[0001] 相关申请

[0002] 本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2017年4月13日提交的美国临时申请号62/485,295和2017年11月8日提交的美国临时申请号62/583,343的权益，其各自通过引用将其全文合并于此。

[0003] 在美国，每年有超过22,000例新的卵巢癌病例和超过14,000例死亡(Siegel RL等(2016)CA Cancer J Clin 66(1):7-30)，估计每年的医疗保健负担超过6亿美元(Dizon D MJ(2010)Gynecol Oncol116(3))。常规方法如化疗(例如卡铂/顺铂和/或紫杉醇)通常不能治愈卵巢癌。大约70％的患者未基于一线化疗实现缓解，而40-50％的确实缓解的患者在三年内复发。

[0004] 其他癌症如乳腺癌和结肠癌的治疗分别与85％和65％的五年生存率相关。治疗通常包括侵入性手术和化疗的组合。发明内容

[0005] 在一些实施方案中，本文提供了基于细胞的组合免疫疗法，其用于癌症的靶向治疗，例如卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌和胰腺癌。这种组合免疫疗法依赖于能够在肿瘤内和/或肿瘤附近(“肿瘤微环境(TME)”)进行多因素调节的工程化细胞回路。尽管组合免疫疗法取得了令人激动的进步，但其抗癌功效有限，这部分地是由于以下挑战。在不引发重大副作用的情况下，难以同时给予多种疗法以达到最大疗效。在临床试验中也难以确定多种全身施用和/或局部注射疗法的合适剂量和时机。然而，本文提供的组合免疫疗法是肿瘤特异性和有效的，且还限制了全身毒性。在某些情况下，这种组合免疫疗法可用于从单一递送媒介将多种免疫调节效应分子递送至肿瘤微环境。有利地，在一些实施方案中，本公开的细胞回路在间充质干细胞(MSC)中工程化，该间充质干细胞能够选择性地归巢至肿瘤(包括转移瘤)，能够产生促炎性/免疫刺激性分泌组(secretome)和，在某些条件下，抗炎性分泌组，且是低免疫原性的。这些特征尤其使得其能够用于例如同种异体细胞疗法，而没有严重的安全性问题、副作用或排斥反应。

[0006] 人们越来越认识到，肿瘤是肿瘤细胞与周围基质之间的复杂相互作用，周围基质包括细胞外基质、癌症相关的基质细胞(MSC和成纤维细胞)、肿瘤脉管系统和免疫系统。TME通过多种针对患者的先天和适应性免疫系统的机制来抑制抗肿瘤免疫反应。例如，肿瘤可以募集并诱导调节T细胞，其通过加工特定的趋化因子(如CCL22)来抑制常规T细胞的抗肿瘤活性。肿瘤还可以表达抑制T细胞和NK细胞活性的分子，例如免疫检查点如PD-L1。因此，靶向单一途径可能不足以实现针对实体肿瘤的稳定功效。

[0007] 因此，在一些方面，本公开提供了经工程化以产生多种效应分子的间充质干细胞(MSC)，其中至少两种效应分子调控不同的肿瘤介导的免疫抑制机制(例如，靶向多种途径)。在一些实施方案中，效应分子(a)刺激T细胞信号传导、活性和/或募集，(b)刺激抗原呈递和/或加工，(c)刺激自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号传导、活性和/或募集，(d)刺激树突细胞分化和/或成熟，(e)刺激免疫细胞募集，(f)刺激促炎性巨噬细胞信号传导、活性和/或募集，或抑制抗炎性巨噬细胞信号传导、活性和/或募集，(g)刺激基质降解，(h)刺激免疫刺激性代谢产物的产生，(i)刺激I型干扰素信号传导，(j)抑制负性共刺激信号传导，(k)抑制抗肿瘤免疫细胞(例如，T细胞/NK细胞)的促凋亡信号传导或诱导癌细胞的凋亡，(l)抑制T调节(Treg)细胞信号传导、活性和/或募集，(m)抑制肿瘤检查点分子，(n)刺激干扰素基因刺激因子(STING)信号传导，(o)抑制骨髓来源抑制细胞信号传导、活性和/或募集，(p)降解免疫抑制因子/代谢产物，(q)抑制血管内皮生长因子信号传导，和/或(r)直接杀死肿瘤细胞。例如，由工程化MSC产生的一种效应分子可以刺激TME中的抗肿瘤免疫介导机制或免疫刺激机制，而由相同MSC(或不同MSC)产生的另一种效应分子可以抑制TME中的免疫抑制机制(例如，CD28/B7家族途径(例如，PD-1、CTLA-4、CD28)或IL-10)。作为另一个例子，由工程化MSC产生的一种效应分子可以在肿瘤微环境中刺激炎性途径(例如，TNF受体超家族途径(例如，OX40、CD137、CD40、GITR)、共同γ链家族途径(例如，IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL15、IL-21)或Toll样受体途径(例如TLR4、TLR9))，而由相同的MSC(或不同的MSC)产生的另一种效应分子可以在肿瘤微环境中抑制炎症的负调节因子(例如，Stat3、Bruton酪氨酸激酶、c-kit和/或SOCS-1)。

[0008] 本公开涵盖的效应分子的非限制性实例包括细胞因子、抗体、趋化因子、核苷酸、肽、酶和溶瘤病毒。例如，可以对MSC进行工程化以表达(并且通常分泌)以下效应分子中的至少一种、两种、三种或更多种：IL-12、IL-16、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、IL-21、OX40-配体、CD40L、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗TGFβ抗体、抗TNFR2、MIP1α(CCL3)、MIP1β(CCL5)、CCL21、CpG寡脱氧核苷酸和抗肿瘤肽(例如，具有抗肿瘤活性的抗微生物肽，参见例如Gaspar，D等，Front Microbiol.2013；4:294；Chu,H.等PLoS One.2015；10(5):e0126390，和网站：aps.unmc.edu/AP/main.php)。

[0009] 本文还提供了包括培养间充质干细胞以产生效应分子的方法。

[0010] 本文还提供了包括将间充质干细胞递送给受试者以体内产生至少一种由间充质干细胞产生的效应分子的方法。在一些实施方案中，效应分子在肿瘤微环境中产生或递送至肿瘤微环境。

[0011] 再进一步，本文提供了治疗癌症的方法，其包括将间充质干细胞递送至诊断为患有癌症的受试者。在一些实施方案中，癌症是卵巢癌，尽管可以治疗其他癌症/肿瘤。例如，本文提供的方法可用于治疗膀胱肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、结肠直肠肿瘤、食道肿瘤、神经胶质瘤、肾肿瘤、肝肿瘤、肺肿瘤、黑素瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、甲状腺肿瘤和/或子宫肿瘤。附图说明

[0012] 图1显示了使用具有人工5’UTR(copGFP上游的bar)和3’UTR(copGFP下游的bar)的核转染质粒在人MSC中的GFP表达。在该实验方案中，>80％的存活MSC表达高水平的GFP(深灰色直方图)。

[0013] 图2显示了2A表达载体设计和流式细胞术直方图，其显示了“效应子1”(BFP)和“效应子2”(GFP)的双重表达。左图：第二峰直方图(中等灰色)表示包含BFP-2A-GFP构建体的细胞，第三峰直方图(深灰色)表示仅包含GFP表达构建体的细胞，和第一峰直方图(浅灰色)表示未转染的细胞。右图：第三峰直方图(中等灰色)表示包含BFP-2A-GFP构建体的细胞，第二峰直方图(浅灰色)表示仅包含GFP表达构建体的细胞，和第一峰直方图(中等灰色)表示未转染的细胞。右图中的偏移曲线表明2A设计产生GFP+细胞，其也共表达BFP。

[0014] 图3显示了表明腹膜内注射的鼠BM源MSC(BM-MSC)在体内归巢至4T1乳腺癌细胞的肿瘤部位的数据。将荧光标记的BM-MSC(治疗细胞)注射到携带4T1乳腺肿瘤细胞的小鼠中。乳腺肿瘤细胞表达荧光素酶报道分子。左侧的顶部前两个图面显示了如所示的注射后第1天和第7天荷瘤小鼠中治疗细胞(BM-MSC)的成像。左侧的顶部第三图面显示了注射后第7天荷瘤小鼠中肿瘤细胞的成像。左侧的底部两个图面显示了如所示的注射后第1天和第7天未携带肿瘤的正常小鼠中治疗细胞的成像。最右侧提供了显示肿瘤对治疗细胞的归巢的影响示意图。

[0015] 图4显示了表明在乳腺癌的原位小鼠模型中，表达IL-12和CCL21a的工程化MSC诱导显著的肿瘤生长延迟的数据。左侧的图显示了工程化的MSC对小鼠中4T1乳腺肿瘤生长的影响(n＝8)。图表中的每条线代表在第0天和第7天接受对照MSC生长培养基或工程化MSC腹膜内注射的小鼠中的肿瘤体积。小鼠接受表达IL-12的工程化MSC和表达CCL21a的工程化MSC腹膜内注射。每隔一天通过卡尺测量来测定肿瘤体积。数据表示平均值±SEM。与对照培养基组相比，*p<0.05，**p<0.005。右侧的示意图显示了治疗的时间表及表达组合基因IL-12和CCL21a的工程化MSC对治疗小鼠的肿瘤负荷的影响。

[0016] 图5A包括表明表达IFN-β、IFN-γ、IL-12、CCL21a或其组合的工程化MSC抑制乳腺癌(4T1三阴性乳腺癌)的原位小鼠模型中的肿瘤生长的数据。每种效应子由不同的MSC表达，并且MSC组合(以1：1的比率)用于组合治疗。每张图显示了表达指示的免疫疗法的工程化MSC单独或组合对小鼠中4T1乳腺肿瘤生长的影响(n＝6-8)。图5A的每条线代表单个小鼠。图5B的左图显示了在第14天每种治疗中的单个小鼠的肿瘤重量。图5B的右图显示了接受每种治疗的小鼠随时间的以平均值±SEM表示的肿瘤体积。

[0017] 图6A包括表明表达OX40L、TRAIL、IL15、cGAS或其组合的工程化MSC在乳腺癌(4T1三阴性乳腺癌)的原位小鼠模型中不显著抑制肿瘤生长的数据。每种效应子由不同的MSC表达，并且MSC组合(以1：1的比率)用于组合治疗。每张图显示了表达指示的免疫疗法的工程化MSC单独或组合对小鼠中4T1乳腺肿瘤生长的影响(n＝6-8)。图6A的每条线表示单个小鼠。图6B的左图显示了每种治疗中的单个小鼠的肿瘤重量。图6B的右图显示了接受每种治疗的小鼠随时间的表示为平均值±SEM的体重。

[0018] 图7A包括表明表达IL-12和CCL21a的工程化MSC抑制乳腺癌(4T1三阴性乳腺癌)的原位小鼠模型中的肿瘤生长的数据；但是，添加抗CD40抗体不降低肿瘤生长。每种效应子由不同的MSC表达，并且MSC组合(以1：1的比率)用于组合治疗。每张图显示了表达指示的免疫疗法的工程化MSC单独或组合对小鼠中4T1乳腺肿瘤生长的影响(n＝6-8)。图7A的每条线代表单个小鼠。图7B显示了每种治疗中单个小鼠的肿瘤重量。

[0019] 图8A包括表明表达OX40L、TRAIL、IL15、HACvPD-1或其组合的工程化MSC在乳腺癌(4T1三阴性乳腺癌)的原位小鼠模型中不显著抑制肿瘤生长的数据。每种效应子由不同的MSC表达，并且MSC组合(以1：1的比率)用于组合治疗。每张图显示表达指示的免疫疗法的工程化MSC单独或组合对小鼠中4T1乳腺肿瘤生长的影响(n＝6-8)。图8A的每条线表示单个小鼠。图8B的左图显示每种治疗中单个小鼠的肿瘤重量。图8B的右图显示接受每种治疗的小鼠随时间的体重，表示为平均值±SEM。

[0020] 图9A包括表明表达IL-12和CCL21a的工程化MSC抑制乳腺癌(4T1三阴性乳腺癌)的原位小鼠模型中的肿瘤生长的数据；但是，表达CCL21a、IL-36γ和IL-7的MSC的组合不减少肿瘤的生长。然而，测试的一些效应子组合可能引起毒性。每种效应子由不同的MSC表达，并且MSC组合(以1：1的比率)用于组合治疗。每张图显示表达指示的免疫疗法的工程化MSC单独或组合对小鼠中4T1乳腺肿瘤生长的影响(n＝6-8)。图9A的每条线表示单个小鼠。图9B显示每种治疗中单个小鼠的肿瘤重量。

[0021] 图10A-10B包括来自用于毒性和筛选的GFP剂量递增研究的数据。图10A显示表达GFP的工程化的MSC不引起毒性。每种效应子由不同的MSC表达，并且MSC组合(以1：1的比率)用于组合治疗。每张图显示表达指示的免疫疗法的工程化MSC单独或组合对小鼠中4T1乳腺肿瘤生长的影响(n＝6-8)。图10A的每条线代表单个小鼠。图10B显示每种治疗中单个小鼠的肿瘤重量。

[0022] 图11A显示工程化人MSC不归巢至小鼠4T1肿瘤。图11B显示每种治疗中单个小鼠的肿瘤重量。每隔一天通过从卡尺测量的肿瘤体积确定功效。

[0023] 图12包括显示IL-12和CCL21a可以减少肿瘤扩增的数据。

[0024] 图13A包括表明表达IL-12和CCL21的工程化MSC足以抑制乳腺癌(4T1三阴性乳腺癌)的原位小鼠模型中的肿瘤生长以及添加检查点抑制剂(抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体)不提高功效的数据。每种效应子由不同的MSC表达，且MSC组合(以1：1的比率)用于组合治疗，并且检查点抑制剂单独注射。每张图显示表达指示的免疫疗法的工程化MSC单独或组合对小鼠中4T1乳腺肿瘤生长的影响(n＝6-8)。图13A的每条线代表单个小鼠。图13B显示每种治疗中单个小鼠的肿瘤重量。

[0025] 图14显示了表明表达IL-12和CCL21a的工程化MSC在结肠直肠癌的小鼠模型中诱导显著的肿瘤生长延迟的数据。左侧的图显示了工程化MSC对小鼠中CT26结肠直肠肿瘤生长的影响(n＝8)。图中的每条线代表在第0天和第7天接受腹膜内注射对照MSC生长培养基或工程化MSC的小鼠中的肿瘤体积。小鼠接受表达IL-12的工程化MSC和表达CCL21a的工程化MSC的腹膜内注射。每隔一天通过卡尺测量来确定肿瘤体积。数据表示平均值±SEM。与对照培养基组相比，*p<0.05，**p<0.005。右侧的示意图显示治疗的时间表及表达组合基因IL-12和CCL21a的工程化MSC对治疗小鼠的肿瘤负荷的影响。

