HCV属于黄病毒科(Flaviviridae)，是导致急性肝炎和慢性肝脏疾病的主 要因素。HCV病毒感染与高比率(54-86％)的慢性感染相关，在5—24％的病 例中在20—30年间可进展为肝硬化，且随后进展为肝细胞癌(McHutchinson， 2004，The American Journalof Managed Care 10，S21-29)。目前在欧洲和美 国，20-30％的肝脏移植和15-33％的肝癌患者可归因于HCV感染。世界卫生 组织在1999年估计全世界有大约1亿7千万人处于慢性HCV感染状态，且每 年新增感染病例3—4百万人。

HCV是具有大约9,600个核苷酸的阳性单链核糖核酸(RNA)基因组的包 膜病毒，其组构对于所有HCV毒株和分离株均相同。HCV基因组在0期的翻 译产生3010-3030个氨基酸的一个大的多蛋白，根据基因型其被病毒和细胞 蛋白酶进行蛋白酶解，产生10个病毒蛋白。三分之一的多蛋白的氨基末端 编码病毒体结构蛋白：核心(C)蛋白、包膜糖蛋白E1和E2。在结构区之后是 一个小的完整膜蛋白p7，看起来其作为离子通道起作用。所述基因组的剩 余部分编码非结构(NS)蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，它 们介导病毒生活周期的胞内过程(Penin，2004，Hepatology39，5-19)。HCV也 编码称作F(移码)或ARFP(可变读框蛋白(alternative reading frame protein)) 的小蛋白质，其可以通过核糖体移码或者内部起始进入核心基因的可变 (alternative)+1读框中而产生(见Branch et al.，2005，Semin.Liver Dis. 25：105-117；和WO2004/069864所述)。所述多蛋白编码序列的两端是两个高 度保守的非翻译区(UTR)，分别为5’UTR和3’UTR。位于5’UTR中的内部核 糖体进入位点容许核糖体固定以进行翻译起始，而3’UTR被认为在起始病 毒复制中起重要作用。

目前对于慢性感染的HCV患者的标准治疗方法是组合使用聚乙二醇化 干扰素-α(PEG-IFN-α)和三氮唑核苷(ribavirin)(Fried et al.，2002，N.Engl.J. Med.347，975-982)。然而，这种治疗方法很昂贵，且具有明显的副作用， 导致10％的病例过早结束治疗及对很多患者不适用(例如代谢失调的肝硬 化、自身免疫性疾病、抑郁史和妊娠患者)。更重要的是，治疗的患者中仅 50％对治疗有反应(Falck-Ytter，et al.，2002，Ann.Intern.Med.136，288-292)， 且基因型1感染的患者对治疗的反应率更低(27％-35％)。

总之，积累了许多实验证据表明T细胞免疫在控制HCV感染中的关键作 用，特别是CD4+和CD8+T-细胞介导的对于非结构(NS)蛋白的直接应答(例 如Francavilla et al.，2004，Eur.J.Immunol.34，427-37；Grakoui et al.，2003， Science302，659-662；Shoukry et al.，2003，J.Exp.Med.197，1645-1655； Thimme et al.，2001，J.Exp.Med.194，1395-1406；Lechner et al.，2000，J.Exp. Med.191，1499-1512；Gerlach，1999，Gastroenterology 117，933-941；Folgori et al.，2006，Nat Med.12，190-197)。实际上，在从急性自限性丙型肝炎中自 然康复的患者中典型观测到强HCV特异性T细胞应答，而在长期感染的患者 中T细胞应答较弱且很少关注。另一方面，中和抗体所起的作用(B细胞介导 的免疫)更不清楚(Logvinoff，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101，10149-54)。

由于HCV病毒的发现已经超过15年，但是由于难以实现病毒在细胞培 养物中的有效生长，且缺少易于获得的病毒感染的实验室模型，因此目前 仍未有HCV的疫苗。然而，目前已经出现了许多疫苗候选物(Barth and Baumert，2004，Novel vaccine strategies，p.214-227，In State of the Art of Hepatology：Molecular and Cell Biology eds Kluwer Academic Publishers； Inchauspe and Feinstone，2003，Clin.Liver Dis.7，243-259)，例如基于HCV- 衍生的肽(Cerny et al.，1995，J.Clin.Invest.95，521-30)、重组产生的HCV抗 原、基于DNA和病毒的疫苗(Brinster et al.，2001，Hepatology 34，1206-1217； Forns et al.，2000，Hepatology 32，618-625)和HCV病毒样颗粒(Baumert et al.， 1999，Gastroenterology 117，1397-1407；Jeong et al.，2004，J.Virol.78， 6995-7003)。目前在临床前模型中评价了一些候选物，第一波正在进入临床 实验阶段。目前在II期的最先进的疫苗使用辅助的E1包膜蛋白(Innogenetics) 及辅助的CD4+和CD8+T细胞表位(Intercell)。

最近十年期间积极探索的一种方法是使用多蛋白相关的各种抗原性结 构域作为免疫原。绝大多数现有技术多蛋白得自源自各种NS HCV蛋白的抗 原性多肽、片段或者表位的彼此融合，以形成单一且有希望的免疫原性多 肽。例如，WO01/30812和WO03/031588揭示了NS3至NS5B的HCV多肽的融 合，形成包含主要NS蛋白的单一多肽。WO03/097677描述了源自NS3、NS4B 和NS5B多肽的30-70个氨基酸的抗原性片段的融合。WO2004/046176揭示了 包含Core、NS3、NS4B和NS5B的多蛋白。WO2004/111082描述了共表达 NS3、NS4和NS5B的腺病毒和MVA载体，其中NS3和NS4作为融合蛋白被 表达，NS5B单独表达。

已经注意到现有技术多蛋白的构型是天然构型，各种成分以其在HCV 前体中存在的顺序出现。特别地，NS3后面是NS4，其后是NS5。然而，“天 然”构型对于所得多蛋白的表达和免疫原性不是最佳的。

由于HCV感染的慢性和持续性、高流行性和显著的相关疾病发病率， 因此预期HCV在多年内将持续是一种严重的全球性健康威胁因素。因此， 非常需要研发更具免疫原性的多肽、表达载体、制备其的方法及其应用， 以改善预防和治疗HCV感染或者HCV相关疾病或病变。

本发明涉及包含以非天然构型排列的非结构性(NS)多肽的融合蛋白。 HCV NS多肽(例如NS3、NS4A、NS5B及任选地NS4B)的特异性片段被选择， 并进行特异性构建以优化所得融合蛋白的免疫原性和/或重组产生过程。与 天然NS多肽对比，本发明提供的新HCV融合蛋白或者其编码核苷酸序列在 导入宿主生物体中时可以改善抗HCV免疫应答和/或改善总体细胞毒性应 答，和/或改善临床批次(clinical lots)的产生。因此，本发明代表了在目前 HCV感染或者HCV相关疾病或病变的治疗和预防中的显著进展。特别地， 其可用于加强现有的治疗方法或者为慢性感染患者、特别是对于常规治疗 无反应的那些患者提供另一种治疗方法。

这个技术问题通过权利要求书中定义的实施方案得以解决。

通过如下对于本发明的优选实施方案的描述，将显而易见本发明的其 它和进一步的方面、特征和优势。这些实施方案例证了本发明。

因此，在第一个方面，本发明提供了一种分离的融合蛋白，其包含源 自丙型肝炎病毒(HCV)的至少三个NS多肽，其中所述NS多肽在所述融合蛋 白中的顺序构建为不同于它们在天然构型中呈现的顺序。

如本文所用，除非另外特别指出，在本说明书中，术语“一个”等是 指“至少一个”、“一或多个”或者“多个”所描述的化合物或步骤。例 如，术语“一个细胞”包括多个细胞及其混合物。

如本文所用，术语“和/或”是指具有“和”、“或”以及“该术语涉 及的元件的所有或者任何其它组合”的含义。

如本文所用，术语“大约”或者“近似”是指在给定值或范围的20％ 以内、优选地在10％、更优选在5％以内。

术语“氨基酸”和“残基”是同义词，包括天然氨基酸以及氨基酸类 似物(例如非天然、合成和修饰的氨基酸，包括D或L光学异构体)。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指氨基酸 残基的聚合物，其包含通过肽键结合的十或多个氨基酸。所述聚合物可以 是线性的、分支的或者环状的，可包含天然存在的和/或氨基酸类似物，且 可以由非氨基酸中断。一般而言，如果氨基酸聚合物较长(例如超过50个氨 基酸)，则优选称作多肽或蛋白质。

在本发明中，术语“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”和“核苷 酸序列”可互换使用，是指任何长度的多脱氧核糖核苷酸(DNA)(例如 cDNA、基因组DNA、质粒、载体、病毒基因组、分离的DNA、探针、引 物及其任何组合)或者多核糖核酸(RNA)分子(例如mRNA、反义RNA)的聚合 物或者混合的多核糖-多脱氧核糖核苷酸。其可包含单链或双链、线性或环 状、天然或合成的多核苷酸。另外，多核苷酸可包含非天然存在的核苷酸， 如甲基化核苷酸和核苷酸类似物(见US 5,525,711、US 4,711,955或EPA 302 175所述修饰的实施例)，且可以由非核苷酸成分中断。如果存在，在聚合 之前或之后可以对核苷酸进行修饰。

如本文所用，当用于描述产物、组合物和方法时，术语“包含”是指 所述产物、组合物和方法包括提及的成分或步骤，但不排除其它成分或步 骤。“基本上由…组成”是指排除任何显著意义的其它成分或步骤。因此， 基本上由列出的成分组成的组合物不排除微量的污染物和药物可接受的载 体。“由…组成”是指排除超过痕量元素的其它成分或步骤。例如，当一 个多肽不含有列出的氨基酸序列之外的任何氨基酸时，则称该多肽“由所 列出的氨基酸序列组成”。当一个氨基酸序列与少量其它氨基酸残基(典型 为大约1-50个其它残基)一起存在时，则称多肽“基本上由所述氨基酸序列 组成”。当一个氨基酸序列是一个多肽最终氨基酸序列的至少一部分时， 则称该多肽“包含”所述氨基酸序列。这个多肽可具有几个直至几百个其 它氨基酸残基。这种其它氨基酸残基可以在多肽运输(trafficking)、促进多 肽产生或纯化、延长半衰期等方面起作用。这个术语可同样用于描述核苷 酸序列。

如本文所用，术语“分离的”是指蛋白质、多肽、肽或核酸从其天然 环境中纯化或移出。术语“纯化的”是指蛋白质、多肽、肽或核酸从其天 然相关联的至少一种其它成分中分离。

“HCV”是指“丙型肝炎病毒”。大量的系统发生分析已经将HCV分 离株分为含有不同亚型(a、b、c等)的6个主要基因型(1-6)(Simmons et al.， 2005，Hepatology 42，962-973)。基因型1a的HCV分离株的例子包括但非限于 HCV-1(Choo et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，2451-2455)、-J1 (Okamoto et al.，1992，Nucleic Acids Res.20，6410-6410)和-H(Inchauspé et al.， 1991，Proc.Natl.Acad.Sci.88，10292-10296)。基因型1b的HCV分离株的例子 包括但非限于HCV-JA(Kato et al.，1990，Proc.Natl.Acad.，Sci.87，9524-9528) 和BK(Takamizawa et al.，1991，J.Virol.65，1105-1113)。基因型1c的HCV分 离株的例子包括但非限于HCV-G9(Okamoto et al.，1994，J.Gen.Virol.45， 629-635)。基因型2a的HCV分离株的例子包括但非限于HCV-J6(Okamoto et al.，1991，J.Gen.Virol.72，2697-2704)。基因型2b的HCV分离株的例子包括 但非限于HCV-J8(Okamoto et al.，1992，Virology 188，331-341)。基因型2c的 HCV分离株的例子包括但非限于HCV-BEBE1(Nako et al.，1996，J.Gen. Virol.141，701-704)。基因型3a的HCV分离株的例子包括但非限于 HCV-NZL1(Sakamoto et al.，1994，J.Gen.Virol.75，1761-1768)。基因型3b 的HCV分离株的例子包括但非限于HCV-Tr(Chayama et al.，1994，J.Gen. Virol.75，3623-3628)。基因型4a的HCV分离株的例子包括但非限于 HCV-ED43(Chamberlain et al.，1997，J.Gen.Virol.78，1341-1347)。基因型5a 的HCV分离株的例子包括但非限于HCV-EUH1480(Chamberlain et al.，1997， Biochem.Biophys.Res.Commun.236，44-49)。基因型6a的HCV分离株的例 子包括但非限于HCV-EUHK2(Adams et al.，1997，Biochem.Biophys.Res. Commun.234，393-396)。

如本文所用，术语“融合”或者“融合蛋白”是指至少三个NS多肽(或 其片段或变体)彼此组合在一个多肽链中。优选地，多个NS多肽之间的融 合是通过遗传方式进行的，即框内(in frame)融合编码每个NS多肽的核苷酸 序列。“框内融合”是指融合的编码序列的表达产生在每个NS多肽之间无 任何翻译终止子的单一蛋白质。

每个NS多肽之间的融合可以是直接融合或者通过接头融合。如本文所 用，“直接融合”是指两个NS多肽之间无任何附加的氨基酸残基的融合(例 如编码一个NS多肽的密码子与编码随后的NS多肽的密码子连接)。或者， 可以在至少两个NS多肽的交界处使用一个接头肽。接头的存在可以促进融 合蛋白的正确形成、折叠和/或起作用。本发明不受应用的接头序列的形式、 大小或数目的限制，且在两个NS多肽的交界处可以插入一个接头序列的多 个拷贝。适于本发明的接头的长度为3-30个氨基酸，由氨基酸残基如甘氨 酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、丙氨酸和/或脯氨酸的重复组成(见例如 Wiederrecht et al.，1988，Cell 54，841；Aumailly et al.，1990 FEBS Lett.262，82； 和Dekker et al.，1993，Nature 362，852)。合适的接头的代表性例子包括 Ser-Gly-Ser接头，其将NS多肽的N末端与第二个NS多肽连接在一起；及 Gly-Ser-Gly-Ser-Gly接头，其将第二个NS多肽与第三个多肽连接在一起。或 者，也可以使用HCV衍生的序列，其将两个NS多肽彼此连接在一起(例如天 然NS4A多肽的C末端部分从相应于全长HCV-1多蛋白的大约第1691位延伸 至大约第1711位)。

“至少三个”是指三个或多于三个，优选三或四个。

如本文所用，术语“NS多肽”是指本领域认可的非结构蛋白，优选选 自NS2、NS3、NS4A、NS4B和NS5B多肽。但是优选所述融合蛋白不含有 NS5A多肽。在本发明中，本发明融合蛋白中包括的NS多肽可以单独源自目 前鉴别的任何HCV毒株或者分离株，如上文关于术语“HCV”所描述的那 些。术语“来源”是指分离、克隆、衍生或相关的来源。因此，根据本发 明，融合蛋白中包括的每个NS多肽可以源自天然NS多肽或者源自修饰的 NS多肽，如下文进一步阐述。

