一种制备重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的方法
阅读：896发布：2020-05-13
专利汇可以提供一种制备重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 技术领域，特别是涉及一种制备重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的方法，并进一步提供了相关重组表达载体。本发明提供一种重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组表达载体，所述重组表达载体包含有P1蛋白表达盒和3C蛋白表达盒，所述P1蛋白表达盒和3C蛋白表达盒位于同一个重组表达载体中或分别位于两个重组表达载体中。本发明方法获得的病毒样颗粒结构上类似于脊髓灰质炎病毒，可用作 疫苗 抗原 ，该抗原由多个 单体 构成，分子量巨大，在电镜下可观察到颗粒状重复性结构，具有较强的免疫原性。，下面是一种制备重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的方法专利的具体信息内容。
1.一种重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组表达载体，所述重组表达载体包含有P1蛋白表达盒和3C蛋白表达盒，所述P1蛋白表达盒和3C蛋白表达盒位于同一个重组表达载体中或分别位于两个重组表达载体中。
2.如权利要求1所述的一种重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组表达载体，其特征在于，所述P1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述3C蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：
2所示。
3.如权利要求1所述的一种重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组表达载体，其特征在于，所述P1蛋白表达盒中，含有启动子以及受启动子调控的P1蛋白的基因表达序列。
4.如权利要求3所述的一种重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组表达载体，其特征在于，所述P1蛋白表达盒中，P1蛋白的基因表达序列如SEQ ID NO：3所示，所述启动子为AOX1启动子，以AOX1(TT)为转录终止序列。
5.如权利要求4所述的一种重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组表达载体，其特征在于，所述P1蛋白表达盒中以5’至3’方向包括AOX1启动子、P1蛋白的基因表达序列、AOX1(TT)转录终止序列。
6.如权利要求1所述的一种重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组表达载体，其特征在于，所述3C蛋白表达盒中，含有启动子以及受启动子调控的3C蛋白的基因表达序列。
7.如权利要求6所述的一种重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组表达载体，其特征在于，所述3C蛋白表达盒中，3C蛋白的基因表达序列如SEQ ID NO：4所示，所述启动子为截短型AOX1启动子，所述截短型AOX1启动子的序列如SEQ ID NO：5所示，以AOX1(TT)为转录终止序列。
8.如权利要求7所述的一种重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组表达载体，其特征在于，所述3C蛋白表达盒中以5’至3’方向包括截短型AOX1启动子、3C蛋白的基因表达序列、AOX1(TT)转录终止序列。
9.如权利要求1所述的一种重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组表达载体，其特征在于，所述P1蛋白表达盒和3C蛋白表达盒位于同一个酵母表达载体中，所述重组表达载体由P1蛋白表达盒和3C蛋白表达盒插入pPICZB后获得。
10.如权利要求9所述的一种重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组表达载体，其特征在于，P1蛋白表达盒和3C蛋白表达盒替换pPICZB的第7-1411碱基。
11.如权利要求10所述的一种重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组表达载体，其特征在于，所述P1蛋白表达盒和3C蛋白表达盒替换pPICZB的第7-1411碱基的具体全序列如SEQID NO：8所示。