[0026] 图15是显示CT26小鼠模型中确定给予工程化MSC细胞的最佳时间的肿瘤生长动力学的图。

[0027] 图16A-16B包括表明表达IL-12和CCL21a的工程化MSC与抗CD40或抗CTLA4抗体组合对结肠癌的同基因小鼠模型中平均肿瘤生长的影响的数据。用七种治疗方法之一治疗携带CT26结肠肿瘤的小鼠(每个治疗组n＝5-6)。MSC-IL-12+MSC-CCL21a指示用于组合治疗的表达IL-12的工程化细胞和表达CCL21a的工程化细胞(1:1比率)的治疗。图16B的左图显示了每种治疗中单个小鼠的肿瘤重量。图16B的右图显示了接受每种治疗的小鼠随时间的肿瘤体积，表示为平均值±SEM。

[0028] 图17A-17B包括来自剂量依赖性长期生存研究的数据。图17A显示了单个组的肿瘤体积。图17B显示了体重(顶图)、肿瘤体积(底图)和存活率(右图)。

[0029] 图18A包括表明表达IL-12、CCL21a以及IL15或HACvPD-1的工程化MSC在小鼠结肠直肠癌模型中显著抑制肿瘤生长的数据。每种效应子由不同的MSC表达，并且MSC组合(以1：1的比率)用于组合治疗。每个图显示了表达所示免疫疗法的工程化MSC单独或组合对小鼠中CT26结肠直肠肿瘤生长的影响(n＝6-8)。图18A的每条线表示单个小鼠。图18B显示了每种治疗中单个小鼠的肿瘤重量。图18C是肿瘤微环境内的浸润免疫群体的代表性图表。图
18D显示了总CD3群体中调节T细胞(Treg)的百分比。在用工程化的MSC-IL2和CCL21a处理的肿瘤微环境中Treg数量具有显著减少。

[0030] 图18E将免疫浸润的百分比与肿瘤重量相关联。发现具有高淋巴细胞(CD3+)的样品与低肿瘤重量相关，而具有高髓样(CD11b+)浸润的样品与较高的肿瘤负荷相关。

[0031] 图19包括表明体内腹膜内注射的鼠BM来源的MSC(BM-MSC)在体内归巢至CT26结肠癌肿瘤部位的数据。左上角提供了简明的实验方案。左下图(荧光素酶信号(肿瘤特异性的))显示了在MSC注射之前在体内表达荧光素酶报告体的CT26肿瘤细胞的可视化。将荧光标记的MSC腹膜内注射到携带CT26肿瘤的小鼠(Tumor+)中，并且MSC的位置通过DiR信号分析可视化。MSC在携带CT26肿瘤的小鼠(Tumor+)中的定位在MSC注射后一天和三天显示(DiR信号(MSC-特异性的)，Tumor+)。在对照(单独的MSC、单独的肿瘤和阴性对照)上进行的DiR信号分析的结果如所示的显示。

[0032] 图20A显示工程化的人MSC不归巢至小鼠CT26肿瘤。图20B显示了每种治疗中单个小鼠的肿瘤重量。通过每隔一天从卡尺测量获得的肿瘤体积确定功效。

[0033] 图21A-21B显示了腹膜内空间中CT26-LUC(荧光素酶)肿瘤生长的动力学。在第0天注射CT26细胞系，并在第7天、第10天、第14天和第18天收获三(3)只小鼠以确定肿瘤生长的动力学。图21A的第一行用IVIS成像仪测量小鼠的体重和ROI以监测肿瘤负荷。第二行监测每组中单个小鼠的肿瘤重量和肿瘤的ROI。第三行将肿瘤重量与全身ROI或肿瘤ROI相关联。图21B显示了在第18天组中三(3)只小鼠的免疫谱以更好地表征肿瘤微环境。

[0034] 图22A包括表明在结肠直肠癌的皮下小鼠模型中表达IL-12和CCL21a的工程化MSC抑制肿瘤生长的数据；但是，表达CCL21a和IL-36γ或IL-7的MSC的组合不减少肿瘤生长。每种效应子由不同的MSC表达，并且将MSC组合(以1：1的比率)用于组合治疗。每个图显示了表达所示免疫疗法的工程化MSC单独或组合对小鼠中CT26结肠肿瘤生长的影响(n＝6-8)。图22A的每条线表示单个小鼠。图22B显示每个治疗组中单个小鼠的肿瘤重量。

[0035] 图23A-23B包括来自图22A-22B所表示的实验的肿瘤免疫浸润统计。三只小鼠选自PBS、原始MSC和MSC-IL12+MSC-CCL21a(combo)组以对免疫谱肿瘤微环境进行流式细胞术分析。图23A显示了与未给药原始MSC的组相比，combo组中浸润CD3和CD8细胞毒性T群体的显著增加。图23B显示了与用原始MSC处理的组相比，combo组中的粒细胞性骨髓源抑制细胞(gMDSCs)和巨噬细胞群体的显著减少。

[0036] 图24A-24B包括与免疫百分比和肿瘤重量有关的数据，与由图22A-22B表示的实验有关。图24A和图24B显示具有更多CD3+和CD8+T细胞的样品(左上和中图)与肿瘤重量的降低强烈相关。这些图还显示具有较少CD11b髓样细胞(包括巨噬细胞、树突细胞和MDSC)的样品显示出较低的肿瘤负荷(图24A的中下图和右图以及图24B的上行)。

[0037] 图25A-25B包括来自腹膜内和皮下结肠直肠癌小鼠模型中的MSC-IL-12+CCL21a疗法的数据。测试了三个不同批次的慢病毒转导系的MSC-IL12和CCL21a(TLOO8-3/4、TL019-01/02和TL022-01/02；每个TL号代表一个批次)。图25A显示了全部三个批次的MSC-IL12+MSC-CCL21a可以在皮下和腹膜内模型中减少肿瘤负荷(前5个图来自SC模型，和后3个图来自IP模型)。在第11天收集来自所有小鼠的肿瘤。图25B显示了各组的平均肿瘤重量。

[0038] 图26A包括表明工程化组合治疗MSC-IL-12+MSC-CCL21a或MSC-CCL21a+MSC-IFN-β抑制皮下结肠直肠癌小鼠模型中的肿瘤生长的数据；然而，表达CCL21a和s41BBL的MSC的组合不减少肿瘤的生长。每种效应子由不同的MSC表达，并且将MSC组合(以1：1的比率)用于组合治疗。每张图显示了表达所示免疫疗法的工程化MSC单独或组合对小鼠中CT26肿瘤生长的影响(n＝6-8)。图26A的每条线表示单个小鼠。图26B显示了每种治疗中单个小鼠的肿瘤重量。与注射原始MSC的小鼠相比，MSC-IL12+MSC-CCL21a显示出最佳功效。在用MSC-IFNb+MSC-CCL21a治疗的组中也观察到治疗功效。

[0039] 图27A-27B提供了来自图26A-26B表示的实验的附加数据。图27A-27B是显示用指示的工程化MSC处理的每个组的免疫谱的图。在用MSC-IL12+MSC-CCL21a处理后观察到巨噬细胞群体的一致减少(图27A)。当针对原始MSC与用MSC-IL12+MSC-CCL21a处理的组相比时，还观察到了CD3+群体的浸润增加和CD11b+群体的浸润减少的总体趋势(图27A和图27B)。

[0040] 图28A-28B还提供了来自图26A-26B表示的实验的附加数据。图28A-28B显示了免疫浸润与肿瘤重量的相关性。具有低巨噬细胞和树突细胞的样品具有较低的肿瘤负荷(图28B，中上和右上图)。

[0041] 图29显示了组合来自以上(图22A和图26A)结肠直肠癌模型的体内数据的图。来自图22A和图26A的组合CT26数据捕获了三个组：仅肿瘤(PBS)、原始MSC处理的及MSC-IL12+MSC-CCL21a处理的。

[0042] 图30A-30C也显示了来自图22A和图26A的组合数据。这些图显示了来自流式细胞术实验数据的平均免疫浸润数。从图30A在CD8+T中观察到统计学显著性，证明了MSC-IL12+MSC-CCL21a再极化肿瘤微环境并允许更多的细胞毒性T细胞浸润的能力。此外，在通过MSC-IL12+MSC-CCL21a治疗的组中存在CD11b+骨髓群体浸润的减少(图30B)。收集的数据表明，树突细胞和巨噬细胞群体具有统计学显著性。

[0043] 间充质干细胞(MSC)(也称为间充质基质细胞)是源自中胚层的非造血成体干细胞的亚群。它们具有自我更新能力和多向分化性(不仅分化为中胚层谱系，如软骨细胞、骨细胞和脂肪细胞，而且分化为外胚层细胞和内胚层细胞)。由于没有伦理问题和畸胎瘤形成，MSC是用于治疗免疫疾病和非免疫疾病的细胞疗法的主要干细胞类型。它们可以很容易地从骨髓、脂肪组织、脐带、胎儿肝脏、肌肉和肺中分离，并且可以在体外成功地扩增。此外，当MSC外源性和系统地递送于人和动物时，它们倾向于归巢至(直接迁移到)具有炎症的受损组织部位，包括肿瘤微环境和转移区域。炎症定向的MSC归巢涉及几种重要的细胞运输相关分子，包括趋化因子、粘附分子和基质金属蛋白酶(MMP)。

[0044] 本文提供了对免疫细胞如MSC工程化以产生调节不同的肿瘤介导免疫抑制机制的效应分子的方法。这些MSC在本文中称为“工程化MSC”。这些MSC(其通常包含工程化的核酸)在自然界中不存在。在一些实施方案中，MSC被工程化以包括含有与编码效应分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子的核酸，例如，刺激免疫反应的效应分子。

[0045] “效应分子”是指与另一分子结合并调节与其结合的该分子的生物学活性的分子(例如，诸如DNA或RNA的核酸，或者蛋白质(多肽)或肽)。例如，效应分子可以充当配体以增加或降低酶活性、基因表达或细胞信号传导。因此，在一些实施方案中，效应分子调节(激活或抑制)不同的免疫调节机制。通过与分子直接结合和调节分子，效应分子也可以间接地调节第二个、下游分子。在一些实施方案中，效应分子是分泌的分子，而在其它的实施方案中，效应分子结合于细胞表面或保持为细胞内的。例如，效应分子包括细胞内转录因子、微RNA和shRNA，其改变内部细胞状态以例如增强免疫调节活性、归巢特性或细胞的持久性。效应分子的非限制性实例包括细胞因子、趋化因子、调节代谢物水平的酶、调节细胞因子的抗体或诱饵分子、归巢分子和/或整联蛋白。

[0046] 术语“调节”包括维持生物活性、抑制(部分或完全)生物活性以及刺激/激活(部分或完全)生物活性。该术语还包括降低或增加(例如，增强)生物活性。当一种效应分子调节的肿瘤介导的免疫抑制机制(例如，刺激T细胞信号传导)与由另一种效应分子调节的肿瘤介导的免疫抑制机制(例如，刺激抗原呈递和/或加工)不同时，认为两种不同的效应分子“调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制”。

[0047] 效应分子的调节可以是直接的或间接的。当效应分子与另一分子结合并调节该分子的活性时，发生直接调节。当效应分子与另一分子结合，调节该分子的活性，并且作为该调节的结果而调节又一分子(效应分子未与其结合)的活性时，发生间接调节。

[0048] 在一些实施方案中，至少一种效应分子对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节导致免疫刺激性和/或抗肿瘤免疫反应(例如全身的或在肿瘤微环境中)增加至少10％(例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或200％)。例如，肿瘤介导的免疫抑制机制的调节可导致免疫刺激性和/或抗肿瘤免疫反应增加至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。在一些实施方案中，肿瘤介导的免疫抑制机制的调节导致免疫刺激性和/或抗肿瘤免疫反应增加10-20％、10-30％、
10-40％、10-50％、10-60％、10-70％、10-80％、10-90％、10-100％、10-200％、20-30％、20-
40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-100％、20-200％、50-60％、50-
70％、50-80％、50-90％、50-100％或50-200％。应当理解，免疫刺激性和/或抗肿瘤免疫反应的“增加”，例如，全身地或在肿瘤微环境中，是相对于在没有效应分子的情况下另外发生的免疫刺激性和/或抗肿瘤免疫反应。

[0049] 在一些实施方案中，至少一种效应分子对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节导致免疫刺激性和/或抗肿瘤免疫反应(例如全身地或在肿瘤微环境中)增加至少2倍(例如2、3、4、5、10、25、20、25、50或100倍)。例如，肿瘤介导的免疫抑制机制的调节可导致免疫刺激性和/或抗肿瘤免疫反应增加至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在一些实施方案中，肿瘤介导的免疫抑制机制的调节导致免疫刺激性和/或抗肿瘤免疫反应增加2-10、2-20、2-30、2-40、2-50、2-60、2-70、2-80、2-90或2-100倍。

[0050] 免疫刺激性和/或抗肿瘤免疫机制的非限制性实例包括T细胞信号传导、活性和/或募集，抗原呈递和/或加工，自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号传导、活性和/或募集，树突细胞分化和/或成熟，免疫细胞募集，促炎性巨噬细胞信号传导、活性和/或募集，基质降解，免疫刺激性代谢产物产生，干扰素基因刺激因子(STING)信号传导(其增加IFN的分泌和Th1极化，从而促进抗-肿瘤免疫反应)和/或I型干扰素信号传导。效应分子可以刺激至少一种(一种或多种)前述的免疫刺激机制，因此导致免疫刺激性反应的增加。可以例如使用针对T细胞增殖或细胞毒性的体外测定、体外抗原呈递测定、表达测定(例如，特定标志物的表达测定)和/或(例如，细胞因子的)细胞分泌测定来评估前述免疫刺激性和/或抗肿瘤免疫机制的变化。

[0051] 在一些实施方案中，至少一种效应分子对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节导致免疫抑制反应(例如全身地或在肿瘤微环境中)降低至少10％(例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或200％)。例如，肿瘤介导的免疫抑制机制的调节可能导致免疫抑制反应降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。在一些实施方案中，肿瘤介导的免疫抑制机制的调节导致免疫抑制反应降低10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、10-60％、10-70％、10-80％、10-
90％、10-100％、10-200％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-
90％、20-100％、20-200％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-100％或50-200％。应当理解，免疫抑制反应(例如，全身地或肿瘤微环境中)的“降低”是相对于在没有效应分子的情况下另外发生的免疫抑制反应。

[0052] 在一些实施方案中，至少一种效应分子对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节导致免疫抑制反应(例如，全身地或在肿瘤微环境中)降低至少2倍(例如2、3、4、5、10、25、20、25、50或100倍)。例如，调节肿瘤介导的免疫抑制机制可导致免疫抑制反应降低至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在一些实施方案中，肿瘤介导的免疫抑制机制的调节导致免疫抑制反应降低2-10、2-20、2-30、2-40、2-50、2-60、2-70、2-80、2-90或2-100倍。

