通过微针贴片辅助的递送增强癌症免疫疗法
阅读：63发布：2020-05-16
专利汇可以提供通过微针贴片辅助的递送增强癌症免疫疗法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文公开用于免疫 治疗 剂的受 控释 放的可自降解微针装置。还公开用于使用针对免疫治疗剂(例如，aPD1 抗体 )的持续递送的可自降解微针贴片来治疗 疾病 (例如，癌症)的方法。，下面是通过微针贴片辅助的递送增强癌症免疫疗法专利的具体信息内容。
1.一种用于将材料转运穿过受试者的生物屏障的装置，其包括：
多个微针，每个微针具有基端和尖端；
基板，所述微针的所述基端附接或整合到所述基板；以及
酸可降解纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包封免疫治疗剂和pH改变剂。
2.如权利要求1所述的装置，其中所述免疫治疗剂选自抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗CTLA4抗体或其组合。
3.如权利要求2所述的装置，其中所述免疫治疗剂是抗PD1抗体。
4.如权利要求3所述的装置，其中所述抗PD1抗体是纳武单抗。
5.如权利要求3所述的装置，其中所述抗PD1抗体是派姆单抗。
6.如权利要求2所述的装置，其中所述免疫治疗剂是抗CTLA4抗体。
7.如权利要求6所述的装置，其中所述抗CTLA4抗体是伊匹单抗。
8.如权利要求2所述的装置，其中所述免疫治疗剂是与抗CTLA4抗体组合的抗PD1抗体。
9.如权利要求1至8中任一项所述的装置，其中所述pH改变剂是葡萄糖氧化酶。
10.如权利要求1至9中任一项所述的装置，其中所述酸可降解纳米颗粒包含修饰的葡聚糖。
11.如权利要求1至10中任一项所述的装置，其中所述酸可降解纳米颗粒还包含表面活性剂。
12.如权利要求11所述的装置，其中所述表面活性剂是藻酸盐。
13.如权利要求1至12中任一项所述的装置，其中所述微针包含透明质酸。
14.一种用于治疗有需要的受试者的疾病的方法，其包括：
向受试者提供微针贴片，其中所述微针贴片包括：
多个微针，每个微针具有基端和尖端；
基板，所述微针的所述基端附接或整合到所述基板；
酸可降解纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包封免疫治疗剂和pH改变剂；
将所述微针插入到生物屏障中，其中所述pH改变剂降低所述酸可降解纳米颗粒内的pH，并且其中所述pH的降低使所述纳米颗粒降解并且以受控释放的方式将所述免疫治疗剂释放到所述受试者中。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述疾病是癌症。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤。
17.如权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述免疫治疗剂选自抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗CTLA4抗体或其组合。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述免疫治疗剂是抗PD1抗体。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述抗PD1抗体是纳武单抗。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述抗PD1抗体是派姆单抗。
21.如权利要求17所述的方法，其中所述免疫治疗剂是抗CTLA4抗体。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述抗CTLA4抗体是伊匹单抗。
23.如权利要求17所述的方法，其中所述免疫治疗剂是与抗CTLA4抗体组合的抗PD1抗体。
24.如权利要求14至23中任一项所述的方法，其中所述pH改变剂是葡萄糖氧化酶。
25.如权利要求14至24中任一项所述的方法，其中所述酸可降解纳米颗粒包含修饰的葡聚糖。
26.如权利要求14至25中任一项所述的方法，其中所述酸可降解纳米颗粒还包含表面活性剂。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述表面活性剂是藻酸盐。
28.如权利要求14至27中任一项所述的方法，其中所述微针包含透明质酸。
29.一种用于将免疫治疗剂递送穿过生物屏障的部件试剂盒，其包括：
微针贴片，所述微针贴片包括：
多个微针，每个微针具有基端和尖端；
基板，所述微针的所述基端附接或整合到所述基板；以及
酸可降解纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包封免疫治疗剂和pH改变剂。
30.如权利要求29所述的试剂盒，其中所述免疫治疗剂选自抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗CTLA4抗体或其组合。
31.如权利要求30所述的试剂盒，其中所述免疫治疗剂是抗PD1抗体。
32.如权利要求31所述的试剂盒，其中所述抗PD1抗体是纳武单抗。
33.如权利要求31所述的试剂盒，其中所述抗PD1抗体是派姆单抗。
34.如权利要求30所述的试剂盒，其中所述免疫治疗剂是抗CTLA4抗体。
35.如权利要求34所述的试剂盒，其中所述抗CTLA4抗体是伊匹单抗。
36.如权利要求30所述的试剂盒，其中所述免疫治疗剂是与抗CTLA4抗体组合的抗PD1抗体。
37.如权利要求29至36中任一项所述的试剂盒，其中所述pH改变剂是葡萄糖氧化酶。
38.如权利要求29至37中任一项所述的试剂盒，其中所述酸可降解纳米颗粒包含修饰的葡聚糖。
39.如权利要求29至38中任一项所述的试剂盒，其中所述酸可降解纳米颗粒还包含表面活性剂。
40.如权利要求39所述的试剂盒，其中所述表面活性剂是藻酸盐。
41.如权利要求29至40中任一项所述的试剂盒，其中所述微针包含透明质酸。
通过微针贴片辅助的递送增强癌症免疫疗法
[0001] 相关申请的交叉引用
技术领域
背景技术
[0004] 皮肤癌是在人类中，尤其是在白种人中最常见的恶性肿瘤。当前的估计表明五分之一的美国人将在其生命中患上皮肤癌( M.等人Cancer Lett.2015,357,(1),8-42；Rogers,H.W.；Weinstock,M.等人Arch.Dermatol.2010,146,(3),283-287)。对于皮肤癌治疗，已在过去的若干年中深入研究了免疫疗法(Chinembiri,T.N.等人Molecules2014,
19,(8),11679-11721；Pardoll,D.M.Nat.Rev.Cancer 2012,12,(4),252-264)。在这些研究中，阻断程序性死亡-1(PD-1)途径的检查点抑制剂显示出强大的临床功效(Pardoll,
D.M.Nat.Rev.Cancer 2012,12,(4),252-264；Gubin,M.M.等人Nature 2014,515,(7528),
577-581；Tumeh,P.C.等人Nature 2014,515,(7528),568-571)。在T细胞上表达的PD-1受体通过触发T细胞受体(TCR)下游的抑制性信号传导并阻止T淋巴细胞的活化而在免疫系统的下调中发挥关键作用(Pardoll,D.M.Nat.Rev.Cancer 2012,12,(4),252-264；Chinai,J.M.等人Trends Pharmacol.Sci.2015,36,(9),587-595；Gubin,M.M.等人Nature2014,515,
(7528),577-581)。靶向抑制性受体的抗PD-1抗体在晚期黑素瘤的II期和III期临床试验中已显示突出的抗肿瘤活性(Kyi,C.；Postow,M.A.FEBS Letters 2014,588,(2),368-376；
Sullivan,R.J.；Flaherty,K.T.Nat.Rev.Clin.Oncol.2015,12,(11),625-626；Topalian,S.L.等人N.Engl.J.Med.2012,366,(26),2443-2454)。
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Sullivan,R.J.；Flaherty,K.T.Nat.Rev.Clin.Oncol.2015,12,(11),625-626；Topalian,S.L.等人N.Engl.J.Med.2012,366,(26),2443-2454)。
[0005] 尽管用于治疗黑素瘤的抗PD-1抗体具有令人兴奋的临床结果，但是所述方法的功效仍有待改进。虽然与化疗相比远远更高，但是长期的持久应答速率和总体应答速率具有增加的潜力(Topalian,S.L.等人J.Clin.Oncol.2014,32,(10),1020-1030)。由于需要的抑制剂的量，治疗成本也是无法支撑地高的。此外，已观察到副作用，诸如剂量依赖性自身免疫病症(Topalian,S.L.等人N.Engl.J.Med.2012,366,(26),2443-2454；Chapman,A.P.Adv.Drug Deliv.Rev.2002,54,(4),531-545；Mitragotri,S.；Burke,P.A.；Langer,R.Nat.Rev.Drug Discovery2014,13,(9),655-72)。因此，需要用于改善免疫治疗剂的递送和功效的新装置和方法。
发明内容
发明内容
[0006] 本文公开一种用于以生理学可控的方式进行免疫治疗剂(例如，aPD1(抗PD1抗体))的持续递送的创新型可自降解微针(MN)贴片。
[0007] 本文公开一种用于将材料转运穿过受试者的生物屏障的装置，其包括：
[0008] i)多个微针，每个微针具有基端和尖端；
[0009] ii)基板，所述微针的基端附接或整合到所述基板；以及
[0010] iii)酸可降解纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包封免疫治疗剂和pH改变剂。
[0011] 本文还公开一种用于治疗有需要的受试者的疾病的方法，其包括：
[0012] a)向受试者提供微针贴片，其中所述微针贴片包括：