12.如权利要求1-11任一权利要求所述的重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组表达载体的制备方法，所述重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组表达载体是由pPICZB质粒改造获得，其具体的制备方法包括如下步骤：
1)pPICZdA质粒的构建：构建截短型AOX1启动子插入片段SEQ ID NO：5，将截短型AOX1启动子插入片段替换pPICZB中AOX1启动子片段，获得质粒pPICZdA；
2)3C-pPICZdA质粒的构建：将3C蛋白的基因表达序列SEQ ID NO：4插入pPICZdA的多克隆位点，获得3C-pPICZdA；3C-pPICZdA中含有3C表达盒；
3)P1-pPICZ质粒的构建：将P1蛋白的基因表达序列SEQ ID NO：3插入pPICZ的多克隆位点，获得P1-pPICZ；
4)P13C-pPICZ质粒的构建：酶联合处理P1-pPICZ得到P1表达盒，并将P1表达盒插入
3C-pPICZdA，获得P13C-pPICZ。
13.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，pPICZdA质粒的构建方法具体为：构建左右两端分别为BglII限制性酶切位点和BstBI限制性酶切位点，中间含有截短型AOX1启动子SEQ ID NO：5的截短型AOX1启动子插入片段；然后将BglII与BstBI联合酶切处理截短型AOX1启动子插入片段和pPICZB，两者连接后获得质粒pPICZdA。
14.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，3C-pPICZdA质粒的构建方法具体为：BstBI酶和KpnI酶联合处理3C蛋白的基因表达序列SEQ ID NO：4与pPICZdA，两者连接后获得3C-pPICZdA。
15.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，P1-pPICZ质粒的构建方法具体为：BstBI酶和KpnI酶联合处理P1蛋白的基因表达序列SEQ ID NO：3与pPICZ，两者连接后获得P1-pPICZ。
16.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4中，P13C-pPICZ质粒的构建方法具体为：BamHI酶BglII酶联合处理P1-pPICZ得到P1表达盒，再使用BamHI酶处理
3C-pPICZdA，将酶处理后的3C-pPICZdA与P1表达盒连接后获得P13C-pPICZ。
17.一种重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的工程菌，为包含有如权利要求1-11任一权利要求所述的重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组表达载体的重组工程菌。
18.一种制备重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的方法，包括如下步骤：
1)将如权利要求1-11任一权利要求所述的重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组表达载体转化酵母细胞，得到表达P1基因和3C基因的重组酵母细胞；
2)通过酵母表达系统表达P1和3C，获得脊髓灰质炎病毒样颗粒。
19.如权利要求18所述的一种制备重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的方法，其特征在于，所述酵母选自酿酒酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、脆壁克鲁维氏酵母、乳酸克鲁维氏酵母，以及栗酒裂殖酵母中的一种或多种的选择。
20.如权利要求1-11任一权利要求所述的重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组表达载体、如权利要求17所述的工程菌，以及如权利要求18-19任一权利要求所述的制备重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的方法在脊髓灰质炎疫苗制备领域中的用途。
一种制备重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的方法
技术领域
背景技术