[0053] 免疫抑制机制的非限制性实例包括负性共刺激信号传导，细胞毒性细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)的促凋亡信号传导，T调节(Treg)细胞信号传导，肿瘤检查点分子的产生/维持，骨髓源抑制细胞信号传导、活性和/或募集，免疫抑制因子/代谢产物的产生和/或血管内皮生长因子信号传导。效应分子可以抑制至少一种(一种或多种)前述免疫抑制机制，从而导致免疫抑制反应的降低。前述免疫抑制机制的变化可以例如通过测定T细胞增殖的增加和/或IFNγ产生(负性共刺激信号传导、Treg细胞信号传导和/或MDSC)的增加；膜联蛋白V/PI流动染色(促凋亡信号传导)；用于表达的流动染色，例如PDL1表达(肿瘤检查点分子的产生/维持)；ELISA、 通过qPCR的RNA、酶测定，例如IDO色氨酸分解代谢(免疫抑制因子/代谢产物的产生)；和PI3K、Akt、p38的磷酸化(VEGF信号传导)来评估。

[0054] 在一些实施方案中，MSC经工程化以表达膜结合的抗CD3和/或抗CD28激动剂细胞外结构域。

[0055] 在一些实施方案中，MSC经工程化以产生至少两种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种)效应分子，其每一种调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在其它的实施方案中，MSC经工程化以产生至少一种不是由MSC天然产生的效应分子。这种效应分子可以例如，补充由MSC天然产生的效应分子的功能。

[0056] 在一些实施方案中，效应分子加性地起作用：例如，两种效应分子的作用可以等于该两种效应分子单独起作用的效果的总和。在其它的实施方案中，效应分子协同地起作用：例如，两种效应分子的作用可以大于该两种效应分子的组合功能。本公开还包括效应分子与产生它们的免疫细胞(例如，MSC)之间的加和和协同作用。

[0057] 调节肿瘤介导的免疫抑制机制的效应分子可以是，例如，分泌的因子(例如，调节免疫系统中涉及的细胞外机制的细胞因子、趋化因子、抗体和/或诱饵受体)、控制细胞状态的细胞内因子(例如，微RNA和/或转录因子，其调节细胞状态以增强促炎性性质)、包装到外来体中的因子(例如，微RNA、细胞溶质因子和/或细胞外因子)、表面展示因子(例如，检查点抑制剂、TRAIL)和/或代谢基因(例如，产生/调节或降解代谢物或氨基酸的酶)。

[0058] 在一些实施方案中，效应分子可以选自以下非限制性分子类别：细胞因子、抗体、趋化因子、核苷酸、肽和酶。前述效应分子类别的非限制性实例列于：

[0059] 表1.示例性效应分子

[0060]

[0061]

[0062]

[0063] 在一些实施方案中，MSC包含工程化的核酸，其包含与编码效应分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，工程化核酸包含与编码至少2种效应分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子。例如，工程化核酸可包含与编码至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少8种、至少9种或至少10种效应分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，工程化核酸包含与编码1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种效应分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子。

[0064] 在一些实施方案中，在一些实施方案中，MSC被工程化以包含至少两个工程化的核酸，每一个工程化核酸包含与编码至少一种(例如，1、2或3种)效应分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子。例如，可以将MSC工程化为包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少8个、至少9个或至少10个工程化的核酸，其每一个包含与编码至少一种(例如，1、2或3种)效应分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，MSC被工程化以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个工程化的核酸，其每一个包含与编码至少一种(例如，1、2或3种)效应分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子。

[0065] “工程化核酸”是非天然存在的核酸。然而，应该理解，虽然工程化的核酸作为整体不是天然存在的，但它可以包含天然存在的核苷酸序列。在一些实施方案中，工程化的核酸包含来自不同生物体(例如，来自不同物种)的核苷酸序列。例如，在一些实施方案中，工程化的核酸包含鼠核苷酸序列、细菌核苷酸序列、人类核苷酸序列和/或病毒核苷酸序列。术语“工程化核酸”包括重组核酸和合成核酸。“重组核酸”是指通过接合核酸分子而构建的，并且在一些实施方案中，可以在活细胞中复制的分子。“合成核酸”是指扩增的或者通过化学方式或通过其它方式合成的分子。合成核酸包含化学修饰的或以其它方式修饰的，但可以与天然存在的核酸分子碱基配对的那些核酸。重组核酸和合成核酸还包括由前述任一种的复制产生的那些分子。本公开的工程化核酸可以由单一分子(例如，包含在相同的质粒或其它载体中)或由多个不同分子(例如，多个不同的独立复制分子)编码。

[0066] 可以使用标准分子生物学方法来产生本公开的工程化核酸(参见，例如，Green和Sambrook，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2012，Cold Spring Harbor Press)。在一些实施方案中，使用GIBSON 克隆产生工程化核酸构建体(参见，例如，Gibson，D.G.等，Nature Methods，343-345，2009；和Gibson，D.G.等，Nature Methods，901-903，2010，其中每一个都通过引用并入本文)。GIBSON 通常
在单管反应中使用三种酶活性：5'核酸外切酶、DNA聚合酶的′Y延伸活性和DNA连接酶活性。
5'核酸外切酶活性消化(chew back)5'末端序列，并暴露用于退火的互补序列。然后聚合酶活性填充退火区域上的空隙。然后，DNA连接酶将切口密封，并将DNA片段共价连接在一起。
邻接片段的重叠序列比Golden Gate Assembly中使用的那些片段长得多，因此导致更高的正确组装的百分比。在一些实施方案中，使用 克隆(Clontech)产生工程
化的核酸构建体。

[0067] “启动子”是指核酸序列的控制区域，在此处核酸序列的其余部分的转录起始和速率被控制。启动子还可以含有调节蛋白和分子(例如RNA聚合酶和其它转录因子)可以在其处结合的子区域。启动子可以是组成型的、诱导型的、可阻抑的、组织特异性的或其任何组合。启动子驱动其调节的核酸序列的表达或驱动其转录。本文中，当启动子相对于其调节的核酸序列处于正确的功能位置和定向中以控制(“驱动”)该序列的转录起始和/或表达时，认为该启动子是“可操作地连接的”。

[0068] 启动子可以是与基因或序列天然相关的启动子，如可以通过分离位于给定基因或序列的编码区段上游的5'非编码序列而获得的。这种启动子可以称为“内源的”。在一些实施方案中，编码核酸序列可以位于重组或异源启动子的控制下，其是指在其自然环境中通常不与编码序列相关的启动子。这些启动子可包括其它基因的启动子；从任何其它细胞分离的启动子；和非“天然存在的”合成启动子或增强子，例如含有不同转录调节区域的不同元件和/或通过本领域已知的基因工程方法改变表达的突变的那些。除了合成地产生启动子和增强子的核酸序列之外，序列可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术来产生，包括聚合酶链式反应(PCR)(参见，例如，美国专利号4,683,202和美国专利号5,928,906)。

[0069] 工程化核酸的启动子可以是“诱导型启动子”，其是指特征在于在信号存在、受信号影响或与信号接触时调节(例如，启动或激活)转录活性的启动子。信号可以是内源的或者通常是外部的条件(例如，光)、化合物(例如，化学或非化学化合物)或蛋白质(例如，细胞因子)，其以具有调节诱导型启动子的转录活性方面的活性的方式与诱导型启动子接触。转录的激活可以涉及直接作用于启动子以驱动转录或通过使阻止启动子驱动转录的阻遏物失活而间接作用于启动子。相反，转录的失活可能涉及直接作用于启动子以阻止转录或通过激活随后作用于启动子的阻遏物而间接作用于启动子。

[0070] 如果在局部肿瘤状态(例如，炎症或缺氧)或信号存在下，启动子的转录被激活、失活、增加或减少，则该启动子对该状态或信号是“响应性”的或“受其调节”的。在一些实施方案中，启动子包含反应元件。“反应元件”是启动子区域内结合调控(调节)该启动子的基因表达的特定分子(例如，转录因子)的短DNA序列。可根据本公开使用的反应元件包括但不限于根皮素调节的控制元件(PEACE)、锌指DNA结合结构域(DBD)、干扰素-γ-激活序列(GAS)(Decker,T.等，J Interferon Cytokine Res.1997Mar；17(3):121-34，通过引用并入本文)、干扰素-刺激的反应元件(ISRE)(Han,K.J.等，J Biol Chem.2004Apr 9；279(15):15652-61，通过引用并入本文)、NF-kappaB反应元件(Wang，V.等，Cell Reports.2012；2(4):824-839，通过引用并入本文)和STAT3反应元件(Zhang，D.等，J of Biol Chem.1996；
271:9503-9509，通过引用并入本文)。其它反应元件包括在本文中。

[0071] 表2中列出了响应性启动子(例如，TGF-β响应性启动子)的非限制性实例，其显示了启动子和转录因子的设计，以及显示了诱导剂分子对转录因子(TF)和转基因转录(T)的作用(B，结合；D，解离；nd，未确定)(A，激活；DA，失活；DR，脱抑制)(参见Horner，M.&Weber，W.FEBS Letters 586(2012)20784-2096m，以及其中引用的参考文献)。

[0072] 表2.响应性启动子的实例

[0073]

[0074]

[0075] 启动子的其它非限制性实例包括巨细胞病毒(CMV)启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、延伸因子(EFS)启动子、MND启动子(包含骨髓增生性肉瘤病毒增强子修饰的MoMuLV LTR的U3区域的合成启动子)、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、脾病灶形成病毒(SFFV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子和泛素C(UbC)启动子(参见表3)。

[0076] 表3.示例性启动子

[0077]

[0078]

[0079]

[0080]

[0081] 在一些实施方案中，本公开的启动子通过肿瘤微环境内的信号来调节。如果在肿瘤微环境的存在下，启动子的活性相对于不存在肿瘤微环境时启动子的活性增加或降低至少10％，则认为肿瘤微环境调节该启动子。在一些实施方案中，启动子的活性相对于不存在肿瘤微环境时启动子的活性增加或降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。例如，启动子的活性相对于不存在肿瘤微环境时启动子的活性增加或降低10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、10-60％、10-70％、
10-80％、10-90％、10-100％、10-200％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-
80％、20-90％、20-100％、20-200％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-100％或50-
200％。

[0082] 在一些实施方案中，启动子的活性相对于不存在肿瘤微环境时启动子的活性增加或降低至少2倍(例如，2、3、4、5、10、25、20、25、50或100倍)。例如，启动子的活性相对于不存在肿瘤微环境时启动子的活性增加或降低至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在一些实施方案中，启动子的活性相对于不存在肿瘤微环境时启动子的活性增加或降低2-10、2-20、2-30、2-40、2-50、2-60、2-70、2-80、2-90或2-100倍。

[0083] 在一些实施方案中，本公开的启动子在低氧条件下被激活。“低氧条件”是其中身体或身体区域在组织水平被剥夺充分的氧供应的状态。低氧条件可引起炎症(例如，炎性细胞因子的水平在低氧条件下增加)。在一些实施方案中，在低氧条件下活化的启动子与编码降低炎性细胞因子的表达或活性的效应分子的核苷酸可操作地连接，从而减少由低氧条件引起的炎症。在一些实施方案中，在低氧条件下活化的启动子包含缺氧反应元件(HRE)。“缺氧反应元件(HRE)”是对低氧诱导因子(HIF)有反应的反应元件。在一些实施方案中，HRE包含共有基序NCGTG(其中N是A或G)。

[0084] 在一些实施方案中，工程化MSC产生多种效应分子。例如，MSC可以工程化以产生2-20种不同的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生2-20、2-19、2-18、2-17、2-
16、2-15、2-14、2-13、2-12、2-11、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-20、3-19、3-18、
3-17、3-16、3-15、3-14、3-13、3-12、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-20、4-19、4-
18、4-17、4-16、4-15、4-14、4-13、4-12、4-11、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-20、5-19、5-
18、5-17、5-16、5-15、5-14、5-13、5-12、5-11、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-20、6-19、6-18、6-
17、6-16、6-15、6-14、6-13、6-12、6-11、6-10、6-9、6-8、6-7、7-20、7-19、7-18、7-17、7-16、7-
15、7-14、7-13、7-12、7-11、7-10、7-9、7-8、8-20、8-19、8-18、8-17、8-16、8-15、8-14、8-13、
8-12、8-11、8-10、8-9、9-20、9-19、9-18、9-17、9-16、9-15、9-14、9-13、9-12、9-11、9-10、10-
20、10-19、10-18、10-17、10-16、10-15、10-14、10-13、10-12、10-11、11-20、11-19、11-18、
11-17、11-16、11-15、11-14、11-13、11-12、12-20、12-19、12-18、12-17、12-16、12-15、12-
14、12-13、13-20、13-19、13-18、13-17、13-16、13-15、13-14、14-20、14-19、14-18、14-17、
14-16、14-15、15-20、15-19、15-18、15-17、15-16、16-20、16-19、16-18、16-17、17-20、17-
19、17-18、18-20、18-19或19-20种效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种效应分子。

[0085] 本公开的工程化MSC通常产生多种效应分子，其中至少两种调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在一些实施方案中，至少一种效应分子在肿瘤微环境中刺激炎症途径，并且至少一种效应分子在肿瘤微环境中抑制炎症的负性调节剂。

[0086] “肿瘤微环境”是其中存在肿瘤的细胞环境，包括周围血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓源炎性细胞、淋巴细胞、信号传导分子和细胞外基质(ECM)(参见，例如，Pattabiraman,D.R.&Weinberg,R.A.Nature Reviews Drug Discovery 13,497–512
(2014)；Balkwill,F.R.等J Cell Sci 125,5591-5596,2012；和Li,H.等J Cell Biochem 
101(4),805-15,2007)。

[0087] 在一些实施方案中，MSC被工程化以产生至少一种归巢分子。“归巢”是指细胞主动导航(迁移)到靶位点(例如，细胞、组织(例如肿瘤)或器官)。“归巢分子”是指将MSC指引向靶位点的分子。在一些实施方案中，归巢分子起到识别和/或启动MSC与靶位点的相互作用的功能。归巢分子的非限制性实例包括CXCR1 CCR9、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CCR2、CCR4、FPR2、VEGFR、IL6R、CXCR1、CSCR7和PDGFR。