[0013] 多个微针，每个微针具有基端和尖端；
[0014] 基板，所述微针的基端附接或整合到所述基板；
[0015] 酸可降解纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包封免疫治疗剂和pH改变剂；
[0016] b)将所述微针插入到生物屏障中，其中所述pH改变剂降低所述酸可降解纳米颗粒内的pH，并且其中所述pH的降低使所述纳米颗粒降解并且以受控释放的方式将所述免疫治疗剂释放到所述受试者中。
[0017] 在一些实施方案中，所述疾病是癌症。在一些实施方案中，所述癌症是实体肿瘤。在一个实施方案中，所述癌症是黑素瘤。
[0019] a)微针贴片，所述微针贴片包括：
[0020] 多个微针，每个微针具有基端和尖端；
[0021] 基板，所述微针的基端附接或整合到所述基板；以及
[0022] b)酸可降解纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包封免疫治疗剂和pH改变剂。
[0023] 在一个实施方案中，所述酸可降解纳米颗粒包含修饰的葡聚糖。在一个实施方案中，所述酸可降解纳米颗粒包括pH敏感的葡聚糖纳米颗粒。在一个实施方案中，所述pH改变剂是葡萄糖氧化酶。在一个实施方案中，所述pH改变剂是与过氧化氢酶的组合的葡萄糖氧化酶。
[0024] 在一个实施方案中，所述纳米颗粒还包含表面活性剂。在一个实施方案中，所述表面活性剂是藻酸盐。
[0025] 在一个实施方案中，所述微针包含透明质酸。
[0026] 在一个实施方案中，所述微针包含与pH敏感的葡聚糖纳米颗粒(NP)整合的生物相容性透明质酸，所述pH敏感的葡聚糖纳米颗粒包封免疫治疗剂(例如，aPD1)和葡萄糖氧化酶(GOx)，所述葡萄糖氧化酶将血糖转化为葡糖酸。在此实施方案中，酸性环境的生成促进NP的自解离并且随后引起免疫治疗剂(例如，aPD1)的实质性释放。发明人已认识到，在相同剂量的情况下，与没有游离aPD1的降解触发物或用肿瘤内注射的MN相比，微针(MN)贴片的甚至单一施用在B16F10小鼠黑素瘤模型中诱导稳健的免疫应答。此外，此施用策略可与其他免疫调节剂(诸如抗CTLA-4)整合，以实现用于增强抗肿瘤功效的联合疗法。
[0027] 本文还公开一种用于将材料转运穿过受试者的生物屏障的装置，其包括：
[0028] i)多个微针，每个微针具有基端和尖端；
[0029] ii)基板，所述微针的基端附接或整合到所述基板；以及
[0032] 图1A至图1B示出用于皮肤癌治疗的aPD1的微针(MN)贴片辅助的递送的示意图。(a)通过负载有生理学上自解离的纳米颗粒(NP)的MN贴片递送的aPD1的示意图。在通过双乳液方法固定在NP内的GOx/CAT酶促系统的情况下，血糖向葡糖酸的酶介导的转化促进NP的持续解离，从而随后导致aPD1的释放。(b)通过aPD1阻断PD-1以激活免疫系统来破坏皮肤癌细胞。
[0033] 图2A至图2F示出负载aPD1的微针的表征。(a)NP的SEM图像(比例尺：1000nm)。(b)通过DLS确定的平均流体动力学大小。(c)MN贴片的SEM图像(比例尺：200μm)。(d)MN顶点的更高放大率的SEM成像确认MN负载有NP(比例尺：5μm)。(e)含有FITC抗体负载的NP的代表性MN贴片的荧光成像(比例尺：200μm)。(f)MN的机械特性。所需MN的失效力定量地测量为0.38N/针。
[0034] 图3A至图3E示出纳米颗粒(NP)负载微针(MN)贴片的体外研究。(a)在37℃下在PBS(左)或100mg/dL(右)葡萄糖溶液中孵育的自解离NP的随时间的图片。(b)在100mg/dL葡萄糖溶液中孵育三天之前(左)和之后(右)的NP形态变化的SEM图像。(比例尺：100nm)(c)在37℃下在100mg/dL葡萄糖溶液中孵育的MN的随时间的相关pH变化。在溶液中孵育时，MN在前10分钟内溶胀之后达到平衡。(d)在A400nm处在96孔板中的NP悬浮液的UV吸光度。(e)从在37℃下在100mg/dL葡萄糖溶液中孵育的MN贴片随时间释放的体外积累的aPD1。误差棒基于样品的标准偏差(SD)(n＝3)。
[0035] 图4A至图4G示出通过微针(MN)递送的aPD1的体内抗皮肤癌治疗。(a)用MN贴片经皮处理小鼠背部和相关皮肤(红色短划线内的区域)(左)，其中台盼蓝染色的图像示出MN贴片到小鼠皮肤中的穿透(右)。(比例尺：1mm)(b)被一个MN穿透的横截面小鼠皮肤区域的H&E染色部分。(比例尺：200μm)(c)被FITC抗体负载MN穿透的小鼠皮肤的合并的荧光和明视场图像。(绿色：aPD1)(比例尺：200μm)(d)指示的不同组的B16F10肿瘤的体内生物发光成像(1，未处理；2，MN-GOx；3，游离aPD1；4，MN-aPD1；5，MN-GOx-aPD1)。误差棒基于三只小鼠的标准偏差(SD)。(e)根据d的定量肿瘤信号。(f)针对处理和对照小鼠的Kaplan Meier存活率曲线。示出8只小鼠/处理组。(g)在不同时间点用MN-GOx-aPD1或游离aPD1处理的肿瘤的免疫荧光染色(绿色：aPD1，蓝色：核)(比例尺：100μm)。使用Tukey事后测试通过双向ANOVA计算统计学显著性。使用对数秩检验进行存活率曲线的比较。P值：*，P<0.05。
[0036] 图5A至图5C示出在通过微针(MN)递送的aPD1的处理之后T细胞浸润到肿瘤中的表征。(a)肿瘤的免疫荧光示出CD4+T细胞和CD8+T细胞浸润(比例尺：100μm)。(b)通过流式细胞术分析的处理肿瘤中T细胞的代表性曲线。(对CD3+T细胞进行门控)。(c)根据b的肿瘤浸润性CD8+T细胞的比例。误差棒基于三只小鼠的SD。使用Tukey事后测试通过双向ANOVA计算统计学显著性。P值：*，P<0.05。
[0037] 图6示出修饰的葡聚糖(m-葡聚糖)的合成和降解。
[0038] 图7示出修饰的葡聚糖的核磁共振(NMR)。
[0039] 图8示出在aPD1与葡聚糖的不同重量比下aPD1的负载容量。
[0040] 图9示出微针(MN)贴片的照片。(比例尺：5mm)
[0041] 图10示出m-HA的合成步骤。
[0042] 图11示出在MBA与HA之间的不同比率下微针(MN)的机械特性。
[0043] 图12A至图12B显示罗丹明-HA和FITC-NP并入到微针中。(a)负载有FITC-抗体负载NP的罗丹明标记的HA微针的代表性共焦图像；比例尺100μm。(b)并入到微针中的罗丹明-HA和FITC-NP的量化。使用沿微针的长度采集的共焦z-stack中的总荧光强度的ImageJ测量执行分析，所述总荧光强度归一化到在制造工艺期间通过5次沉积获得的总强度(所示的结果从n＝15个个体微针/条件进行平均)。
[0044] 图13A至图13B示出在100mg/dL葡萄糖溶液中孵育三天之前(a)和之后(b)的纳米颗粒(NP)形态变化的TEM图像。(比例尺：200μm)
[0045] 图14示出在37℃下在100mg/dL葡萄糖溶液中孵育期间纳米颗粒(NP)的随时间的通过动态光散射确定的平均流体动力学粒度变化。
[0046] 图15示出在37℃下在100mg/dL葡萄糖溶液中孵育的MN的随时间的相关pH变化。变化指示在制备期间NP的不同的酶含量。在溶液中孵育时，MN在前10分钟内溶胀之后达到平衡。
[0047] 图16示出从在37℃下在葡萄糖溶液中孵育3天的MN释放的aPD1。
[0048] 图17示出在微针(MN)中包封之后aPD1的生物活性。
[0049] 图18示出与B16F10细胞一起孵育24h之后空纳米颗粒(NP)的细胞毒性研究。误差棒指示SD(n＝6)。
[0050] 图19示出施用MN贴片(左)的H&E染色皮肤部分和施用2天之后的周围组织(右)。(比例尺：200μm)
[0051] 图20示出在5min、10min和30min处的皮肤穿孔标记。
[0052] 图21A至图21C示出aPD1对于B16F10肿瘤的影响。(a)指示的不同组的B16F10肿瘤的体内生物发光成像(1，未处理；2，aPD1静脉内注射；3，负载有aPD1的NP的肿瘤内注射；4，MN-GOx-aPD1)。误差棒基于标准偏差(SD)(n＝3)。(b)根据a的定量肿瘤信号。(c)针对处理和对照小鼠组的Kaplan Meier存活率曲线(n＝7或8)。(P值：*，P<0.05)
[0053] 图22A至图22B示出aPD1和aCTLA4处理对于肿瘤生长的影响。(a)在各种指示的处理之后不同组的小鼠的肿瘤生长曲线(7-8只小鼠/组)。误差棒基于SEM。(b)在各种指示的处理之后60天时小鼠的存活率曲线。使用Tukey事后测试通过双向ANOVA计算统计学显著
性。(P值：*，P<0.05)。
性。(P值：*，P<0.05)。
具体实施方式
[0054] 本文公开用于使用针对免疫治疗剂(例如，aPD1抗体)的持续释放的可自降解微针(MN)进行免疫治疗剂的持续递送的装置和方法。在一个实施方案中，所述微针包含与pH敏感的葡聚糖纳米颗粒(NP)整合的生物相容性透明质酸，所述pH敏感的葡聚糖纳米颗粒包封免疫治疗剂和pH改变剂。通过pH改变剂生成酸性环境促进NP的自解离并且随后引起免疫治疗剂的持续释放。发明人已发现，在相同剂量的免疫治疗剂的情况下，与没有游离aPD1的降解触发物(例如，pH改变剂诸如葡萄糖氧化酶)或使用游离aPD1的肿瘤内注射的微针相比，微针贴片的甚至单一施用诱导稳健的免疫应答。此外，aPD1与其他免疫调节剂(诸如抗CTLA-4)一起施用引起协同抗肿瘤功效。
[0055] 现将详细参考本发明的实施方案，其实例在附图和实施例中示出。然而，本发明可以许多不同形式加以实施，并且不应视为只局限于本文所阐述的实施方案。
[0056] 除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语都具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。提供以下定义以用于完全理解本说明书中使用的术语。
[0057] 术语
[0058] 贯穿本申请使用的术语应被解释为具有对于本领域普通技术人员而言普通的和典型的含义。然而，申请人希望以下术语被给予如下定义的特定定义。
[0060] 如本文所用，术语“可”、“任选地”和“可任选地”可互换使用，并且意味着包括条件发生的情况以及条件不发生的情况。因此，例如，制剂“可包含赋形剂”的声明意味着包括制剂包含赋形剂的情况以及制剂不包含赋形剂的情况。