[0002] 脊髓灰质炎(Poliomyelitis)是由脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)感染所引起的以肢体麻痹为主的急性肠道传染病，主要通过粪-口传播，影响五岁以下的儿童，俗称小儿麻痹症，发生麻痹症的儿童多数留下跛行、终身致残。目前脊髓灰质炎无特效治疗方法，只能以疫苗作为预防。
[0003] 脊髓 灰 质炎 病 毒属 于 小RNA病 毒 科(Picornaviridae)肠 道病 毒 属(Enteroviruse)，内含单股正链RNA基因，蛋白衣壳为二十面体立体对称结构，无包膜。脊髓灰质炎病毒基因组RNA长约7.5kb。基因组分为5'端非编码区、多聚蛋白编码区、3'端非编码区和3'端Poly(A)尾四部分。其中多聚蛋白编码区编码产生一个多聚蛋白前体，分为P1、P2和P3区；P1区可经蛋白酶水解产生衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，P2和P3区则可水解产生蛋白酶、RNA复制酶及用于识别细胞、调节基因的其他蛋白。5个拷贝的VP1、VP2、VP3和VP4构成了五聚体，12个五聚体构成二十面体核壳。脊髓灰质炎病毒有三个血清型，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，各型之间无交叉免疫反应。
[0004] 口服脊髓灰质炎减毒活疫苗(oral polio vaccine，OPV)在1958年研制成功在美国上市，后来推广至全球。OPV的优点包括接种简单(口服)、费用低、可产生稳定的肠道粘膜免疫、有效阻断脊灰病毒传播等。但随着全世界消灭脊灰目标的推进，生物安全在遏制脊灰病毒传播中的作用越来越重要。服用OPV后产生的疫苗相关麻痹型脊灰(Vaccine associated paralytic poliomyelitis，VAPP)病例，疫苗衍生脊灰病毒(Vaccine-derived poliovirus，VDPV)及其所引起的疫苗衍生脊灰病毒的循环(Circulating vaccine-derived polioviruses，cVDPVs)和免疫缺陷疫苗衍生脊灰病毒(Immunodeficient related vaccine-derived poliovirus，iVDPV)病例越来越受到关注。
[0005] Salk等人研制成功的脊髓灰质炎灭活疫苗(Inactivated poliovirus vaccine，IPV)，用于生产的野毒株包括Ⅰ型Mahoney株、Ⅱ型MEF株、Ⅲ型Saukett株。IPV的免疫原性和安全性都很理想，能有效预防脊灰爆发。并且IPV不存在引起VAPP、cVDPVs等风险，其群体免疫优于OPV。虽然每支IPV的价格比OPV昂贵，但是考虑到常规脊灰免疫和加强免疫，现 在仍在使用OPV的148个国家如果改用IPV免疫接种，也不会加重财政负担。
[0006] 目前国际上实际使用的IPV，都是通过用甲醛灭活的脊灰野病毒株生产的传统脊灰灭活疫苗(Conventional inactivated poliovirus vaccine，cIPV)。全球消灭脊髓灰质炎病毒后，将会更加严格管理脊灰野毒株，所以新一代脊髓灰质炎疫苗的开发迫在眉睫。
[0007] 很多病毒的病毒结构蛋白重组表达后可以自发组装成病毒样颗粒，该病毒样颗粒的抗原性与真病毒没有区别，但缺少病毒核酸因而不具有感染性。病毒样颗粒已经成为开放安全有效的病毒性疾病疫苗的一个有效策略，因此，针对脊髓灰质炎病毒的病毒样颗粒有效制备是生产脊灰疫苗的有效途径。
发明内容
[0008] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种制备重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的方法，并进一步提供了相关重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组表达载体，用于解决现有技术中的问题。
[0009] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组表达载体，所述重组表达载体包含有P1蛋白表达盒和3C蛋白表达盒，所述P1蛋白表达盒和3C蛋白表达盒位于同一个重组表达载体中或分别位于两个重组表达载体中。
[0010] 优选的，所述P1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述3C蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0011] 优选的，所述P1蛋白表达盒中，含有启动子以及受启动子调控的P1蛋白的基因表达序列。P1蛋白表达盒能够表达P1蛋白。