“天然”的NS多肽是指可以在天然来源中发现或者分离自其中的NS蛋 白质、多肽或者肽，不同于在实验室中经人工修饰的或者人为改变的多肽。 因此，术语“天然NS多肽”包括天然存在的NS多肽及其片段。这种天然来 源包括生物学样品(例如HCV感染的患者或者过去感染过HCV的患者的血 液、血浆或者血清)、培养的细胞以及重组材料(例如HCV病毒或基因组，基 因组或cDNA文库，含有HCV基因组片段的质粒，重组的加工前的前体或者 成熟加工的NS多肽等)。许多天然NS多肽/基因的核苷酸和氨基酸序列已经 在文献中描述，且可得自专门的数据库。天然NS多肽的代表性例子是如SEQ ID NO：1-4所示序列(SEQ ID NO：1-4提供了基因型1b HCV JA毒株的天然 NS3、NS4A、NS4B和NS5B多肽的氨基酸序列)。然而，天然NS多肽非限于 这些序列。事实上，所述氨基酸序列在不同的HCV基因型、亚型和分离株 之间可以有所不同，这种遗传变异包含在本发明范围内。

本发明的融合蛋白的一或多个NS多肽可彼此独立，与例证的序列或者 其它天然NS多肽相比包括一或多个氨基酸修饰。修饰可以通过突变和/或添 加化学部分(例如烷基化、乙酰化、酰胺化、磷酸化等)或者标记部分而产生。 突变包括缺失、取代或添加一或多个氨基酸残基或者任意组合这些突变。 当计划进行一些突变时，它们可以涉及连续的残基和/或不连续的残基。可 以通过本领域技术人员已知的多种方式进行修饰。例如，可以使用常规的 重组技术修饰编码NS多肽的核苷酸序列，如酶裂解后修饰和连接指定的片 段、定向诱变(例如使用法国Amersham，Les Ullis的SculptorTM体外诱变系 统)、PCR诱变或者DNA改组(shuffling)。

优选的修饰的NS多肽保留与相应天然NS多肽高度的氨基酸序列相同 性，例如与全长氨基酸序列或者其较短的片段(例如长度为至少10、15、20、 25、30、40、50、100个氨基酸)具有至少75％相同性的氨基酸残基。更特别 地，在本发明中使用的修饰的NS多肽与相应的天然NS多肽的相同性程度高 于75％，优选高于80％、85％、90％、95％，，更优选高于97％。两个多肽之 间的相同性百分比是由这两个序列共享的相同位置数的函数，这也考虑了 针对最佳序列排列而需要导入的缺口数以及每个缺口的长度。可以利用本 领域已知的多种计算机程序和数学算法确定氨基酸序列之间的相同性百分 比，例如可在NCBI获得的Blast程序(例如Altschul et al.，1997，Nucleic Acids Res.25，3389-3402；Altschul et al.，2005，FEBS J.272，5101-5109)。

例如，本发明的融合蛋白中包括的任一或全部NS多肽可以被修饰，从 而代表特定基因型或亚型，并因此包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序 列对应于在特定基因型或亚型的各种NS序列对比后典型确定的共有或近共 有序列。也可以对任何或者所有NS多肽进行修饰，以提供具有修饰的性质 的NS多肽，如降低的酶功能，和/或降低的锚定细胞膜的能力和/或降低的 翻译后加工的能力，如下文所述。对于这种功能性质是关键的氨基酸可以 通过常规方法鉴别，例如通过结构和功能分析进行鉴别。本领域技术人员 可易于确定能降低或破坏指定的酶活性的修饰类型。例如，可以通过定向 诱变或者PCR技术缺失或取代酶活性功能区(例如催化位点)中的一或多个 氨基酸，由此天然酶活性被显著降低或消除。可以使用本领域技术人员已 知的方法在适当的酶活性分析中确定生物学活性的降低或缺乏。膜锚定结 构域通常基于其疏水性而被预测。

根据本发明，本发明融合蛋白中包含的至少三个多肽的顺序构建为不 同于其在天然构型中的顺序。本领域已知所述天然构型(见本申请介绍部分 所述)，其中所述NS多肽呈现的顺序与在HCV多蛋白前体中发现的顺序相 同，即从N末端至C末端为NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B。根据所述天 然构型：

·NS2多肽总是在NS3多肽或NS4A多肽或NS4B多肽或NS5A多肽或 NS5B多肽之前；及

·NS3多肽总是在NS4A多肽或NS4B多肽或NS5A多肽或NS5B多肽之 前；及

·NS4A多肽总是在NS4B多肽或NS5A多肽或NS5B多肽之前；及

·NS4B多肽总是在NS5A多肽或NS5B多肽之前；及

·NS5A多肽总是在NS5B多肽之前。

在本发明的融合蛋白中，所述构型不是天然的，即至少一个NS多肽呈 现与其天然构型不同的顺序。因此，如果所述融合蛋白包含一个NS3多肽、 一个NS4A多肽及一个NS5B多肽，则天然构型是NS3-NS4A-NS5B，NS3 在N末端，NS5B在C末端。相反，非天然构型可以是NS5B-NS3-NS4A、 NS5B-NS4A-NS3、NS4A-NS3-NS5B、NS4A-NS5B-NS3或者 NS3-NS5B-NS4A。

特别地，本发明的融合蛋白包含至少如下一种情况：

·NS4A多肽与NS3多肽的N末端直接融合或者通过接头融合；

·NS3多肽与NS5B多肽的N末端直接融合或者通过接头融合；

·NS4B多肽与NS5B多肽的N末端直接融合或者通过接头融合；

·NS4A多肽与NS3多肽的N末端直接融合或者通过接头融合，所述NS3 多肽与NS4B多肽的N末端直接融合或者通过接头融合；和/或

·NS3多肽与NS4B多肽的N末端直接融合或者通过接头融合，所述 NS4B多肽与NS5B多肽的N末端直接融合或者通过接头融合。

在本发明的融合蛋白的这种特定部分中，每个NS多肽均可以单独是天 然或修饰的。例如，NS4A-NS3部分中包含的NS4A多肽可以是天然的，而 NS3多肽包含如下述的至少一个修饰。

在一个实施方案中，本发明的融合蛋白中包含的所有NS多肽均源自相 同的HCV毒株或分离株。或者，至少两个NS多肽源自不同的HCV毒株或分 离株，以提供对抗更广泛的HCV基因型的保护作用。其也可以使所述融合 蛋白适应特定的地理区域，将该区域特有的HCV分离株的至少一个NS多肽 包括进来而在该地使用(例如基因型1a、1b、2和3在北美洲、欧洲和亚洲最 普遍；基因型4在北非和中非较普遍；基因型5目前主要在南非鉴别，基因 型6分离株主要在越南和香港发现)。例如，如果所述融合蛋白包含NS多肽、 NS4A多肽和NS5B多肽，则所述NS3多肽可源自第一个HCV毒株，所述NS4A 和NS5B多肽源自第二个HCV毒株。或者，所述NS4A多肽可源自第一个HCV 毒株，而NS3和NS5B多肽可源自第二个HCV毒株。或者，所述NS5B多肽可 源自第一个HCV毒株，而NS3和NS4A多肽可源自第二个HCV毒株。或者， NS3、NS4A和NS5B多肽源自不同的HCV毒株。当本发明的融合蛋白也包 含NS4B多肽时，其可源自与其它多肽相同或不同的HCV毒株。

本发明优选的实施方案涉及一种融合蛋白，其包含NS4A多肽、NS3多 肽和NS5B多肽或者基本上由或者由NS4A多肽、NS3多肽和NS5B多肽组成， NS4A在N末端而NS5B在C末端(NS4A-3-5B融合体)。任选地，所述融合也 可包括NS4B多肽(或者其片段或变体)，以进一步改善所得融合蛋白的免疫 原性。所述NS4B多肽优选包含在所述NS3与NS5B多肽之间。因此，本发明 还涉及一种融合蛋白，其包含NS4A多肽、NS3多肽、NS4B多肽和NS5B多 肽或者基本上由或者由NS4A多肽、NS3多肽、NS4B多肽和NS5B多肽组成， NS4A在N末端，NS5B在C末端(NS4A-3-4B-5B融合体)。除了NS3、NS4A、 NS5B和任选的NS4B多肽之外，优选的是本发明的融合蛋白不含有其它 HCV多肽，特别是不含有核心蛋白，并且如上所述与NS多肽相关时不含有 NS5A多肽。

更具体地，术语“NS3多肽”是指得自任何HCV毒株的天然NS3蛋白、 多肽或肽，或者是指如上所定义的修饰的NS3蛋白、多肽或肽。本发明中使 用的NS3多肽的长度为至少200个氨基酸，有利地至少300个氨基酸，优选至 少400个氨基酸，更优选至少500个氨基酸，还更优选至少600个氨基酸。为 举例目的，天然HCV-1 NS3蛋白长度为631个氨基酸，且位于多蛋白前体中 大约第1027至1657位。天然NS3多肽包含两个不同的活性结构域，即N末端 中的丝氨酸蛋白酶结构域和C末端中的解旋酶结构域。NS3蛋白酶负责在 NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A和NS5A/NS5B交界处加工HCV多蛋 白前体，且需要NS4A作为蛋白酶解活性(Tomei et al.，1993，J.Virol.67， 4017-4026)和正确折叠(Yao et al.，1999，Structure(London)7 pp 1353)的辅因 子。由在裂解位点上游第6位的天冬氨酸或谷氨酸和在第1位的半胱氨酸或 苏氨酸及在裂解位点下游第1位的丝氨酸或丙氨酸组成的基序由HCV NS3 蛋白酶特异识别。NS3解旋酶被认为对于在病毒复制期间解旋双链RNA中 间体是重要的(Tai et al.，1996，J.Virol.70，8477-8484)。

“NS4A多肽”是指来自任何HCV毒株的天然NS4A蛋白、多肽或肽， 或者如上定义的修饰的NS4A蛋白、多肽或肽。本发明中使用的NS4A多肽 的长度为至少10个氨基酸，有利地至少11个氨基酸，优选至少12个氨基酸， 更优选至少13个氨基酸。“NS4B多肽”是指来自任何HCV毒株的天然NS4B 蛋白、多肽或肽，或者如上定义的修饰的NS4B蛋白、多肽或肽。本发明中 使用的NS4B多肽的长度为至少20个氨基酸，有利地至少25个氨基酸，优选 至少30个氨基酸，更优选至少31个氨基酸，还更优选至少32个氨基酸。为 举例目的，天然HCV-1NS4(A-B)蛋白长度为315个氨基酸，且位于多蛋白 前体中大约第1658至1972位。NS4A多肽(第1658至1711位)是NS3蛋白酶的 辅因子，而且也是NS3在内质网(ER)膜中的稳定性和定位所需要的(Failla et al.，1994，J.Virol.68，3753-3760)。NS4B多肽(第1712至1972位)是一种完整 的膜蛋白，其功能仍未知。预测算法提示存在4-6个跨膜节段。然而，其表 达诱导表面上ER衍生的膜状网的形成(Egger et al.，2002，J.Virol.76， 5974-5984)。

“NS5B多肽”是指来自任何HCV毒株的天然NS5B蛋白、多肽或肽， 或者如上述定义的修饰的NS5B蛋白、多肽或肽。本发明中使用的NS5B多 肽的长度为至少200个氨基酸，有利地至少300个氨基酸，优选至少400个氨 基酸，更优选至少500个氨基酸，还更优选至少550个氨基酸。为举例目的， 天然HCV-1NS5B蛋白长度为591个氨基酸，且位于多蛋白前体中大约第 2421至3011位。天然NS5B蛋白发挥RNA依赖性RNA聚合酶作用，其被认为 允许负链RNA中间体和正链子代拷贝的合成(Lohman et al.，1997，J.Virol.71， 8416-8428)。发现其通过21个C末端氨基酸序列与内质网膜相结合 (Schmidt-Mende et al.，2001，J.Biol.Chem.276，44052-44063)。

为清楚起见，本文提及的关于NS3、NS4A、NS4B和NS5B多肽的氨基 酸序列段是针对其在HCV-1多蛋白前体中的位置而给出的(如Choo et al.， 1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，2451-2455所述，或者在GenBank登录号 M62321中所述)。然而，如上所述，本发明还涉及其它HCV毒株和分离株 的NS多肽，以及修饰的NS多肽。因此，除了另外明确指出，当其在本文是 指HCV-1多蛋白前体的NS多肽或其肽时，是指HCV-1的NS多肽或其肽、任 何其它HCV毒株或分离株的NS多肽或其肽，或者修饰的NS多肽或其肽。本 发明的优选的实施方案涉及融合蛋白，其包含源自基因型1bHCVJA毒株的 NS3、NS4A、NS5B和任选的NS4B多肽(Kato et al.，1990，Proc.Natl.Acad.， Sci.87，9524-9528)。

在一个实施方案中，本发明的融合蛋白中包含的NS3多肽与相应的天然 NS3多肽相比被修饰，以呈现出明显降低的蛋白酶活性，并因此不能介导所 述融合蛋白裂解为单独的多肽。蛋白酶活性位于NS3多肽的N末端部分，相 对于全长HCV-1多蛋白的大约第1027位至大约1207位(从SEQ ID NO：1所示 天然HCV-JANS3多肽的大约第1位至大约181位)。更特别地，NS3蛋白酶活 性归因于催化三联体残基，所述催化三联体残基即在第1083位的残基His (H)、在第1107位的Asp(D)和在第1165位的Ser(S)(分别为SEQ ID NO：1的 第57、81和139位)。合适的蛋白酶缺陷的NS3多肽的代表性实例在 Bartenshlager et al.，1993，J.Virol.67，3835-3844和Tomei et al.，1993，J.Virol. 67，4017-4026中描述。优选地，因为催化性的Asp和Ser残基位于预计的抗 原性结构域，因此本发明中使用的NS3多肽包含在第1083位的His残基(相应 于SEQ ID NO：1的第57位)或者位于另一HCV血清型的天然NS3多肽的等价 位置的氨基酸由除了His之外的任何氨基酸残基取代，优选由Ala残基取代 (H1083A)。蛋白酶活性的破坏可以使用本领域熟知的测定法确定(Takeshita et al.，1997，Anal.Biochem.247，242-246；Kakiuchi et al.，1997 J.Biochem 122， 749-755；Sali et al.，1998，Biochemistry 37，3392-3401；Kakiuchi et al.，1999， J.Virol.Meth.80，77-84)。