[0061] 如本领域普通技术人员所理解的，术语“约”和“大约”被定义为“接近于”。在一个非限制性实施方案中，所述术语被定义为在10％以内。在另一个非限制性实施方案中，所述术语被定义为在5％以内。在又另一个非限制性实施方案中，所述术语被定义为在1％以内。
[0063] 术语“施用”指代口服、局部、静脉内、皮下、经皮、透皮、肌肉内、关节内、肠胃外、小动脉内、皮内、脑室内、颅内、腹膜内、病灶内、鼻内、直肠、阴道、通过吸入或通过植入储器进行的施用。可使用透皮微针阵列贴片执行施用。术语“胃肠外”包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内以及颅内注射或输注技术。
[0064] “生物相容的”通常指代材料及其任何代谢物或降解产物，其通常对接受者无毒并且不对受试者造成任何显著的不良作用。
[0065] “组合物”旨在包括活性剂与另一惰性(例如，可检测的试剂或标记)或活性(诸如助剂)化合物或组合物的组合。
[0066] 如本文所用，术语“包含”旨在意味着组合物和方法包括所述要素，但不排除其他要素。“基本上由…组成”在用于定义组合物和方法时将意味着排除对于组合具有任何重要意义的其他要素。因此，基本由本文定义的要素组成的组合物将不排除来自分离和纯化方法的痕量杂质和药学上可接受的载体，诸如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等等。“由…组成”意味着排除对于施用本发明的组合物的其他超过微量成分的元素和实质性的方法步骤。由这些过渡术语的各者定义的实施方案在本发明的范围内。
[0067] “对照”是用于比较目的的实验中使用的可替代受试者或样品。对照可以是“阳性”或“阴性”。
[0068] 如本文所用，“缀合的”指代不可逆的结合相互作用。
[0069] 如本文所用，“置换”指代通过比所置换的肽、化学物或核酸具有对于蛋白质结构域的亲和力的化学物、肽或核酸来干扰例如此特定蛋白质结构域与肽、蛋白质结构域与化学物、蛋白质结构域与核酸序列之间的分子或化学相互作用。
[0070] 如本文所用的“接头”指代联接相邻分子的分子。通常，接头除了联接相邻分子或保持其间一定程度的最小距离或其他空间关系外，不具有特定生物活性。在一些情况下，可选择接头以影响或稳定相邻分子的某种特性，诸如分子的折叠、净电荷或疏水性。
[0071] 术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”可互换使用来指代包含两个或更多个氨基酸的天然或合成分子，所述两个或更多个氨基酸通过一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的α氨基连接。
[0072] 术语“载体”或“药学上可接受的载体”意指可用于制备通常安全且无毒的药物或治疗组合物的载体或赋形剂，并且包括对于兽医和/或人类药物或治疗用途可接受的载体。如本文使用的，术语“载体”或“药学上可接受的载体”涵盖可包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(诸如水包油或油包水乳液)和/或各种类型的润湿剂。如本文所用，术语“载体”涵盖任何赋形剂、稀释剂、填料、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂、脂质、稳定剂或本领域熟知的用于药物配制及如下另外描述的其他材料。
[0073] 如本文所用，术语“聚合物”指代天然或合成的相对高分子量有机化合物，它的结构可由重复的小单元、即单体表示(例如，聚乙烯、橡胶、纤维素)。合成的聚合物通常通过单体的加聚或缩聚来形成。如本文所用，术语“共聚物”指代由两种或更多种不同的重复单元(单体残基)形成的聚合物。以举例的方式但在不受限制的情况下，共聚物可以是交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物或接枝共聚物。还设想，在某些方面，嵌段共聚物的各种嵌段链段本身可包括共聚物。
[0074] 在本文中，范围可表达为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表达这类范围时，另一个实施方案包括从所述一个特定值和/或至所述另一个特定值。类似地，在通过使用先行词“约”将值表达为近似值时，应理解特定值形成另一个实施方案。应进一步理解，每个范围的端点既与另一端点显著相关，又独立于另一端点。还应理解，本文公开了多个值，并且本文中每个值除所述值本身之外还公开为“约”所述特定值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。
[0075] 术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指代在广义的时间段内将引发由研究者、兽医、医师或其他临床医生所研究的组织、系统、动物或人类的生物学或医学应答的组合物(诸如免疫治疗剂)的量。在一些情况下，所需的生物学或医学应答在数天、数周或数年的时间段内向受试者施用多个剂量的组合物后实现。
[0076] 如本文所用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”以及其语法变化包括部分或完全延迟、减缓、减轻病症或病状的一种或多种伴随性症状或减小其强度和/或减缓、减轻或阻碍病症或病状的一种或多种原因。根据本发明的的治疗可预防地、防止地、姑息地或矫正地应用。预防性治疗在发病之前(例如，在明显的癌症现象之前)、在早期发病期间(例如，在初始癌症现象和症状时)或在建立的癌症发展之后向受试者施用。预防性施用可在显现感染症状之前发生若干天至若干年。
[0077] 如本文所用，当提及多肽(包括抗体)或受体时，术语“特异性地结合”指代确定蛋白质和其他生物制品的异质群体中存在蛋白质或多肽或受体的结合反应。因此，在指定条件(例如，在抗体的情况下的免疫测定条件)下，当指定的配体或抗体不以显著量结合到存在于样品中的其他蛋白质或者配体或不易显著量结合到配体或抗体在生物体中可接触的其他蛋白质时，所述配体或抗体“特异性地结合”到其特定“靶标”(例如，抗体特异性地结合到内皮抗原)。通常，“特异性地结合”第二分子的第一分子与此第二分子具有大于约105M–1(例如，106M–1、107M–1、108M–1、109M–1、1010M–1、1011M–1以及1012M–1或更大)的亲和力常数(Ka)。
[0078] 术语“免疫检查点抑制剂”或“免疫治疗剂”指代完全地或部分地减少、抑制、干扰或调控一种或多种检查点蛋白的分子。检查点蛋白调节T细胞活化或功能。多种检查点蛋白是已知的，诸如CTLA-4及其配体CD 80和CD86；以及PD1与其配体PDL1和PDL2(Pardoll,Nature Reviews Cancer 12:252-264，2012)。这些蛋白质负责T细胞应答的共刺激或抑制性相互作用。免疫检查点蛋白调节并维持自身耐受性以及生理免疫应答的持续时间和幅
度。免疫检查点抑制剂包括抗体或衍生自抗体。
度。免疫检查点抑制剂包括抗体或衍生自抗体。
[0079] 术语治疗剂的“有效量”意指有益剂的提供所需作用的无毒但足够的量。“有效”的有益剂的量将因受试者而异，这取决于受试者的年龄和总体状况、具体的一种或多种有益剂等。因此，并不总是能够指定确切的“有效量”。然而，本领域普通技术人员可使用常规实验确定在任何受试者情况下的适当“有效”量。另外，如本文所用，并且除非另外特别说明，有益的“有效量”也可指代覆盖治疗有效量和预防有效量两者的量。
[0080] 实现治疗效果所必需的药物的“有效量”可根据诸如受试者的年龄、性别和体重等因素而变化。可调整剂量方案以提供最佳的治疗性应答。例如，可每日施用若干分次剂量或可如治疗情况的紧急程度所指示地按比例减少所述剂量。
[0081] 如本文所用，治疗剂的“治疗有效量”指代有效于实现所需的治疗结果的量，并且治疗剂的“预防有效量”指代有效于预防不想要的生理病状的量。给定治疗剂的治疗有效量和预防有效量通常关于诸如以下的因素而变化：正在治疗的病症或疾病的类型和严重性以及受试者的年龄、性别和体重。
[0082] 术语“治疗有效量”还可指代有效于促进所需的治疗效果的治疗剂的量或治疗剂的递送速率(例如，随时间推移的量)。精确的所需治疗效果将根据以下变化：待治疗的病状、受试者的耐受性、待施用的药物和/或药物制剂(例如，治疗剂(药物)的效力、制剂中的药物的浓度等)、以及本领域普通技术人员了解的各种其他因素。
[0083] 如本文所用，术语“药学上可接受的”组分可指代不是生物学上或其他方面不希望的组分，即，所述组分可并入到本发明的药物制剂中并如本文所述施用给受试者而不导致任何显著的不希望的生物作用或以有害方式与制剂中所含有的任何其他组分相互作用。当术语“药学上可接受的”用于指代赋形剂时，它通常表示所述组分符合毒理学和生产测试所要求的标准或包括在由美国食品和药品管理局制定的非活性成分指南中。
[0084] 另外，如本文所用，如在“药理学上活性的”衍生物或类似物中的术语“药理学上活性的”(或简单地“活性的”)可指代具有与母体化合物相同类型并且在程度上大约相等的药理学活性的衍生物或类似物(例如，盐、酯、酰胺、缀合物、代谢物、异构体、片段等)。
[0085] 如本文所用，术语“混合物”可包括：溶液，其中混合物的组分是可完全混溶的；以及悬浮液和乳液，其中混合物的组分不是可完全混溶的。
[0086] 如本文所用，术语“受试者”可指代活生物体，诸如哺乳动物，包括但不限于人类、牲畜、狗、猫和其他哺乳动物。治疗剂的施用可在有效治疗受试者的剂量下和时间段内进行。在一些实施方案中，受试者是人类。
[0087] 如本文所用，术语“受控释放”或“受控释放药物递送”或“持续释放”指代以受控方式施用来自给定剂型的药物以便实现所需的体内药代动力学特征。“受控”药物递送的一个方面是操纵制剂和/或剂型以便建立所需的药物释放动力学的能力。
[0088] 如本文所用，短语“并行施用”、“组合施用”、“同时施用(simultaneous administration)”或“同时施用(administered simultaneously)”意指化合物在同一时间点施用或彼此紧密相继施用。在后一种情况下，两种化合物的施用时间足够接近以使得所观察到的结果与在同一时间点施用化合物时所达到的结果没有区别。
[0089] 微针装置(贴片)
[0090] 本文公开一种用于以生理学可控的方式进行免疫治疗剂(例如，aPD1)的持续递送的创新型可自降解微针(MN)贴片。
