接注射两种病毒而组合使用它们的方法，每种病毒含有一个转基因盒(即ITR-hEf1α-
sTGFbR2-Fc-WPRE3-SV40pA-ITR和ITR-hEf1α-Nrf2-WPRE3-SV40pA-ITR)。本公开提供了通
过使用病毒2A序列或IRES将两种转基因合并成一种载体，其中两种基因由一个启动子表达
(即ITR-hEf1α-sTGFbR2-Fc-P2A-Nrf2-WPRE3-SV40pA-ITR或ITR-hEf1α-sTGFbR2-Fc-IRES-Nrf2-WPRE3-SV40pA-ITR)。
编码脂连蛋白的核酸在第一载体中提供，编码DsbA-L的核酸在第二载体中提供。第一载体
和第二载体是自身互补AAV载体。自身互补的腺相关病毒(scAAV)是由天然存在的腺相关病
毒(AAV)工程化的病毒载体。rAAV被称为“自身互补”，因为编码区被设计为形成分子内双链DNA模板。标准AAV基因组的限速步骤涉及第二链合成，因为典型的AAV基因组是单链DNA模
板。然而，scAAV基因组不是这种情况。在感染时，scAAV的两个互补半部分将关联而不是等待第二链的细胞介导的合成，以形成一个准备立即复制和转录的双链DNA(dsDNA)单元。在
利用rAAV的基因治疗应用中，病毒用单链DNA(ssDNA)转导细胞，侧翼为两个反向末端重复
序列(ITR)。这些ITR在序列末端形成发夹，用作在随后的感染步骤开始之前引发第二链合
成的引物。第二链合成被认为是用以有效感染的几个区块之一。scAAV的其他优点包括体外和体内增加和延长的转基因表达，以及更高的体内DNA稳定性和更有效的环化。
为了平衡由于增加的FGF21表达而引起的骨损失的负面影响，递送了多个基因。FGF21会导
致体重减轻，如图8A和8B所示，而没有任何明显的毒性(通过身体状况评分和活性监测所
示)。保持高脂肪饮食的小鼠能够减掉高达40％的体重(恢复到他们年龄的小鼠的正常体
重)并且似乎已经达到正常范围。为了对抗骨损失，BMP2、BMP4或Sema3a中的一种或两种或全部与FGF21同时或串联递送，作为组合疗法的一部分，以将平衡转变回成骨细胞和破骨细胞的体内平衡。
(上调或下调)FGF21。
状态改变。参见图16。确定了基因治疗对呼吸率和活动的影响。将用FGF21处理的小鼠置于Columbus Instruments CLAMS系统中以测量它们的O2消耗，CO2产生及其在X、Y、Z平面中的移动，结果显示在图17中。一旦小鼠进入系统，数据就会自动生成。与对照相比，维持瘦体重同时消耗更多食物的FGF21小鼠具有更高的代谢活性，如通过增加的O2消耗和CO2产生所示。
然而，正如运动传感器所示，FGF21小鼠表现出较少的运动，这另外表明，它们改变的线粒体活性和代谢状态而不是它们的行为是导致它们在高脂肪饮食时维持瘦体重的能力的原因。
平。然后通过口服管饲法对小鼠给予一定剂量的葡萄糖溶液，使用多至500ul的ddH2O中的
250mg/ml葡萄糖。然后采集血液并以下列增量测量血糖：15分钟，30分钟，60分钟和120分钟。数据显示在图18中，左手图是几种不同剂量的FGF21，然后是其他蛋白质恒定1E10剂量的FGF21的不同组合。测试了FGF21+sTGFbR2-FC和FGF21+sTGFbR2-FC+Klotho，结果显示在
右手图中，标明了葡萄糖的差异。
组合递送已经显示体重减轻而没有毒性的证据(通过身体状况评分和活动监测所示)。如图
9所示，这些小鼠体重减轻了多达15％并继续呈下降趋势。
miRNA-shRNA序列。面向上游的盒和面向下游的盒防止两个盒之间的通读。两个盒的示意图如下：ITR_3'UTR-1_7miRNA_启动子-1__启动子-2_7miRNA_3'UTR-2_ITR。第一盒面向上游
3’←5’.<-------第二盒面向下游5’→3’("正常")------>，如示意图所示：ITR___
<---------------____--------------->___ITR.