[0012] 更优选的，所述P1蛋白表达盒中，P1蛋白的基因表达序列如SEQ ID NO：3所示。所述P1蛋白的基因表达序列的5’和3’端分别设有BstBI酶和KpnI酶的限制性酶切位点序列。
[0013] 更优选的，所述启动子为AOX1启动子(调控P1蛋白的基因表达序列)。AOX1启动子序列具体可参见pPICZA,B,&C Pichia Vectors说明书及载体信息(Lifetechnologies,货号V190-20)。
[0014] 更优选的，P1蛋白表达盒中，以AOX1(TT)为转录终止序列。AOX1(TT)转录终止区域序列具体可参见pPICZA,B,&C Pichia Vectors说明书及载体信息(Lifetechnologies,货号V190-20)。
[0015] 进一步优选的，所述P1蛋白表达盒中以5’至3’方向包括AOX1启动子、P1蛋白的基因表达序列、AOX1(TT)转录终止序列。
[0016] 优选的，所述3C蛋白表达盒中，含有启动子以及受启动子调控的3C蛋白的基因表达序列。3C蛋白表达盒能够表达3C蛋白。
[0017] 更优选的，所述3C蛋白表达盒中，3C蛋白的基因表达序列如SEQ ID NO：4所示。所述3C蛋白的基因表达序列的5’和3’端分别设有BstBI酶和KpnI酶的限制性酶切位点序列。
[0018] 更优选的，所述启动子为截短型AOX1启动子(调控3C蛋白的基因表达序列)，所述截短型AOX1启动子的序列如SEQ ID NO：5所示。
[0019] 更优选的，3C蛋白表达盒中，以AOX1(TT)为转录终止序列。
[0020] 进一步优选的，所述3C蛋白表达盒中以5’至3’方向包括截短型AOX1启动子、3C蛋白的基因表达序列、AOX1(TT)转录终止序列。
[0021] 优选的，所述P1蛋白表达盒和3C蛋白表达盒位于同一个重组表达载体中，优选为酵母表达载体。
[0022] 当P1蛋白表达盒和3C蛋白表达盒位于同一个重组表达载体中时，可以以5’至3’方向先后排列本发明的P1蛋白表达盒和3C蛋白表达盒，也可以反过来排列。
[0023] 更优选的，所述重组表达载体由P1蛋白表达盒和3C蛋白表达盒插入pPICZB后获得。
[0024] 更优选的，P1蛋白表达盒和3C蛋白表达盒替换pPICZB的7-1411碱基。
[0025] 进一步优选的，所述P1蛋白表达盒和3C蛋白表达盒替换pPICZB的7-1411碱基的具体全序列如SEQ ID NO：8所示。所述SEQ ID NO：8中包含有P1蛋白表达盒和3C蛋白表达盒。
[0026] 本发明第二方面提供所述重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组表达载体的制备方法，通过构建能够同时调控表达P1蛋白和3C蛋白的真核表达载体制备。
[0027] 优选的，所述重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组表达载体通过构建P1蛋白受AOX1启动子调控表达、并且3C蛋白受截短型AOX1启动子调控表达的真核表达载体制备。
[0028] 更优选的，所述重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组表达载体是由pPICZB质粒改造获得，其具体的制备方法包括如下步骤：
[0029] 1)pPICZdA质粒的构建：构建截短型AOX1启动子插入片段SEQ ID NO：5，将截短型AOX1启动子插入片段替换pPICZB中AOX1启动子片段，获得质粒pPICZdA；
[0030] 2)3C-pPICZdA质粒的构建：将3C蛋白的基因表达序列SEQ ID NO：4插入pPICZdA的多克隆位点，获得3C-pPICZdA；3C-pPICZdA中含有3C表达盒；
[0031] 3)P1-pPICZ质粒的构建：将P1蛋白的基因表达序列SEQ ID NO：3插入pPICZ的 多克隆位点，获得P1-pPICZ；
[0032] 4)P13C-pPICZ质粒的构建：酶联合处理P1-pPICZ得到P1表达盒，并将P1表达盒插入3C-pPICZdA，获得P13C-pPICZ，插入位置位于3C表达盒之前或之后。
[0033] 更优选的，所述步骤1中，pPICZdA质粒的构建方法具体为：构建左右两端分别为BglII限制性酶切位点和BstBI限制性酶切位点，中间含有截短型AOX1启动子SEQ ID NO：5的截短型AOX1启动子插入片段；然后将BglII与BstBI联合酶切处理截短型AOX1启动子插入片段和pPICZB，两者连接后获得质粒pPICZdA。