[0088] 在一些实施方案中，归巢分子是趋化因子受体(结合趋化因子的细胞表面分子)。趋化因子是由细胞分泌的小细胞因子或信号传导蛋白，其可诱导细胞中的定向趋化性。趋化因子可分为四个主要亚家族：CXC、CC、CX3C和XC，它们都通过选择性结合位于靶细胞表面上的趋化因子受体发挥生物学作用。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生CXCR4，一种允许MSC沿趋化因子梯度朝向表达基质细胞衍生因子1(也称为SDF1、C-X-C基序趋化因子12和CXCL12)的细胞、组织或肿瘤归巢的趋化因子受体。可以由本公开的工程化MSC产生的趋化因子受体的非限制性实例包括：CXC趋化因子受体(例如，CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6和CXCR7)、CC趋化因子受体(CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10和CCR11)、CX3C趋化因子受体(例如，CX3CR1，其结合CX3CL1)和XC趋化因子受体(例如，XCR1)。在一些实施方案中，趋化因子受体是G蛋白连接的跨膜受体或肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员(包括但不限于TNFRSF1A、TNFRSF1B)。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生CXCL8，CXCL9和/或CXCL10(促进T细胞募集)、CCL3和/或CXCL5、CCL21(Th1募集和极化)。

[0089] 在一些实施方案中，MSC被工程化以产生G蛋白偶联受体(GPCR)，其检测含N-甲酰化的寡肽(包括但不限于FPR2和FPRL1)。

[0090] 在一些实施方案中，MSC被工程化以产生检测白介素的受体(包括但不限于IL6R)。

[0091] 在一些实施方案中，MSC被工程化以产生检测从其他细胞、组织或肿瘤分泌的生长因子的受体(包括但不限于FGFR、PDGFR、EGFR和VEGF家族的受体，包括但不限于VEGF-C和VEGF-D)。

[0092] 在一些实施方案中，归巢分子是整联蛋白。整联蛋白是跨膜受体，其促进细胞-细胞外基质(ECM)粘附。整联蛋白是具有两个亚基的专性异二聚体：α(阿尔法)和β(贝塔)。整联蛋白的α亚基可以是，但不限于：ITGA1、ITGA2、ITGA3、ITGA4、ITGA5、ITGA6、IGTA7、ITGA8、ITGA9、IGTA10、IGTA11、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAV、ITGA2B、ITGAX。整联蛋白的β亚基可以是，但不限于：ITGB1、ITGB2、ITGB3、ITGB4、ITGB5、ITGB6、ITGB7和ITGB8。本公开的MSC可以被工程化以产生整联蛋白α和β亚基的任何组合。

[0093] 在一些实施方案中，归巢分子是基质金属蛋白酶(MMP)。MMP是切割内皮细胞壁下面的基底膜的组分的酶。MMPs的非限制性实例包括MMP-2、MMP-9和MMP。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生抑制MMP的分子(例如蛋白质)的抑制剂。例如，MSC可以工程化以表达膜型1MNM(MT1-MMP)或TIMP金属肽酶抑制剂1(TIMP-1)的抑制剂(例如，RNAi分子)。

[0094] 在一些实施方案中，例如，归巢分子是结合于靶组织的内皮上的选择蛋白的配体(例如，造血细胞E-/L-选择蛋白配体(HCELL)，Dykstra等，Stem Cells.2016Oct；34(10):2501-2511)。

[0095] 术语“归巢分子”还包括调节改善/增强MSC的归巢的分子的产生的转录因子。

[0096] 在一些实施方案中，MSC归巢通过局部照射受试者中的肿瘤/癌细胞来增加。放射组织损伤有助于MSC归巢，以及对于该受损组织的内源性T细胞归巢。

[0097] 工程化细胞的实例

[0098] 如本文提供的细胞(例如，MSC)被工程化以产生多种效应分子，其中至少两种调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在一些实施方案中，至少一种(例如1、2、3、4、5种或更多种)效应分子在肿瘤微环境中刺激至少一种免疫刺激机制，或在肿瘤微环境中抑制至少一种免疫抑制机制。在一些实施方案中，至少一种(例如1、2、3、4、5种或更多种)效应分子在肿瘤微环境中抑制至少一种免疫抑制机制，并且至少一种效应分子(例如1、2、3、4、5种或更多种)在肿瘤微环境中抑制至少一种免疫抑制机制。在再其他的实施方案中，至少两种(例如2、3、4、5种或更多种)效应分子在肿瘤微环境中刺激至少一种免疫刺激机制。在再其他的实施方案中，至少两种(例如1、2、3、4、5种或更多种)效应分子在肿瘤微环境中抑制至少一种免疫抑制机制。

[0099] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生至少一种刺激T细胞信号传导、活性和/或募集的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生至少一种刺激抗原呈递和/或加工的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生至少一种刺激自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号传导、活性和/或募集的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生至少一种刺激树突细胞分化和/或成熟的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化以产生至少一种刺激免疫细胞募集的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生至少一种刺激M1巨噬细胞信号传导、活性和/或募集的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化以产生至少一种刺激Th1极化的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化以产生至少一种刺激基质降解的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化以产生至少一种刺激免疫刺激性代谢产物产生的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化以产生至少一种刺激I型干扰素信号传导的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化以产生至少一种抑制负性共刺激信号传导的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生至少一种抑制抗肿瘤免疫细胞的促凋亡信号传导(例如，通过TRAIL)的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生至少一种抑制T调节(Treg)细胞信号传导、活性和/或募集的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化以产生至少一种抑制肿瘤检查点分子的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化以产生至少一种激活干扰素基因刺激因子(STING)信号传导的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生至少一种抑制骨髓源抑制细胞信号传导、活性和/或募集的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化以产生至少一种降解免疫抑制因子/代谢产物的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化以产生至少一种抑制血管内皮生长因子信号传导的抑制分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化以产生至少一种直接杀死肿瘤细胞的效应分子(例如，颗粒酶、穿孔素、溶瘤病毒、细胞溶解肽和酶、抗肿瘤抗体，例如，其引发ADCC)。

[0100] 在一些实施方案中，至少一种效应分子：刺激T细胞信号传导、活性和/或募集，刺激抗原呈递和/或加工，刺激自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号传导、活性和/或募集，刺激树突细胞分化和/或成熟，刺激免疫细胞募集，刺激巨噬细胞信号传导，刺激基质降解，刺激免疫刺激性代谢产物产生或刺激I型干扰素信号传导；和至少一种效应分子抑制负性共刺激信号传导，抑制抗肿瘤免疫细胞的促凋亡信号传导，抑制T调节(Treg)细胞信号传导、活性和/或募集，抑制肿瘤检查点分子，激活干扰素基因刺激因子(STING)信号传导，抑制骨髓源抑制细胞信号传导、活性和/或募集，降解免疫抑制因子/代谢产物，抑制血管内皮生长因子信号传导或直接杀死肿瘤细胞。

[0101] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生选自IL-12、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、OX40-配体和CD40L的至少一种效应分子；和/或选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗IL-35抗体的至少一种效应分子；和/或选自MIP1α(CCL3)、MIP1β(CCL5)和CCL21的至少一种效应分子；和/或选自CpG寡脱氧核苷酸的至少一种效应分子；和/或选自微生物肽的至少一种效应分子。

[0102] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β及至少一种选自的细胞因子、抗体、趋化因子、核苷酸、肽、酶和干扰素基因刺激因子(STING)的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和至少一种细胞因子或受体/配体(例如，IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、OX40-配体和/或CD40L)。

[0103] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和至少一种细胞因子或受体/配体(例如，IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、OX40-配体和/或CD40L)。

[0104] 在一些实施方案中，细胞因子作为与自身结合于细胞因子的抗体、抗体片段或受体结合的工程化融合蛋白形式产生以诱导细胞特异性靶向结合，例如IL-2与至抗体片段融合，从而阻止其与Treg细胞结合并优先与CD8和NK细胞结合。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和至少一种抗体(例如，抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗VEGF、抗TGF-β、抗IL-10、抗TNF-α和/或抗IL-35抗体)。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和至少一种趋化因子(MIP1α(CCL3)、MIP1β(CCL5)和/或CCL21)。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和至少一种核苷酸(例如，CpG寡脱氧核苷酸)。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和至少一种肽(例如，抗肿瘤肽)。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和至少一种酶。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和至少一种STING激活剂。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和至少一种具有直接抗肿瘤活性的效应子(例如，溶瘤病毒)。

[0105] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-α和MIP1-α。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-α和MIP1-β。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-α和CXCL9。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-α和CXCL10。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-α和CXCL11。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-α和CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。

[0106] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和MIP1-α。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和MIP1-β。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和CXCL9。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和CXCL10。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和CXCL11。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。

[0107] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-12和MIP1-α。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-12和MIP1-β。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-12和CXCL9。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-12和CXCL10。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-12和CXCL11。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-12和CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。

[0108] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)和MIP1-α。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生TRAIL和MIP1-β。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生TRAIL和CXCL9。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生TRAIL和CXCL10。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生TRAIL和CXCL11。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生TRAIL和CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。

[0109] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生干扰素基因刺激因子(STING)和MIP1-α。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生STING和MIP1-β。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生STING和CXCL9。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生STING和CXCL10。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生STING和CXCL11。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生STING和CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。

[0110] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CD40L和MIP1-α。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CD40L和MIP1-β。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CD40L和CXCL9。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CD40L和CXCL10。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CD40L和CXCL11。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CD40L和CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18和/或41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。

[0111] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生胞嘧啶脱氨酶和MIP1-α。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生胞嘧啶脱氨酶和MIP1-β。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生胞嘧啶脱氨酶和CXCL9。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生胞嘧啶脱氨酶和CXCL10。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生胞嘧啶脱氨酶和CXCL11。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生胞嘧啶脱氨酶和CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。

[0112] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-α和IL-12。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-α和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-α和IL-2。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-α和IL-7。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-α和IL-15。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-α和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-α和IL-18。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-α和CD40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-α和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。

[0113] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和IL-12。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和IL-2。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和IL-7。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和IL-15。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和IL-18。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和CD40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。

[0114] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)和IL-12。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生TRAIL和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生TRAIL和IL-2。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生TRAIL和IL-7。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生TRAIL和IL-15。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生TRAIL和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生TRAIL和IL-18。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生TRAIL和CD40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生TRAIL和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。

[0115] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生干扰素基因刺激因子(STING)和IL-12。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生STING和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生STING和IL-2。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生STING和IL-7。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生STING和IL-15。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生STING和IL-36γ。
在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生STING和IL-18。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生STING和CD40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生STING和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。

[0116] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CD40L和IL-12。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CD40L和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CD40L和IL-2。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CD40L和IL-7。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CD40L和IL-15。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CD40L和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CD40L和IL-18。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CD40L和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。

[0117] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生胞嘧啶脱氨酶和IL-12。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生胞嘧啶脱氨酶和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生胞嘧啶脱氨酶和IL-2。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生胞嘧啶脱氨酶和IL-7。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生胞嘧啶脱氨酶和IL-15。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生胞嘧啶脱氨酶和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生胞嘧啶脱氨酶和IL-18。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生胞嘧啶脱氨酶和CD40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生胞嘧啶脱氨酶和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。

[0118] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生MIP1-α和IL-12。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生MIP1-α和MIP1-γ。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生MIP1-α和IL-2。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生MIP1-α和IL-7。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生MIP1-α和IL-15。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生MIP1-α和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生MIP1-α和IL-18。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生MIP1-α和CD40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生MIP1-α和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。

[0119] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生MIP1-β和IL-12。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生MIP1-β和MIP1-γ。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生MIP1-β和IL-2。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生MIP1-β和IL-7。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生MIP1-β和IL-15。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生MIP1-β和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生MIP1-β和IL-18。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生MIP1-β和CD40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生MIP1-β和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。

[0120] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL9和IL-12。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL9和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL9和IL-2。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL9和IL-7。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL9和IL-15。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL9和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL9和IL-18。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL9和CD40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL9和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。

[0121] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL10和IL-12。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL10和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL10和IL-2。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL10和IL-7。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL10和IL-15。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL10和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL10和IL-18。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL10和CD40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL10和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。

[0122] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL11和IL-12。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL11和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL11和IL-2。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL11和IL-7。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL11和IL-15。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL11和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL11和IL-18。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL11和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。

[0123] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CCL21和IL-12。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CCL21和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CCL21和IL-2。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CCL21和IL-7。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CCL21和IL-15。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CCL21和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CCL21和IL-18。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CCL21和CD40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CCL21和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。

[0124] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-α和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-α和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-α和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-α和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CXCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。

[0125] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-β和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CXCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。

[0126] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生TRAIL和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生TRAIL和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生TRAIL和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生TRAIL和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CXCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。

[0127] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生STING和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生STING和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生STING和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生STING和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CXCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。

[0128] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CD40L和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CD40L和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CD40L和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CD40L和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CXCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。

[0129] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生胞嘧啶脱氨酶和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生胞嘧啶脱氨酶和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生胞嘧啶脱氨酶和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生胞嘧啶脱氨酶和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CXCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。

[0130] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生MIP1-α和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生MIP1-α和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生MIP1-α和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生MIP1-α和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。

[0131] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生MIP1-β和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生MIP1-β和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生MIP1-β和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生MIP1-β和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。

[0132] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL9和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL9和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL9和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL9和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。

[0133] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL10和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL10和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL10和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL10和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。

[0134] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL11和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL11和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL11和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CXCL11和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。

[0135] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CCL21和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CCL21和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CCL21和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CCL21和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。

[0136] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-12和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-12和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-12和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-12和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。

[0137] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-γ和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-γ和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-γ和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IFN-γ和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。

[0138] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-2和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-2和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-2和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-2和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。

[0139] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-7和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-7和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-7和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-7和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。

[0140] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-15和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-15和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-15和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-15和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。

[0141] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-36-γ和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-36-γ和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-36-γ和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-36-γ和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。

[0142] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-18和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-18和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-18和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生IL-18和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。

[0143] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CD40L和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CD40L和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CD40L和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生CD40L和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。

[0144] 在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生41BB-L和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生41BB-L和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生41BB-L和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如，MSC)被工程化以产生41BB-L和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化以进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。

[0145] 细胞类型

[0146] 本公开主要涉及经工程化以产生多种效应分子的间充质干细胞(MSC)(例如，人MSC)。然而，应该理解，本公开不限于MSC，而是旨在涵盖其他细胞类型(例如，免疫系统的细胞类型)。例如，如本文提供的工程化细胞(经工程化以产生效应分子)可以选自自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、先天性淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞、T细胞(例如CD8+T细胞、CD4+T细胞、γ-δT细胞和T调节细胞(CD4+、FOXP3+、CD25+))和B细胞。因此，在任何实施方案中，本公开的MSC可以替代一种或多种前述细胞类型。

[0147] 在一些实施方案中，工程化间充质干细胞来自(例如，获自或源自)骨髓。在一些实施方案中，工程化间充质干细胞来自(例如，获自或源自)脂肪组织。在一些实施方案中，工程化间充质干细胞来自(例如，获自或源自)脐带。在一些实施方案中，工程化间充质干细胞来自多能干细胞(例如，胚胎干细胞或诱导多能干细胞)。