上清液与含有天然狗TGFb1的狗血清混合，并测定细胞分泌可溶性TGFβ受体2的能力。如图
15所示，天然狗蛋白不会产生或分泌，包括小鼠/人分泌信号的杂合狗蛋白质也不会产生或分泌。293-Hek细胞能够更好地分泌包括小鼠/人分泌信号的杂合狗蛋白。
调节分泌信号的功效，并且可以针对特定的目的基因优化分泌信号。
sHef1a-Nrf2-WPRE3-SV40pA(双重疗法)。第二组小鼠用1E11vg/小鼠的AAV8:sHef1a-
sTGFbR2-FC-WPRE3-SV40pA(单一疗法)处理。对照AAC小鼠接受手术但未接受治疗。与对照
相比，接受双重治疗或单一治疗的小鼠具有更高的缩短分数，更高的射血分数和更低的心
脏质量。根据某些方面，在治疗或预防心力衰竭或肾衰竭的方法中，用sTGFbR2-FC,
sTGFbR2-FC+FGF21,sTGFbR2-FC+Klotho,或sTGFbR2-FC+FGF21+Klotho处理小鼠。
分叉为补偿方案，从而克服3个月前放置的手术带。所有对照小鼠都会失去功能，很可能在未来几周内死亡。而最终补偿的其他组中的老鼠没有表现出他们将会死亡的迹象。超声心
动图全部在有意识的小鼠上进行，并用天然回声软件进行分析。
sHef1a-FGF21-WPRE3-SV40pA,1E11vg/小鼠的AAV8:sHef1a-Klotho-WPRE3-SV40pA,
1E11vg/小鼠的AAV8:sHef1a-sTGFbR2-Fc-WPRE3-SV40pA。所有剂量均促进体重减轻，而
1E11和1E10促进体重持续减轻。
小鼠的体重。结果如图21所示。该实验在各种治疗组之间在昼夜节律，呼吸速率，寿命，每日运动和夜间运动方面产生了许多差异。治疗组和基因治疗的组合如下表5所示。
Klotho和sTGFbR2-FC。图22显示了对照小鼠和用sTGFbR2-Fc基因疗法治疗的小鼠的肾脏之
间的显著差异。A和C描绘了非手术对侧对照肾脏。B和D描绘UUO肾脏，B描绘了与D相比改善的结果。
TGTGGTGGTGGATCTGGACCCAGAAGACCCTGAGGTGCAGATCAGCTGGTTCGTGGACGGTAAGCAGATGCAAACAG
CCAAGACTCAGCCTCGTGAGGAGCAGTTCAATGGCACCTACCGTGTGGTCAGTGTCCTCCCCATTGGGCACCAGGAC
TGGCTCAAGGGGAAGCAGTTCACGTGCAAAGTCAACAACAAAGCCCTCCCATCCCCGATCGAGAGGACCATCTCCAA
GGCCAGAGGGCAAGCCCATCAGCCCAGTGTGTATGTCCTGCCGCCATCCCGGGAGGAGTTGAGCAAGAACACAGTCA
GCTTGACATGCCTGATCAAAGACTTCTTCCCACCTGACATTGATGTGGAGTGGCAGAGCAATGGACAGCAGGAGCCT
GAGAGCAAGTACCGCACGACCCCGCCCCAGCTGGACGAGGACGGGTCCTACTTCCTGTACAGCAAGCTCTCTGTGGA
CAAGAGCCGCTGGCAGCGGGGAGACACCTTCATATGTGCGGTGATGCATGAAGCTCTACACAACCACTACACACAGG
AATCCCTCTCCCATTCTCCGGGTAAATGA
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GGCAAGGCGTTCGCATGCGCGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGG
GTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCT
GCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAG
AACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGT
GGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGA
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AGCTACTCCCAGGTTGCCCACATTCCCAAACAAGATGCCTTGTACTTTGAAGACTGTATGCAGCTTTTGGCAGAGAC
ATTCCCATTTGTTGATGACCATGAGTCGCTTGCCCTGGATATCCCCAGCCACGCTGAAAGTTCAGTCTTCACTGCCC
CTCATCAGGCCCAGTCCCTCAATAGCTCTCTGGAGGCAGCCATGACTGATTTAAGCAGCATAGAGCAGGACATGGAG
CAAGTTTGGCAGGAGCTATTTTCCATTCCCGAATTACAGTGTCTTAATACCGAAAACAAGCAGCTGGCTGATACTAC
CGCTGTTCCCAGCCCAGAAGCCACACTGACAGAAATGGACAGCAATTACCATTTTTACTCATCGATCTCCTCGCTGG
AAAAAGAAGTGGGCAACTGTGGTCCACATTTCCTTCATGGTTTTGAGGATTCTTTCAGCAGCATCCTCTCCACTGAT
GATGCCAGCCAGCTGACCTCCTTAGACTCAAATCCCACCTTAAACACAGATTTTGGCGATGAATTTTATTCTGCTTT
CATAGCAGAGCCCAGTGACGGTGGCAGCATGCCTTCCTCCGCTGCCATCAGTCAGTCACTCTCTGAACTCCTGGACG
GGACTATTGAAGGCTGTGACCTGTCACTGTGTAAAGCTTTCAACCCGAAGCACGCTGAAGGCACAATGGAATTCAAT
GACTCTGACTCTGGCATTTCACTGAACACAAGTCCCAGCCGAGCGTCCCCAGAGCACTCCGTGGAGTCTTCCATTTA