或者或相组合地，本发明融合蛋白中包含的NS3多肽与相应的天然NS3 多肽相比被修饰，以呈现显著降低的解旋酶活性。四个残基参与NS3相关的 解旋酶活性，分别是在相对于全长HCV-1多蛋白的第1295位的Thr、在第 1437位的Thr、在第1490位的Arg及在第1493位的Arg(相应于SEQ ID NO：1 所示天然HCV-JA NS3多肽的第269位和411位的Thr残基及第464和467位的 Arg残基)。合适的解旋酶缺陷的NS3多肽的代表性实例在Kim et al.(1997，J. Virol.71，9400)和Lin and Kim(1999，J.Virol.73，8798-8807)中描述。优选 地，本发明中使用的NS3多肽包含第1490位(相应于SEQ ID NO：1的第464 位)的Arg残基或者位于另一HCV血清型的天然NS3多肽的等价位置的氨基 酸残基由除了Arg之外的任何氨基酸残基取代，在第1295位(相应于SEQ ID NO：1的第269位)的Thr残基或者位于另一血清型的天然NS3多肽的等价位 置的氨基酸残基由除了Thr之外的任何氨基酸残基取代，优选在这两种情况 中均由Ala残基取代(T1295A和R1490A)。解旋酶活性的破坏可以使用本领 域熟知的测定法确定，例如通过评估解旋活性而确定。

最优选地，本发明中使用的NS3多肽被突变，以降低或破坏天然NS3多 肽的蛋白酶和解旋酶活性，并包含如上论述的关于这些酶功能方面的修饰， 优选突变体H1083A、T1295A和R1490A。

或者或与上文关于NS3多肽建议的修饰相组合，本发明的融合蛋白中包 含的NS5B多肽与相应的天然NS5B多肽相比被修饰，以呈现显著降低的 RNA依赖性RNA聚合酶活性。两个Asp残基参与这种酶功能，分别位于相 对于全长HCV-1多蛋白第2640位和2738位(相应于SEQ ID NO：4所示天然 HCV-JA NS5B多肽的第220和318位的Asp残基)。合适的聚合酶缺陷的NS5B 多肽的代表性例子在Lohmann et al.(1997，J.Virol.71，8416-8428)中描述。 优选地，本发明中使用的NS5B多肽包含至少第2640位(相应于SEQ ID NO： 4的第220位)的Asp残基或者位于另一HCV血清型的天然NS5B多肽的等价 位置的氨基酸残基由除了Asp之外的任何氨基酸残基取代，和/或第2738位 (相应于SEQ ID NO：4的第318位)的Asp残基或者位于另一HCV血清型的天 然NS5B多肽的等价位置的氨基酸残基由除了Asp之外的任何氨基酸残基取 代，优选在这两种情况中均由Asn残基取代。RNA聚合酶活性的破坏可以使 用本领域熟知的测定法确定，例如基于在新生RNA产物中掺入放射性核苷 酸底物的常规复制酶测定法(见例如Behrens et al.，1996，EMBO J.15，12-22； Ferrari et al.，1999，J.Virol.73，1649-1654)。

在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白中包含的NS多肽与相应的天 然NS多肽相比可进一步包含额外的修饰。合适的修饰是有益于所得融合蛋 白的加工、稳定性和溶解性的那些修饰，例如旨在失活潜在的裂解位点、 膜锚定和/或糖基化的那些修饰，如下文所述。

有利地，本发明的融合蛋白不包含正常存在于天然HCV多蛋白前体的 NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A和NS5A/NS5B交界处(junction)的一 或多个NS3识别的裂解位点，以避免其加工为单独的NS多肽。尽管本发明 中使用的优选的NS3多肽呈现显著降低的蛋白酶活性，但是NS3识别的裂解 位点的失活使得安全性进一步增强。裂解位点的共有序列是 Asp/Glu-X4-Cys/Thr-Ser/Ala，其中X是任何氨基酸残基。天然NS3多肽的裂 解在Cys/Thr残基之后发生。优选地，本发明中使用的NS3多肽不包含正常 存在于天然NS3多肽C末端的Thr或Cys残基(HCV-1多蛋白的第1657位，相应 于SEQ ID NO：1的第361位或者另一HCV血清型的天然NS3多肽的等价位 置)。或者或相组合地，NS4A多肽不包含正常存在于天然NS4A多肽C末端 的Cys残基(HCV-1多蛋白的第1711位，相应于SEQ ID NO：2的第54位或者另 一HCV血清型的天然NS4A多肽的等价位置)。或者或相组合地，任选NS4B 多肽不包含正常存在于天然NS4B多肽C末端的Cys残基(HCV-1多蛋白第 1972位，相应于SEQ ID NO：3的第261位或者另一HCV血清型的天然NS4B 多肽的等价位置)。

在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白可以被进一步修饰，以缺失 正常参与天然NS4A、NS4B和/或NS5B多肽的膜锚定的一或多个疏水性结构 域。在天然NS4B多肽中已经鉴别了六个膜锚定疏水性结构域，然而一个结 构域存在于天然NS4A多肽的N末端部分，一个结构域存在于NS5B天然多肽 的C末端部分。其至少部分缺失可以改善所述融合蛋白的溶解性并因此便于 通过重组方式产生。与在指定的宿主生物体中给予单独的HCV多肽相比， 这也可以限制所述融合蛋白的整体细胞毒性。

在这方面，NS4A多肽通过缺失或取代正常存在于天然NS4A多肽N末端 部分中的一或多个疏水性氨基酸残基而被有利地修饰。优选的NS4A多肽缺 失N末端的达前20个氨基酸(例如优选缺失相对于全长HCV-1多蛋白的大约 第1658位至第1677位，相应于缺失SEQ ID NO：2所示天然HCV-JA NS4A多 肽的大约第1位至大约第20位)，而保留全长HCV-1多蛋白的从大约第1678 位至大约1690位的天然NS4A多肽部分(从SEQ ID NO：2所示天然HCV-JA NS4A多肽的第21位至大约33位)。可以保留或者不保留天然NS4A多肽的C 末端部分，例如全长HCV-1多蛋白的大约第1691位至大约1711位的那部分 (相应于SEQ ID NO：2所示天然HCV-JA NS4A多肽的大约第34位至大约54 位)。最优选地，本发明的融合蛋白中包含的NS4A多肽由全长HCV-1多蛋白 的第1678位至第1690位的天然NS4A多肽部分组成(相应于SEQ ID NO：2所 示天然HCV-JA NS4A多肽的第21位至第33位的NS4A部分)。

或者或相组合地，优选的NS5B多肽缺失正常存在于天然NS5B多肽C末 端的10-30个氨基酸残基，优选缺失最后21个C末端氨基酸残基(例如HCV-1 多蛋白的第2991位至第3011位，相应于SEQ ID NO：4的第571位至591位)。

或者或相组合地，优选的任选NS4B多肽缺失六个膜锚定疏水性结构域 的至少一个结构域。更优选地，任选NS4B多肽在相应的天然NS4B多肽的N 和C末端截短一或多个氨基酸，以基本上保留内部抗原性结构域。优选地， 本发明中使用的任选的NS4B多肽包含全长HCV-1多蛋白的大约第1789位 至大约第1820位的氨基酸序列段或者基本上由全长HCV-1多蛋白的大约第 1789位至大约第1820位的氨基酸序列段组成(相应于SEQ ID NO：3所示天然 HCV-J NS4B多肽的大约第78位至大约109位)。

在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白被进一步修饰，以当在指定 的宿主细胞中表达时抑制潜在的N-糖基化。在这点上，已经在天然NS5B多 肽中从全长HCV-1多蛋白的第2789位至第2792位鉴别了共有的糖基化位点 Asn-Val-Ser-Val(SEQ ID NO：4所示天然HCV-JA NS5B蛋白的第369位至372 位)。由此，一个突变的例子是全长HCV-1多蛋白第2791位(SEQ ID NO：4的 第371位)的Ser残基由不同于Ser的残基取代，例如由Gly残基取代。

希望的是，本发明的融合蛋白是免疫原性的，即在导入宿主生物体中 时能诱导或刺激抗原特异性免疫应答-体液免疫或细胞免疫或者这二者。本 发明还涉及这样的融合蛋白，其已经被工程化，以增强免疫原性(例如通过 二硫键氧化)。希望的是，本发明的融合蛋白中包含的各种NS多肽的折叠与 天然NS多肽的折叠相同。在本发明中，优选所述融合蛋白保留T细胞受体 识别的一或多个抗原性结构域。可以适当保留在所述融合蛋白中的许多 HCV抗原性结构域在文献中描述(见例如Chien et al.，1992，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 89，10011-10015；Chien et al.，1993，J.Gastroent.Hepatol.8，S33-39 and WO03/097677)。

优选地，本发明的融合蛋白中包含的NS3多肽保留全长HCV-1多蛋白 的大约第1038位至第1082位、大约第1096位至大约1181位及大约1244位至 大约1274位的天然NS3多肽部分(例如SEQ ID NO：1所示天然HCV-JA NS3 多肽的大约第12位至大约第56位、大约70位至大约155位和/或大约第218位 至大约第248位)。优选地，本发明的融合蛋白中包含的NS5B多肽保留全长 HCV-1多蛋白的第2573位至第2601位的天然NS5B多肽部分(例如SEQ ID NO：4所示天然HCV-J NS5B多肽的大约第155位至大约第182位)。当本发明 的融合蛋白包含NS4B多肽时，优选保留全长HCV-1多蛋白的大约第1789位 至第1820位的天然NS4B多肽部分(例如SEQ ID NO：3所示天然HCV-J NS4B 多肽的大约第78位至大约第109位)。

本发明的融合蛋白的免疫原性活性可以通过本领域熟知的许多技术评 估，如后文关于本发明的方法或者在实施例中例证的那些技术。在本发明 中，优选所述融合蛋白的免疫原性活性在延伸和/或天然状态比天然NS多肽 提供的通常的免疫原性活性高。例如，当在宿主生物体中导入所述融合蛋 白时，所述免疫应答可以是更强、更广泛(例如包括更多的免疫细胞如i CD4+ 和CD8+细胞)，或者其范围与导入天然NS多肽的范围不同(例如针对非显性 的隐蔽表位)。由此增强了治疗作用，因此可以减少给药剂量并改善生命质 量。

优选的NS3多肽源自SEQ ID NO：1所示天然HCV-JA NS3蛋白，所述NS3 多肽经至少如下方式修饰从而：

·其保留从第12位至第56位、第70位至第155位及从第218位至248位的 部分；

·其包含第57位His残基由不同于His的氨基酸残基如Ala残基的取代；

·其包含第269位Thr残基由不同于Thr的氨基酸残基如Ala残基的取代； 及

·其包含第464位Arg残基由不同于Arg的氨基酸残基如Ala残基的取代； 及

·其在第631位不包含Thr残基。

更优选地，本发明中使用的NS3多肽包含、基本上由或者由SEQ ID NO： 5所示氨基酸序列组成。

优选的NS4A多肽多肽源自SEQ ID NO：2所示天然HCV-JA NS4A蛋白， 所述NS4A多肽经至少如下方式修饰从而：

·其含有SEQ ID NO：2的第21位至第33位的部分；

·其不含有SEQ ID NO：2的第1位至第20位的部分。

更优选地，NS4A多肽具有基本上由起始子Met残基在前及随后SEQ ID NO：2的第21位至第33位的那部分组成的氨基酸序列。最优选地，NS4A 多肽基本上由起始子Met在前及随后SEQ ID NO：6所示氨基酸序列组成。

优选的任选的NS4B多肽源自SEQ ID NO：3所示天然HCV-JA NS4B蛋 白，所述NS4B多肽经至少如下方式修饰从而：

·其包含第78位Ser残基至第109位Leu残基的部分；

·其不包含第261位Cys残基。

更优选地，任选的NS4B多肽基本上由或者由SEQ ID NO：7所示氨基 酸序列组成。

优选的NS5B多肽源自SEQ ID NO：4所示天然HCV-JA NS5B蛋白，所 述NS5B多肽经至少如下方式修饰从而：

·其包含第154位Arg残基至第182位Leu残基的部分；

·其包含第220位Asp残基由不同于Asp的氨基酸残基如Asn残基的取 代；

·其包含在318位Asp残基由不同于Asp的氨基酸残基如Asn残基的取 代；

·其不包含第571位Trp残基至第591位Arg残基的部分。

更优选地，NS5B多肽包含、基本上由或者由SEQ ID NO：8所示氨基 酸序列组成。

本发明最优选的融合蛋白包含或者基本上由或者由与SEQ ID NO：9或 10所示氨基酸序列同源或相同的氨基酸序列组成。SEQ ID NO：9(图1)所示 序列相应于上述优选的NS4A、NS3与NS5B多肽的融合体，其中N末端起始 子Met在第1位，NS4A多肽从第2位氨基酸残基延伸至第14位氨基酸残基， 接头肽从第15位氨基酸残基延伸至第17位氨基酸残基，NS3多肽从第18位氨 基酸残基延伸至第647位氨基酸残基，接头从第648位氨基酸残基延伸至第 652位氨基酸残基，及NS5B多肽从第653位氨基酸残基延伸至第1222位氨基 酸残基。SEQ ID NO：10(图2)所示序列相应于上述最优选的NS4A、NS3、 NS4B与NS5B多肽的融合体，其中N-末端起始子Met在第1位，NS4A多肽从 第2位氨基酸残基延伸至第14位氨基酸残基，接头肽从第15位氨基酸残基延 伸至第17位氨基酸残基，NS3多肽从第18位氨基酸残基延伸至第647位氨基 酸残基，NS4B多肽从第648位氨基酸残基延伸至第679位氨基酸残基，及 NS5B多肽从第680位氨基酸残基延伸至第1249位氨基酸残基。

本发明进一步包括本发明的融合蛋白的新的肽片段，特别是SEQ ID NO： 9或SEQ ID NO：10所示那些片段。如本文所用，所述片段包含本发明揭示 的融合蛋白的至少10、15、20、50或更多个连续的氨基酸残基。可以基于 完成功能的能力选择这种片段，例如基于结合底物或者作为免疫原的能力 加以选择。合适的肽片段典型是包含含有新的免疫原性结构的融合蛋白的 结构域或基序的那些片段。预测的免疫原性结构域可易于通过熟知且易于 为暴露于技术人员所利用的计算机程序鉴别。本发明的肽片段可以使用已 知的蛋白质合成方法合成。

本发明的融合蛋白及其肽片段可以通过任何合适方法产生，例如标准 的直接肽合成技术(例如Bodanszky，1984在Principles of peptide synthesis， Springer-Verlag中所述)及如下文关于本发明载体描述的重组DNA技术。

因此，本发明还提供了编码本发明融合蛋白的分离的核酸分子，优选 所述核酸分子编码一种融合蛋白，所述融合蛋白包含或者基本上由或者由 SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10同源的氨基酸序列组成。

希望的是，本发明的核酸分子经优化以提供在特定宿主细胞中高水平 表达，所述宿主细胞例如是哺乳动物细胞、酵母(例如酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、Saccharomyces pombe或巴斯德毕赤氏酵母 (Pichiapastoris))或者原核宿主(例如大肠杆菌)细胞。已经确实观测到当可利 用一个以上的密码子编码指定的氨基酸时，生物体的密码子使用是高度随 机的(见例如Wada et al.，1992，Nucleic Acids Res.20，2111-2118)，且密码子 的使用在不同宿主之间可以显著不同(见例如Nakamura et al.，1996，Nucleic Acids Res.24，214-215)。由于本发明中使用的NS编码核苷酸序列源于病毒 (HCV)，因此它们也许具有对于在宿主细胞如细菌或者低等真核细胞中有效 表达不适当的密码子使用模式。