[0091] 本文公开一种用于将材料转运穿过受试者的生物屏障的装置，其包括：
[0092] 多个微针，每个微针具有基端和尖端；
[0093] 基板，所述微针的基端附接或整合到所述基板；以及
[0094] 酸可降解纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包封免疫治疗剂和pH改变剂。
[0095] 另外，本文公开一种用于将免疫治疗剂递送穿过生物屏障的部件试剂盒，其包括：
[0096] 微针贴片，所述微针贴片包括：
[0097] 多个微针，每个微针具有基端和尖端；
[0098] 基板，所述微针的基端附接或整合到所述基板；以及
[0099] 酸可降解纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包封免疫治疗剂和pH改变剂。
[0100] 在一个实施方案中，所述微针包含透明质酸。在一个实施方案中，所述微针包含与pH敏感的葡聚糖纳米颗粒(NP)整合的生物相容性透明质酸，所述pH敏感的葡聚糖纳米颗粒包封aPD1和葡萄糖氧化酶(GOx)，所述葡萄糖氧化酶将血糖转化为葡糖酸。在此实施方案中，酸性环境的生成促进NP的自解离并且随后引起aPD1的实质性释放。发明人已认识到，在相同剂量的情况下，与没有游离aPD1的降解触发物或用肿瘤内注射的MN相比，MN贴片的甚至单一施用在B16F10小鼠黑素瘤模型中诱导稳健的免疫应答。此外，此施用策略可与其他免疫调节剂(诸如抗CTLA-4)整合，以实现用于增强抗肿瘤功效的联合疗法。
[0101] 除免疫治疗剂之外，待递送给接受者的药剂也可以是治疗剂、预防剂或诊断剂。例如，药剂可选自由以下组成的组：肽、蛋白质、碳水化合物、核酸分子、脂质、有机分子、生物活性的无机分子以及其组合。例如，可配制宽范围的药物以用于用本发明的微针装置和方法递送。如本文所用，术语“药物”或“药物制剂”广泛地用于指代预防剂、治疗剂或诊断剂或可适于引入到生物组织的其他物质，包括药物赋形剂和用于纹身、化妆品等的物质。药物可以是具有生物活性的物质。药物制剂可包括各种形式，诸如液体溶液、凝胶、固体颗粒(例如，微粒、纳米颗粒)或其组合。药物可包括小分子、大(即，大(macro))分子或其组合。在代表性而非非限制性的实施方案中，药物可选自免疫佐剂(例如，单磷酰基脂质A(MPLA)、铝盐(明矾)、CpG寡脱氧核苷酸(ODN))、氨基酸、疫苗、抗病毒剂、基因递送载体、白细胞介素抑制剂、免疫调节剂、神经营养因子、神经保护剂、抗肿瘤剂、化学治疗剂、多糖、抗凝血剂、抗生素、镇痛剂、麻醉剂、抗组胺药、抗炎剂和病毒。药物可选自合适的蛋白质、肽及其片段，其可以是天然存在的、合成的或重组产生的。
[0102] 在另一个实施方案中，本文公开一种用于将材料转运穿过受试者的生物屏障的装置，其包括：
[0103] 多个微针，每个微针具有基端和尖端；
[0104] 基板，所述微针的基端附接或整合到所述基板；以及
[0105] 酸可降解纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包封治疗剂、预防剂或诊断剂和pH改变剂。
[0106] 在一个实施方案中，所述纳米颗粒包封治疗剂和pH改变剂。在一个实施方案中，所述纳米颗粒包封预防剂和pH改变剂。在一个实施方案中，所述纳米颗粒包封诊断剂和pH改变剂。
[0107] 药物制剂还可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂，包括本领域已知的pH调节剂、粘度调节剂、稀释剂等。
[0108] 在一个实施方案中，所述微针包含透明质酸。除透明质酸之外，所述微针还可包含各种材料，包括金属、陶瓷、半导体、有机物、聚合物、复合物或其组合。典型的结构材料包括药物级不锈钢、金、钛、镍、铁、锡、铬、铜、钯、铂、这些或其他金属的合金、硅、二氧化硅和聚合物。代表性的可生物降解的聚合物包括羟基酸的聚合物，诸如乳酸和乙醇酸聚丙交酯、聚乙交酯、聚丙交酯-共-乙交酯、以及与PEG、聚酐、聚(原酸酯)酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)和聚(丙交酯-共-己内酯)的共聚物。
[0109] 微针应具有在插入到生物屏障中时、在保持在适当位置中多至数天并且在被去除时仍保持完整的机械强度。在一些实施方案中，微针必须保持完整至少足够长以使微针服务于其预期目的(例如，免疫治疗剂的递送)。
[0110] 微针可具有直的或锥形的轴。在一个实施方案中，微针的直径在微针的基端处最大，并且在基部远端的端部逐渐变细至点。微针还可制造成具有包括直的(非锥形)部分和锥形部分两者的轴。针也可根本不具有锥形端部，即它们可简单地是具有钝头或扁平尖端的圆柱体。
[0112] 微针可以形成有在垂直方向上具有圆形横截面的轴，或者横截面可以是非圆形的。例如，微针的横截面可以是多边形(例如，星形、正方形、三角形)、椭圆形或其他形状。横截面尺寸可在约1μm与1000μm之间，使得基部可以是约100-500μm，并且尖端可在1与20μm之间。在一个实施方案中，微针在基部处可以是大约300μm，并且在尖端处是大约5μm。
[0113] 微针的长度通常在约10μm与1mm之间，优选地在400μm与1mm之间。在一个实施方案中，微针的长度(或高度)是约600μm。考虑插入和未插入部分两者，针对特定应用选择长度。微针阵列可包括具有例如各种长度、外径、内径、横截面形状以及微针之间的间隔的微针的混合物。在一个实施方案中，微针以15×15阵列布置，具有600μm的尖端到尖端间隔。
[0114] 在一个实施方案中，所述酸可降解纳米颗粒包含修饰的葡聚糖。在一个实施方案中，所述酸可降解纳米颗粒包含乙缩醛修饰的葡聚糖。在一个实施方案中，修饰的葡聚糖的合成在图6中示出。
[0115] 在一个实施方案中，所述纳米颗粒还包含表面活性剂。在一个实施方案中，所述表面活性剂是藻酸盐。
[0116] 在一个实施方案中，所述pH改变剂是葡萄糖氧化酶(GOx)。葡萄糖氧化酶将血糖转化为葡糖酸。这导致pH降低。然后此pH降低导致纳米颗粒的降解并导致免疫治疗剂的持续释放。
[0117] 治疗方法
[0118] 本文还公开一种用于治疗有需要的受试者的疾病的方法，其包括：
[0119] 向受试者提供微针贴片，其中所述微针贴片包括：
[0120] 多个微针，每个微针具有基端和尖端；
[0121] 基板，所述微针的基端附接或整合到所述基板；
[0122] 酸可降解纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包封免疫治疗剂和pH改变剂；
[0123] 将所述微针插入到生物屏障中，其中所述pH改变剂降低所述酸可降解纳米颗粒内的pH，并且其中所述pH的降低使所述纳米颗粒降解并且以受控释放的方式将所述免疫治疗剂释放到所述受试者中。
[0124] 本文所述的装置和方法可用于治疗癌症或肿瘤。在一个实施方案中，待治疗的癌症是皮肤癌。在一个实施方案中，所述癌症是黑素瘤。
[0125] 如本文所设想的，所治疗的癌症可以是原发性肿瘤或转移性肿瘤。在一方面，本文所述的方法用于治疗实体肿瘤，除其他之外例如黑素瘤、肺癌(包括肺腺癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、大细胞癌、细支气管肺泡癌、支气管癌、非小细胞癌、小细胞癌、间皮瘤)；乳腺癌(包括导管癌、小叶癌、炎症性乳腺癌、透明细胞癌、粘液癌、浆膜腔乳腺癌)；结直肠癌(结肠癌、直肠癌、结肠直肠腺癌)；肛门癌；胰腺癌(包括胰腺癌、胰岛细胞癌、神经内分泌肿瘤)；前列腺癌；前列腺腺癌；卵巢癌(卵巢上皮癌或表面上皮-间质肿瘤，包括浆液性肿瘤、子宫内膜样肿瘤和粘液性囊腺癌、性索间质肿瘤)；肝胆管癌(包括肝细胞癌、胆管癌、血管瘤)；
食管癌(包括食管腺癌和鳞状细胞癌)；口腔和口咽鳞状细胞癌；涎腺腺样囊性癌；膀胱癌症；膀胱癌；子宫癌(包括子宫内膜腺癌、眼部、子宫乳头状浆液性癌、子宫透明细胞癌、子宫肉瘤、平滑肌肉瘤、混合苗勒氏肿瘤)；神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、成神经管细胞瘤和其他脑肿瘤；肾脏癌(包括肾细胞癌、透明细胞癌、维尔姆斯氏肿瘤(Wilm's tumor))；头颈癌(包括鳞状细胞癌)；胃癌(胃癌、胃腺癌、胃肠间质肿瘤)；睾丸癌；生殖细胞肿瘤；神经内分泌肿瘤；宫颈癌；胃肠道、乳腺及其他器官的类癌；印戒细胞癌；间充质肿瘤包括肉瘤、纤维肉瘤、血管瘤、血管瘤病、血管外皮细胞瘤、假血管瘤性间质增生、成肌纤维胞瘤、纤维瘤病、炎性肌纤维母细胞瘤、脂肪瘤、血管脂肪瘤、颗粒细胞肿瘤、神经纤维瘤、神经鞘瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、皮肤包括黑素瘤、宫颈、视网膜母细胞瘤、头颈癌、胰腺、脑、甲状腺、睾丸、肾、膀胱、软组织、肾上腺、尿道、阴茎癌、粘液肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、恶性纤维组织细胞瘤、淋巴管肉瘤、间皮瘤、鳞状细胞癌；表皮样癌、恶性皮肤附件肿瘤、腺癌、肝细胞癌、肾细胞癌、肾上腺样瘤、肝胆管型肝癌、移行细胞癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎细胞癌、间变性神经胶质瘤；多形性成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、成神经管细胞瘤、恶性脑膜瘤、恶性神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、甲状旁腺腺癌、甲状腺髓样癌、支气管类癌、嗜铬细胞瘤、胰岛细胞癌、恶性类癌、恶性副神经节瘤、黑素瘤、梅克尔细胞肿瘤、叶状囊肉瘤、涎腺癌、胸腺癌、以及阴道癌。