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GCCCTAAAGCACAGCCAGCACATTCTCCTGGAGACACAGTACAGCCTCTGTCACCAGCTCAAGGGCACAGTGCTCCT
ATGCGTGAATCCCAATGTGAAAATACAACAAAAAAAGAAGTTCCCGTGAGTCCTGGTCATCAAAAAGCCCCATTCAC
AAAAGACAAACATTCAAGCCGCTTAGAGGCTCATCTCACACGAGATGAGCTTAGGGCAAAAGCTCTCCATATTCCAT
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CAGCTCGCATTGATCCGAGATATACGCAGGAGAGGTAAGAATAAAGTCGCCGCCCAGAACTGTAGGAAAAGGAAGCT
GGAGAACATTGTCGAGCTGGAGCAAGACTTGGGCCACTTAAAAGACGAGAGAGAAAAACTACTCAGAGAAAAGGGAG
AAAACGACAGAAACCTCCATCTACTGAAAAGGCGGCTCAGCACCTTGTATCTTGAAGTCTTCAGCATGTTACGTGAT
GAGGATGGAAAGCCTTACTCTCCCAGTGAATACTCTCTGCAGCAAACCAGAGATGGCAATGTGTTCCTTGTTCCCAA
AAGCAAGAAGCCAGATACAAAGAAAAACTAG
AAAGAAACCTATGAGTTCATACCTTCGATTTTCCACAGAACAGCTACCCAAATTTAAAGCTAAACACCCAGATGCAA
AACTTTCAGAATTGGTTAGGAAAATTGCAGCCCTGTGGAGGGAGCTACCAGAAGCAGAAAAAAAGGTTTATGAAGCT
GATTTTAAAGCTGAGTGGAAAGCATACAAAGAAGCTGTGAGCAAGTATAAAGAGCAGCTAACTCCAAGTCAGCTGAT
GGGTATGGAGAAGGAGGCCCGGCAGAGACGGTTAAAAAAGAAAGCACTGGTAAAGAGAAGAGAATTAATTTTGCTTG
GAAAACCAAAAAGACCTCGTTCAGCATATAACATTTATGTATCTGAAAGCTTCCAGGAGGCAAAGGATGATTCGGCT
CAGGGAAAATTGAAGCTTGTAAATGAGGCTTGGAAAAATCTGTCTCCTGAGGAAAAGCAGGCATATATTCAGCTTGC
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GTCTTCTTGGTCCTAAGGGTGAGACAGGAGATGTTGGAATGACAGGAGCTGAAGGGCCACGGGGCTTCCCCGGAACC
CCTGGCAGGAAAGGAGAGCCTGGAGAAGCCGCTTATGTGTATCGCTCAGCGTTCAGTGTGGGGCTGGAGACCCGCGT
CACTGTTCCCAATGTACCCATTCGCTTTACTAAGATCTTCTACAACCAACAGAATCATTATGACGGCAGCACTGGCA
AGTTCTACTGCAACATTCCGGGACTCTACTACTTCTCTTACCACATCACGGTGTACATGAAAGATGTGAAGGTGAGC
CTCTTCAAGAAGGACAAGGCCGTTCTCTTCACCTACGACCAGTATCAGGAAAAGAATGTGGACCAGGCCTCTGGCTC
TGTGCTCCTCCATCTGGAGGTGGGAGACCAAGTCTGGCTCCAGGTGTATGGGGATGGGGACCACAATGGACTCTATG
CAGATAACGTCAACGACTCTACATTTACTGGCTTTCTTCTCTACCATGATACCAACTGATAA
AGTTGCTAAGTCAGAGCTCAAGGCTAAAACGGCCCACCGCGCGCTGGCCGACCACTTCAGGGACTACGCCGAGCTCT
GCTTCCGCCACTTCTGCGGCCAGGTCAAGTACTGGATCACCATCGACAACCCCTACGTGGTGGCCTGGCACGGCTAC
GCCACCGGTCGCCTGGCACCCGGAGTCAGAGGCAGCCCGCGGCTCGGGTACCTGGTGGCGCACAACCTCCTCCTGGC
TCACGCCAAAATCTGGCATCTCTACAATACTTCTTTCCGCCCAACTCAGGGAGGCCAGGTATCCATTGCCCTAAGCT
CCCACTGGATCAATCCTCGAAGAATGACCGACCATAGCATCAAAGAATGTCAAAAATCTCTTGACTTTGTACTAGGC
TGGTTTGCCAAGCCCATATTTATTGATGGTGACTATCCTGAGAGCATGAAGAATAACCTGTCATCTCTTCTGCCTGT
TTTTACTGAATCTGAGAAAAAGTTCATCAAGGGAACAGCTGACTTTTTTGCTCTTTCTTTTGGACCAACTTTGAGTT
TTCAACTCTTGGACCCTCATATGAAGTTCCACCAATTAGAATCTCCCAGCCTGAGGCAACTCCTTTCTTGGATTGAC
CTTGAATATAACCACCCTCAAATATTTATTGTGGAAAATGGCTGGTTTGTCTCAGGGACCACCAAGAGAGATGATGC
CAAATATATGTATTACCTCAAAAAATTCATAATGGAAACCTTAAAAGCCATCAGGCTGGATGGGGTGGATGTCATAG
GATACACAGCGTGGTCCCTTATGGATGGCTTCGAGTGGCACAGAGGCTACAGCATCAGACGTGGACTCTTCTACGTG