典型地，进行密码子优化，通过将相应于在这种特定宿主细胞中不太 常用的密码子的一或多个“天然”(例如HCV)密码子用一或多个编码相同氨 基酸且更常用的一或多个密码子置换进行。这可以通过常规的诱变方法或 者通过化学合成技术(例如产生合成的核酸分子)实现。不是必需置换相应于 不常用的密码子的全部天然密码子，因为通过部分置换即可达到表达增加。 另外，可以对优化的密码子的严格遵守进行一些变化，以适应限制位点导 入所得核酸分子中。

为了进一步优化密码子的使用，可以通过对核苷酸序列进行额外的修 饰而进一步改良宿主细胞中的表达。例如，可以对本发明的核酸分子进行 修饰，以防止浓缩区域中存在的罕见的非优化的密码子聚集，和/或抑制或 修饰预期负面影响表达水平的至少部分阴性序列元件。这种阴性序列元件 包括但非限于具有极高(>80％)或极低(<30％)GC浓度的区域；AT-富集或者 GC富集序列段；不稳定的正向或反向重复序列；RNA二级结构；和/或内部 隐蔽的调节元件如内部TATA-盒、chi-位点、核糖体进入位点，和/或剪接 供体/受体位点。

与在相同条件(例如相同细胞类型、相同培养条件、相同表达载体等) 下的涉及相应天然HCV基因的核酸分子表达水平相比，本发明优化的核酸 分子优选在指定宿主细胞中能以更高水平即至少110％、有利地至少150％及 优选至少200％表达本发明的融合蛋白。表达水平可以通过常规技术如 Western印迹法评估，使用特异于本发明的融合蛋白中包含的HCV多肽之一 的抗体进行。

根据一个优选的实施方案，本发明提供了核酸分子，其包含或者基本 上由或者由与SEQ ID NO：11-16所示序列同源或者更优选相同的核苷酸序 列组成。SEQ ID NO：11的核酸分子编码NS4A-3-5B融合蛋白，其核苷酸序 列已经被优化以在哺乳动物(例如人)细胞中表达。SEQ ID NO：12的核酸分 子编码NS4A-3-4B-5B融合体，其核苷酸序列已经被优化以在哺乳动物(例如 人细胞)中表达。SEQ ID NO：13的核酸分子编码NS4A-3-5B融合体，其核苷 酸序列已经被优化以在酵母(例如巴斯德毕赤氏酵母)中表达。SEQ ID NO： 14的核酸分子编码NS4A-3-4B-5B融合体，其核苷酸序列已经被优化以在酵 母(例如巴斯德毕赤氏酵母)中表达。SEQ ID NO：15的核酸分子编码 NS4A-3-5B融合体，其核苷酸序列已经被优化以在原核生物(例如大肠杆菌) 中表达。SEQ ID NO：16的核酸分子编码NS4A-3-4B-5B融合体，其核苷酸序 列已经被优化以在原核生物(例如大肠杆菌)中表达。当然，如果需要，则所 述序列可具有5’和3’非编码序列，起始子Met在5’末端，一或多个终止密码 子在3’末端，及合适的限制位点在这两端以便于进行克隆(clonage)步骤。核 酸分子的例子也在图3-8中提供。

本发明还涉及在严格条件下能与上述核酸分子杂交的核酸分子。严格 条件为本领域技术人员所已知。典型地，杂交在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC) 中在大约45℃进行，随后在0.2×SSC、0.1％SDS中在50-65℃洗涤一或多次。 优选地，这种增加核酸与上述核酸分子在全长核苷酸序列或者其较短的片 段(例如长度为至少30、45、50、60、80、100、150、200个核苷酸)对比中 呈现高于70％的序列相同性。更优选地，它们之间的相同性程度高于70％、 有利地高于80％、期望高于85％、优选高于90％、更优选高于95％、还更优 选高于97％。

这种杂交核酸分子的代表性例子包括但非限于这样的核酸分子，其与 SEQ ID NO：11-16任一序列中包含的至少大约20、30、40、50、100或者150 个连续核苷酸互补(例如反义核酸分子)。举例示出的序列的变化如简并密码 子或者不同HCV的分离株/毒株之间的多态性或者得自如DNA改组等技术 的变化也包含在本发明中。

本发明的另一个实施方案涉及本发明核酸分子的片段，例如限制性核 酸内切酶和PCR产生的片段。这种片段可用作探针、引物或者编码本发明 免疫原性部分的片段。

本发明的核酸分子可以使用本领域可登陆的序列数据库及本发明提供 的序列信息产生。编码本发明的融合蛋白中包含的每个HCV多肽的DNA序 列可以直接分离自含有HCV的细胞、cDNA和基因组文库、病毒基因组或者 已知包含其的任何现有载体，通过常规的分子生物学或者PCR技术分离， 且如果需要，可以通过常规诱变技术对其进一步修饰(例如优化在特定宿主 细胞中表达，顺应基因型或亚型特异性序列，如上文所述)。融合编码每个 HCV多肽的序列可以例如通过框内直接连接或者通过编码肽接头的序列连 接而实现。或者，本发明的核酸分子也可以通过化学合成法自动化产生(例 如从重叠合成的寡核苷酸中装配，例如Edge，1981，Nature292，756；Nambair et al.，1984，Science223，1299；Jay et al.，1984，J.Biol.Chem.259，6311所述)。

本发明还提供了一种包含本发明核酸分子的一或多个拷贝的载体。例 如，其可以有利地在同一载体中包含编码源自不同基因型或亚型的融合蛋 白的核酸分子。

如本文所用，术语“载体”既是指表达载体也是指非表达载体，且包 括病毒载体以及非病毒载体，包括染色体外载体(例如多拷贝质粒)和设计为 掺入宿主染色体中的整合载体。本发明中特别重要的是用于基因治疗的载 体(即能将核酸分子输送至宿主生物体)以及用于各种表达系统中的表达载 体。

可以使用多种宿主-载体系统表达本发明的融合蛋白，包括用含有编码 融合蛋白的核酸分子的噬菌体、质粒或粘粒载体转化的原核生物如细菌(例 如大肠杆菌或枯草杆菌)；用含有编码融合蛋白的核酸分子的酵母表达载体 转化的酵母(例如酿酒酵母、Saccharomyces pombe、巴斯德毕赤氏酵母)； 用含有编码融合蛋白的核酸分子的病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆 虫细胞系统(例如Sf9细胞)；用含有编码融合蛋白的核酸分子的病毒表达载 体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染的或者用质粒表达 载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或者用含有编码融合蛋白的核酸分 子的质粒或病毒表达载体转染或感染的哺乳动物细胞系统(例如培养的细 胞)。

用于原核系统中的合适载体包括但非限于pBR322(Gibco BRL)、pUC (Gibco BRL)、pBluescript(Stratagene)、p Poly(Lathe et al.，1987，Gene 57， 193-201)、pTrc(Amann et al.，1988，Gene69，301-315)；pET11d(Studier et al.，1990，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology185，60-89)； pIN(Inouye et al.，1985，Nucleic Acids Res.13，3101-3109；Van Heeke et al.， 1989，J.Biol.Chem.264，5503-5509)；和pGEX载体，其中本发明的核酸序列 可以在具有谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合体中表达。质粒pGEX-2T (Amersham Biosciences Product code：27-4801-01，Genbank accession No. U13850)特别适用于本发明中。

用于在酵母(例如酿酒酵母)中表达的合适载体包括但非限于pYepSecl (Baldari et al.，1987，EMBO J.6，229-234)、pMFa(Kujan et al.，1982，Cell 30， 933-943)、pJRY88(Schultz et al.，1987，Gene54，113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，Calif.)和pTEF-MF(Dualsystems Biotech Product code： P03303)。

适于在哺乳动物宿主细胞中表达的载体可以是源于病毒载体或非病毒 载体(例如质粒DNA)。合适的质粒载体包括但非限于：pREP4、pCEP4 (Invitrogene)、pCI(Promega)、pCDM8(Seed，1987，Nature329，840)和 pMT2PC(Kaufman et al.，1987，EMBO J.6，187-195)、pVAX及pgWiz(Gene Therapy System Inc；Himoudi et al.，2002，J.Virol.76，12735-12746)。

另外，本发明中使用的宿主载体系统也可以包含使得本发明的核酸分 子在宿主细胞中维持、增殖或表达的一或多个额外元件。这种额外的元件 包括但非限于标记基因，以便于重组宿主细胞的鉴别和分离(例如通过细胞 营养缺陷型的互补或者通过抗生素抗性)；稳定元件(例如cer序列，如 Summers and Sherrat，1984，Cell 36，1097-1103所述；及DAP系统，如US 5,198,343所述)；及整合元件(例如LTR病毒序列和转座子)。

在原核宿主细胞中表达的合适的标记基因包括四环素和氨苄青霉素抗 性基因。同样，抗性基因也可以用于在哺乳动物宿主细胞中表达，如二氢 叶酸还原酶(dhfr)，其赋予氨甲喋呤抗性(Wigler et al.，1980，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 77，3567；O′Hare et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78，1527)； gpt，其赋予霉酚酸抗性(Mulligan and Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78，2072)；neo，其赋予氨基糖苷G-418抗性(Colberre-Garapin et al.，1981，J. Mol.Biol.150，1)；zeo，其赋予新霉素抗性；kana，其赋予卡那霉素抗性； 及hygro，其赋予潮霉素抗性(Santerre et al.，1984，Gene 30，147)。URA3和 LEU2基因可用于在酵母系统中表达，其与ura3或leu2酵母突变体互补。特 别地，可有利地使用其中已经缺失了启动子的URA3基因。

在本发明中也可以使用衍生自各种不同病毒(例如逆转录病毒、腺病 毒、AAV、痘病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、泡沫病毒等)的众多基于病毒的 表达系统。如本文所用，术语“病毒载体”包含载体DNA以及其产生的病 毒颗粒。病毒载体可以是具有复制能力，或者可以经遗传失效以成为复制 缺陷的或者复制削弱的状态。如本文所用，术语“具有复制能力”包含复 制选择性和有条件地复制的病毒载体，其被工程化为在特定宿主细胞(例如 肿瘤细胞)中更好或选择性地复制。

这种载体包括例如腺病毒载体，在基因转移或者重组产生中其具有许 多经充分论证的优势(见“Adenoviral vectors for gene therapy”，2002，Ed D. Curiel and J.Douglas，Academic Press所述)。根据本发明使用的腺病毒载体 可以衍生自许多人或动物来源。可应用从腺病毒血清型1至51的任何血清 型，优选人腺病毒2(Ad2)、5(Ad5)、6(Ad6)、11(Ad11)、24(Ad24)和35 (Ad35)。所述腺病毒可得自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville， Md.)，且已经有许多出版物描述了其序列、组构和生产方法，使得技术人 员可以应用其(见例如US 6,133,028；U S6,110,735；WO 02/40665；WO 00/50573；EP 1016711；Vogels et al.，2003，J.Virol.77，8263-8271)。

在一个实施方案中，本发明的腺病毒载体具有复制能力。这种具有复 制能力的腺病毒载体的例子为本领域所熟知，且易于技术人员利用(见例如 Hernandez-Alcoceba et al.，2000，Human Gene Ther.11，2009-2024；Nemunaitis et al.，2001，Gene Ther.8，746-759；Alemany et al.，2000，Nature Biotechnology 18，723-727)。用于本发明的合适的具有复制能力的腺病毒载体可以从野生 型腺病毒基因组中工程化，通过E1A CR2结构域中缺失以消除与Rb的结合 (见例如WO00/24408)和/或通过用组织、肿瘤或细胞特异性启动子置换天然 E1和/或E4启动子(见例如US5,998,205、WO99/25860、US5,698,443、 WO00/46355、WO00/15820和WO01/36650)。

在另一个实施方案中，本发明的腺病毒载体是复制缺陷的(见例如 WO94/28152；Lusky et al.，1998，J.Virol 72，2022-2032)。优选的复制缺陷性 腺病毒载体是E1-缺陷的(见例如US6,136,594和US6,013,638)，其中E1缺陷 从大约第459位延伸至第3328位或者从大约第459位延伸至3510位(参考 GeneBank中登记号为M73260的人腺病毒5型的序列及Chroboczek et al.， 1992，Virol.186，280-285所述)。克隆能力可以通过缺失腺病毒基因组的额 外部分(全部或部分非必需的E3区域或者其它必需的E2、E4区域)而进一步 改良。

本发明的核酸分子可以被插入腺病毒基因组的任何位置。优选地，将 其插入以置换E1区域。其也可以与所述区域的天然转录方向的有义或反义 方向放置。

其它合适的病毒载体衍生自痘病毒(见例如Cox et al.in“Viruses in Human Gene Therapy”Ed J.M.Hos，Carolina Academic Press)。在本发明中， 痘病毒可以得自痘病毒科的任何成员，特别是金丝雀痘病毒、鸟痘病毒和 痘苗病毒，优选痘苗病毒。合适的痘苗病毒包括但非限于Copenhagen毒株 (Goebel et al.，1990，Virol.179，247-266 and 517-563；Johnson et al.，1993， Virol.196，381-401)、Wyeth毒株和修饰的Ankara(MVA)毒株(Antoine et al.， 1998，Virol.244，365-396)。构建痘病毒的一般条件为本领域所熟知(见例如 EP 206 920；Mayr et al.，1975，Infection 3，6-14；Sutter and Moss，1992，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 89，10847-10851；US6,440,422)。本发明的核酸分子优 选插入在痘病毒基因组的非必需基因座中。胸苷激酶基因特别适于插入 Copenhagen痘苗载体中(Hruby et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci USA 80， 3411-3415；Weir et al.，1983，J.Virol.46，530-537)及缺失II或III以插入MVA 载体中(Meyer et al.，1991，J.Gen.Virol.72，1031-1038；Sutter et al.，1994， Vaccine12，1032-1040)。

根据一个优选的实施方案，本发明的载体包含适于在宿主细胞或生物 体中表达的形式的本发明的核酸分子，这意味着所述核酸分子被置于适于 所述载体和/或宿主细胞的一或多个调节序列的控制下。如本文所用，术语 “调节序列”是指允许、有助于或者调节核酸分子在指定宿主细胞中表达 包括复制(replication)、倍增(duplication)、转录、剪接、翻译、稳定性和/ 或所述核酸分子或其衍生物之一(即mRNA)转运至宿主细胞中的任何序列。 本领域技术人员意识到所述调节序列的选择可以根据宿主细胞、希望的表 达水平等这类因素进行。