食管癌(包括食管腺癌和鳞状细胞癌)；口腔和口咽鳞状细胞癌；涎腺腺样囊性癌；膀胱癌症；膀胱癌；子宫癌(包括子宫内膜腺癌、眼部、子宫乳头状浆液性癌、子宫透明细胞癌、子宫肉瘤、平滑肌肉瘤、混合苗勒氏肿瘤)；神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、成神经管细胞瘤和其他脑肿瘤；肾脏癌(包括肾细胞癌、透明细胞癌、维尔姆斯氏肿瘤(Wilm's tumor))；头颈癌(包括鳞状细胞癌)；胃癌(胃癌、胃腺癌、胃肠间质肿瘤)；睾丸癌；生殖细胞肿瘤；神经内分泌肿瘤；宫颈癌；胃肠道、乳腺及其他器官的类癌；印戒细胞癌；间充质肿瘤包括肉瘤、纤维肉瘤、血管瘤、血管瘤病、血管外皮细胞瘤、假血管瘤性间质增生、成肌纤维胞瘤、纤维瘤病、炎性肌纤维母细胞瘤、脂肪瘤、血管脂肪瘤、颗粒细胞肿瘤、神经纤维瘤、神经鞘瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、皮肤包括黑素瘤、宫颈、视网膜母细胞瘤、头颈癌、胰腺、脑、甲状腺、睾丸、肾、膀胱、软组织、肾上腺、尿道、阴茎癌、粘液肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、恶性纤维组织细胞瘤、淋巴管肉瘤、间皮瘤、鳞状细胞癌；表皮样癌、恶性皮肤附件肿瘤、腺癌、肝细胞癌、肾细胞癌、肾上腺样瘤、肝胆管型肝癌、移行细胞癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎细胞癌、间变性神经胶质瘤；多形性成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、成神经管细胞瘤、恶性脑膜瘤、恶性神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、甲状旁腺腺癌、甲状腺髓样癌、支气管类癌、嗜铬细胞瘤、胰岛细胞癌、恶性类癌、恶性副神经节瘤、黑素瘤、梅克尔细胞肿瘤、叶状囊肉瘤、涎腺癌、胸腺癌、以及阴道癌。
[0126] 免疫治疗剂(免疫检查点抑制剂)和免疫佐剂
[0127] 存在多种已知抑制免疫检查点蛋白的免疫治疗剂(免疫检查点抑制剂)。已知的免疫检查点蛋白包括CTLA-4、PD1及其配体PD-L1和PD-L2以及另外LAG-3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3、KIR。在本领域中认识到涉及LAG3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3和KIR的途径构成与CTLA-4和PD-1依赖性途径相似的免疫检查点途径(参见例如Pardoll,2012.Nature Rev Cancer 12:252-264)。
[0128] 免疫检查点抑制剂是抑制免疫检查点蛋白的功能的任何化合物。抑制包括功能减少和/或完全阻断。在一个实施方案中，免疫检查点蛋白是人类免疫检查点蛋白。因此，免疫检查点蛋白抑制剂可以是人免疫检查点蛋白的抑制剂。免疫检查点蛋白在本领域中描述(参见例如Pardoll,2012.Nature Rev.Cancer 12:252-264)。
[0129] 优选的免疫检查点蛋白抑制剂是特异性识别免疫检查点蛋白的抗体。多种PD1、PDL-1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、BTLA、B7H3、B7H4、4-1BB(CD137)、TIM3和KIR抑制剂是已知的并且类似于这些已知的免疫检查点蛋白抑制剂，可使用本文公开的装置和方法施用可替代的免疫检查点抑制剂。
[0130] PD-1抑制剂的实例包括但不限于阻断人类PD-1的人源化抗体，诸如派姆单抗(pembrolizumab)(以前为兰利珠单抗(lambrolizumab))或pidilizumab以及完全人类抗体诸如纳武单抗(nivolumab)(先前称为MDX-1106或BMS-936558)。伊匹单抗(ipilimumab)是一种完全人类CTLA-4阻断抗体，目前以Yervoy的名称销售(Bristol-Myers Squibb公司)。
第二种CTLA-4抑制剂是tremelimumab。在一个实施方案中，免疫治疗剂是纳武单抗。
第二种CTLA-4抑制剂是tremelimumab。在一个实施方案中，免疫治疗剂是纳武单抗。
[0131] 此外，免疫检查点抑制剂可包括但不限于阻断PD-L1的人源化或完全人类抗体，诸如MEDI-4736(在WO2011066389A1中公开)、MPDL328OA(在US8217149B2中公开)和MIH1(Affymetrix，可通过eBioscience公司获得(16.5983.82))以及目前正在研究的其他PD-L1抑制剂。对PD-L1的其他抗体包括阿特珠单抗(atezolizumab)和度伐鲁单抗(durvalumab)。
[0132] 在一个实施方案中，施用KIR抑制剂。利丽单抗(Lirilumab)是一种结合到KIR2DL1/2L3的人类单克隆抗体。在一个实施方案中，施用4-1BB(CD137)的抑制剂。乌瑞鲁单抗(Urelumab)靶向CD137的细胞外结构域。
[0133] 在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂优选地选自CTLA-4、PD-1或PD-L1抑制剂，诸如选自以上提及的已知的CTLA-4、PD-1或PD-L1抑制剂(伊匹单抗、tremelimumab、派姆单抗、纳武单抗、pidilizumab、阿特珠单抗、度伐鲁单抗、AMP-244、MEDI-4736、MPDL328OA、MIH1)或其组合。
[0134] 更优选地从PD1和PD-L1抑制剂(诸如以上提及的已知的PD1或PD-L1抑制剂)选择免疫检查点抑制剂，并且最优选地从PD-1抑制剂(诸如以上提及的已知的PD1抑制剂)进行选择。在优选的实施方案中，PD1抑制剂是纳武单抗或派姆单抗或另一种针对抗人类PD1的拮抗剂抗体。
[0135] 在一个实施方案中，免疫治疗剂可与免疫佐剂组合施用。免疫佐剂是在与其他免疫治疗剂结合使用时作用来加速、延长或增强免疫应答的任何物质(例如，单磷酰基脂质A(MPLA)、铝盐(明矾)、含有非甲基化CpG二核苷酸的DNA)(参见Lim,YT.Clin Exp Vaccine Res.2015年1月；4(1):54-58)。
[0136] 实施例
[0137] 以下实施例列出在下文中，以示出根据所公开主题的组合物、装置、方法和结果。这些实施例并不意图包括本文所公开主题的所有方面，而是示出代表性方法和结果。这些实施例并不排除本发明的等效方案和变体，这些对应本领域技术人员而言显而易见。
[0138] 实施例1.通过抗PD1抗体的微针贴片辅助的递送增强癌症免疫疗法
[0139] 材料
[0140] 所有化学品均从商业来源获得并且不需要进一步纯化即使用。透明质酸钠(300kDa的分子量)购自Freda Biochem有限公司(山东，中国)。藻酸盐(Mn＝160kDa)、葡聚糖(Mn＝9-11kDa)、葡萄糖氧化酶(GOx)和牛过氧化氢酶(CAT)购自Sigma-Aldrich公司。2-乙氧基-1-丙烯从Synthonix公司获得。去离子水通过Millipore NanoPure纯化系统制备
(高于18.2MΩ·cm-1的电阻率)。用于合成和分析的所有有机溶剂均从Fisher Scientific公司订购并按原样使用。
(高于18.2MΩ·cm-1的电阻率)。用于合成和分析的所有有机溶剂均从Fisher Scientific公司订购并按原样使用。
[0141] 细胞系
[0142] 小鼠黑素瘤细胞系B16F10购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。针对生物发光体内肿瘤成像，B16F10-luc细胞由UNC的Leaf Huang博士惠赠。将细胞维持在增补有10％胎牛血清(Invitrogen，Carlsbad，CA)、100U/mL青霉素(Invitrogen)和100U/mL链霉素(Invitrogen)的Dulbecco's改良Eagle培养基(Gibco，
Invitrogen)中。从美国典型培养物保藏中心购买RAW264.7鼠巨噬细胞并且维持在增补有
10％胎牛血清(Invitrogen，Carlsbad，CA)、100U/mL青霉素(Invitrogen)和100μg/mL链霉素(Invitrogen)的RPMI 1640培养基(Gibco，Invitrogen)中。
Invitrogen)中。从美国典型培养物保藏中心购买RAW264.7鼠巨噬细胞并且维持在增补有
10％胎牛血清(Invitrogen，Carlsbad，CA)、100U/mL青霉素(Invitrogen)和100μg/mL链霉素(Invitrogen)的RPMI 1640培养基(Gibco，Invitrogen)中。
[0143] 抗体
[0144] 体内使用的aPD1(抗PD1抗体)和aCTLA4(抗CTLA4抗体)购自Biolegend公司。每次注射的剂量是1mg/kg。染色抗体包括用于FACS的CD3、CD4和CD8并且遵循制造商的说明书进行分析。在Calibur FACS仪器(BD)上分析染色细胞，并且使用flowjo软件分析。
[0145] 丙烯酸酯修饰的HA(m-HA)的合成和表征
[0146] m-HA根据文献(Lee,D.-K.等人ACS Nano2015,9,(11),11490-11501)合成。简而言之，在4℃下将1.0g的HA溶解在50mL的DI水中，向其滴加0.8mL的甲基丙烯酸酐(MA)。通过添加5NNaOH将反应溶液调整至pH 8-9并在4℃下搅拌24h。通过在丙酮中沉淀、接着用乙醇洗涤3次来获得所得的聚合物。将产物再溶解在DI水中并且将溶液用DI水透析2天。通过冻干实现m-HA，产率为87.5％。通过在执行标准去卷积算法来分开紧密间隔的峰之后，将在5.74和6.17ppm处的质子峰(甲基丙烯酸酯质子)与在1.99ppm处的峰(HA的N-乙酰基葡糖胺)下的面积的比率进行比较来将修饰程度计算为15％。
[0147] m-HA：1H NMR(D2O,300MHz,δppm):1.85-1.96(m,3H,CH2＝C(CH3)CO),1.99(s,3H,NHCOCH3),5.74(s,1H,CH1H2＝C(CH3)CO),6.17(s,1H,CH1H2＝C(CH3)CO)。
[0148] 侧基式乙缩醛修饰的葡聚糖(m-葡聚糖)的合成和表征
[0149] 简而言之，将1.0g葡聚糖(分子量：9-11kDa)添加到焰火干燥的烧瓶并且用氩气吹扫。添加10mL无水DMSO并搅拌，直至葡聚糖完全溶解为止。将对甲苯磺酸吡啶(PPTS，15.6mg，0.062mmol)加入到溶液，接着添加2-乙氧基丙烯(4.16mL，37mmol)。用氩气吹扫混合物，并且然后密封以防止反应物蒸发。在室温下将反应搅拌30min，并且然后用1mL的三乙胺淬灭。将所得的混合物沉淀并且在碱性水(pH～8)中洗涤三次以防止降解并通过离心