[0148] 因此，本公开提供经工程化以产生多种效应分子的T细胞(例如CD8+T细胞、CD4+T+ + +细胞、γ-δT细胞和T调节细胞(CD4、FOXP3、CD25))，其中至少两种调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在一些实施方案中，B细胞经工程化以产生多种效应分子，其中至少两种调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在一些实施方案中，NK细胞经工程化以产生多种效应分子，其中至少两种调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在一些实施方案中，NKT细胞经工程化以产生多种效应分子，其中至少两种调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在一些实施方案中，先天免疫细胞经工程化以产生多种效应分子，其中至少两种调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在一些实施方案中，肥大细胞经工程化以产生多种效应分子，其中至少两种调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在一些实施方案中，嗜酸性粒细胞经工程化以产生多种效应分子，其中至少两种调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在一些实施方案中，嗜碱性粒细胞经工程化以产生多种效应分子，其中至少两种调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在一些实施方案中，巨噬细胞经工程化以产生多种效应分子，其中至少两种调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在一些实施方案中，嗜中性粒细胞经工程化以产生多种效应分子，其中至少两种调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在一些实施方案中，树突细胞经工程化以产生多种效应分子，其中至少两种调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。

[0149] 在一些实施方案中，至少一种效应分子在肿瘤微环境中刺激免疫刺激机制和/或在肿瘤微环境中抑制免疫抑制机制。

[0150] 在一些实施方案中，至少一种效应分子(a)刺激T细胞信号传导、活性和/或募集，(b)刺激抗原呈递和/或加工，(c)刺激自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号传导、活性和/或募集，(d)刺激树突细胞分化和/或成熟，(e)刺激免疫细胞募集，(f)刺激促炎性巨噬细胞信号传导、活性和/或募集，或者抑制抗炎性巨噬细胞信号传导、活性和/或募集，(g)刺激基质降解，(h)刺激免疫刺激性代谢产物产生，(i)刺激I型干扰素信号传导，(j)抑制负性共刺激信号传导，(k)抑制抗肿瘤免疫细胞的促凋亡信号传导，(l)抑制T调节(Treg)细胞信号传导、活性和/或募集，(m)抑制肿瘤检查点分子，(n)刺激干扰素基因刺激因子(STING)信号传导，(o)抑制骨髓源抑制细胞信号传导、活性和/或募集，(p)降解免疫抑制因子/代谢产物，(q)抑制血管内皮生长因子信号传导和/或(r)直接杀死肿瘤细胞。

[0151] 免疫系统包括先天免疫系统和适应性系统，各自包含具有特定功能的不同类型的细胞。先天免疫系统包含保卫宿主免受其它生物体感染的细胞和机制。先天免疫系统(提供针对感染的即时防御)以非特异性方式识别病原体和对其作出响应，并且不向宿主提供持久的免疫力。先天免疫系统(例如，在诸如哺乳动物的脊椎动物中)的主要功能包括：通过产生化学因子将免疫细胞募集到感染部位，所述化学因子包括称为细胞因子和趋化因子的专用化学介质；激活补体级联以鉴别细菌、激活细胞和促进抗体复合物或死细胞的清除；通过专门的白细胞识别和去除器官、组织、血液和淋巴中存在的外来物质；通过称为抗原呈递的过程激活适应性免疫系统；和作为传染因子的物理和化学屏障发挥作用。

[0152] 先天免疫系统的组成部分包括物理屏障(皮肤、胃肠道、呼吸道)、防御机制(分泌物、粘液、胆汁)和一般免疫反应(炎症)。白细胞(也称为白血球)和吞噬细胞是在先天免疫系统和反应中起作用的主要细胞类型，其识别和消除可能引起感染的病原体。

[0153] 白细胞不与特定器官或组织紧密相关，并且与独立的单细胞生物体类似地发挥功能。白细胞能够自由移动并与细胞碎片、外来颗粒和入侵的微生物相互作用和将其捕获。与身体中的许多其它细胞不同，大多数先天免疫白细胞不能自行分裂或繁殖，而是存在于骨髓中的多能造血干细胞的产物。白细胞的类型包括但不限于：肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、先天淋巴细胞(ILC)和γ-δT细胞。

[0154] 肥大细胞是一种先天免疫细胞类型，其驻留于结缔组织和粘膜中。肥大细胞与伤口愈合和针对病原体的防御相关，但也常常与变应性和过敏性相关。在激活时，肥大细胞迅速释放出富含组胺和肝素的特征性颗粒，以及各种激素介质和趋化因子或趋化性细胞因子进入环境中。组胺扩张血管，从而引起炎症的特有体征，并募集中性粒细胞和巨噬细胞。

[0155] 嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞是与嗜中性粒细胞有关的细胞。当被病原体接触激活时，释放组胺的嗜碱性粒细胞在针对寄生虫的防御中是重要的，并在变态反应如哮喘中发挥作用。激活后，嗜酸性粒细胞分泌一系列高毒性蛋白质和自由基，其在杀死寄生虫方面非常有效，但在变态反应过程中也可能损伤组织。因此，嗜酸性粒细胞激活和释放毒素受到严格调控以防止任何不适当的组织破坏。

[0156] 自然杀伤细胞(NK细胞)是先天免疫系统的组成部分，其不直接攻击入侵的微生物。相反，NK细胞破坏受损的宿主细胞(例如肿瘤细胞或病毒感染的细胞)，其具有异常低水平的细胞表面标志物，称为MHC I(主要组织相容性复合物)-这种情况可能在宿主细胞的病毒感染中出现。NK细胞之所以如此命名，是因为它们不需要活化以杀死具有低表面MHC I分子的细胞的最初观念。

[0157] γ-δT细胞表现出使它们处于先天免疫和适应性免疫之间的边界处的特征。在一些情况下，γ-δT细胞可被认为是适应性免疫的组分，因为它们重排TCR基因以产生连接多样性并形成记忆表型。各种亚群也可以被认为是先天免疫系统的部分，其中限制的TCR或NK受体可以用作模式识别受体。例如，大量Vγ9/Vδ2T细胞对微生物产生的常见分子迅速作出反应，且高度限制的上皮内Vδ1T细胞将对应激的上皮细胞产生反应。

[0158] 吞噬细胞是吞食或“吞噬”病原体或颗粒的先天免疫细胞。为了吞噬颗粒或病原体，吞噬细胞伸展其质膜的部分，将膜包裹在颗粒周围直至其被包围(颗粒现在在细胞内)。一旦在细胞内部，入侵的病原体就容纳在内体中，内体与溶酶体合并。溶酶体含有杀死和消化颗粒或生物体的酶和酸。通常，吞噬细胞在身体内巡逻而寻找病原体，但也能够对由其它细胞产生的一组高度特化的分子信号(称为细胞因子)起反应。吞噬细胞的类型包括但不限于：巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞。

[0159] 巨噬细胞是大的吞噬细胞，其能够通过迁移穿过毛细血管壁并进入细胞之间的区域以追踪入侵的病原体而移动到血管系统之外。在组织中，器官特异性的巨噬细胞与血液中存在的称为单核细胞的吞噬细胞区分。巨噬细胞是最有效的吞噬细胞，且可以吞噬大量细菌或者其它细胞或微生物。细菌分子与巨噬细胞表面上的受体的结合触发其通过产生“呼吸爆发”从而导致活性氧物质的释放而吞噬和破坏细菌。病原体还刺激巨噬细胞以产生趋化因子，其将其它细胞募集到感染部位。促进炎症的巨噬细胞被称为M1巨噬细胞，而那些减少炎症和促进组织修复的巨噬细胞被称为M2巨噬细胞。

[0160] 嗜中性粒细胞以及另外两种细胞类型(嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)被称为粒细胞，因为它们的细胞质中存在颗粒，或者被称为多形核细胞(PMN)，因为其独特的裂片细胞核。嗜中性粒细胞颗粒含有杀死或抑制细菌和真菌的生长的多种毒性物质。与巨噬细胞类似，嗜中性粒细胞通过激活呼吸爆发来攻击病原体。嗜中性粒细胞呼吸爆发的主要产物是强氧化剂，包括过氧化氢、游离氧自由基和次氯酸盐。嗜中性粒细胞是大量的，并且通常是第一种到达感染部位的细胞。

[0161] 树突细胞(DC)是存在于与外部环境接触的组织，主要是皮肤(在其中它们通常被称为朗格汉斯细胞)，以及鼻、肺、胃和肠的内部粘膜衬里中的吞噬细胞。它们因其与神经元树突的相似性而得名，但树突细胞不连接到神经系统。树突细胞在抗原呈递过程中非常重要，并且用作先天免疫系统和适应性免疫系统之间的联系。

[0162] 先天淋巴细胞(ILC)在保护性免疫以及体内平衡和炎症的调节中起重要作用。ILC基于它们产生的细胞因子以及调节其发育和功能的转录因子进行分类。1类ILC产生1型细胞因子并包括自然杀伤细胞。2类ILC产生2型细胞因子，以及3类ILC产生细胞因子IL-17A和IL-22。自然杀伤细胞破坏受损的宿主细胞，如肿瘤细胞或病毒感染的细胞。他们可以在不存在抗体的情况下识别应激的细胞，从而使它们对受损的宿主细胞快速作出反应。

[0163] 骨髓细胞是在先天免疫系统中起作用的细胞。骨髓细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、树突细胞和巨核细胞或血小板。淋巴细胞包括T细胞、B细胞和自然杀伤细胞。

[0164] 适应性免疫系统产生适应性免疫反应。一般形式的适应性免疫反应始于辅助(TH、CD4+)和细胞毒性(CD8+)T细胞亚群通过其与表达与抗原性片段(源自抗原的特定氨基酸序列，其与MHC I和/或MHC II结合以在细胞表面上呈递)相关的主要组织相容性(MHC)-I类或II类分子的抗原呈递细胞(APC)相互作用的敏化。致敏或激发的CD4+T细胞产生参与B细胞+以及各种T细胞亚群的活化的淋巴因子。致敏的CD8T细胞响应于淋巴因子而增加数量，并且能够破坏任何表达与匹配的MHC编码的I类分子结合的特异性抗原片段的细胞。因此，在癌性肿瘤的过程中，CTL根除表达癌症相关或癌症特异性抗原的细胞，从而限制肿瘤扩散和疾病发展的进程。

[0165] “B淋巴细胞”或“B细胞”是一种白细胞类型。B细胞通过分泌抗体在适应性免疫系统的体液免疫组分中起作用。B细胞具有两个主要功能：它们将抗原呈递给T细胞，和更重要的是，它们产生中和感染性微生物的抗体。抗体覆盖病原体表面并发挥三种主要作用：中和、调理作用和补体激活。

[0166] 当病原体由于被覆盖在抗体中而不能结合和感染宿主细胞时，发生中和。在调理作用中，抗体结合的病原体用作红旗(red flag)以提醒如嗜中性粒细胞和巨噬细胞的免疫细胞吞食和消化病原体。补体是直接破坏或裂解细菌的过程。

[0167] 抗体以两种方式表达。位于B细胞表面上的B细胞受体(BCR)实际上是抗体。B细胞还分泌抗体以扩散和与病原体结合。这种双重表达是重要的，因为初始问题(例如，细菌)被独特的BCR识别并激活B细胞。活化的B细胞通过分泌抗体(主要是BCR，但是为可溶形式)来作出响应。这确保了反应针对起动整个过程的细菌是特异性的。

[0168] 每一种抗体是独特的，但它们归属于大类：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。(Ig是免疫球蛋白的缩写，这是抗体的另一个名词。)虽然它们具有重叠的作用，但IgM通常对补体激活是重要的；IgD参与激活嗜碱性粒细胞；IgG对中和、调理作用和补体激活是重要的；IgA对胃肠道中的中和至关重要；和IgE对于在寄生和过敏反应中激活肥大细胞是必需的。

[0169] 记忆B细胞激活始于其靶抗原(由其亲本B细胞共享的)的检测和结合。一些记忆B细胞可以在没有T细胞帮助的情况下被激活，例如某些病毒特异性记忆B细胞，但是其它记忆B细胞需要T细胞帮助。在抗原结合后，记忆B细胞通过受体介导的内吞作用摄取抗原，使其降解，并将其作为与细胞膜上的MHC-II分子复合的肽段呈递给T细胞。衍生自用相同抗原激活的T细胞的记忆T辅助(TH)细胞，通常是记忆滤泡T辅助(TFH)细胞，通过它们的TCR识别和结合这些MHC-II-肽复合物。在TCR-MHC-II-肽结合和传递来自记忆TFH细胞的其它信号后，记忆B细胞被激活并通过滤泡外反应分化成浆母细胞和浆细胞或者进入生发中心反应，在那里它们产生浆细胞和更多的记忆B细胞。

[0170] 调节性B细胞(Breg)代表小的B细胞群体，其参与免疫调节和免疫反应的抑制。这些细胞通过不同的机制调节免疫系统。主要机制是产生抗炎性细胞因子白介素10(IL-10)。Breg的调节作用在炎症、自身免疫疾病、移植反应和抗肿瘤免疫的各种模型中有所描述。

[0171] T细胞具有多种作用，并按亚群分类。基于细胞表面上存在哪种蛋白质，T细胞分为两大类：CD8+T细胞或CD4+T细胞。T细胞完成多种功能，包括杀死感染的细胞和激活或募集其它免疫细胞。

[0172] CD8+T细胞也称为细胞毒性T细胞或细胞毒性淋巴细胞(CTL)。它们对于识别和清除病毒感染的细胞和癌细胞至关重要。CTL具有特化的区室或颗粒，其含有引起细胞凋亡(程序性细胞死亡)的细胞毒素。由于其效能，颗粒的释放受到免疫系统的严格调控。

[0173] 四个主要的CD4+T细胞亚群是Th1、Th2、Th9、Th17、Tfh(T滤泡辅助)和Treg，其中“Th”指的是“T辅助细胞”。Th1细胞对于协调针对细胞内微生物，特别是细菌的免疫反应是至关重要的。它们产生并分泌警示和激活其它免疫细胞的分子(如摄入细菌的巨噬细胞)。通过警示B细胞、粒细胞和肥大细胞，Th2细胞对于协调针对细胞外病原体(如蠕虫(寄生蠕虫))的免疫反应是重要的。Th17细胞以其产生白介素17(IL-17)的能力而得名，白介素17是激活免疫和非免疫细胞的信号传导分子。Th17细胞对于募集嗜中性粒细胞是重要的。

[0174] 调节T细胞(Treg)监测并抑制其它T细胞的活性。它们防止不利的免疫激活和维持耐受性，或防止针对身体自身细胞和抗原的免疫反应。1型调节T(Tr1)细胞是在促进和维持耐受中起关键作用的调节性T细胞的诱导型亚群。Tr1细胞控制免疫反应的主要机制是高水平IL-10的分泌，以及通过释放颗粒酶B杀死骨髓细胞。另外，存在Th3(TGF-β分泌)、iTreg(转化为Treg细胞的非胸腺Tconv)和iTR35(转化Tconv为Treg细胞的IL-35)。