启动子是特别重要的，本发明中使用的合适启动子包括组成型启动子， 其指导核酸分子在许多类型宿主细胞中表达，及指导核苷酸序列仅在特定 宿主细胞中表达的那些启动子(例如肝特异性调节序列)或者应答特定事件 或外界因素(例如温度、营养添加剂、激素或其它配体)的那些启动子。

适于在大肠杆菌宿主细胞中表达的启动子包括但非限于噬菌体λpL启 动子、lac、TRP和IPTG-诱导型pTAC启动子。适于在酵母中表达的启动子 包括TEF(Mumberg et al.，1995，Gene 156，119-122)、PGK(Hitzeman et al.， 1983，Science 219，620-625)、MF α(Inokuchi et al.，1987，Mol.Cell.Biol.7， 3185-3193)、CYC-1(Guarente et al，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78，2199)、 GAL-1、GAL4、GAL10、PHO5、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP或GAPDH)和 醇脱氢酶(ADH)(Denis et al.，1983，J.Biol.Chem.25，1165)启动子。为了在痘 病毒载体中表达，可以使用痘苗7.5K、H5R、TK、p28、p11或K1L启动子， 在Chakrabarti et al.(1997，Biotechniques 23，1094-1097)、Hammond et al.(1997， J.Virological Methods 66，135-138)和Kumar和Boyle(1990，Virology 179， 151-158)中描述的合成启动子，以及早期/晚期嵌合启动子。适于在哺乳动 物细胞中组成型表达的启动子包括巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子 (Boshart et al.，1985，Cell 41，521-530)、腺病毒主要晚期启动子、单纯疱疹病 毒(HSV)-1的磷酸甘油激酶(PGK)启动子(Adra et al.，1987，Gene 60，65-74)和 胸苷激酶(TK)启动子。由外源提供的化合物调节的诱导型真核启动子包括 但非限于锌-诱导型金属硫蛋白(MT)启动子(Mc Ivor et al.，1987，Mol.Cell Biol.7，838-848)、地塞米松(Dex)-诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、 T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088)、蜕皮激素昆虫启动子(No et al.，1996， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，3346-3351)、四环素抑制型启动子(Gossen et al.， 1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，5547-5551)、四环素诱导型启动子(Kim et al.，1995，J.Virol.69，2565-2573)、RU486诱导型启动子(Wang et al.，1997， Nat.Biotech.15，239-243 and Wang et al.，1997，Gene Ther.4，432-441)及雷 帕霉素(rapamycin)诱导型启动子(Magari et al.，1997，J.Clin.Invest.100， 2865-2872)。

也可以使用组织特异性启动子，特别是可以靶向HCV感染的细胞发挥 预期治疗益处的那些启动子。合适的启动子包括肝特异性启动子如 HMG-CoA还原酶(Luskey，1987，Mol.Cell.Biol.7，1881-1893)、甾醇调节元 件1(SRE-1；Smith et al.，1990，J.Biol.Chem.265，2306-2310)、白蛋白(Pinkert et al.，1987，Genes Dev.1，268-277)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK) (Eisenberger et al.，1992，Mol.Cell Biol.12，1396-1403)、人C-反应蛋白(CRP) (Li et al.，1990，J.Biol.Chem.265，4136-4142)、人葡糖激酶(Tanizawa et al.， 1992，Mol.Endocrinology 6，1070-1081)、胆固醇7-α羟化酶(CYP-7)(Lee et al.， 1994，J.Biol.Chem.269，14681-14689)、α-1抗胰蛋白酶(Ciliberto et al.，1985， Cell 41，531-540)、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP-1)(Babajko et al.， 1993，Biochem Biophys.Res.Comm.196，480-486)、人运铁蛋白(Mendelzon et al.，1990，Nucleic Acids Res.18，5717-5721)、I型胶原(Houglum et al.，1994， J.Clin.Invest.94，808-814)和FIX(US5,814,716)基因。

适用于本发明中的其它的启动子可以得自优先在增殖性肿瘤细胞中表 达的基因，如在肝癌中过表达的α-甲胎蛋白基因的启动子(Kanai et al.，1997， Cancer Res.57，461-465)、端粒酶逆转录酶(TERT)(WO99/27113，WO 02/053760和Horikawa et al.，1999，Cancer Res.59，826)及缺氧反应元件(HRE) 启动子。

本领域技术人员意识到控制本发明的核酸分子表达的调节元件可进一 步包含额外的元件用于在宿主细胞或生物体中正确起始、调节和/或终止转 录(例如polyA转录终止序列)、mRNA转运(例如核定位信号序列)、加工(例 如剪接信号)和稳定性(例如内含子和非编码5’和3’序列)、翻译(例如肽信号、 原肽、三元前导序列、核糖体结合位点、Shine-Dalgamo序列等)以及纯化步 骤(例如标记)中。

例如，信号肽最后与原肽组合，可用于促进融合蛋白在培养基中的分 泌。信号肽典型被插入在融合蛋白的N末端紧邻Met起始子之后，且如果需 要，则所述原肽插入在信号肽的下游。信号肽和/或原肽的选择非常广泛， 且易于为本领域技术人员所得到。适于本发明的信号肽/原肽的例子包括但 非限于交配型因子(MF)α(Kurjan and Herskowitz，1982，Cell 30，933-934和US 5,879,926)、转化酶(WO84/01153)、PHO5(DK3614/83)、YAP3(酵母天冬氨 酸蛋白酶3；WO95/02059)及BAR1(WO87/02670)的信号肽序列。在进入ER 期间，信号肽在加工位点从前体多肽裂解分离。所述加工位点可包含由宿 主细胞蛋白裂解酶识别的任何肽序列。优选的加工位点的例子包括但非限 于两个碱性碱基Lys和Arg(优选Lys-Arg)的任意组合，其被酿酒酵母的 KEX2基因编码的内肽酶(见Fuller et al.，1986，Microbiology，273-278)或者其 它酵母物种的等价蛋白酶(见Julius et al.，1983，Cell32，839-852)裂解。

肽标记(例如能由可获得的抗血清识别的短肽序列)可用于促进重组融 合蛋白从宿主细胞或培养上清中纯化。优选地，所述标记插入在融合蛋白 的C末端。所述标记的例子包括但非限于His标记(例如由6个或更多个组氨 酸残基组成)、来自S mansoni的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的肽序列、来自大 肠杆菌的麦芽糖结合蛋白(MPB)、人碱性磷酸酶、FLAG八肽，及e-标记(US 6,686,152)。

本发明优选的实施方案涉及在酵母中表达的穿梭质粒，其包含置于TEF 启动子及适当的转录终止子序列(例如细胞色素cyc终止子)控制下的本发明 的核酸分子(例如核苷酸序列SEQ ID NO：13和14)，其进一步包含大肠杆菌 和酵母宿主细胞的复制起点(例如分别为ORI和2μ)，适于在大肠杆菌(例如 氨苄青霉素抗性基因)和酵母(例如营养缺陷型URA3和leu2-3)中表达的选择 标记。

本发明另一个优选的实施方案涉及适于在大肠杆菌中表达的pGEX质 粒，其包含置于IPTG诱导型pTAC启动子及适当的转录终止子序列控制下的 本发明的核酸分子(例如核苷酸序列SEQ ID NO：15和16)，其进一步包含大 肠杆菌合适的复制起点(例如ORI)及合适的选择标记(例如氨苄青霉素抗性 基因)。

本发明的再一个优选的实施方案涉及在哺乳动物细胞中表达的复制缺 陷的腺病毒载体，其包含置于适当的调节元件控制下的本发明的核酸分子 (例如核苷酸序列SEQ ID NO：11和12)。优选复制缺陷的腺病毒载体是缺失 E1和E3的Ad5基因组，E1缺失从大约第459位核苷酸延伸至大约第3511位核 苷酸，E3缺失从大约第28592位核苷酸延伸至大约第30470位核苷酸。优选 的腺病毒载体包含Ad5序列，从大约第1位核苷酸至大约第458位核苷酸，从 5’至3’的含有CMV立即早期增强子/启动子的表达盒，嵌合的人β-球蛋白 /IgG内含子(如在可得自Promega的pCI载体中发现)，编码两个多蛋白形式中 任一个的序列(SEQ ID NO：11或12)及SV40晚期聚腺苷酸化信号，随后是从 大约第3512位核苷酸至大约第28592位核苷酸及从大约第30470位核苷酸至 大约第35935位核苷酸的Ad5序列。

如果需要，本发明的载体可进一步包含一或多个转基因，例如与本发 明的核苷酸分子一起在宿主细胞或生物体中表达的感兴趣的基因。理想地， 转基因的表达对于HCV相关疾病或病变具有治疗或保护性活性。合适的转 基因包括但非限于细胞因子编码基因(例如IL-2、IL-7、IL-15、IL-18、IL-21、 IFNg)、毒素编码基因(例如蓖麻毒蛋白、白喉毒素、霍乱毒素)、自杀基因， 特别是编码TK HSV-1的基因(Caruso et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，7024-7028)(其与无环鸟苷(acyclovir)或者更昔洛韦(ganciclovir)前体药物 组合使用)、胞嘧啶脱氨酶(CDase)、尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRTase)(其与 前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)组合使用)。FCU-1基因产物(在WO 99/54481中 描述)特别适用于此。如果使用转基因，其置于适当的调节元件的控制下， 且可以插入本发明的载体的任何位置或者插入与本发明的载体组合使用的 独立载体中。

将本发明的核酸分子插入载体主链中可以通过常规分子生物学方法进 行，例如Sambrook et al.(2001，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory)所述方法。插入腺病毒载体或痘病毒载体中可以通 过同源重组技术进行，分别如Chartier et al.(1996，J.Virol.70，4805-4810)和 Paul et al.(2002，Cancer gene Ther.9，470-477)所述。

本发明还包含与脂质或聚合物复合以形成特殊结构如脂质体、 lipoplexes或纳米颗粒的载体(例如质粒DNA)。这种技术可为本领域所利用 (见例如Arangoa et al.，2003，Gene Ther.10：5-14；Eliaz et al.，2002，Gene Ther. 9，1230-1237和Betageri et al.，1993，“Liposome drug delivery systems”， Technomic Publishing Company，Inc)。

在另一个实施方案中，本发明提供了感染性病毒颗粒，其包含上述本 发明的核酸分子或载体。

典型地，这种病毒颗粒通过包括如下步骤的方法产生：

(a)将本发明的病毒载体导入合适的细胞系中，

(b)在适当条件下培养所述细胞系，以产生所述感染性病毒颗粒，

(c)从所述细胞系的培养物中回收产生的感染性病毒颗粒，及

(d)任选纯化所述回收的感染性病毒颗粒。

当所述病毒载体是缺陷的时，感染性颗粒通常在互补细胞系中产生， 或者通过使用辅助病毒产生，所述辅助病毒提供反式非功能性病毒基因。 例如，适于互补的E1缺失的腺病毒载体的细胞系包括293细胞(Graham et al.， 1997，J.Gen.Virol.36，59-72)以及PER-C6细胞(Fallaux et al.，1998，Human Gene Ther.9，1909-1917)。适于增殖性痘病毒载体的细胞是禽细胞，最优选 从得自受精卵的鸡胚中制备的鸡胚原代成纤维细胞(CEF)。

感染性病毒颗粒可以从培养上清中或者从细胞溶解后的细胞中回收。 可以根据标准技术对其进一步纯化(层析法、在氯化铯梯度超速离心法，例 如WO96/27677、WO98/00524、WO98/22588、WO98/26048、WO00/40702、 EP1016700和WO00/50573所述)。

本发明还包含已经修饰以优先靶向特定靶细胞的载体或病毒颗粒(见 例如Wickam et al.，1997，J.Virol.71，8221-8229；Arnberg et al.，1997，Virol. 227，239-244；Michael et al.，1995，Gene Therapy 2，660-668；WO94/10323； WO02/96939和EP1146125)。本发明的靶向载体和病毒颗粒的特征是在其 表面存在能识别并结合细胞和表面暴露的成分的配体，所述成分如细胞特 异性标记(例如HCV-感染的细胞)、组织特异性标记(例如肝特异性标记)以 及病毒(例如HCV)抗原。合适的配体的例子包括针对HCV抗原性结构域的 抗体或其片段。细胞靶向可以通过将配体经遗传插入病毒表面上存在的多 肽(例如腺病毒纤维、五邻体(penton)、pIX或者痘苗p14基因产物)中而进行。

本发明还涉及宿主细胞，其包含本发明的核酸分子、载体或者感染性 病毒颗粒。在本发明中，术语“宿主细胞”应理解为包括但非限于组织、 器官或分离的细胞中的特定组构。这种细胞可以是独特类型的细胞或者一 组不同类型的细胞，并包含培养的细胞系、原代细胞和增殖性细胞。

在本发明中，宿主细胞包括原核细胞、低等真核细胞如酵母，及其它 真核细胞如昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物(例如人或非人)细胞。优选的大 肠杆菌宿主细胞包括但非限于大肠杆菌BL21(得自Amersham Biosciences)。 优选的酵母宿主细胞包括但非限于酿酒酵母、S.pombe、巴斯德毕赤氏酵母， 特别优选EP 607 080中所述表达KEX-2的酵母细胞如TGY47.1(或其同基因 的Leu+转化体TGY73.4)酵母株，及在US 5,879,926、US 5,162,208和US 6,103,515中描述的那些宿主细胞。优选的哺乳动物宿主细胞包括但非限于 BHK(幼仓鼠肾)、CV-1(非洲猴肾细胞系)、COS(例如COS-7)细胞、中国仓 鼠卵巢(CHO)细胞，小鼠NIH/3T3细胞、HeLa细胞和Vero细胞。宿主细胞也 包含能互补本发明复制缺陷的载体(例如腺病毒载体)的至少一种缺陷的功 能的互补细胞，如293和PERC.6细胞。

根据本发明的一个特殊实施方案，宿主细胞可以进一步形成微囊。先 前对细胞微囊化技术已经加以描述(Tresco et al.，1992，ASAIO J.38，17-23； Aebischer et al.，1996，Human Gene Ther.7，851-860)。

本发明另一方面提供了一种应用本发明的载体、感染性病毒颗粒和/或 宿主细胞经重组产生融合蛋白的方法。产生融合蛋白的方法包括：(a)将本 发明的载体或感染性病毒颗粒导入合适的宿主细胞中，以产生转染的或感 染的宿主细胞，(b)在适于宿主细胞生长的条件下，在体外培养所述转染或 感染的宿主细胞，(c)从细胞培养物中回收所述融合蛋白，(d)任选地纯化回 收的融合蛋白。

预期本领域技术人员已知可用于在适当的宿主细胞中产生本发明的融 合蛋白的多种表达系统，及将载体或感染性病毒颗粒导入宿主细胞中的方 法。这种方法包括但非限于显微注射法(Capechi et al.，1980，Cell 22， 479-488)、CaPO4-介导的转染(Chen and Okayama，1987，Mol.Cell Biol.7， 2745-2752)、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔(Chuetal.，1987，Nucleic Acid Res.15，1311-1326)、脂染/脂质体融合(Felgner et al.，1987，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 84，7413-7417)、粒子轰击(Yang et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci. USA87，9568-9572)、基因枪、转导、病毒感染以及通过各种方式直接给予 宿主生物体。