(8000rpm，15min)采集。通过冻干除去残余水。
(8000rpm，15min)采集。通过冻干除去残余水。
[0150] m-葡聚糖：1H NMR(DMSO-d6,300MHz,δppm):1.10(m,OCH2CH3),1.30(m,C(CH3)2),3.40(m,OCH2CH3),3.55-3.85(br,葡聚糖C2-H～C6-H),4.88(br,葡聚糖C1-H)。
[0151] 纳米颗粒的制备
[0152] 通过改进的双乳液(水包油包水)溶剂蒸发/提取方法制备纳米颗粒。简而言之，通过45个循环的超声处理(1s，每个具有45％的占空比)将含有25mg的m-葡聚糖的1mL的有机相(二氯甲烷(DCM))仅与含有0.25mg的抗PD-1抗体和抗CTLA-4抗体的0.5mL的水相或连同1.25mg的酶(4:1的葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶的重量比)一起乳化。此后，立即将初乳液倒入到25mL的藻酸盐水溶液(1％)中并超声处理45个循环。随后将双乳液转移到150mL的藻酸盐水溶液(0.2％)中。将混合的悬浮液在室温下搅拌以通过蒸发去除DCM。在2h之后，通过在
10,000rpm下重复离心程序并且悬浮在蒸馏水中三次来清洁并采集所得的纳米颗粒。用于制备双乳液的m-葡聚糖/抗PD-1抗体/酶的最终重量比被确定为100/1/5。含有异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体的颗粒以与以上相同的方式制备。
10,000rpm下重复离心程序并且悬浮在蒸馏水中三次来清洁并采集所得的纳米颗粒。用于制备双乳液的m-葡聚糖/抗PD-1抗体/酶的最终重量比被确定为100/1/5。含有异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体的颗粒以与以上相同的方式制备。
[0153] 通过小鼠单克隆抗体ELISA测定测量非包封IgG的量并使用空颗粒作为基础校正来确定抗体包封纳米颗粒的负载容量(LC)和包封效率(EE)。LC和EE计算为LC＝(A-B)/C，EE＝(A-B)/A，其中A是抗体的预期包封量，B是采集溶液中的游离抗体量，并且C是颗粒的总重量。通过动态光散射(DLS)测量粒度和多分散性强度。在DI水中适当稀释之后，使用相同的仪器通过它们的电泳迁移率确定NP的ζ电位。在室温下一式三份进行测量。
[0154] 通过扫描电子显微镜法来研究纳米颗粒(NP)形态。将颗粒在0.5mg/mL的浓度下悬浮在去离子水中，并且将所得的分散体滴到硅晶片上并使其在室温下风干过夜。然后将颗粒用金/钯溅射涂覆并成像。通过JEOL 6400F SEM(东京，日本)，在20kV下操作捕获图像。
[0155] 纳米颗粒负载微针的制造和表征
[0156] 此研究中的所有MN均使用来自Blueacre Technology有限公司的六个相同的硅树脂模具来制造，直接通过激光烧蚀进行加工来产生圆柱形孔的阵列。每个微针具有300μm×
300μm的圆形基部，逐渐变细至600μm的高度，其中尖端半径约为约5μm。微针以15×15阵列布置，具有600μm的尖端到尖端间隔。
300μm的圆形基部，逐渐变细至600μm的高度，其中尖端半径约为约5μm。微针以15×15阵列布置，具有600μm的尖端到尖端间隔。
[0157] 在制备纳米颗粒之后，将制备的纳米颗粒在浴式超声波仪中分散在0.6mL蒸馏水中1min。然后，通过移液到每个硅树脂微模具表面上，接着经受真空(600mmHg)条件5min以使NP溶液流动到微针腔中来直接沉积50uL的NP悬浮液(含有2mg的NP)。然后，将微模具转移到在rpm＝2000下的Hettich Universal 32R离心机20min来将NP压缩到微针腔中。重复沉积过程共五次，并且除去在制造期间模具表面上的残余NP来消除任何不想要的结果。为了获得更好的微针形态，在2cm×2cm的微模具底座周围施加一片4cm×9cm的银色粘合带。此
外，将3mL与N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBA，4重量％)和光引发剂(Irgacure 2959，0.05重量％)预混合的m-HA(4重量％)添加到制备的微模具储器。最终装置在25℃下在真空干燥器中经历6-8小时的干燥。在干燥完成之后，将微针阵列小心地与硅树脂模具分离并暴露于UV光(波长：320-450nm)，持续30s。针基部可定制成适配注射器。所得的产物可储存在密封的六孔容器中长达30天。用FITC标记的纳米颗粒和罗丹明B标记的m-HA制造荧光微针。在北卡罗来纳州立大学分析仪器设施的FEI Verios 460L场发射扫描电子显微镜(FESEM)上表征
微针的形态。通过Olympus IX70多参数荧光显微镜拍摄MN的荧光图像。使用Dymax
BlueWave 75UV固化点形灯实施UV交联过程。
外，将3mL与N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBA，4重量％)和光引发剂(Irgacure 2959，0.05重量％)预混合的m-HA(4重量％)添加到制备的微模具储器。最终装置在25℃下在真空干燥器中经历6-8小时的干燥。在干燥完成之后，将微针阵列小心地与硅树脂模具分离并暴露于UV光(波长：320-450nm)，持续30s。针基部可定制成适配注射器。所得的产物可储存在密封的六孔容器中长达30天。用FITC标记的纳米颗粒和罗丹明B标记的m-HA制造荧光微针。在北卡罗来纳州立大学分析仪器设施的FEI Verios 460L场发射扫描电子显微镜(FESEM)上表征
微针的形态。通过Olympus IX70多参数荧光显微镜拍摄MN的荧光图像。使用Dymax
BlueWave 75UV固化点形灯实施UV交联过程。
[0158] 机械强度测试
[0159] MN的机械强度测量在环境和等轴测试条件下在拉伸载荷框架上实施。在应力-应变仪上随着不锈钢板沿y方向压缩微针阵列连续监测拉伸力。初始仪器设置在MN尖端与不锈钢板之间的2.00mm处，测压元件负载量为10.00N。顶部不锈钢板朝向MN阵列贴片移动的速度为0.1mm/s。当针开始弯曲时，记录MN的失效力。
[0160] 皮肤穿透效率测试
[0161] 将MN阵列施加到小鼠背部30min并移除。将小鼠安乐死并且将皮肤样品包埋在OCT化合物(Sakura Finetek公司)中并在干冰上在异戊烷浴中快速冷冻。对冷冻的组织进行切片(10-μm厚度)，安装在显微镜载玻片上并储存在-80℃下。通过Olympus IX70多参数荧光显微镜拍摄插入FITC标记的微针之后的皮肤组织切片的荧光显微照片。在北卡罗来纳州大学兽医学院(NC State College of Veterinary Medicine)的组织学实验室对样品进行苏木精和伊红(H&E)染色。在单独的实验中，用台盼蓝对激发皮肤的部位染色5min，然后进行成像。用干燥薄纸从皮肤表面擦去残留染料之后，通过光学显微镜法(Leica EZ4D立体显微镜)观察皮肤样品。
[0162] 来自MN的体外抗体释放研究
[0163] 通过在轨道式震荡器上在6孔板中在37℃下在2mL PBS缓冲液(NaCl，137mM；KCl，2.7mM；Na2HPO4，10mM；KH2PO4，2mM；pH 7.4)中孵育MN贴片来评估抗体从MN的体外释放。将各种量的葡萄糖添加到每个管以达到最终葡萄糖浓度(0mg/dL，100mg/dL)。在预先确定的时间处，取出25μL样品用于分析，然后向孔添加25μL新鲜释放培养基以维持恒定体积并放回培养箱内。通过pH计(Fisher Scientific公司，AB15)记录样品的pH值，并且然后使用ELISA检查总抗体含量。在UV-Vis分光光度计中在450nm处检测每个孔的吸光度，并且从抗体标准曲线内插得到浓度。
[0164] 细胞毒性研究
[0165] 使用B16F10细胞执行针对MN的细胞毒性研究。将细胞在5,000个细胞/孔的密度下接种到96孔板中，并且在具有10％胎牛生长血清(FBS)、1×青霉素/链霉素、1×L-谷氨酰胺和2.5μL的β巯基乙醇(Biorad，Hercules，CA，USA)/500mL培养基的100μL Dulbecco’s改良Eagle培养基(DMEM，25mM葡萄糖)中培养。然后将板在37℃下在5％CO2中孵育12h以达到70％-80％汇合度，之后添加系列稀释度的与空MN一起孵育的释放培养基。在与MN一起孵育
24h之后，将细胞用PBS溶液洗涤并且与100μL新鲜的不含FBS的DMEM和20μL的新鲜制备的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑溶液(MTT溶液，5mg/mL)一起孵育。将板再孵育4h。4h之后，小心地除去溶液，并且然后添加150μL二甲基亚砜(DMSO)。在10min内使用微板读数器(Infinite M200Pro，Tecan，Morrisville，NC，USA)在590nm处和在620nm的参考波长处读取板的吸光度。
24h之后，将细胞用PBS溶液洗涤并且与100μL新鲜的不含FBS的DMEM和20μL的新鲜制备的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑溶液(MTT溶液，5mg/mL)一起孵育。将板再孵育4h。4h之后，小心地除去溶液，并且然后添加150μL二甲基亚砜(DMSO)。在10min内使用微板读数器(Infinite M200Pro，Tecan，Morrisville，NC，USA)在590nm处和在620nm的参考波长处读取板的吸光度。
[0166] 小鼠和体内肿瘤模型
[0167] 雌性C57B6小鼠购自Jackson Lab(USA)。所有小鼠研究均在由北卡罗来纳州立大学和北卡罗来纳大学教堂山分校的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal
Care and Use Committee)批准的动物方案的背景下执行。将小鼠称重并随机分成不同组。
在第10天之后，将1×106个荧光素酶标记的B16F10肿瘤细胞移植到小鼠的背部中(肿瘤达
到～50-60mm3)，通过肿瘤内/静脉内注射或通过微针将aPD1(1mg/kg)施用到小鼠中。通过