[0034] 更优选的，所述步骤2中，3C-pPICZdA质粒的构建方法具体为：BstBI酶和KpnI酶联合处理3C蛋白的基因表达序列SEQ ID NO：4与pPICZdA，两者连接后获得3C-pPICZdA。
[0035] 更优选的，所述步骤3中，P1-pPICZ质粒的构建方法具体为：BstBI酶和KpnI酶联合处理P1蛋白的基因表达序列SEQ ID NO：3与pPICZ，两者连接后获得P1-pPICZ。
[0036] 更优选的，所述步骤4中，P13C-pPICZ质粒的构建方法具体为：BamHI酶BglII酶联合处理P1-pPICZ得到P1表达盒，再使用BamHI酶处理3C-pPICZdA，将酶处理后的3C-pPICZdA与P1表达盒连接后获得P13C-pPICZ。
[0037] 进一步优选的，所述步骤4中，在将酶处理后的3C-pPICZdA与P1表达盒连接之前，还使用碱性磷酸酶处理使用BamHI酶处理3C-pPICZdA所得的产物。
[0038] 本发明第三方面公开了一种重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的工程菌，为包含有所述重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组表达载体的重组工程菌。
[0039] 优选的，所述重组工程菌为酵母菌。
[0040] 更优选的，所述酵母菌选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、脆壁克鲁维氏酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)，以及栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中的一种或多种的组合。
[0041] 本发明第四方面提供一种制备重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的方法，包括如下步骤：
[0042] 1)将所述重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组表达载体转化酵母细胞，得到表达P1基因和3C基因的重组酵母细胞；
[0043] 2)使用步骤1所得的重组酵母细胞，通过酵母表达系统表达P1和3C，纯化后即获得脊髓灰质炎病毒样颗粒。
[0044] 本领域技术人员可根据经验，对步骤1所得的重组酵母细胞进行筛选，并在筛选后对菌种进行活化。
[0045] 优选的，所述筛选的具体步骤为：将菌液涂布YPD平板(Zeocin)，30℃过夜培养后挑取部分克隆划线YPD平板(Zeocin)，30℃倒置培养2-3天，挑取生长情况较好的一株作为发酵菌种。
[0046] 优选的，所述活化的具体步骤为：在恒温振荡培养器内30℃振荡培养，培养基为YPD培养基，测得活化液的OD600在1～2的范围时停止培养，镜检无杂菌后将活化液转接入YPD种子培养基，在恒温振荡培养器内30℃培养过夜即得活化的种子培养液。
[0047] 优选的，所述酵母选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、脆壁克鲁维氏酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)，以及栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中的一种或多种的选择。
[0048] 本领域技术人员可根据经验，使用所述重组酵母细胞，采用适当的酵母表达系统表达P1和3C。
[0049] 采用BSM培养基，初始温度设定为30℃，初始pH5～6，DO值100％，添加PTM1痕量盐类，初始增殖阶段培养20～24小时，溶氧值20～40％，当菌体湿重达到约60～90g/L时，补加甘油，维持溶氧值20～40％，补加4～8小时，检测菌体湿重增加到100～200g/L时，停止补料；维持溶氧值高于20～40％，将温度设定在30℃，pH值控制调为6±0.05，开始加入甲醇诱导，甲醇的补加速度为50～100mL/min，诱导40小时发酵结束。
[0050] 优选的，所述纯化的具体方法为：对发酵液进行固液分离后弃上清，收集菌泥；将菌泥加入破菌用缓冲溶液，充分搅拌后获得菌体混悬液，高压破碎菌体混悬液获得破菌液；将破菌液离心分离，收集上清液并在上清液中加入固体硫酸铵(终浓度为16.4g-22.6g/100ml)至饱和度为30～40％，放置过夜后，再次离心分离，弃去上清保留沉淀物；再加入缓冲溶液后充分搅拌，离心分离并收集离心上清样品；密度梯度离心，收集所需梯度样品并进行膜过滤，即得纯化的病毒样颗粒蛋白样品。
[0051] 本领域技术人员可根据经验判断密度梯度离心时，目标样品所在的梯度。
[0052] 更优选的，所述密度梯度离心使用的介质为蔗糖。