本发明的载体可以与脂染试剂联合应用，以便于将载体导入宿主细胞 中，所述脂染试剂如聚阳离子聚合物(例如壳聚糖、聚甲基丙烯酸酯、PEI 等)及阳离子脂质(例如DC-Chol/DOPE，目前得自Promega的转染lipofectin)。 另外，如上文所论述，可以使用重组DNA技术改良核酸分子在宿主细胞中 的表达，例如使用高拷贝数载体、取代或修饰一或多个转录调节序列(例如 启动子、增强子等)、优化融合体编码核酸对于宿主细胞的密码子使用，及 抑制可使转录物不稳定的阴性序列。

本发明的宿主细胞可以在常规发酵生物反应器、培养瓶和培养皿中培 养。培养可以在适于指定宿主细胞的温度、pH和氧含量的条件下进行。本 文未试图详细描述在原核和真核细胞中产生蛋白质的各种方法。融合蛋白 的产生可以在宿主细胞的周质、细胞内或者分泌到细胞外部(例如培养基 中)。

在融合蛋白未分泌至或者未完全分泌至生产宿主细胞外部的情况中， 可以通过标准的细胞溶解方法回收所述融合蛋白，包括冷冻-解冻法、超声 法、机械破坏法、使用细胞溶解剂等。如果分泌，可以从培养基中直接回 收。

然后可以通过熟知的纯化方法对融合蛋白进行纯化，所述方法包括硫 酸铵沉淀、酸提取、凝胶电泳、过滤和层析方法(例如反向层析、大小排阻 层析、离子交换层析、亲和层析、磷酸纤维素层析、疏水性相互作用、羟 磷灰石层析，或者高效液相层析)。用于纯化本发明特殊融合蛋白的条件和 技术依赖于许多因素，如净电荷、分子量、疏水性、亲水性，这些为本领 域技术人员所显而易见。另外，纯化水平依赖于指定用途。也已知根据生 产宿主细胞，融合蛋白可具有许多糖基化模式，或者可以是非糖基化的(例 如当在细菌中产生时)。

另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含本发明的融合蛋白、核 酸分子、载体、感染性病毒颗粒、宿主细胞(在此也称作“活性剂”)或者其 任意组合(例如融合蛋白或者编码不同基因型或亚型的融合蛋白的载体/病 毒颗粒的组合)。优选地，所述组合物是药物组合物，其进一步包含治疗有 效量的活性剂，药物可接受的载体。如本文所用，“治疗有效量”是足以 减轻与希望治疗的疾病或病变正常相关的一或多个症状的剂量。当涉及预 防性应用时，该术语是指足以预防或延缓疾病或病变发生的剂量。例如， 诱导免疫应答的治疗有效量可以是导致免疫系统激活必需的量(例如导致 抗HCV应答的发生)。

如本文所用，“药物可接受的载体”是指包括与药物给予相容的任何 及所有载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂、分散介质、包膜、抗菌剂和 抗真菌剂，及延缓吸收剂等。

适当地，本发明的药物组合物包含适于人或动物应用的稀释剂。优选 等张、低渗或弱高渗的稀释剂，且具有相对较低的离子浓度。代表性例子 包括无菌注射用水、生理盐水(例如氯化钠)、Ringer’s溶液、葡萄糖溶液、 海藻糖溶液或者蔗糖溶液、Hank’s溶液，及其它生理平衡的盐溶液(见例如 最新版本Remington：The Science and Practice of Pharmacy，A.Gennaro， Lippincott，Williams & Wilkins)。对本发明的组合物进行适当缓冲，以在生理 状态或略碱性pH值(例如大约pH7至大约pH9之间)用于人体。合适的缓冲 液包括但非限于磷酸盐缓冲液(例如PBS)、碳酸氢盐缓冲液和/或Tris缓冲 液。

所述组合物也可以含有其它药物学可接受的赋形剂，以提供希望的药 物学或药效学性质，包括例如更改或维持pH、渗量、粘性、透明度、颜色、 无菌、稳定性、配制品的溶解速度、更改或维持释放或吸收进人或动物体 中、促进通过血液屏障或者渗入特定器官(例如肝)中。合适的赋形剂包括氨 基酸。

本发明的组合物中包含的药物可接受的载体必须也允许在生产和在冷 冻(例如-70℃、-20℃)、冷藏(例如4℃)或者室温下长期贮存(即至少一个月) 条件下保持其稳定性。在这方面，特别适于本发明组合物的配方包括：

·1M蔗糖、150mM NaCl、1mM MgCl2、54mg/l Tween 80、10mM Tris pH 8.5(尤其当活性剂是腺病毒载体时)，及

·10mg/ml甘露醇、1mg/ml HAS、20mM Tris，pH7.2及150mM NaCl

·生理盐水。

另外，本发明的组合物可包含适于全身性或经粘膜应用于人体的一或 多个佐剂。优选地，所述佐剂能刺激本发明组合物的免疫原性，特别是T细 胞介导的免疫原性，例如通过toll样受体(TLR)如TLR-7、TLR-8和TLR-9介 导的免疫原性。有益的佐剂的代表性例子包括但非限于明矾、矿物质油乳 状液如弗氏完全和不完全佐剂(IFA)、脂多糖或其衍生物(Ribi et al.，1986， Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins，Plenum Publ. Corp.，NY，p407-419)、皂苷如QS21(Sumino et al.，1998，J.Virol.72， 4931-4939；WO 98/56415)、咪唑-喹啉化合物如Imiquimod(Suader，2000，J. Am Acad Dermatol.43，S6-S11)及相关的化合物S-27609(Smorlesi，2005， Gene Ther.12，1324-1332)、胞嘧啶磷酸鸟苷寡脱氧核苷酸如CpG(Chu et al.， 1997，J.Exp.Med.186：1623；Tritel et al.，2003，J.Immunol.171：2358-2547) 及阳离子肽如IC-31(Kritsch et al.，2005，J.Chromatogr Anal.Technol Biomed Life Sci822，263-270)。

本发明的组合物可以通过多种给予方式给予，包括全身性、局部和定 位给予。注射可以通过任何方式进行，例如通过皮下注射、皮内注射、肌 内注射、静脉内注射、腹膜内注射、肿瘤内注射、血管内注射、动脉内注 射或者直接注入动脉中(例如通过肝动脉注入)或者肝脏静脉介入(例如注入 门静脉)。注射可以使用常规注射器和注射针头或者本领域可获得的任何其 它适当设备进行。或者，本发明的组合物可以通过粘膜途径给予，如口腔/ 食物、鼻、气管内、肺内、阴道内或者直肠内途径。在呼吸道中给药可以 通过组合物雾滴的雾化吸入、喷雾或者使用加压容器(例如具有合适的推进 剂如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等)或者于非加压分配器中给予干粉组合物。 局部给药也可以使用经皮方式进行(例如皮肤贴片等)。在本发明中，优选肌 内和皮下给药途径。

本发明的组合物可以是各种形式，例如固体、液体或冷冻形式。固体(例 如干粉或者冻干的)组合物可以通过包括真空干燥和冻干的方法获得。对于 经粘膜给药而言，所述组合物可以配制为口服的肠溶胶囊和颗粒形式、经 直肠或阴道给药的栓剂，最后与用于增加粘膜孔大小的吸收增强剂组合。 这种吸收增强剂典型是与粘膜的磷脂结构域具有结构相似性的物质，如去 氧胆酸钠、甘胆酸钠、二甲基-β-环式糊精、十二烷酰-1-溶血卵磷脂)。

合适的剂量可以根据多个参数加以调整，特别是根据给药模式、应用 的组合物、宿主的生物体年龄、健康状况、体重、症状的性质和程度、协 同治疗的种类、治疗频率、和/或预防或治疗的需要加以调整。为确定适当 的治疗剂量必需的进一步精确计算由从业人员根据相应的情况常规进行。 作为一般性指导，给予包含病毒的组合物(例如腺病毒颗粒)的合适剂量为大 约105至1013iu(感染单位)，希望的是大约107至1012iu。给予载体质粒的组 合物的给药剂量可以是10μg至20mg，有利地是100μg至2mg。蛋白质组合 物的给药剂量可以是给予一或多剂10ng至20mg，优选剂量为每公斤体重大 约0.1μg至大约2mg治疗蛋白。给药组合物可以一次给药或者以一定时间间 隔重复给药一或几次。

本发明的药物组合物可以用于治疗多种疾病和病变的方法中，特别是 用于治疗HCV感染的那些方法中。如本文所用，术语“治疗”包括预防和/ 或治疗。其特别用于治疗HCV长期感染和HCV感染患者中的肝癌病变。术 语“癌症”涵盖了任何癌症病变，包括播散的或局部的肿瘤、癌症转移、 癌性息肉以及癌前病变(例如肝硬化)。优选地，当根据本文所述方案 (modalities)导入宿主生物体中时，本发明的组合物为治疗宿主提供了治疗 益处。术语“宿主生物体”是指包含任何动物，特别是哺乳动物如任何的 小鼠、大鼠、牛、猪、狗、猫、马、猴或人对象，例如感染HCV的人。所 述治疗益处可以通过许多情形证实，例如在感染的个体的血液、血浆或血 清中检测的HCV病毒血症较治疗之前降低，和/或检测到抗HCV免疫应答 (例如抗HCV抗体的产生和/或T细胞介导的免疫)，或者延缓HCV感染相关症 状的出现(例如延缓肝硬化或肝癌的发生)，或者降低与HCV感染典型相关的 肝炎症/脂肪变性/纤维化病变，或者改善个体对于常规治疗的反应。

因此，本发明还涵盖了本发明的融合蛋白、核酸分子、载体、感染性 病毒颗粒、宿主细胞或组合物在制备用于治疗或预防HCV感染性疾病、HCV 相关疾病和病变的药物中的应用。

本发明还提供了治疗或预防人或动物生物体的方法，包括给予所述生 物体治疗有效量的本发明的融合蛋白、核酸分子、载体、感染性病毒颗粒、 宿主细胞或者组合物。

如果需要，本发明的方法可以与一或多种常规治疗方案(例如放疗、化 疗和/或手术)联合进行。多种治疗方法的应用为患者提供了更广泛的基本干 预。在一个实施方案中，本发明的方法可以在手术之前或之后进行。在另 一个实施方案中，本发明的方法可以在放疗(例如γ射线放射)之前或之后进 行。本领域技术人员可易于制定合适的放疗方案及使用的参数(见例如Perez and Brady，1992，Principles and Practice of Radiation Oncology，2nd Ed.JB Lippincott Co；使用合适的版本和修改方案易于为该领域技术人员所明了)。

在另一个实施方案中，本发明的方法或应用与化疗联合应用，所述化 疗使用常规用于治疗或预防HCV感染、HCV相关疾病和病变的一或多种 HCV药物。HCV药物的代表性例子包括但非限于蛋白酶抑制剂(例如丝氨酸 蛋白酶抑制剂如Vertex的VX950)、聚合酶抑制剂、解旋酶抑制剂、抗肝纤 维化药物(antifibrotics)、核苷类似物、TLR激动剂、N-糖基化抑制剂、siRNA、 反义寡核苷酸、抗-HCV抗体、免疫调节剂、通常用于治疗HCV相关的肝癌 的治疗疫苗和抗肿瘤制剂(例如阿霉素或者碘油阿霉素与的混合物，通常在 肝动脉中通过化疗栓塞给药)。例如，治疗疫苗包括重组抗原、VLP、基于 或编码HCV结构蛋白(核心、包膜E1和/或E2蛋白)的载体或合成的肽，其特 别适于触发抗HCV体液应答。这种HCV药物可以单一剂量提供，或者根据 标准方案、用量和状况以多重剂量提供，间隔几小时、几天和/或几周给药。 给药HCV药物可以在给药本发明的组合物之前、同时或随后给药。特别合 适的组合包括在进行本发明的方法之前、同时或随后用聚乙二醇化的 IFN-α2a(例如剂量为10μg/周)和/或三氮唑核苷(例如800-1200mg/天)治疗24 至48周。

在另一个实施方案中，本发明的方法或应用根据引发加强(prime boost) 治疗形式进行，包括相继给予一或多种引发组合物及一或多种加强组合物。 典型地，所述引发和加强组合物使用包含或编码至少一个普通的抗原性结 构域的不同载体。所述引发组合物最先被给予宿主生物体，随后在1天至12 个月之后给予加强组合物。本发明的方法可包括1-10次相继给予引发组合 物，随后1-10次相继给予加强组合物。期望的注射间隔为1周至6个月。另 外，所述引发和加强组合物可以在同一位置或者在不同位置通过相同或不 同给予途径给予。例如，基于多肽的组合物可以通过经粘膜途径给予，而 基于载体的组合物优选例如经皮下注射(对于MVA载体)、肌内注射(对于 DNA质粒和腺病毒载体)给予。

在本发明中，本发明的组合物用于引发或加强或者既引发又加强抗 HCV免疫应答。优选的本发明的引发组合物是包含编码融合体的腺病毒载 体/病毒和编码融合体的质粒DNA的那些组合物。编码融合体的MVA载体/ 病毒优选用于加强。另一方面，重组产生的融合蛋白可单独用于引发或加 强。例如，可以用具有SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的重 组产生的融合蛋白引发，及用编码这种融合蛋白的腺病毒载体加强。再例 如，可以用编码具有SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的融合 蛋白的DNA质粒引发，及用编码这种融合蛋白的MVA病毒颗粒加强。

本发明的组合物也可以与编码或包含与本发明的组合物共有的抗原性 结构域(例如NS3、NS4B和/或NS5B多肽的抗原性结构域)的任何现有技术材 料组合使用。这种材料的来源很广泛，包括但非限于肽、蛋白质、来自多 种病毒的病毒载体、质粒DNA、蛋白质样颗粒如病毒样颗粒(Burns et al.， 1994，Mol.Biol.Techno.1，137-145)，及细胞材料如经照射的细胞、病毒颗 粒等。例如，特别适用于本发明的载体是WO2004/111082中描述的腺病毒 和MVA载体，其编码NS3、NS4和NS5B。再例如，WO03/097677中描述的 包含NS3、NS4B和NS5B的抗原性结构域的肽也可用于本发明中。为了举例 说明，可以用WO2004/111082所述腺病毒颗粒引发，随后用SEQ ID NO：9 或SEQ ID NO：10所示重组产生的融合蛋白或者用编码SEQ ID NO：9或SEQ IDNO：10所示融合蛋白的MVA载体/病毒加强。再例如，可以用编码SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示融合蛋白的DNA质粒引发，及用WO2004/111082 所述MVA载体加强。