3
B16F10细胞的生物发光信号监测肿瘤生长。还通过数字卡尺测量肿瘤。肿瘤体积(mm)计算为(长直径×短直径2)/2
Care and Use Committee)批准的动物方案的背景下执行。将小鼠称重并随机分成不同组。
在第10天之后，将1×106个荧光素酶标记的B16F10肿瘤细胞移植到小鼠的背部中(肿瘤达
到～50-60mm3)，通过肿瘤内/静脉内注射或通过微针将aPD1(1mg/kg)施用到小鼠中。通过
3
B16F10细胞的生物发光信号监测肿瘤生长。还通过数字卡尺测量肿瘤。肿瘤体积(mm)计算为(长直径×短直径2)/2
[0168] 体内生物发光和成像
[0169] 用Xenogen IVIS光谱成像系统采集生物发光图像。在将在DPBS(15mg/ml)中的d-荧光素(Pierce公司)腹膜内注射到动物(10μL/g体重)中之后10min，使用Living Image软件(Xenogen)获取数据。
[0170] 共焦显微镜法
[0171] 从小鼠切下肿瘤并在最佳切削培养基(O.C.T.)中快速冷冻。使用冷冻切片机切割若干微米切片并安装在载玻片上。将切片在冰冷的丙酮中固定10分钟，然后用PBS再水合。用BSA(3％)阻断之后，将切片用一抗在4℃下染色过夜。使用共聚焦显微镜(Zeiss)分析载玻片。
[0172] ELISA
[0173] 为了测试aPD1的生物活性，在不同时间点从MN贴片提取总aPD1用于ELISA测定。用在PBS中的纯化的小鼠PD1蛋白涂覆Corning Costar 9018ELISA板。将板密封并在4℃下孵育过夜。在洗涤和阻断之后，将aPD1样品在室温下添加到孔中，持续2小时。用洗涤缓冲液洗涤之后，在室温下将HRP缀合的抗大鼠lg(H+L)mAb添加到孔中1小时，接着进行洗涤。添加TMB底物溶液用于检测aPD1的生物活性。
[0174] 统计分析
[0175] 使用GraphPad Prism(5.0)评估统计分析。用配对Student t测试和双向ANOVA计算统计学显著性。0.05或更小的P值被认为是显著的。
[0176] 结果
[0177] 此实施例中公开一种用于针对黑素瘤的aPD1的受控递送的生理学上可自降解的MN贴片辅助的癌症免疫疗法(图1)。在过去的十年期间已在经皮药物递送中广泛探究MN
(Chiappini,C.等人Nat.Mater.2015；Yu,J.等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2015,112,
(27),8260-8265；Sullivan,S.P.等人Adv.Mater.2008,20,(5),933-938；Prausnitz,
M.R.Adv.Drug Deliv.Rev.2004,56,(5),581-587；Lee,D.-K.等人ACS Nano2015,9,(11),
11490-11501)。皮肤是充当免疫监视系统的活性保护屏障。MN可无痛地刺入到富含免疫细胞的表皮中，并且将aPD1递送到区域淋巴结和毛细血管，从而促进其与T细胞的相互作用(Harvey,A.J.等人J.Pharm.Res.2010,28,(1),107-116)。为了增强aPD1在肿瘤微环境中的保持，提供酶介导的持续药物释放，允许与其他治疗剂的容易组合，将MN与pH敏感的葡聚糖NP整合(Lu,Y.等人J.Control Release2014,194,1-19)。每个MN包含与NP整合的生物相容性透明质酸(HA)，所述NP包封aPD1和葡萄糖氧化酶(GOx)。GOx用于在氧气(O2)存在下将血糖转化为葡糖酸。过氧化氢酶(CAT)通过O2的再生来辅助葡萄糖氧化，并且帮助消耗不需要的过氧化氢(H2O2)：
(Chiappini,C.等人Nat.Mater.2015；Yu,J.等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2015,112,
(27),8260-8265；Sullivan,S.P.等人Adv.Mater.2008,20,(5),933-938；Prausnitz,
M.R.Adv.Drug Deliv.Rev.2004,56,(5),581-587；Lee,D.-K.等人ACS Nano2015,9,(11),
11490-11501)。皮肤是充当免疫监视系统的活性保护屏障。MN可无痛地刺入到富含免疫细胞的表皮中，并且将aPD1递送到区域淋巴结和毛细血管，从而促进其与T细胞的相互作用(Harvey,A.J.等人J.Pharm.Res.2010,28,(1),107-116)。为了增强aPD1在肿瘤微环境中的保持，提供酶介导的持续药物释放，允许与其他治疗剂的容易组合，将MN与pH敏感的葡聚糖NP整合(Lu,Y.等人J.Control Release2014,194,1-19)。每个MN包含与NP整合的生物相容性透明质酸(HA)，所述NP包封aPD1和葡萄糖氧化酶(GOx)。GOx用于在氧气(O2)存在下将血糖转化为葡糖酸。过氧化氢酶(CAT)通过O2的再生来辅助葡萄糖氧化，并且帮助消耗不需要的过氧化氢(H2O2)：
[0178]
[0179] 在GOx/CAT酶促系统固定在NP内的情况下，葡糖酸的酶介导的生成促进NP的逐渐自解离并且使得aPD1在三天施用时间段内持续释放(Mura,S.等人Nat.Mater.2013,12,
(11),991-1003；Chen,Q.等人Biomaterials2015,73,214-230)。MN贴片的单一施用在
B16F10小鼠黑素瘤模型中诱导超过在触发物元素(pH改变剂)(GOx)不存在下或用游离aPD1的肿瘤内注射的MN的稳健免疫应答。另外，MN充当用于与其他免疫调节剂组合的疗法以增强免疫疗法效率的平台。这些结果证明MN贴片辅助的系统提供一种通过简单且安全的技术进行的创新型aPD1递送策略，其提高癌症免疫原性并有利于黑素瘤的临床治疗。
(11),991-1003；Chen,Q.等人Biomaterials2015,73,214-230)。MN贴片的单一施用在
B16F10小鼠黑素瘤模型中诱导超过在触发物元素(pH改变剂)(GOx)不存在下或用游离aPD1的肿瘤内注射的MN的稳健免疫应答。另外，MN充当用于与其他免疫调节剂组合的疗法以增强免疫疗法效率的平台。这些结果证明MN贴片辅助的系统提供一种通过简单且安全的技术进行的创新型aPD1递送策略，其提高癌症免疫原性并有利于黑素瘤的临床治疗。
[0180] 自解离的纳米颗粒(NP)包含四种组分：酸可降解的聚合物基质，基于聚电解质的表面活性剂，GOx/CAT酶促系统以及aPD1。天然葡聚糖是完全生物相容的、可生物降解的、广泛可用的且易于修饰，并且被选作NP的基质组分(Naessens ,M .等人J.Ind.Microbiol.Biotechnol.2005,32,(8),323-334)。乙氧基丙烯通过酸催化反应缀合到葡聚糖，这产生衍生的葡聚糖(命名为m-葡聚糖)，其中羟基89％取代为侧基式乙缩醛(图
6、图7)(Bachelder,E.M.等人J.Am.Chem.Soc.2008,130,(32),10494-10495；Gu,Z.等人ACS Nano2013,7,(5),4194-4201)。m-葡聚糖可溶于有机溶剂，并且在双乳液法中在NP形成期间允许aPD1的包封(Gu,Z.等人G.ACS Nano2013,7,(5),4194-4201)。另外并入阴离子多糖藻酸酯作为表面活性剂，以形成带负电荷的表面涂层。如在扫描电子显微镜法(SEM)图像中所描绘(图2A)，所得的NP具有球形形状，具有单分散粒度。通过动态光散射(DLS)确定的平均流体动力学大小是250nm(图2b)。NP具有7.1重量％的抗体负载容量，在4℃下持续三周没有显著的抗体泄漏或明显的形态变化(图8)。
6、图7)(Bachelder,E.M.等人J.Am.Chem.Soc.2008,130,(32),10494-10495；Gu,Z.等人ACS Nano2013,7,(5),4194-4201)。m-葡聚糖可溶于有机溶剂，并且在双乳液法中在NP形成期间允许aPD1的包封(Gu,Z.等人G.ACS Nano2013,7,(5),4194-4201)。另外并入阴离子多糖藻酸酯作为表面活性剂，以形成带负电荷的表面涂层。如在扫描电子显微镜法(SEM)图像中所描绘(图2A)，所得的NP具有球形形状，具有单分散粒度。通过动态光散射(DLS)确定的平均流体动力学大小是250nm(图2b)。NP具有7.1重量％的抗体负载容量，在4℃下持续三周没有显著的抗体泄漏或明显的形态变化(图8)。
[0181] 将纳米颗粒(NP)进一步包埋在基于聚合物的MN中，以用于在易于施用的情况下将包封的aPD1朝向黑素瘤部位递送。在9×9mm2贴片上组装225个MN的阵列，其中中心到中心的间隔为600μm(图9)。每个针具有圆锥形状，在基部处具有300μm的直径，具有600μm的高度并且具有逐渐变细至5μm曲率半径的尖锐尖端(图2C)。选择HA作为聚合物MN的结构材料，这是因为其具有优异的生物相容性、机械特性和定制的交联密度(图2F)。通过在暴露于UV光(365nm，在9mW/cm2的强度下持续30s，一种没有显著的光毒性的良好建立的方案)之后的原位聚合，从交联透明质酸(HA)、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)和光引发剂(Irgacure 2959，0.05重量％)制备MN基质(Yu,J.等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2015,112,(27),8260-
8265；Bryant,S.J.等人J.Biomater.Sci.Polym.Ed.2000,11,(5),439-57)(图10)，这提供温 和的 反 应 条 件以 避免 使 抗 体 变 性 或影 响 其 稳 定 性 (Y e ,Y .等 人
Macromol.Chem.Phys.2015,DOI:10.1002/macp.201500296；DeMuth,P.C.等人
Nat.Mater.2013,12,(4),367-376)。此外，MBA与HA之间较高重量比反映MN的增强的机械特性(图11)。通过多次沉积，NP集中在针的尖端处。在沉积循环增加多至5次的情况下，通过共焦显微镜法测量，观察到负载药物的荧光强度的规则线性增加(图12)。在SEM图像中进一步确认负载NP的分布(图2D)。含有FITC-抗体负载的NP的代表性MN贴片的荧光视图清楚地证明NP主要分布在MN的尖端处(图2E)。所需MN的失效力定量地测量为0.38N/针(图2F)，这提供足够的强度来在没有破裂的情况下促进皮肤插入(Gittard ,S.D .等人