[0053] 进一步优选的，所述密度梯度离心的具体方法为：在离心管内由下至上依次缓慢加入60％蔗糖溶液，50％蔗糖溶液，40％蔗糖溶液，30％蔗糖溶液，所述离心上清样品，液体石蜡，离心后收集50-60％蔗糖梯度中的样品。
[0054] 本发明第五方面提供所述重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组表达载体、工程菌，以及制备重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的方法在脊髓灰质炎疫苗制备领域中的用途。
[0055] 本发明根据毕赤酵母密码子偏爱性合成编码P1和3C蛋白的DNA序列，合成所得的两条基因连接到毕赤酵母表达载体上，得到同时表达P1前体蛋白和3C蛋白酶的双表达质粒(非分泌表达质粒)。重组质粒通过基因工程方法整合到毕赤酵母基因组中，经大规模筛选得到高表达菌株，以此重组表达菌株为种子，发酵表达得到P1和3C蛋白。3C酶在酵母细胞内部将P1前体蛋白裂解为VP1、VP3和VP0，三种衣壳蛋白亚基自组装成为病毒样颗粒(VLPs)。通过柱层析等纯化方法获得高纯度、形态均一、性状稳定的VLPs，纯化后的VLPs吸附适当的佐剂(如铝佐剂)成为重组疫苗制剂。经动物实验验证含有本发明方法制备的脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组疫苗制剂具有较好的免疫原性。
[0056] 本发明的有益效果：本发明通过使用不同的启动子，调节病毒衣壳蛋白P1与蛋白酶3C的表达量，调控病毒样颗粒前体蛋白P1的剪切，从而获得形态均一的病毒样颗粒。本发明方法获得的病毒样颗粒结构上类似于脊髓灰质炎病毒，可用作疫苗抗原，该抗原由多个单体构成，分子量巨大，在电镜下可观察到颗粒状重复性结构，具有较强的免疫原性(0.01μg剂量的免疫组即有一定阳转率，而0.1μg剂量的免疫组小鼠阳转率即可达到83.3％)；并且，本发明制备的疫苗抗原不含有病毒的遗传物质，不会有潜在的感染可能性，是更合适的疫苗候选抗原。附图说明
[0057] 图1：P13C-pPICZdual质粒图谱。
[0058] 图2：P13C-pPICZdual酶切鉴定图：
[0059] 泳道1：P13C-pPICZdual质粒(未酶切)；
[0060] 泳道2：P13C-pPICZdual质粒(BglII+SacI)；
[0061] 泳道3：250bp DNA ladder(TAKARA)。
[0062] 图3：重组脊髓灰质炎病毒样颗粒Western-Blot检测结果：
[0063] 泳道1：X-33空宿主菌诱导表达结果；
[0064] 泳道2：标准蛋白分子量Marker；
[0065] 泳道3：P13C-X33诱导表达结果。
[0066] 图4：重组脊髓灰质炎病毒样颗粒电镜观察(30000倍)。
具体实施方式
[0067] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加 以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0068] 在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
[0069] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0070] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等 MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
[0071] 实施例1病毒颗粒的制备
[0072] 1.表达基因的选择与密码子的优化设计
[0073] 编码脊髓灰质炎I型Mahoney株P1蛋白与3C蛋白的DNA序列参照GeneBank：V01149.1，P1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，3C蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0074] 对I型Mahoney株中编码SEQ ID NO:1所示P1蛋白和SEQ ID NO:2所示3C蛋白的野生型DNA序列进行改造，密码子尽可能采用毕赤酵母中使用频率较高的密码子，同时避免了可能影响表达的转录因子结合区、重复序列和RNA高级结构。密码子优化后得到编码P1 蛋白的重组基因序列如SEQ ID NO:3所示，编码3C蛋白的重组基因序列如SEQ ID NO:4所示。
[0075] 2.P13C-pPICZdual重组表达载体的构建