[0175] 记忆T细胞是抗原特异性T细胞的亚群，其在初始T细胞反应后长期持续。它们在重新暴露于其同源抗原时迅速扩增至大量效应T细胞，从而为免疫系统提供针对过去抗原的“记忆”。本文所述的癌症疫苗为免疫系统提供针对肿瘤特异性抗原的“记忆”，从而引发针对新出现的癌细胞或转移的癌细胞的强烈免疫反应。

[0176] 淋巴细胞或淋巴样细胞是脊椎动物的适应性免疫系统中的白细胞。淋巴细胞包括自然杀伤细胞(NK细胞)(其在细胞介导的细胞毒性先天免疫中起作用)、T细胞(用于细胞介导的、细胞毒性适应性免疫)和B细胞(用于体液、抗体驱动的适应性免疫)。

[0177] 方法

[0178] 本文还提供了包括培养本公开的工程化MSC(或其它工程化免疫细胞)的方法。培养MSC的方法是已知的。在一些实施方案中，MSC在生长培养基(例如，MSCGM人间充质干细胞生长BULLETKITTM培养基(含血清)、THERAPEAKTMMSCGM-CDTM间充质干细胞化学限定培养基(无血清)或RoosterBio xeno-free MSC培养基)中培养。

[0179] 本文进一步提供的方法包括将如本文提供的工程化MSC递送或施用于受试者(例如，人类受试者)以在体内产生至少一种由MSC产生的效应分子。在一些实施方案中，MSC通过静脉内、腹膜内、气管内、皮下、肿瘤内、口服、肛门、鼻内(例如，包装在递送颗粒中)或动脉(例如，颈内动脉)途径施用。因此，MSC可以全身或局部施用(例如，施用于TME)。

[0180] 一些方法包括选择患有肿瘤(或癌症)的受试者(或患者群体)，并用调节肿瘤介导的免疫抑制机制的工程化MSC治疗该受试者。

[0181] 在某些情况下，本公开的工程化MSC可以用于治疗癌症，如卵巢癌。本文描述了其他癌症。例如，工程化MSC可以用于治疗膀胱肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、结肠直肠肿瘤、食道肿瘤、神经胶质瘤、肾肿瘤、肝肿瘤、肺肿瘤、黑素瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、甲状腺肿瘤和/或子宫肿瘤。

[0182] 本文提供的方法还包括递送工程化细胞如工程化MSC的制剂。在一些实施方案中，制剂是基本上纯的制剂，其包含例如小于5％(例如，小于4％、3％、2％或1％)的MSC之外的细胞。制剂可包含1x105细胞/kg至1x107细胞/kg，例如MSC。

[0183] 另外的实施方案

[0184] 1.一种经工程化以产生多种效应分子的间充质干细胞，其中至少两种效应分子调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制；或包含经工程化以产生调节肿瘤介导的免疫抑制机制的多种效应分子的间充质干细胞的组合物，其任选地以有效量配制以减小受试者中肿瘤的体积。

[0185] 2.段落1的间充质干细胞或组合物，其中至少一种效应分子在肿瘤微环境中刺激免疫刺激机制和/或在肿瘤微环境中抑制免疫抑制机制。

[0186] 3.段落1的间充质干细胞或组合物，其中至少一种效应分子(a)刺激T细胞信号传导、活性和/或募集，(b)刺激抗原呈递和/或加工，(c)刺激自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号传导、活性和/或募集，(d)刺激树突细胞分化和/或成熟，(e)刺激免疫细胞募集，(f)刺激促炎性巨噬细胞信号传导、活性和/或募集，或者抑制抗炎性巨噬细胞信号传导、活性和/或募集，(g)刺激基质降解，(h)刺激免疫刺激性代谢产物产生，(i)刺激I型干扰素信号传导，(j)抑制负性共刺激信号传导，(k)抑制抗肿瘤免疫细胞的促凋亡信号传导，(l)抑制T调节(Treg)细胞信号传导、活性和/或募集，(m)抑制肿瘤检查点分子，(n)刺激干扰素基因刺激因子(STING)信号传导，(o)抑制骨髓源抑制细胞信号传导、活性和/或募集，(p)降解免疫抑制因子/代谢产物，(q)抑制血管内皮生长因子信号传导和/或(r)直接杀死肿瘤细胞。

[0187] 4.段落1-3任一的间充质干细胞或组合物，其包含含有与编码效应分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子的工程化核酸。

[0188] 5.段落1-4任一的间充质干细胞或组合物，其包含：(a)含有与编码至少两种效应分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子的工程化核酸；或(b)至少两个工程化核酸，其各自包含与编码至少一种效应分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子。

[0189] 6.段落1-5任一的间充质干细胞或组合物，其中肿瘤选自膀胱肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、子宫颈肿瘤、结肠直肠肿瘤、食管肿瘤、神经胶质瘤、肾肿瘤、肝肿瘤、肺肿瘤、黑素瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、甲状腺肿瘤和子宫肿瘤。

[0190] 7.段落1-6任一的间充质干细胞或组合物，其中由间充质干细胞或组合物产生的至少一种效应分子选自细胞因子、受体/配体、抗体、核苷酸、肽和酶。

[0191] 8.段落7的间充质干细胞或组合物，其中细胞因子选自趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子。

[0192] 9.段落8的间充质干细胞或组合物，其中趋化因子选自MIP1a(CCL3)、MIP1b(CCL5)、CCL21、CXCL9、CXCL10和CXCL11。

[0193] 10.段落8或9的间充质干细胞或组合物，其中干扰素选自IFN-β和IFN-γ。

[0194] 11.段落8-10任一的间充质干细胞或组合物，其中白介素选自IL-12、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18和IL-1β。

[0195] 12.段落7-11任一的间充质干细胞或组合物，其中受体/配体选自OX40-配体和CD40L。

[0196] 13.段落7-12任一的间充质干细胞或组合物，其中抗体选自检查点抑制剂和抗IL-35抗体。

[0197] 14.段落13的间充质干细胞或组合物，其中检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和抗CTLA-4抗体。

[0198] 15.段落7-14任一的间充质干细胞或组合物，其中核苷酸选自CpG寡脱氧核苷酸。

[0199] 16.段落7-15任一的间充质干细胞或组合物，其中肽是抗肿瘤肽。

[0200] 17.段落7-16任一的间充质干细胞或组合物，其中酶选自降解基质的酶、降解免疫抑制代谢产物的酶和刺激免疫刺激性代谢产物产生的酶。

[0201] 18.段落1-17任一的间充质干细胞或组合物，其中至少一种效应分子是IFN-β，且其中至少一种效应分子选自细胞因子、抗体、趋化因子、核苷酸、酶和溶瘤病毒。

[0202] 19.段落1-18任一的间充质干细胞或组合物，其中至少一种效应分子在肿瘤微环境中刺激炎症途径和/或至少一种效应分子在肿瘤微环境中抑制炎症的负调节剂。

[0203] 20.段落19的间充质干细胞或组合物，其中炎症途径是TNF受体超家族途径、共同γ链家族途径或Toll样受体途径。

[0204] 21.段落19或20的间充质干细胞或组合物，其中炎症的负调节剂是Stat3、Bruton’s酪氨酸激酶、c-kit或SOCS-1。

[0205] 22.段落1-21任一的间充质干细胞或组合物，其中间充质干细胞或组合物经工程化以产生归巢分子。

[0206] 23.段落22的间充质干细胞或组合物，其中归巢分子选自：CCR9、CXCR3、CXCR4、CCR2、CCR4、FPR2、VEGFR、IL6R、CXCR1、CSCR7和PDGFR。

[0207] 24.段落4-23任一的间充质干细胞或组合物，其中启动子是诱导型启动子。

[0208] 25.段落4-23任一的间充质干细胞或组合物，其中启动子是CMV启动子、EF1a启动子、EFS启动子、MND启动子、PGK启动子、SFFV启动子、SV40启动子或UbC启动子。

[0209] 26.段落2-22任一的间充质干细胞或组合物，其中启动子是合成启动子，任选地包含转录因子结合结构域。

[0210] 27.段落2-26任一的间充质干细胞或组合物，其中启动子受局部肿瘤状态调节。

[0211] 28.段落27的间充质干细胞或组合物，其中局部肿瘤状态是低氧。

[0212] 29.段落27的间充质干细胞或组合物，其中局部肿瘤状态是炎症。

[0213] 30.段落25的间充质干细胞或组合物，其中诱导型启动子包含根皮素调节的控制元件(PEACE)或锌指DNA结合结构域(DBD)。

[0214] 31.段落1-30任一的间充质干细胞或组合物，其中间充质干细胞或组合物来自骨髓、脂肪组织、脐带或多能干细胞。

[0215] 32.段落1-31任一的间充质干细胞或组合物，其中间充质干细胞或组合物经工程化以产生IL-12和CCL21。

[0216] 33.段落32的间充质干细胞或组合物，其中间充质干细胞或组合物经工程化以产生IFN-β和/或IFN-γ。

[0217] 34.段落32或33的间充质干细胞或组合物，其中间充质干细胞或组合物经工程化以产生抗CD40抗体和/或抗CTLA4抗体。

[0218] 35.一种方法，包括培养段落1-34任一的间充质干细胞以产生效应分子。

[0219] 36.一种方法，包括向受试者递送段落1-34任一的间充质干细胞或组合物以在体内产生由间充质干细胞产生的至少一种效应分子。

[0220] 37.段落36的方法，其中至少一种效应分子在受试者的肿瘤微环境中产生。

[0221] 38.一种治疗癌症的方法，包括将段落1-34任一的间充质干细胞或组合物递送至诊断患有癌症的受试者。

[0222] 39.段落38的方法，其中癌症是卵巢癌。

[0223] 40.段落38的方法，其中癌症是乳腺癌。

[0224] 41.段落38的方法，其中癌症是结肠癌。

[0225] 42.段落36-41任一的方法，还包括向受试者施用抗CD40抗体和/或抗CTLA4抗体。

[0226] 43.一种治疗受试者的乳腺癌的方法，包括向患有乳腺肿瘤的受试者递送治疗有效量的经工程化以产生IL-12和CCL21的间充质干细胞的制剂。

[0227] 44.段落43的方法，其中制剂还包含抗CD40抗体和/或抗CTLA4抗体。

[0228] 45.段落43的方法，还包括向受试者施用抗CD40抗体和/或抗CTLA4抗体。

[0229] 46.段落43-45任一的方法，其中制剂包含药学上可接受的载体和/或药学上可接受的赋形剂。

[0230] 47.段落43-46任一的方法，其中治疗有效量减小乳腺肿瘤的体积至少20％。

[0231] 48.段落47的方法，其中乳腺肿瘤的体积在向受试者递送制剂的14天内减小至少20％。

[0232] 49.段落48的方法，其中乳腺肿瘤的体积在向受试者递送制剂的7天内减小至少20％。

[0233] 50.段落43-46任一的方法，其中治疗有效量减小乳腺肿瘤的体积至少50％。

[0234] 51.段落47的方法，其中乳腺肿瘤的体积在向受试者递送制剂的14天内减小至少50％。

[0235] 52.段落48的方法，其中乳腺肿瘤的体积在向受试者递送制剂的7天内减小至少50％。

[0236] 53.一种治疗受试者的结肠癌的方法，包括向患有结肠肿瘤的受试者递送治疗有效量的经工程化以产生IL-12和CCL21的间充质干细胞的制剂。

[0237] 54.段落53的方法，其中制剂还包含抗CD40抗体和/或抗CTLA4抗体。

[0238] 55.段落53的方法，还包括向受试者施用抗CD40抗体和/或抗CTLA4抗体。

[0239] 56.段落53-55任一的方法，其中制剂包含药学上可接受的载体和/或药学上可接受的赋形剂。

[0240] 57.段落53-56任一的方法，其中治疗有效量减小结肠肿瘤的体积至少20％。

[0241] 58.段落57的方法，其中结肠肿瘤的体积在向受试者递送制剂的14天内减小至少20％。

[0242] 59.段落58的方法，其中结肠肿瘤的体积在向受试者递送制剂的7天内减小至少20％。

[0243] 60.段落53-56任一的方法，其中治疗有效量减小结肠肿瘤的体积至少50％。

[0244] 61.段落57的方法，其中结肠肿瘤的体积在向受试者递送制剂的14天内减小至少50％。

[0245] 62.段落58的方法，其中结肠肿瘤的体积在向受试者递送制剂的7天内减小至少50％。

[0246] 实施例

[0247] 实施例1

[0248] 本实施例描述了表达人类免疫治疗(hIT)有效载荷的工程化间充质干细胞(MSC)(hMSC-hIT)和表达小鼠免疫治疗(mIT)有效载荷的小鼠MSC(mMSC)(mMSC-mIT)。编码人和鼠免疫调节基因(抗PD1抗体、抗CTLA4抗体、CCL21、IL2、IL12、IL15和组成型活性STING(干扰素基因刺激因子；Woo SR等，(2015)Trends Immunol36(4):250-256)突变体)的DNA被合成、克隆到表达载体中、引入其相应小鼠和人MSC中，并表征其表达。然后与IFN-β结合在MSC中表达编码免疫调节基因的DNA。

[0249] 方法:合成了编码具有不同作用机制的免疫治疗有效载荷的基因：1)检查点抑制剂，2)趋化因子，3)细胞因子和4)STING(干扰素基因刺激因子)途径调节剂(Woo SR等(2015)Trends Immunol36(4):250-256)。对于检查点抑制剂，表达抗PD1和抗CTLA4抗体。对于趋化因子，表达了已知介导树突细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的运输的CCL21(Dubinett SM等，(2010)Cancer J16(4):325-335)。对于细胞因子，表达IL2、IL12和IL15。对于STING途径调节剂，表达具有组成型活性的细胞内STING突变体(Tang ED&Wang CY(2015)PLoS One 10(3):e0120090)。小鼠和人类形式的免疫治疗(分别mIT和hIT)都可以使用。测试的另外的效应分子包括：IL1beta、IFN-γ、IL17以及IL7(Cieri N等(2013)Blood121(4):573-584)。

[0250] 这些基因在CMV启动子的下游编码以实现高水平的表达。如图1所示，GFP可以使用具有CMV启动子的电穿孔质粒(核转染技术)在MSC中高水平表达。质粒被核转染到MSC中。人骨髓源的MSC(hMSC)购自商业来源。小鼠MSC(mMSC)源自股骨骨髓(Kidd S等(2009)Stem Cells 27(10):2614-2623)。