然而，本发明也可以使用其它引发-加强组合。

本发明还提供了在宿主生物体中诱导或刺激抗HCV免疫应答的方法， 包括给予所述生物体本发明的融合蛋白、核酸分子、载体、感染性病毒颗 粒、宿主细胞或组合物，以诱导或刺激所述免疫应答。所述免疫应答可以 是特异性和/或非特异性、体液和/或细胞介导的应答。所述免疫应答优选是 针对HCV抗原的T细胞应答。

当给予动物或人生物体时，本发明的方法诱导或刺激抗HCV免疫应答 的能力可以在体外或体内使用本领域标准的多种测定方法评估。关于可用 于评估免疫应答发生和激活，见例如Coligan et al.(1992 and 1994，Current Protocols in Immunology；edJ Wiley & Sons Inc，National Institute of Health) 所述。细胞免疫性的测量可以通过测量激活的效应细胞包括衍生自CD4+和 CD8+T-细胞的那些细胞分泌的细胞因子(例如通过ELIspot量化细胞产生的 IL-10或IFNγ)、通过确定免疫效应细胞的激活状态(例如通过经典[3H]胸苷吸 收进行T细胞增殖测定)、测定激活的对象中抗原特异性T淋巴细胞(例如在 胞毒性测定中肽特异性细胞溶解)进行。刺激体液应答的能力可以通过抗体 结合和/或结合竞争分析确定(见例如Harlow，1989，Antibodies，Cold Spring Harbor Press)。本发明的方法也可进一步在用适当的感染性或诱导肿瘤的药 剂(例如表达NS基因的痘苗病毒)激发的动物模型中验证，以确定所述感染 性或诱导肿瘤的制剂的中和作用，及最后对于相关症状的部分抗性，反映 抗HCV免疫应答被诱导或增强。本发明组合物的测试和验证也在所附实施 例中例证。

本发明还提供了选择性结合本发明的融合蛋白或其肽片段的抗体。如 本文所用，当抗体结合靶肽而不明显结合不相关蛋白质时，称该抗体选择 性结合所述靶肽。在一些情况中，应理解尽管存在一定程度的交叉反应性， 仍认为所述抗体与所述肽的结合是选择性的。但是优选本发明的抗体不是 高度亲和性或高度选择性地结合各个天然NS多肽及结合天然构型的NS多 肽的融合体。

如本文所用，术语抗体的含义与本领域认可的含义一致。本发明的抗 体包括多克隆抗体和单克隆抗体，以及这种抗体的片段，包括但非限于Fab 或F(ab′)2和Fv片段。本发明的抗体可以使用本领域常规技术产生，例如给予 动物有效量的本发明融合蛋白和/或其肽片段而产生。抗体优选从本发明的 融合蛋白的包含独特序列的区域或分离的片段中制备，所述片段如重叠 NS4A与NS3多肽及NS3与NS5B多肽之间的融合位点的那些。

本发明的抗体具有多种潜在用途，这些用途包含在本发明范围内。例 如，这种抗体可(a)用作测定试剂以检测本发明的融合蛋白，(b)用作测定试 剂以检测生物学样品中HCV病毒的存在，和/或(c)用作工具以从蛋白质混合 物及其它污染物中回收重组产生的本发明的融合蛋白(例如允许通过亲和 层析或者免疫沉淀方法从培养的宿主细胞中纯化)。

本发明还涉及使用本发明的融合蛋白、核酸分子、载体、感染性病毒 颗粒、宿主细胞、组合物或抗体，检测和/或量化取自怀疑感染所述HCV病 毒的生物学样品(例如血浆、血清、组织)中HCV病毒或者抗HCV抗体的方 法。

在一个实施方案中，本发明的方法特别适于检测和/或量化生物学样品 中的HCV病毒，包括至少如下步骤：将所述生物学样品与至少一种本发明 的抗体在使得所述病毒与抗体之间形成复合物的条件下接触，并通过合适 方式检测和/或量化所述复合物的形成。

在另一个实施方案中，本发明的方法特别适于检测和/或量化生物学样 品中抗HCV抗体，包括至少如下步骤：将所述生物学样品与至少一种本发 明的融合蛋白、核酸分子、载体、感染性病毒颗粒、宿主细胞、组合物在 使得抗HCV抗体与本发明的融合蛋白、核酸分子、载体、感染性病毒颗粒、 宿主细胞、组合物之间形成复合物的条件下接触，并通过合适方式检测和/ 或量化所述复合物的形成。

本领域技术人员易于确定用于本发明中的抗体、融合蛋白、核酸分子、 载体、感染性病毒颗粒、宿主细胞、组合物的数量。检测和/或量化病毒的 方法是本领域常规方法且为本领域技术人员所熟知。例如，可以利用印迹、 ELISA、所谓的夹心技术、竞争技术和PCR技术，特别是所谓的“实时”技 术。本发明的抗体、融合蛋白、核酸分子、载体、感染性病毒颗粒、宿主 细胞或组合物作为试剂的应用，可以通过与可检测的物质的结合(即物理连 接)而便于应用。可检测的物质的例子包括各种酶(例如辣根过氧化物酶、碱 性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶)、辅基(例如链霉亲和素/生物素， 或者抗生物素蛋白/生物素)、荧光材料(例如7-羟基香豆素、荧光素、或者荧 光素衍生物)、发光材料、生物发光材料(例如荧光素酶、萤光素或水母发光 蛋白)，及放射性材料(例如125I、131I、35S或3H)。

最后，本发明涉及本发明的融合蛋白、核酸分子、载体、感染性病毒 颗粒、宿主细胞、组合物或抗体在体外诊断生物学样品中HCV感染中的应 用。

本发明已经以例证的方式加以描述，应理解所用技术只是进行描述而 非限于此。显然，根据上述教导可以对本发明进行许多修改和改变。因此， 应理解在本发明所附权利要求书的范围内，可以与本文所述不同的方式进 行本发明。

上述所有引用的专利、出版物和数据库均以其全部内容并入本文作参 考，如同这种各个专利、出版物或数据库是专门且单独指定并入作参考一 样。

附图简述

图1示出NS4A-3-5B融合蛋白的氨基酸序列。添加或修饰的氨基酸残基 以下划线标出，置换的天然残基在序列下方示出。

图2示出NS4A-3-4B-5B融合蛋白的氨基酸序列。添加或修饰的氨基酸 残基以下划线标出，置换的天然残基在序列下方示出。

图3示出经优化用于在哺乳动物细胞中表达的编码NS4A-3-5B融合蛋 白的核苷酸序列。

图4示出经优化用于在哺乳动物细胞中表达的编码NS4A-3-4B-5B融合 蛋白的核苷酸序列。

图5示出经优化用于在酵母细胞中表达的编码NS4A-3-5B融合蛋白的 核苷酸序列。

图6示出经优化用于在酵母细胞中表达的编码NS4A-3-4B-5B融合蛋白 的核苷酸序列。

图7示出经优化用于在原核细胞中表达的编码NS4A-3-5B融合蛋白的 核苷酸序列。

图8示出经优化用于在原核细胞中表达的编码NS4A-3-4B-5B融合蛋白 的核苷酸序列。

图9示出在如下实施例中举例说明的NS4A-3-5B和NS4A-3-4B-5B融合 蛋白的设计示意图。A、B、C、D和E代表可以在NS3、NS4B和NS5B多肽 中预知的抗原性结构域(见WO03/097677)。

图10示出gWiz NS4A-3-5B Hs和gWiz NS4A-3-4B-5B Hs表达载体的构 建示意图。

图11示出通过Western印迹检测的用gWiz NS4A-3-5B(A泳道1和C泳道 3)、gWiz NS4A-3-4B-5B(B泳道1和C泳道2)和gWiz(A泳道2、B泳道2和C 泳道1)质粒转染Huh-7细胞后的体外表达。转染的Huh-7细胞在转染后48小 时裂解，融合蛋白通过印迹法使用小鼠单克隆抗NS3(A和B)或者小鼠单克 隆抗-NS5B(C)抗体检测。

图12示出通过IFNγELISPOT测定法评估在肌内注射gWiz NS4A-3-5B Hs之后CD8+T细胞的NS3特异性应答。将各个小鼠的脾细胞在存在NS3特异 性肽GLL或者不相关肽的条件下培养40小时。结果以一式三份孔中获得的 106个脾细胞检测到的斑点数的平均值表示。M1、M2、M3和M4代表用gWiz NS4A-3-5B Hs免疫的四只小鼠。Mc是对照小鼠。

图13示出了融合蛋白从腺病毒感染的细胞中的表达。将A549细胞(1.5 ×106个细胞)以MOI为10分别用不同腺病毒-表达融合体的腺病毒 AdTG17476和AdTG17477-感染，空腺病毒和不相关的重组腺病毒作为阴性 对照感染。将细胞用10％血清培养48小时，之后用Laemmli缓冲液裂解。将 蛋白质样品(1/20体积)加样于SDS PAGE电泳凝胶上。通过Coomassie Blue 检测蛋白质。泳道1：分子量标记；泳道2：未感染的A549细胞；泳道3：空 腺病毒感染的A549细胞；泳道4：不相关腺病毒感染的A549细胞；泳道5： AdTG17476感染的A549细胞；泳道6：AdTG17477感染的A 549细胞。

图14示出在HLA-A2.1转基因小鼠中Ad HCV融合蛋白诱导的IFNγ Elispot应答。将AdTG17476、AdTG17477或空腺病毒经一次肌内注射进小 鼠胫骨前肌，剂量为109IU/小鼠。注射2周后通过IFNγELISPOT检测每组动 物的细胞免疫应答情况(测试组4只小鼠，对照组2只小鼠)。存在各个小鼠 (M1-4)对于NS3-特异性HLA-A2限制表位GLL(图14A)和KLT(图14B)及 NS5B-特异性HLA-A2限制表位KLQ(图14C)的应答。不相关的肽DLM用作 阴性对照。如果106个脾细胞的斑点数高于50(截断线)，则认为ELISPOT应 答是阳性的。

如下实施例例证了本发明。

实施例

材料和方法

下述构建体根据如Sambrook et al.(2001，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor NY)详述的基因工程和分子克隆的通用技术制备，或者当使用商购试剂盒时 根据厂商推荐制备。PCR扩增技术是本领域技术人员已知的(见例如PCR Protocols-A guide to Methods and applications，1990；Ed Innis，Gelfand， Sninsky and White，Academic Press Inc)。使用人Huh-7肝细胞瘤细胞系评价 下述实施例所述的构建体对融合蛋白的正确表达。培养条件是本领域常规 的。为举例目的，细胞在含有补加10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和 100IU/ml青霉素/链霉素的Dulbecco’s改良的Eagles培养基的完全 DMEM(Sigma)中在5％CO2气氛下于37℃生长。细胞用Lipofectamine Plus 试剂(Invitrogen)根据厂商指导转染。针对NS3和NS5B的小鼠单克隆抗体可 商业购买或可以根据本领域常规技术制备。

质粒构建

用重叠寡核苷酸产生分别编码NS4A-NS3-NS5B(3666个核苷酸)和 NS4A-NS3-NS4B-NS5B(3747个核苷酸)融合蛋白的合成基因(GeneART， Regensburg，Germany)。融合体的设计如图9所示。核苷酸序列被优化以在 人(SEQ ID NO：11和12及图3和4)，毕赤氏酵母(SEQ ID NO：13和14及图5 和6)和大肠杆菌(SEQ ID NO：15和16及图7和8)中高表达。所得融合体的氨 基酸序列见SEQ ID NO：9(NS4A-NS3-NS5B)和SEQ ID NO：10 (NS4A-NS3-NS4B-NS5B)。将每种合成核苷酸序列克隆进pPCR-Script质粒 (Stratagene)的SacI和KpnI限制位点。

为了在哺乳动物中的瞬时表达，将优化用于在人中表达的融合体编码 基因(SEQ ID NO：11-12及图3和4)插入到gWiz表达载体(Gene Therapy Systems)的SacI和NotI限制位点中，在巨细胞病毒启动子的转录控制下，以 产生gWiz NS4A-3-5B Hs和gWiz NS4A-3-4B-5B Hs载体(图10)。该序列然 后用SEQ ID NO：17所示寡核苷酸(5’-ATG TAC GTC GAC CACC ATG GGC AGC GTG GTG ATT GTG GGC CGG ATC3’)修饰以改进Kozak共有序列， 并用SEQ ID NO：18所示寡核苷酸(5’-CAT GTA GC GGC CGC TCA TCA TCT AGG CCT GGC CCT GGA CAG-3’)修饰以产生终止密码子(黑体)。所 有质粒用测序验证。

体外表达研究

Western印迹分析

转染前一天，将Huh-7(5 x 105每孔)铺板进6孔板。细胞用gWiz NS4A-3-5B Hs，gWiz NS4A-3-4B-5B Hs载体或作为阴性对照的gWiz质粒转 染。转染后48小时，细胞在50mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％SDS，1％ NP40和0.5％脱氧胆酸钠中裂解。裂解物样品在95℃加热5分钟，在 SDS-8％聚丙烯酰胺上电泳分离蛋白质。用特异于NS3的小鼠单克隆抗体 (例如8G4C3，bioMérieux)或特异于NS5B的小鼠单克隆抗体(例如11F6C8， bioMérieux)作为第一抗体，之后用山羊抗小鼠IgG-过氧化物酶抗体(Sigma) 作为第二抗体进行免疫印迹。信号用商业ECL试剂盒(Amersham Biosciences) 显示。

免疫荧光分析

转染前一天，将盖玻片置于6孔板中并用0.2％明胶处理10分钟，然 后将5 x 105Huh-7细胞铺板进每孔中。将细胞单层用gWiz NS4A-3-5B Hs， gWiz NS4A-3-4B-5B Hs载体或作为阴性对照的gWiz质粒转染。转染后48 小时，盖玻片在PBS中洗2次，细胞用4％PFA固定10分钟，然后用在PBS 中的0.1％TritonX-100洗涤和透化10分钟。洗涤盖玻片并用特异于NS3的 小鼠单克隆抗体(例如8D8E1，bioMérieux)或特异于NS5B的小鼠单克隆抗 体(例如5B-12B7 provided by D.Moradpour)提供作为第一抗体在室温处理1 小时。洗涤后，加入TRITC抗小鼠IgG(Dako)30分钟。洗涤后，盖玻片在 80％甘油中固定(mounted)。用Carl Zeiss Axioplan显微镜观测荧光(Lames) 并用AxioCam Color数码相机取图像。

体内表达研究

喂养根据Pascolo et al.(1997，J.of Experimental Medicine 185， 2043-2051)所述产生的HLA-A2.1转基因小鼠。这些小鼠敲除了H-2Db和小 鼠β2-微球蛋白基因并表达转基因单链组织相容性I类分子，其中人β2m 的C末端与嵌合重链(HLA-A2.1α1-α2，H-2Dbα3跨膜和细胞质内结构域) 的N末端共价连接。