[0076] 设计5’端和3’端分别含有BstBI酶切位点和KpnI酶切位点的P1蛋白表达序列并进行全基因合成，获得SEQ ID NO:3所示序列的核苷酸片段；设计5’端和3’端别含有BstBI酶切位点和KpnI酶切位点的3C蛋白表达序列并进行全基因合成，获得SEQ ID NO:4所示序列的核苷酸片段。P13C-pPICZdual质粒改造自pPICZ质粒(Life Technologies)，简述如下：
[0077] 采用SEQ ID NO：6-7所示序列的引物从pPICZB质粒中扩增得到截短型AOX1启动子插入片段。BglII+BstBI联合酶切处理截短型AOX1启动子(SEQ ID NO：5)插入片段和pPICZB，两片段连接后得到pPICZdA。采用BstBI酶和KpnI酶的混合酶酶切处理P1蛋白表达序列(SEQ ID NO：3)与pPICZB质粒，两片段连接后得到P1-pPICZ。采用BstBI酶和KpnI酶的混合酶酶切3C蛋白表达序列与pPICZdA质粒，两片段连接后得到3C-pPICZdA。采用BglII酶和BamHI酶的混合酶酶切P1-pPICZ质粒，BamHI酶酶切3C-pPICZdA，再用碱性磷酸酶(BamHI+BglII酶切使用的buffer3即碱性磷酸酶最适反应buffer，无需更换或添加其他缓冲液)处理3C-pPICZdA，两片段连接后得到P13C-pPICZdual(图1)。P13C-pPICZdual酶切鉴定图如图2所示。
[0078] 引物1：5’-CCCCAGATCTCATTCCAATTCCTTCT-3’(SEQ ID NO：6)
[0079] 引物2：5’-GGCCCCGTTTCGAATAATTAGTTG-3’(SEQ ID NO：7)
[0080] 3.P13C-pPICZdual重组表达菌株构建
[0081] 毕赤酵母菌株X33购自Life Technologies。将重组构建的P13C-pPICZdual质粒由SacI酶线性化，电转毕赤酵母，电转条件为1500V，120Ω，50μF。电转后菌液涂布YPD平板(200μg/mlZeocin)，30℃过夜倒置培养。挑取部分克隆划线YPD平板(1500μg/ml Zeocin)，30℃倒置培养2-3天，挑取生长情况较好的一株作为发酵菌种，命名为P13C-X33。
[0082] 4.重组蛋白的发酵罐培养
[0083] 采用YPD培养基对重组表达菌株P13C-X33进行活化，在恒温振荡培养器内200rpm，30℃培养过夜，振荡培养20小时左右测得活化液的OD600在1～2的范围，停止培养。
[0084] 镜检无杂菌后取1ml活化液转接入500ml种子培养基(YPD)，在恒温振荡培养器内以200rpm，30℃培养过夜。镜检无杂菌后按1:15接种发酵罐。
[0085] 使用BIOENGINEERING RALF Basic发酵罐，发酵采用基础盐培养基BSM。发酵初始温度设定为30℃，初始pH5～6，转速300rpm，通气量0.5vvm，DO值100％，添加PTM1痕量盐类(PTM1母液配方：硫酸铜0.6％，碘化钠0.008％，硫酸锰0.3％，钼酸钠0.02％，硼酸0.002％，氯化钴0.12％，硫酸铁6.5％，氯化锌2.0％，硫酸0.5％，生物素0.02％(质量体积比)，发酵中PTM1母液浓度为12ml/L)。初始增殖阶段培养20～24小时左右，通过调节搅拌转速、空气流量、罐压和补加纯氧维持溶氧值20～40％。当菌体湿重达到约60～90g/L时，补加50％甘油溶液(质量百分比浓度)200-300克。维持溶氧值20～40％，补加
4～8小时。检测菌体湿重增加到100～200g/L时，停止补料。将温度设定在30℃，pH值控制调为6±0.05，开始加入甲醇诱导，甲醇的补加速度为50～100mL/min。维持溶氧值高于20～40％，温度设定在30℃，pH值控制为6±0.05，诱导40小时发酵结束。
4～8小时。检测菌体湿重增加到100～200g/L时，停止补料。将温度设定在30℃，pH值控制调为6±0.05，开始加入甲醇诱导，甲醇的补加速度为50～100mL/min。维持溶氧值高于20～40％，温度设定在30℃，pH值控制为6±0.05，诱导40小时发酵结束。
[0087] 5.病毒样颗粒纯化
[0088] 取200g发酵菌体，加入4℃预冷的破菌用缓冲溶液(50mM PB，0.2M NaCl，0.5％Tween-80，pH7.0)800ml，于磁力搅拌器上搅拌至完全混匀，获得菌体混悬液。采用高压均质机(ATS AH-100B)高压破碎制备的菌体混悬液，调节均质阀，控制破菌压力为1200bar。重复以上高压破碎过程3～4次，收集破菌液。