[0251] 分泌的治疗有效载荷的表达使用具有识别该有效载荷的可商购抗体的ELISA或基于珠的多重测定进行确认。或者，将有效载荷与Myc标签融合，并使用抗Myc抗体进行标记。对于组成型STING突变体，使用从IFN-β启动子表达荧光素酶的报告质粒确认激活
(Fitzgerald KA等(2003)Nat Immunol 4(5):491-496)。有效载荷的功能测试也在实施例2中进行并更详细地描述。

[0252] 接下来，这些免疫治疗有效载荷与IFN-β结合表达。目标之一是鉴定针对卵巢癌细胞与IFN-β具有加性或协同活性的效应子。两种策略用于表达来自MSC的组合免疫治疗有效载荷。(1)MSC用两种质粒进行核转染，一种表达上述列表中的有效载荷，和另一种编码IFN-β，从而导致表达这些基因的混合细胞群体。(2)在单一载体内构建共表达上述列表的有效载荷和IFN-β的质粒。三种结构用于这一方法：(i)表达被2A“核糖体跳过”标签分隔的有效载荷和IFN-β的单一启动子(图2)；(ii)表达由内部核糖体进入位点(IRES)分隔的有效载荷和IFN-β的单一启动子；和(iii)两个启动子用于独立地驱动有效载荷和IFN-β的表达。使用不同的启动子表达有效载荷和IFN-β(例如，SFFV、CMV和/或MND启动子)。评估这些启动子和终止序列的不同组合以鉴定表达两种有效载荷的构型。

[0253] 测试了这些策略，并评估了免疫治疗有效载荷和IFN-β的表达水平。还评估了MSC的存活。CMV、SFFV和MND启动子已在MSC中得到验证。

[0254] 作为质粒转染和电穿孔的替代方案，慢病毒载体可用于将有效载荷表达构建体转导至MSC中。慢病毒载体可用于在MSC中表达GFP(数据未显示)。慢病毒工程化的MSC应具有翻译能力，并准备用于即将进行的临床试验(Deng P等(2016)Neural Regen Res11(5):702-705；Beegle JR等(2016)Mol Ther Methods Clin Dev3:16053)。在一些实施方案中，可以使用转座子将表达构建体引入MSC中，使用PhiC31整合到基因组假位点中，或者使用核酸酶(例如锌指(ZF))、规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)或转录激活物样效应核酸酶(TALEN)。

[0255] 可以用于进行组合免疫疗法表达的另外的策略是每个有效载荷构建一个质粒，将每个质粒独立地核转染到MSC群体中，并混合所得的细胞群体。或者，有效载荷可编码到慢病毒上且多种慢病毒基因组整合到MSC中。

[0256] 实施例2

[0257] 该实施例描述了具有单独和联合免疫治疗有效载荷的MSC的体外表征。首先测量表达免疫治疗的MSC对癌细胞的直接抗癌作用。接下来，测量表达免疫治疗的MSC对与原代免疫细胞(集中于T细胞)和癌细胞的共培养的影响。表达免疫治疗的MSC的免疫刺激特性基于小鼠和人类细胞系统中的炎症生物标志物小组排序。鉴定了其自身或与T细胞一起显著增强癌细胞杀伤的表达免疫治疗的MSC，并选择进一步进行体内测试的最佳候选者。

[0258] 方法:使用与癌症治疗相关的体外模型评价来自实施例1的表达免疫治疗的MSC的功能性作用。人卵巢癌细胞(例如，OVCAR8和SKOV3)和从循环PBMC分离的人免疫细胞用于测试表达hIT的hMSC。小鼠卵巢癌细胞(例如，ID8)和小鼠免疫细胞用于测试表达mIT的mMSC。

[0259] 检查点抑制剂。细胞结合测定用于验证表达的抗体的活性。抗体的靶标，CTLA4和PD1，均负性调节T细胞，但它们在T细胞活化的不同阶段上调(Boutros C等(2016)Nat Rev Clin Oncol13(8):473-486；Valsecchi ME(2015)New Engl J Med 373(13):1270-1270)。CTLA4在激发阶段短暂上调，而PD1在T细胞活化的效应子阶段始终表达(Pardoll DM(2012)Nat Rev Cancer12(4):252-264；Legat A等(2013)Front Immunol 4:455)。抗CTLA4抗体与T细胞表面上的CTLA4结合，从而阻断CTLA4在早期阶段停止T细胞激活，而人抗PD1抗体与PD1结合，从而防止肿瘤细胞抑制T细胞活性。

[0260] 使用EASYSEPTM磁珠(STEMCELL Technologies)通过负向选择从PBMC分离T细胞。分离的T细胞通过Human T-Activator CD3/28Dynabeads(Thermo Fisher)激活，并且CTLA-
4和PD-1的表达监测5天的时间以选择每种表面标志物的最佳表达时机。在适当的日子，将来自表达CTLA-4或PD-1的抗体的MSC的条件培养基或者来自非表达MSC的对照条件培养基应用于活化的T细胞以验证这些抗体的直接细胞表面受体结合。荧光染料标记的二级检测抗体与流式细胞术一起应确认结合。

[0261] 趋化因子。CCL21趋化因子的功能性使用细胞迁移测定和分离的幼稚T细胞确认，该细胞表达对CCL21趋化性有响应的趋化因子受体CCR7。具体地，表达CCL21的或对照的MSC添加到trans-well的一个隔室中，和然后通过从另一隔室的分离的幼稚T细胞评估细胞迁移，接着计数迁移的T细胞的数量(Justus CR等(2014)J Vis Exp(88))。

[0262] 细胞因子。测量IL2、IL12和IL15的活性。对IL2、IL12和IL15特异性的ELISA分析用于检测MSC上清液中这些细胞因子的水平。功能性生物活性测定采用CTLL-2细胞系来评估IL2或IL15介导的增殖，或采用NKG细胞系来评估MSC上清液的IL12介导的IFN-γ产生。使用技术的多重细胞因子谱分析也可用于评估细胞因子表达及对免疫细胞的影响。

[0263] STING途径。用组成型STING突变体有效载荷测量STING途径的激活。使用珠，在MSC中分析了具有STING突变体表达的I型干扰素(例如IFN-α2和IFN-
β)的分泌。

[0264] 表达免疫治疗的MSC对卵巢癌细胞的直接作用。在体外测试MSC对卵巢癌细胞生长和存活力的任何直接影响。例如，mMSC或hMSC候选物与小鼠卵巢癌细胞系(ID8)或人卵巢癌细胞系(OVCAR8和SKOV3)共培养，并通过明确的乳酸脱氢酶(LDH)测定来测量癌细胞细胞毒性。共培养24小时后，收集上清液并通过随后通过酶标仪上的比吸收定量的酶反应测量与细胞死亡相关的LDH水平。此外，通过台盼蓝排除法对活细胞与死细胞进行计数，并通过使用膜联蛋白-V和碘化丙啶染色的流式细胞术测量对活细胞与凋亡/死细胞进行计数来评估癌细胞的数量。

[0265] 表达免疫治疗的MSC对T细胞和卵巢癌细胞共培养系统的作用。测试确定表达免疫治疗的MSC是否可刺激免疫细胞(如T细胞)以在体外针对卵巢癌细胞具有增强的抗癌活性。具体地，mMSC-mIT候选物与小鼠脾细胞和ID8癌细胞系共培养，或hMSC-hIT候选物与人PBMC和OVCAR8或SKOV3细胞系共培养。共培养试验需要使用PBMC/脾细胞与卵巢癌细胞(有或没有MSC)，及用抗CD3/28珠的刺激。为了评估癌细胞死亡，使用诸如LDH细胞毒性测量的技术，将染料标记的卵巢癌细胞与未标记的效应PBMC/脾细胞以固定比率组合并通过流式细胞术测定杀伤进行16小时杀灭测定(Jedema I等(2004)Blood 103(7):2677-2682)，和使用膜联蛋白-V与碘化丙啶通过流式细胞术检测细胞凋亡读数。通过3-5天的CFSE细胞分裂和1-3天的IFN-γ的细胞因子产生来特异性地测定T细胞活化/增殖。

[0266] 产生表达CTLA-4和PD1的T细胞的替代策略是用植物血凝素(PHA)激活以表达细胞表面受体PD1和CTLA4。在第3天，约99％的活化T细胞应表达PD1，而约15％的T细胞应表达CTLA4(Pardoll DM(2012)Nat Rev Cancer 12(4):252-264；Legat A等(2013)Front Immunol 4:455)。在第10天，当CTLA4表达下调但PD1表达维持时，活化的T细胞应处于效应子阶段。评估这些抗体的直接细胞表面受体结合。在诱导后第3天和第10天，将具有相应的检查点抑制剂抗体表达构建体的MSC应用于T细胞培养物。标记的检测抗体与流式细胞术一起使用以确认结合。商业抗体用作对照。

[0267] 实施例3

[0268] 该实施例描述了在同系卵巢癌模型中表达免疫治疗有效载荷的MSC的体内表征。使用卵巢癌的同系小鼠模型(具有小鼠免疫系统的mMSC-mIT)来表征表达免疫治疗的MSC的抗肿瘤功效。测量同系卵巢小鼠模型中工程化MSC的肿瘤归巢以及单个和组合免疫治疗的表达。还测量工程化MSC治疗的卵巢肿瘤负荷和小鼠存活率。该实施例应证明工程化MSC选择性地归巢于TME以及免疫治疗因子在卵巢肿瘤中相对于其他身体部位的局部产生。该实施例还应证明用表达免疫治疗的工程化MSC的肿瘤负荷显著降低和小鼠存活的延长。

[0269] 方法:源自小鼠卵巢上皮表面细胞(MOSE)的自发转化的小鼠ID8细胞系用于建立同系卵巢肿瘤模型(Roby KF等(2000)Carcinogenesis 21(4):585-591)。ID8细胞系感染表达海肾荧光素酶(rLuc)的慢病毒以允许体内生物发光成像，其与表达萤火虫荧光素酶(ffLuc)的MSC正交。在建立小鼠的同系卵巢癌模型之前，在体外ID8中确认成功的rLuc表达。对于同系模型，将5x105 ID8细胞注射到6至8周龄的C57BL/6小鼠的腹腔中(36,54)。用实施例1的有效载荷表达质粒及表达ffLuc的质粒对MSC进行核转染。

[0270] mMSC-mIT候选物在第25天(肿瘤细胞注射后)开始以每只动物106MSC的剂量每周一次连续5周引入同系小鼠模型中(Dembinski JL等(2013)Cytotherapy 15(1):20-32)。分别通过rLuc和ffLuc生物发光成像以及最终时间点后的组织学分析，随时间可视化卵巢肿瘤负荷和mMSC-mIT候选物。当小鼠出现危象(如体重减轻、皮毛褶皱、身体姿态不良、腹部胀大和黄疸)时，将其处死。测量小鼠的存活曲线。通过生物发光成像(BLI)和通过处死时的尸检来量化肿瘤细胞的远端转移。在不同时间点测量免疫系统谱型和活性作为对治疗的反应的生物标志物。

[0271] 为了评估MSC的预期抗肿瘤作用的变异性，改变用于建立模型的ID8细胞的剂量(例如，将细胞数量增加至5x106)、改变所用MSC的剂量以及调节肿瘤建立后递送MSC的时间。

[0272] 即使在小鼠模型中显示mMSC归巢至卵巢肿瘤，但有可能某些有效载荷破坏这种归巢活性。在这些情况中，可以将这些有效载荷的表达设计为诱导性的。例如，这可以通过根皮素素诱导的系统来实现(Gitzinger M等(2009)Proc Natl Acad Sci U S A106(26):10638-10643)。或者，Dimerizer系统可以用于使用小分子将合成锌指DNA结合结构域与反式激活结构域连接(Clackson T等(1998)Proc Natl Acad Sci U S A 95(18):10437-
10442)。可选地或另外地，可以构建基于信号如低O2在肿瘤微环境中触发的可诱导的有效载荷表达构建体。

[0273] 慢病毒ffLuc构建体也可用于感染MSC。

[0274] 实施例4

[0275] 该实施例描述了在具有人免疫细胞的小鼠的人卵巢癌异种移植模型中表达免疫治疗有效载荷的MSC的功效的体内表征。测试了工程化MSC在通过CD34+细胞移植物移植人免疫细胞的免疫缺陷小鼠(具有人源化免疫系统的hMSC-hIT)的人卵巢癌模型中的活性。测量了在具有人免疫细胞的小鼠的人异种移植卵巢肿瘤中工程化MSC的归巢以及单个和联合免疫疗法的表达。还测试了具有工程化MSC治疗的卵巢肿瘤负荷和小鼠存活率。该实施例应证明与小鼠的其他身体部位相比，在人异种移植卵巢肿瘤中工程化MSC的归巢升高和免疫治疗因子的局部产生。该实施例还应证明与免疫系统组成的变化相关的表达免疫治疗的工程化MSC的肿瘤负荷显著降低和小鼠存的延长。

[0276] 方法.为了能够将工程化MSC转用于人类临床试验，在人类癌症的人源化小鼠模型中测试hMSC-hIT构建体。通过在移植CD34+造血干细胞(HSC)的免疫缺陷小鼠(NSG)中使用人卵巢癌细胞系的异种移植物，对表达免疫治疗的hMSC在小鼠中的作用进行建模。

[0277] 对于人卵巢癌细胞，使用OVCAR8和SKOV3细胞系。与实施例3中描述的类似的测定用于研究随时间的肿瘤负荷和小鼠存活。

[0278] 也可以使用两种替代方法。(1)可以将人T细胞输注入小鼠中。(2)可以将人PBMC输注入小鼠中。

[0279] 表达载体:pL+MCS ACGCGTGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCACTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCCTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGGTTAACTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATCAAAATTTTATCTCGACATGGTGGCGACCGGTAGCGCTAGCGGATCGATAAGCTTGATATCGCCTGCAGCCGAATTCCTTGACTTGGGATCCGCGTCAAGTGGAGCAAGGCAGGTGGACAGTCCTGCAGGCATGCGTGACTGACTGAGGCCGCGACTCTAGTTTAAACTGCGTGACTGACTCTAGAAGATCCGGCAGTGCGGCCGCGTCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAAATAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTAGTAGTTCATGTCATCTTATTATTCAGTATTTATAACTTGCAAAGAAATGAATATCAGAGAGTGAGAGGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGCTCTAGCTATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGACTTTTGCAGAGACGGCCCAAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTG(SEQ ID NO:8)

[0280] 实施例5. 4T1三阴性乳腺癌

[0281] 在以下实验中，MSC进行工程化以表达以下效应分子之一，然后单独或组合施用于原位乳腺癌小鼠模型：IFNβ、IFNγ、IL12、IL15、IL36γ、IL7、TRAIL、cGAS、CCL21a、OX40L、CD40L或HACv-PD1。在一些实例中，与工程化MSC的施用结合，注射检查点抑制剂(抗CD40、抗PD1或抗CTLA-4抗体)。