免疫方案

在质粒注射5天前，用10μM心脏毒素(Latoxan)预处理HLA-A2转 基因小鼠。以100μg剂量(于100μl 1X PBS中)以2周间隔肌肉内注射gWiz NS4A-3-5B，gWIZNS4A-3-4B-5B和gWiz(阴性对照)质粒2次。在第二次 免疫后2周如Himoudi et al.(2002，J.Virol.76，12735-46)所述研究HLA-A2 限制的CD8+-T细胞应答。

通过ELISPOT测定监测免疫应答

脾细胞(2 x 105)在用抗小鼠IFNγ单克隆抗体(Pharmingen；10μg/ml) 包被的Multiscreen平板(Millipore)中的一式三份的孔中培养40小时，所述 细胞培养在完全αMEM培养基(Invitrogen)中，在所述培养基中单独存在10 单位/ml重组IL-2(PeproTech Inc，England)的孔作为阴性对照，存在5μg/ml Concavalin A的孔作为阳性对照，另一孔的培养基中含有10μM肽(DLM 无关肽，位于NS3蛋白中的GLL肽，如Martin et al.，2004，J.Med.Virol.74， 397-405和Himoudi et al.，2002，J.Virol.76，12735-46所述)。产生IFNγ的细 胞用先前所述(Himoudi et al.，2002，J.Virol.76，12735-46)的细胞因子特异性 酶联免疫斑点测定(ELISPOT)量化。从含有肽的测试孔的斑点数中减去在 阴性对照孔中的斑点数(代表个体产生IFNγ的细胞)。结果以得自三份孔的 平均值表示。

实施例1：NS4A-3-5B和NS4A-3-4B-5B多蛋白的体外表达

编码融合蛋白NS4A-3-5B和NS4A-3-4B-5B的序列如图9所示构建。

序列被优化以用于分别在三种不同的宿主(GeneART，Regensburg， Germany)，人(Hs)，巴斯德毕赤氏酵母(Pp)和大肠杆菌(Ec)中表达，如下 所列：

优化用于在人中表达的NS4A-3-5B Hs(SEQ ID NO：11和图3)

优化用于在毕赤氏酵母中表达的NS4A-3-5B Pp(SEQ ID NO：13和图 5)

优化用于在大肠杆菌中表达的NS4A-3-5B Ec(SEQ ID NO：15和图7)

优化用于在人中表达的NS4A-3-4B-5B Hs(SEQ ID NO：12和图4)

优化用于在毕赤氏酵母中表达的NS4A-3-4B-5B Pp(SEQ ID NO：14和 图6)

优化用于在大肠杆菌中表达的NS4A-3-4B-5B Ec(SEQ ID NO：16和图 8)

编码NS4A-NS3-NS4B-NS5B和NS4A-NS3-NS5B融合体的优化用于在 人中表达的序列被克隆到gWiz表达载体(GeneTherapy Systems)中处于巨细 胞病毒启动子的转录控制下(图10)。NS融合蛋白的表达通过Western印迹和 用gWiz NS4A-3-5B Hs，gWiz NS4A-3-4B-5B Hs载体或作为阴性对照的 gWiz质粒转染的Huh-7细胞中的免疫荧光评价。

如图11所示，在用抗NS3(图11A和7B)或抗NS5B(图11C)特异性抗体检 测后，Western印迹分析揭示了针对每个个体融合体的具有约135kDa的预期 分子量的独特条带(图11A泳道1和图11C泳道3，针对短的NS4A-3-5B融合 体；图11B泳道1和图11C泳道2，针对长的NS4A-3-4B-5B融合体)。如所预 期的，在得自用gWiz质粒转染的Huh-7细胞的样品中没有检测到蛋白(图 11A泳道2，图11B泳道2和图11C泳道1)。这些结果证实短的融合体 NS4A-NS3-NS5B和额外掺入NS4B的长的融合体在Huh-7细胞中表达。

免疫荧光分析证实两个融合蛋白在Huh-7转染的细胞中的表达。令人 感兴趣地，两个融合蛋白均显示细胞质定位，提示缺失大部分疏水性膜锚 定结构域产生的正确加工。用gWiz质粒转染的细胞不显示任何信号。

实施例2：gWIZ NS4A-3-5B Hs和NS4A-3-4B-5B Hs免疫原性的体内 评价

为了评价质粒gWiz NS4A-3-5B Hs和NS4A-3-4B-5B Hs在HLA-A2转基 因小鼠中诱导CD8+-T细胞应答的能力，如材料和方法中所述在HLA-A2转基 因小鼠中进行免疫原性研究。在第二次免疫后2周经IFNγELISPOT测定研究 HLA-A2限制的CD8+-T细胞应答。如图12所示，pgWizNS4A-3-5B能够诱 导特异于HLA-A2限制的公知免疫显性GLL肽(NS3蛋白，Martin et al.，2004， J.Med.Virol.74，397-405)的产生IFNγ的T细胞，提示这一表位的正确呈递。

还可以使用临床前小鼠攻击测定以评价融合蛋白的保护性免疫。由于 小鼠不能被HCV病毒直接感染，这些测定采用表达HCVNS抗原的重组痘苗 病毒(WR株)或李斯特菌。注射痘苗病毒或李斯特菌后，小鼠产生感染，在 注射后2-6天达到峰值，导致在注射的小鼠的卵巢(痘苗病毒模型)或肝脏(李 斯特菌模型)中检测到病毒或细菌。临床前评价涉及用候选疫苗(给予重组融 合蛋白或表达融合蛋白的腺病毒颗粒)、对照(例如给予天然构型的NS多肽 的融合体)和阴性构建体(例如非HCV抗原或空腺病毒)免疫小鼠。动物随后 用表达所有HCV NS抗原(NS2至NS5)的重组痘苗病毒或表达包括在候选疫 苗中的NS抗原之一的李斯特菌攻击。如果疫苗成功引起特异性T细胞，被 攻击的小鼠将产生对痘苗病毒或李斯特菌载体或对NS抗原的免疫应答。候 选疫苗的保护性活性将导致与在未免疫的小鼠的卵巢或肝脏中测得的痘苗 病毒或李斯特菌效价相比降低的在免疫的小鼠的卵巢或肝脏中测得的痘苗 病毒或李斯特菌效价。

实施例3：NS4A-3-5B和NS4A-3-4B-5B融合蛋白在哺乳动物细胞中 的表达

相应于NS4A-NS3-NS5B(3666个核苷酸)和NS4A-NS3-NS4B-NS5B (3747个核苷酸)的经优化用于在人中表达的融合体编码合成基因(SEQ ID NO：11-12)经PCR从相应的pPCR-Script质粒中扩增出，使用下述引物 OTG18033(GGGGGGCTAGCGCCACCATGGGCAGCGTGGTGATTG； SEQ        ID       NO：     19)       和       OTG18036 (GGGGGGGTACCCTCATCATCTAGGCCTGGCCCTG；SEQ ID NO：20)。 两个片段被插入到含有由腺病毒序列(腺病毒核苷酸1-458和核苷酸 3328-5788)围绕的CMV驱动的表达盒的腺病毒穿梭质粒的NheI和KpnI限制 位点中，以通过同源重组产生载体基因组(Chartier et al.，1996，J.Virol.70， 4805-4810)。所得的腺病毒载体是E3(核苷酸28592-30470)和E1(核苷酸 459-3511)缺失的，E1区由表达盒置换，该表达盒从5’到3’含有CMV立即早 期增强子/启动子、嵌合人β-球蛋白/IgG内含子(在得自Promega的pCI载体 中发现的)、编码两种多蛋白形式之一种的序列和SV40晚期聚腺苷酸化信 号。所得腺病毒载体命名为pTG17476(NS4A-3-4B-5B)和pTG17477 (NS4A-3-5B)。通过将PacI线性化病毒基因组转染进常规E1互补细胞系而产 生重组腺病毒AdTG17476和AdTG17477。如先前所述(Erbs，2000，CancerRes. 60，3813-3822)进行病毒繁殖、纯化和滴定。

融合蛋白的表达在腺病毒感染的细胞中经SDS PAGE电泳评价。将 A549细胞(1.5 x 106细胞)(ATCC CCL-185)以MOI 10或100用融合表达腺病 毒AdTG17476和AdTG17477以及作为阴性对照的空腺病毒和无关重组腺病 毒进行感染。细胞用10％血清培养48小时，之后用Laemmli缓冲液裂解。蛋 白质样品(1/20体积)上样至SDS PAGE电泳凝胶上并且用考马斯蓝染色蛋白 质。如图13所示，在用AdTG17476和AdTG17477感染的细胞中观察到具有 大约135kDa的预期分子量的独特条带(泳道5和6)，反映了在用融合体编码 腺病毒载体感染的细胞中的高表达水平。另一方面，这一条带在收集自用 阴性对照感染的细胞的样品中不存在(泳道3和4)，在未感染的A549细胞中 也不存在(泳道2)。

在以MOI为10用病毒构建体感染48小时的A549细胞中经Western印迹 分析了表达水平。收集细胞沉淀并用抗NS3小鼠单克隆抗体(例如1B6， bioMerieux)和抗NS4兔多克隆抗体(例如RB，bioMerieux)探查。在用抗NS3 或抗NS4特异性抗体检测后在收集自用AdTG17476和AdTG17477感染的细 胞的样品中揭示了具有预期分子量的主条带，证实了用考马斯蓝染色后检 测到的表达水平。

实施例4：表达HCV多蛋白的腺病毒在HLA A2转基因小鼠中的免疫原 性

动物模型

HLA-A2.1转基因小鼠根据Pascolo et al.(1997，J Ex Med)所述产生。这 些小鼠敲除了H-2Db和小鼠β2微球蛋白基因并表达转基因单链组织相容性I 类分子，其中人β2m的C末端与嵌合重链(HLA-A2.1α1-α2，H-2Dbα3跨膜 和细胞质内结构域)的N末端共价连接。

免疫方案

三组小鼠包括在方案中，分别有4只小鼠注射AdTG17476(Ad NS4A-3-4B-5B)，4只小鼠注射AdTG17477(Ad NS4A-3-5B)，2只对照小鼠注 射空Ad(Ad1514)。以在100μl 1X PBS中109IU的剂量将腺病毒在胫骨前肌 中注射1次。注射后2周研究细胞应答。

免疫应答的监测

ELISPOT测定

收集每组小鼠的脾细胞并裂解红血细胞。将2.105个细胞在用抗小鼠 IFNγ单克隆抗体(Pharmingen；10μg/ml)包被的Multiscreen平板(Millipore) 中的三份孔中培养40小时，培养在完全αMEM培养基(GIBCO BRL)中， 其中在所述培养基中单独存在10单位/ml重组小鼠IL-2(PeproTech Inc， England)的孔作为阴性对照，另一孔中所述培养基中含有10μM肽(DLM无 关肽，位于NS3蛋白中的GLL和KLT肽，位于NS5B蛋白中的KLQ肽 (Martin et al.，2004，J Med Virol.74，397-405)和(Himoudi et al.，2002，J Virol.， 76，12735-12746))，在所述培养基中含有5μg/ml Concavalin A的孔作为阳性 对照。产IFNγT细胞用先前所述(Himoudi et al.，J Virol2002)的细胞因子特 异性酶联免疫斑点测定(ELISPOT)量化。从含有肽的测试孔的斑点数中减 去在阴性对照孔中的斑点数(代表个体产IFNγT细胞)。结果以得自三份孔 的平均值表示。

结果

HLA-A2限制的T细胞应答在腺病毒免疫后2周经IFNγELISPOT测定 进行了研究。如图14所示，AdTG17476和AdTG17477在所有免疫动物中 均能诱导高频率特异于HLA-A2限制的GLL表位的产IFNγT细胞(图14A； 中位值：分别为1210和868个斑点)，AdTG17476具有统计学显著更高的效 率(Mann-Whitney检验：P＝0,0209)。两个病毒还诱导特异于亚优势KLT表位 的产IFNγT细胞(图14B)，频率较低(中位值：187和90个斑点)。另外，用 AdTG17476免疫的2:4小鼠和用AdTG17477免疫的1:4小鼠产生靶向NS5B 蛋白的KLQ表位的应答(图14C)。

这表明本发明的融合蛋白可以在真核系统中高水平产生，且所得蛋白 质在常规的动物模型中是免疫原性的。

序列表

<110>特兰斯吉恩股份有限公司

<120>丙型肝炎病毒非结构性融合蛋白

<130>TG173

<160>20

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>631

<212>PRT

<213>Hepatitis C virus

<400>1

<210>2

<211>54

<212>PRT

<213>Hepatitis C virus

<400>2

<210>3

<211>261

<212>PRT

<213>Hepatitis C virus

<400>3

<210>4

<211>591

<212>PRT

<213>Hepatitis C virus

<400>4

<210>5

<211>630

<212>PRT

<213>artificial sequence

<220>

<223>NS3 moiety derived from HCV-JA NS3 polypeptide with protease and

     helicase activities inactivated

<400>5

<210>6

<211>13

<212>PRT

<213>artificial sequence

<220>

<223>NS4A moiety derived from HCV JA NS4A polypeptide by N and C-terminal truncation

<400>6

<210>7

<211>32

<212>PRT

<213>artificial sequence

<220>

<223>NS4B moiety derived from HCV JA NS4B polypeptide by N and C truncation

<400>7

<210>8

<211>570

<212>PRT

<213>artificial sequence

<220>

<223>NS5B moiety derived from HCV JA NS5B polypeptide with polymerase

     activity inactivated and C terminus truncation

<400>8

<210>9

<211>1222

<212>PRT

<213>artificial sequence

<220>

<223>fusion of NS4A，NS3and NS5B HCV JA moieties

<400>9

<210>10

<211>1249

<212>PRT

<213>artificial sequence

<220>

<223>fusion of the NS4A，NS3，NS4B and NS5B HCV JA moieties

<400>10

<210>11

<211>3666

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>nucleotide sequence encoding HCV JA NS4A-3-5B fusion optimised for expression

in mammalian cells

<400>11

<210>12

<211>3747

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>nucleotide sequence of the HCV JA NS4A-3-4B-5B fusion optimised for expression

in mammalian

<400>12

<210>13

<211>3666

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>nucleotide sequence encoding the HCV JA NS4A-3-5B fusion optimi sed for

expression in Pichia

<400>13

<210>14

<211>3747

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>nucleotide sequence encoding the HCV JA NS4A-3-4B-5B fusion optmised for

expression in Pichia

<400>14

<210>15

<211>3666

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>nucleotide sequence encoding the NS4A-3-5B fusion optimized for expression

in E.coli

<400>15

<210>16

<211>3747

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>nucleotide sequence encoding the NS4A-3-4B-5B fusion optimized for expression

in E.coli

<400>16

<210>17

<211>46

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>oligonucleotide for improving kozak consensus

<400>17

<210>18

<211>41

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>oligonucleotide to create stop codons

<400>18

<210>19

<211>36

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>primer

<400>19

<210>20

<211>34

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>PCR primer

<400>20