[0089] 采用高速冷冻离心机(ThermoFisher lynx4000)离心澄清破菌液，设定条件10000rpm，30min，8℃，离心分离，收集离心后的上清液。上清液中加入固体硫酸铵(终浓度为16.4g-22.6g/100ml)至饱和度为30～40％，4℃放置过夜后，按10000rpm、30min、8℃条件第二次离心分离，弃去上清保留沉淀物，加入缓冲溶液(50mM PB pH7.0)100ml，搅拌2～
4h。最后再次按10000rpm、30min、8℃条件离心分离，保留上清用于下一步的分离。
4h。最后再次按10000rpm、30min、8℃条件离心分离，保留上清用于下一步的分离。
[0090] 在离心管中由下至上依次缓慢加入60％蔗糖溶液1ml，50％蔗糖溶液1ml，40％蔗糖溶液1ml，30％蔗糖溶液1ml，上述离心上清样品0.5ml，液体石蜡0.5ml。使用Beckman Coulter Optima Max台式超速离心机，MLS-50转子，在4℃，40000rpm离心4小时。收集50％-60％蔗糖梯度中样品，用100KD超滤管(Millipore公司)去除蔗糖并浓缩20倍，用
0.45um膜过滤，即得纯化的病毒样颗粒蛋白样品。
0.45um膜过滤，即得纯化的病毒样颗粒蛋白样品。
[0091] 6.病毒样颗粒性质鉴定
[0092] 纯化的病毒样颗粒蛋白样品经过Western-blot检测，可与脊髓灰质炎病毒VP1的多克隆 抗体(本实施例多抗采用CalBioreagents公司产品，货号P046，二抗采用北京鼎国昌盛生物技术有限公司，货号SH-0071辣根酶标记兔抗山羊IgG)呈特异性的显色反应(图3)。纯化的病毒样颗粒蛋白样品，加入20g/L磷酸钨染液染色0.5-1分钟，自然晾干后电镜观察，电镜(Philips)观察呈现病毒样颗粒(图4)。
[0093] 实施例2病毒颗粒的抗原性能检测
[0094] 1.病毒样颗粒疫苗制备
[0095] 将纯化获得的脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白吸附铝佐剂(50μg蛋白：500μg，铝佐剂)，制备获得具有免疫原性的脊髓灰质炎病毒疫苗。
[0096] 2.脊髓灰质炎病毒样颗粒免疫原性的测定
[0097] 选取6～8周龄的SPF级BALB/c小鼠，分为4组，每组6只小鼠。其中1组小鼠用含有铝佐剂的缓冲液(50mM PB pH7.0)进行免疫(作为阴性对照组)，其它3组每次免疫剂量为1μg/只、0.1μg/只、0.01μg/只(此处免疫剂量是指病毒样颗粒蛋白量的质量)，分别于第0、14天皮下注射免疫，共免疫两次，第二次免疫后两周采血。将采集得到的血液于4℃放置过夜后，5000g离心10min，吸取上清，即得到鼠多抗血清，于-20℃存放，并检测该鼠多抗血清的阳转率，具体方法如下：
[0098] 用包被液(0.1M pH9.8NaHCO3)稀释纯化的脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白至1μg/ml，向酶标板每个孔中各加0.1ml，4℃包被过夜。除去包被液，洗板。每孔加入0.3ml封闭液(5％脱脂奶粉+PBST)于37℃保温2小时。除去包被液，每孔加入用稀释缓冲液(2％脱脂奶粉+PBST)以1：1000稀释的被检血清各0.1ml，于37℃保温1小时，除去血清液，洗板。然后向每孔加入用稀释缓冲液(2％脱脂奶粉+PBST)以1：5000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG(鼎国，货号SH-0011辣根酶标记羊抗小鼠IgG)各0.1ml，37℃保温0.5小时后除去酶标液，洗板；然后向每孔中加入0.1ml DAB显色液，室温避光作用10分钟后加2M H2SO40.05ml终止液终止反应，并用酶标比色仪测定OD450值，三个检测组的阳转率结果如表1所示。Cutoff值为阴性对照被检血清抗体的OD450值的平均值加上3倍标准差，OD450值大于Cutoff值的小鼠判定为阳性，OD450值小于Cutoff值的小鼠判定为阴性。
[0099] 表1脊髓灰质炎病毒样颗粒阳转率结果
[0100]组别 1μg组 0.1μg组 0.01μg组
阳转率 100％ 83.3％ 16.7％
阳转率 100％ 83.3％ 16.7％
[0101] 实验结果说明，0.1μg剂量的免疫组小鼠阳转率即可达到83.3％，说明上述方法制备获得 的脊髓灰质炎病毒疫苗具有高免疫原性。
[0102] 综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
[0103] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
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