GACTTTCTAAGCCAGGATAAGAAACTGTTGCCAAAGTCTTCAGCCTTGTTCTACCAAAAGCTGATAGAGAAAAATGG
CTTCCCTCCTTTACCTGAAAATCAGCCCCTAGAAGGGACATTTCCCTGTGACTTTGCTTGGGGAATTGTTGACAACT
ACATTCAAGTGGACACCACTCTGTCTCAGTTTACCGACCCGAACGTTTACCTGTGGGACGTCCATCACAGCAAGAGG
CTGATTAAGGTGGACGGGCTGCGGGCCAAGAAGAGGAAGCCCTACTGCGTGGACTTTGCCGCCATCGGGCCCCAGGT
GGCCCTGCTGCAGGAGATGCACGTCTCGCATTTTCACTTCTCGCTGGACTGGGCCCTGCTCCTGCCGCTGGGCAACC
AGTCCCGGGTGAACCACGCGGCCCTGCACTACTACGGCTGCGTGGCCAGCGAGCTCCTGCGCGCCAACATCACCCCG
GTGGTGGCGCTCTGGAGACCAGCCGCTGCGCACCAGGGTCTGCCTGGACCGCTGGCACAGCGCGGTGCCTGGGAGAA
CCCACGCACCGCCCTGGCGTTCGCCGAGTACGCGCGCCTGTGCTTCCGCGCCCTGGGCCGCCACGTCAAGGTGTGGA
TCACGCTGCGCGAGCCGCCCACGCGGAACCTGACGCTCCGCGCCGGGCACAACCTGCTGCGGGCGCACGCGCTGGCC
TGGCGCGTGTACGACGAGCAGTTCCGGGGCTCGCAGCAGGGGAAGGTGTCCATCGCCCTGCAGGCCGACTGGGTGGA
GCCCGCCTGCCCCTCCTCCCAGAAGGACCGCGAAGTGGCCGAGAGGGTTCTGGAGTTCGACGTCGGCTGGCTGGCCG
AGCCCATCTTCGGCTCCGGGGACTACCCGCGGCTGATGCGCGACTGGCTCACCCGGAGAGACCATTCCCTCCTGCCC
TATTTCACTGACGAAGAGAAGAGGCTAATCCGGGGTTCCTTTGACTTCCTGGCCTTGAGCCATTACACCACCATCCT
CGTGGACTGGGAAAAGGAAGACCCAGTCAAATACAATGATTACCTGGAAGTGCAGGAGATGACCGACATCACCTGGC
TCAACTCCCCCAGTCAGGTGGCCGTAGTGCCCTGGGGCCTGCGCAAAGTGCTCAACTGGCTCAAGTTCAAGTACGGA
GACCTCCCCATGTATATCGTATCCAACGGCATAGATGACGATCCGCGGGCAGCCCAGGACTCGTTGAGGGTGTATTA
CATGCAGAACTATGTAAATGAAGCTCTGAAAGCCTACGTATTGGATGGTATCAATCTTTGTGGATACTTTGCCTACT
CATTTAATGATCGCACAGCTCCGAAGTTTGGCCTCTATCATTATGCTGCAAACCAGTTTGAGCCCAAACCGTCGGTG
AAGCATTACAGGAAAATTATTGACAACAATGGCTTCCCAGGCCCTGAAACTTTGGGGCGGTTTTGTCCAGAGGAATT
CACCCTGTGCACCGAATGCAGCTTTTTTCACACCCGAAAGTCTTTACTGGCTTTCATAGCTTTCCTACTTTTTGCTT
TTATTATTTCTCTTTCTCTGATTTTCTACTACTCTAGGAAAGGCAGAAGAAGTTATAAAGGAGGGAGTGGTGGGTCC
GATTACAAAGATCACGATGGGGACTATAAAGATCACGACATCGACTATAAGGATGACGATGATAAATGA
CTACACCGACGATGCCCAGGAGACAGAGGCCCACCTAGAGATCAGGGCCGATGGCACAGTGGTGGGGGCTGCCCGCC
AGAGCCCTGAAAGTCTCCTGGAGCTGAAAGCCCTAAAGCCAGGGGTCATTCAAATCTTGGGAGTCAAAACATCCAGG
TTCCTGTGCCAGGGCCCAGATGGGACACTATATGGCTCGCTCCATTTCGACCCTGTGGCCTGCAGTTTCCGAGAACT
GCTTCTTGAGGATGGGTACAACATCTACCACTCCGAGACCCTTGGTCTCCCGCTTCGCCTGCGCCCCCACAACTCCG
CATACCGGGACTTGGCACCCCGCGGGCCTGCCCGCTTCCTGCCACTGCCAGGCCTGCTTCCAGCACCCCCAGAGCCT
CCAGGGATCCTGGCCCCGGAGCCTCCTGACGTGGGCTCCTCGGACCCTCTGAGCATGGTGGGGCCTTCACAGGGCCG
GAGTCCCAGCTATGCTTCCTGATAG
TTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGC
CAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAA
TTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCT
TGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTG
GTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGC
TTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGC
GGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACG
GGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAA
GGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGG
AGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGC
TTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTT
TAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGG
CACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGT
TCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGT
TTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCC
AGAACACA
CTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGG
GTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCC
GCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTA
AGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCAC
GCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGT
GACCGGCGCCTAC
AGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCT
GGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCC
TCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATA
GTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTG
TATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCC
CGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAAGCCACC
CTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCGGACGCAGCGGCCCTCGAGC
ACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTGCAGGCGGGTGACAATCCGTACCTGCGGTATAACCACGCCGACGCCGAGTTT
CAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGCGGGTTCT
CGAACCTCTCGGTCTGGTTGAGGAAGGCGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGACCGGTAGAGCCATCACCCCAGC
GTTCTCCAGACTCCTCTACGGGCATCGGCAAGAAAGGCCAACAGCCCGCCAGAAAAAGACTCAATTTTGGTCAGACT
GGCGACTCAGAGTCAGTTCCAGACCCTCAACCTCTCGGAGAACCTCCAGCAGCGCCCTCTGGTGTGGGACCTAATAC
AATGGCTGCAGGCGGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAGTTCCTCGGGAAATT
GGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAAC
AACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACGGGACATCGGGAGGAGCCACCAACGACAACACCTACTTCGGCTACAGCAC
CCCCTGGGGGTATTTTGACTTTAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACA
ACTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTCAGCTTCAAGCTCTTCAACATCCAGGTCAAGGAGGTCACGCAGAATGAAGGC
ACCAAGACCATCGCCAATAACCTCACCAGCACCATCCAGGTGTTTACGGACTCGGAGTACCAGCTGCCGTACGTTCT
CGGCTCTGCCCACCAGGGCTGCCTGCCTCCGTTCCCGGCGGACGTGTTCATGATTCCCCAGTACGGCTACCTAACAC
TCAACAACGGTAGTCAGGCCGTGGGACGCTCCTCCTTCTACTGCCTGGAATACTTTCCTTCGCAGATGCTGAGAACC
GGCAACAACTTCCAGTTTACTTACACCTTCGAGGACGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCCCACAGCCAGAGCTTGGA
CCGGCTGATGAATCCTCTGATTGACCAGTACCTGTACTACTTGTCTCGGACTCAAACAACAGGAGGCACGGCAAATA
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