[0282] MSC归巢

[0283] 以下实验证明，在原位小鼠乳腺癌模型中，鼠MSC归巢至肿瘤。表达荧光素酶的4T1乳腺肿瘤细胞(5x105)原位移植到雌性BALB/cJ小鼠的背侧脂肪垫中。5天后，小鼠腹膜内注射1百万个荧光标记(用XenoLight DiR(Caliper Life Sciences))的鼠BM源的MSC(BM-MSC，治疗细胞)。在MSC注射后第1天和第7天，利用Ami HT活体动物成像仪(Spectral Instruments)使用荧光分析确定MSC定位。在第7天，使用Ami HT成像仪通过4T1细胞的荧光素酶生物发光报告体确定肿瘤的定位和大小。如图3所示，注射的MSC共定位于肿瘤部位，表明这些细胞实际上在体内特异性地归巢至4T1乳腺肿瘤的部位。注射的MSC在一天内归巢至肿瘤并持续超过7天。相反，在正常小鼠中没有肿瘤的情况下，注射的MSC不归巢至背部。这些结果表明，MSC可以用作抗癌分子、蛋白质或化合物的递送媒介。

[0284] 为了确定工程化人MSC是否可以向小鼠肿瘤归巢，将表达GFP、IL2或CCL21a的不同工程化人MSC系注射到具有4T1肿瘤的BALB/c小鼠中。每隔一天从卡尺测量中通过肿瘤体积确定功效。图11A-11B显示人MSC不归巢至小鼠4T1肿瘤。

[0285] 体内功效

[0286] 以下实验证明了表达免疫治疗效应子(有效载荷)的MSC在原位乳腺癌模型中的体内功效。4T1-Neo-Fluc小鼠乳腺肿瘤细胞(Imanis Life Sciences,5x105细胞)原位植入雌性BALB/cJ小鼠(The Jackson Laboratory)的背侧脂肪垫中。然后将小鼠在肿瘤植入后5天随机分组到治疗组中。小鼠每周一次接受腹膜内注射对照MSC生长培养基或表达不同免疫治疗效应子(有效载荷)的工程化MSC(2x106细胞)共两周。每种免疫治疗由不同的MSC表达，并且MSC组合(1:1比率)用于组合治疗。每隔一天通过卡尺测量监测肿瘤生长，并且每周两次记录小鼠的体重。在第一次MSC治疗后14天处死小鼠，并收集组织进行进一步分析。

[0287] 图4显示，与用培养基治疗的对照相比，在用表达组合基因IL-12和CCL21a的工程化MSC治疗的小鼠中肿瘤生长被延迟。

[0288] 图5A-5C显示与培养基治疗的小鼠相比，表达单一免疫治疗效应子(例如，IFN-β、IFN-γ、IL-12或CCL21a)的工程化MSC抑制同系4T1小鼠肿瘤的生长。令人惊讶地，当免疫治疗效应子组合时，特别地IL-12和CCL21a的组合，以及IFN-β、IFN-γ、IL-12和CCL21a的组合，观察到对肿瘤生长的协同作用(图5A-5C)。

[0289] 图6A-6B显示表达OX40L、TRAIL、IL15、cGAS或其组合的工程化MSC不抑制肿瘤生长。

[0290] 图7A-7B显示表达IL-12和CCL21a的工程化MSC抑制肿瘤生长；但是，添加抗CD40抗体不降低肿瘤生长。

[0291] 图8A-8B显示表达OX40L、TRAIL、IL15、HACvPD-1或其组合的工程化MSC不显著抑制肿瘤生长。

[0292] 图9A-9B显示了表达IL-12和CCL21a的工程化MSC抑制肿瘤生长；然而，表达CCL21a、IL-36γ和IL-7的MSC的组合不降低肿瘤生长。但是，测试的一些效应子组合可能引起毒性。

[0293] 剂量递增和毒性

[0294] 在GFP组的以上一些实验中观察到毒性，因此进行了剂量递增研究以确定毒性的基础原因。该实验确定表达GFP的工程化MSC细胞不引起毒性(图10A-10B)，而是MSC悬浮培养基可能是毒性的主要原因。

[0295] 对大肿瘤的作用

[0296] 该实验测试了表达IL12和CCL21a的工程化小鼠MSC是否可以降低较大肿瘤(>3
800mm)的肿瘤负荷。较大的肿瘤比较小的肿瘤更难以治疗，并且该实验证明这种效应子组合可以减少肿瘤扩增(图12A-12B)。

[0297] 检查点抑制剂

[0298] 图13A显示表达IL-12和CCL21的工程化MSC足以抑制肿瘤生长，并且通过注射添加检查点抑制剂(抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体)不增加功效。

[0299] 实施例6.CT26结肠直肠癌

[0300] 在以下实验中，MSC进行工程化以表达以下效应分子之一，然后单独或组合施用于结肠直肠癌小鼠模型：IFNβ、IL12、IL15、IL36γ、IL7、CCL21a、HACv-PD1或41BB。在一些实例中，与工程化MSC的施用结合注射检查点抑制剂(抗CD40或抗CTLA-4抗体)。

[0301] 图14显示表达IL-12和CCL21a的工程化MSC诱导显著的肿瘤生长延迟。

[0302] 图15显示了CT26小鼠模型中的肿瘤生长动力学以确定给药工程化MSC细胞的最佳时间。

[0303] 体内功效

[0304] 以下实验证明了表达免疫治疗效应子(有效载荷)的MSC在皮下结肠(结肠直肠)癌小鼠模型中的体内功效。CT26-Neo-Fluc小鼠结肠癌细胞(Imanis Life Sciences,5x 105)皮下注射到雌性BALB/cJ小鼠(The Jackson Laboratory)的腹侧中。肿瘤植入后7天，小鼠然后随机分组到以下治疗组中：对照MSC生长培养基、工程化MSC(MSC-12+CCL21a)、抗CD40抗体、抗CTLA4抗体(Bio X细胞)、与抗CD40抗体组合的MSC-12+CCL21a或与抗CTLA4抗体组合的MSC-12+CCL21a。每周一次腹膜内(ip)注射工程化MSC(2x106细胞)，持续两周(第0天和第7天)。在第0天和第3天ip注射(100μg)抗CD40抗体。在第0、3和7天ip注射(100μg)抗CTLA4抗体。每隔一天通过卡尺测量监测肿瘤的生长，并每周两次记录小鼠体重。在第一次MSC治疗后11天处死小鼠，并收集肿瘤和称重。测量每个治疗组中单个小鼠的肿瘤重量，且结果显示在图16B(左图)的左下。随时间监测每个治疗组的平均肿瘤体积(图16B，右图)。与GFP处理的小鼠相比，治疗组2(IL-12+CCL21a+抗CTLA4抗体)、治疗组4(IL-12+CCL21a)和治疗组7(IL-12+CCL21a+抗CD40抗体)抑制CT26结肠肿瘤的平均生长(图16B，右图)。当随时间测量每个治疗组中单个小鼠的肿瘤体积时，观察到类似的结果(图16A)。因此，用表达免疫治疗的MSC的组合治疗抑制体内结肠癌细胞的生长。

[0305] 图18A显示了表达IL-12、CCL21a以及IL15或HACvPD-1的工程化MSC在小鼠结肠直肠癌模型中显著抑制肿瘤生长。图18B显示了每种治疗中单个小鼠的肿瘤重量。图18C是肿瘤微环境内浸润免疫群体的代表性图。图18D显示了总CD3群体中调节T细胞(Treg)的百分比。用工程化MSC-IL2和CCL21a治疗的肿瘤微环境中Treg数量显著减少。图18E将免疫浸润的百分比与肿瘤重量相关联。发现淋巴细胞(CD3+)增加的样品与低肿瘤重量相关，而具有高髓样(CD11b+)浸润的样品与较高的肿瘤负荷相关。

[0306] 长期存活率

[0307] 与注射的抗CD40抗体结合给予小鼠两次不同浓度的工程化MSC-IL12和CCL21a治3
疗。在第二剂量后，每周两次监测肿瘤体积直到肿瘤负荷大于1500mm并处死小鼠。图17A示出了单个组的肿瘤体积。图17B左图随时间追踪来自单个组的小鼠体重和肿瘤体积。图17B右图显示了不同组的生存图。

[0308] MSC归巢

[0309] 以下的这一实验证明，鼠MSC在结肠癌小鼠模型中归巢至肿瘤。在图19的左上部分中提供了简明的实验方案。将表达荧光素酶的CT26结肠癌肿瘤细胞(5x105)皮下植入雌性BALB/cJ小鼠的右大腿中。4天后，使用Ami HT活体动物成像仪(Spectral Instruments)通过CT26细胞的荧光素酶报告体确定肿瘤定位和大小(图19，左下图，荧光素酶信号(肿瘤特异性的))。在肿瘤植入后5天，通过腹膜内注射将用XenoLight DiR(Caliper Life Sciences)荧光标记的200万鼠BM-MSCs移植到荷瘤小鼠(肿瘤+)中。在MSC注射后第1天和第
3天，使用Ami HT成像仪确定XenoLight DiR荧光标记的MSC的定位(图19，右图，DiR信号(MSC-特异性的))。注射的MSC共定位于CT26结肠肿瘤的部位(图19，比较在左下图中MSC注射前小鼠中的肿瘤特异性荧光素酶信号和右侧注射后第1天和第3天肿瘤+小鼠中MSC-特异性DiR信号的定位)。因此，MSC在体内确实特异性地归巢至CT26结肠肿瘤的部位，并且这些结果表明，MSC可以用作抗癌分子、蛋白质或化合物的递送媒介。

[0310] 图20A显示工程化人MSC不归巢至小鼠CT26肿瘤。图20B显示每种治疗中单个小鼠的肿瘤重量。每隔一天从卡尺测量中通过肿瘤体积确定功效。

[0311] 肿瘤生长动力学

[0312] 图21A-21B显示了腹膜内空间中CT26-LUC(荧光素酶)肿瘤生长的动力学。在第0天注射CT26细胞系，并在第7天、第10天、第14天和第18天收获三(3)只小鼠以确定肿瘤生长的动力学。图21A的第一行用IVIS成像仪测量小鼠体重和ROI以监测肿瘤负荷。第二行监测每个组中单个小鼠的肿瘤重量和肿瘤的ROI。第三行将肿瘤重量与全身ROI或肿瘤ROI相关联。图21B显示了第18天组中三(3)只小鼠的免疫谱以更好地理解肿瘤微环境。

[0313] 肿瘤浸润物统计学/免疫百分比/肿瘤重量

[0314] 皮下小鼠模型

[0315] 图22A包括表明在皮下结肠直肠癌小鼠模型中表达IL-12和CCL21a的工程化MSC抑制肿瘤生长的数据；但是，表达CCL21a和IL-36γ或IL-7的MSC的组合不减少肿瘤生长。图23A-23B包括肿瘤免疫浸润物统计。从PBS、幼稚MSC和MSC-IL12+MSC-CCL21a(combo)组选择三只小鼠进行流式细胞术分析以对肿瘤微环境进行免疫谱分析。图23A显示了与给药幼稚MSC的组相比，combo组中浸润CD3和CD8细胞毒性T群体的显著增加。图23B显示了与用幼稚MSC处理的组相比，combo组中粒细胞性骨髓源抑制细胞(gMDSC)和巨噬细胞群体的显著减少。

[0316] 图24A-24B包括与免疫百分比和肿瘤重量有关的数据，表明具有更多CD3+和CD8+T细胞的样品(左上和中图)与肿瘤重量的减小强烈相关。这些图还显示具有较少CD11b髓样细胞(包括巨噬细胞、树突细胞和MDSC)的样品显示较低的肿瘤负荷(图24A的中下和右图以及图24B的上行)。

[0317] 原位小鼠模型

[0318] 图26A显示在原位结肠直肠癌小鼠模型中，表达IL-12和CCL21a或CCL21a和IFN-β的工程化MSC抑制肿瘤生长；然而，表达CCL21a和s41BBL的MSC的组合不减少肿瘤生长。各种效应子由不同的MSC表达，并且MSC组合(以1：1的比率)用于组合治疗。每张图显示了表达指示的免疫治疗的工程化MSC单独或组合对小鼠中4T1乳腺肿瘤生长的影响(n＝6-8)。图26A的每条线表示单个小鼠。图26B显示了每种治疗中单个小鼠的肿瘤重量。与注射幼稚MSC的小鼠相比，MSC-IL12+MSC-CCL21a显示出最佳功效。在用MSC-IFNb+MSC-CCL21a治疗的组中也观察到治疗功效。

[0319] 图27A-27B是显示用指示的工程化MSC治疗的每个组的免疫谱的图。在用MSC-IL12+MSC-CCL21a治疗后观察到巨噬细胞群体的一致减少(图27A)。当与针对幼稚MSC用MSC-IL12+MSC-CCL21a治疗的组相比时，还观察到了CD3+群体浸润增加和CD11b+群体浸润减少的总体趋势(图27A和图27B)。

[0320] 图28A-28B显示了免疫浸润与肿瘤重量的相关性。具有低巨噬细胞和树突细胞的样品具有较低的肿瘤负荷(图28B，中上和右上)。

[0321] 图28C显示了各组的平均肿瘤重量。与幼稚MSC相比，MSC-IL12+MSC-CCL21a或MSC-IFNb+MSC-CCL21a均观察到统计学显著性。

[0322] 图29显示组合来自以上结肠直肠癌模型的体内数据(图22A和图26A)的图。来自图22A和图26A的组合CT26数据捕获三个组：仅肿瘤(PBS)、幼稚MSC治疗的以及MSC-IL12+MSC-CCL21a治疗的。

[0323] 图30A-30C还显示了来自图22A和图26A的组合数据。这些图显示了来自流式细胞术实验数据的平均免疫浸润数。在图30A的CD8+T中观察到统计学显著性，证明MSC-IL12+MSC-CCL21a重新极化肿瘤微环境并允许更多的细胞毒性T细胞浸润的能力。此外，在用MSC-IL12+MSC-CCL21a治疗的组中，CD11b+骨髓群体浸润减少(图30B)。使用树突细胞和巨噬细胞群体收集的数据具有统计学显著性。

[0324] 腹膜内和皮下结肠直肠癌小鼠模型中的IL12和CCL21a疗法

[0325] 图25A-25B包括来自腹膜内和皮下结肠直肠癌小鼠模型中的MSC-IL-12+CCL21a疗法的数据。测试了三个不同批次的慢病毒转导系的MSC-IL12和CCL21a(TLOO8-3/4、TL019-01/02和TL022-01/02；每个TL编号代表一个批次)。图25A显示了全部三个批次的MSC-IL12+MSC-CCL21a都可以减轻皮下和腹膜内模型的肿瘤负荷(前5幅图来自SC模型，和后3幅图来自IP模型)。在第11天收集来自所有小鼠的肿瘤。图25B显示了每个组的平均肿瘤重量。

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