J.Adhes.Sci.Technol.2013,27,(3),227-243)。为了检查aPD1的受控释放特征，将在不存在或存在GOx的情况下的NP两者在含有在人体中血糖量正常的水平(100mg/dL)下的葡萄糖的PBS缓冲液中孵育。根据在400nm处UV吸光度以及孵育溶液的透明性的降低(图3D)，具有GOx的NP在接下来的三天逐渐解离(图3A)(Tao,P.等人ACS Appl.Mater.Interfaces2011,
3,(9),3638-3645)。SEM和TEM图像进一步验证NP的构象变化(图3B，图13)。随着时间推移，包埋有NP的MN的记录的pH值从7.10降至4.28，从而确认葡萄糖酶促转化为葡糖酸(图3C)。
同时，具有GOx的NP的流体动力学大小变化稳定下降(图14)。相比之下，在没有GOx的对照样品中没有观察到明显的解离。还评定aPD1的释放动力学。将含有NP的针的尖端在葡萄糖溶液中孵育80小时。从具有GOx的MN实现持续释放特征，而从没有GOx的样品获得不显着的释放(图3E)。此外，aPD1的释放动力学还可通过改变NP中酶的负载量来定制(图15)。因此，根据黑素瘤的不同阶段，aPD1的治疗效率可进一步通过改变酶的水平来优化。检查正常葡萄糖浓度下的药物释放，并且在血糖量正常范围内的不同葡萄糖水平之间未观察到显著差异(图16)。总体上，这些结果证实aPD1从MN的释放是以葡萄糖介导的且pH依赖性的方式进行的。还测试包封在MN中之后aPD1的生物活性(图17)。据估计，在4℃下储存一个月之后，超过
90％的aPD1仍保持结合PD1抗原的生物活性。
8265；Bryant,S.J.等人J.Biomater.Sci.Polym.Ed.2000,11,(5),439-57)(图10)，这提供温 和的 反 应 条 件以 避免 使 抗 体 变 性 或影 响 其 稳 定 性 (Y e ,Y .等 人
Macromol.Chem.Phys.2015,DOI:10.1002/macp.201500296；DeMuth,P.C.等人
Nat.Mater.2013,12,(4),367-376)。此外，MBA与HA之间较高重量比反映MN的增强的机械特性(图11)。通过多次沉积，NP集中在针的尖端处。在沉积循环增加多至5次的情况下，通过共焦显微镜法测量，观察到负载药物的荧光强度的规则线性增加(图12)。在SEM图像中进一步确认负载NP的分布(图2D)。含有FITC-抗体负载的NP的代表性MN贴片的荧光视图清楚地证明NP主要分布在MN的尖端处(图2E)。所需MN的失效力定量地测量为0.38N/针(图2F)，这提供足够的强度来在没有破裂的情况下促进皮肤插入(Gittard ,S.D .等人
J.Adhes.Sci.Technol.2013,27,(3),227-243)。为了检查aPD1的受控释放特征，将在不存在或存在GOx的情况下的NP两者在含有在人体中血糖量正常的水平(100mg/dL)下的葡萄糖的PBS缓冲液中孵育。根据在400nm处UV吸光度以及孵育溶液的透明性的降低(图3D)，具有GOx的NP在接下来的三天逐渐解离(图3A)(Tao,P.等人ACS Appl.Mater.Interfaces2011,
3,(9),3638-3645)。SEM和TEM图像进一步验证NP的构象变化(图3B，图13)。随着时间推移，包埋有NP的MN的记录的pH值从7.10降至4.28，从而确认葡萄糖酶促转化为葡糖酸(图3C)。
同时，具有GOx的NP的流体动力学大小变化稳定下降(图14)。相比之下，在没有GOx的对照样品中没有观察到明显的解离。还评定aPD1的释放动力学。将含有NP的针的尖端在葡萄糖溶液中孵育80小时。从具有GOx的MN实现持续释放特征，而从没有GOx的样品获得不显着的释放(图3E)。此外，aPD1的释放动力学还可通过改变NP中酶的负载量来定制(图15)。因此，根据黑素瘤的不同阶段，aPD1的治疗效率可进一步通过改变酶的水平来优化。检查正常葡萄糖浓度下的药物释放，并且在血糖量正常范围内的不同葡萄糖水平之间未观察到显著差异(图16)。总体上，这些结果证实aPD1从MN的释放是以葡萄糖介导的且pH依赖性的方式进行的。还测试包封在MN中之后aPD1的生物活性(图17)。据估计，在4℃下储存一个月之后，超过
90％的aPD1仍保持结合PD1抗原的生物活性。
[0182] 获得的MN贴片可有效地穿透小鼠皮肤，如通过台盼蓝染色以及苏木精和伊红染色(H&E)染色证明的(图4A至图4B)。在插入到小鼠皮肤中之后，MN穿透至大约200μm的深度(图4B)。为了评定系统的生物相容性，在0.1至1.0mg/mL范围内的各种浓度下评估纳米颗粒
(NP)及其降解产物对B16F10细胞的细胞毒性。对于研究的所有浓度，基于m-葡聚糖的NP和相关的降解产物未显示出细胞存活率的显著降低(图18)。为了进一步研究贴片的体内生物相容性，发现皮肤在MN注射之后快速恢复，并且与周围组织相比，在施用后2天在所述区域内未观察到显著的炎症(图19至图20)。
(NP)及其降解产物对B16F10细胞的细胞毒性。对于研究的所有浓度，基于m-葡聚糖的NP和相关的降解产物未显示出细胞存活率的显著降低(图18)。为了进一步研究贴片的体内生物相容性，发现皮肤在MN注射之后快速恢复，并且与周围组织相比，在施用后2天在所述区域内未观察到显著的炎症(图19至图20)。
[0183] 为了评估通过MN贴片递送的aPD1的抗皮肤癌效率，将黑素瘤的B16F10小鼠模型用于模拟临床转移性黑素瘤。将B16F10-luc癌细胞皮下植入在雌性C57BL/6小鼠的后背区域3
中。在肿瘤大小达到约50-60mm 之后，通过单一局部施用将MN贴片(具有GOx)、游离aPD1以及负载有aPD1连同或不连同GOx的MN贴片施用到肿瘤部位中(贴片面积大于肿瘤部位)。为了比较各组之间的抗黑素瘤效率，用相对较低剂量的aPD1处理小鼠(一个剂量：1mg/kg)。在接下来的两周中，通过B16F10-luc细胞的生物发光信号容易地观察并测量肿瘤生长(图4D至图4E)。观察到与未处理组相比，对照MN贴片(具有GOx)处理对肿瘤消退具有很少的影响。
虽然用游离aPD1处理的小鼠在最初几天显示出延迟的肿瘤生长，但是之后肿瘤复发显著地发生。由于aPD1的受限释放，在没有GOx负载的MN-抗-PD-1处理的组中对肿瘤消退的影响是有限的。相比之下，接受通过MN贴片(具有GOx)递送aPD1的小鼠显示出显著的持续肿瘤抑制作用，一些肿瘤甚至在治疗之后消失。重要的是，发现40％的小鼠在用aPD1-GOx-MN贴片治疗之后仍然存活40天。形成鲜明对比的是，对照组中没有小鼠存活(图4F)。此明显的抗肿瘤功效可归因于在肿瘤部位中通过MN进行的aPD1的持续释放以及aPD1在肿瘤微环境中的增
强保留。
中。在肿瘤大小达到约50-60mm 之后，通过单一局部施用将MN贴片(具有GOx)、游离aPD1以及负载有aPD1连同或不连同GOx的MN贴片施用到肿瘤部位中(贴片面积大于肿瘤部位)。为了比较各组之间的抗黑素瘤效率，用相对较低剂量的aPD1处理小鼠(一个剂量：1mg/kg)。在接下来的两周中，通过B16F10-luc细胞的生物发光信号容易地观察并测量肿瘤生长(图4D至图4E)。观察到与未处理组相比，对照MN贴片(具有GOx)处理对肿瘤消退具有很少的影响。
虽然用游离aPD1处理的小鼠在最初几天显示出延迟的肿瘤生长，但是之后肿瘤复发显著地发生。由于aPD1的受限释放，在没有GOx负载的MN-抗-PD-1处理的组中对肿瘤消退的影响是有限的。相比之下，接受通过MN贴片(具有GOx)递送aPD1的小鼠显示出显著的持续肿瘤抑制作用，一些肿瘤甚至在治疗之后消失。重要的是，发现40％的小鼠在用aPD1-GOx-MN贴片治疗之后仍然存活40天。形成鲜明对比的是，对照组中没有小鼠存活(图4F)。此明显的抗肿瘤功效可归因于在肿瘤部位中通过MN进行的aPD1的持续释放以及aPD1在肿瘤微环境中的增
强保留。
[0184] 接下来，在不同的时间点处针对免疫染色采集处理的肿瘤。作为对照，当游离aPD1直接在肿瘤内注射时，在施用日期(第0天)在肿瘤部位中发现强抗体信号。然而，信号在接下来的三天内显著减弱，从而指示抗体扩散到其他组织中，而通过MN递送的aPD1可产生在肿瘤部位中发现的抗体的连续观察到的信号。肿瘤微环境中aPD1的存在对于在肿瘤微环境中改变抑制性相对于细胞毒性应答的平衡发挥关键作用(Zou,W.Nat.Rev.Cancer 2005,5,(4),263-274)，从而产生识别并破坏癌细胞的免疫细胞。
[0185] 为了研究在处理之后免疫细胞到肿瘤部位中的浸润，然后收获来自肿瘤的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)并在处理之后10天通过免疫荧光和流式细胞术分析。免疫荧光染色揭示未处理肿瘤具有有限的T细胞浸润(图5A)。相比之下，来自MN-GOx-aPD1处理的小鼠的肿瘤被CD8+T细胞和CD4+T细胞两者明显地浸润。通过MN贴片递送的aPD1之后肿瘤中的CD8+T细胞的百分比是游离aPD1处理组中的百分比的1.5倍并且与在对照MN和未处理组中的百分比相比时是两倍(图5B至图5C)。
[0186] 在另一个步骤中，将MN贴片的抗黑素瘤功效与先前的方法进行比较，包括通过静脉内(i.v.)注射进行aPD1的系统性施用或直接肿瘤内注射负载有aPD1的自解离NP(1mg/kg)。如图21所示，与其他处理相比，用MN-GOx-aPD1处理的小鼠显示出显著的抗肿瘤效率。
在40天内用aPD1-GOx-MN贴片处理之后，约50％的小鼠存活而没有可检测到的肿瘤。系统性施用aPD1或肿瘤内注射自解离的aPD1-NP适度增加平均存活时间，但是没有小鼠在40天内存活。这些结果清楚地指示MN在施用后增强aPD1在肿瘤中的保持，从而产生通过aPD1检查点抑制进行的增强的癌症免疫疗法。
在40天内用aPD1-GOx-MN贴片处理之后，约50％的小鼠存活而没有可检测到的肿瘤。系统性施用aPD1或肿瘤内注射自解离的aPD1-NP适度增加平均存活时间，但是没有小鼠在40天内存活。这些结果清楚地指示MN在施用后增强aPD1在肿瘤中的保持，从而产生通过aPD1检查点抑制进行的增强的癌症免疫疗法。
[0187] 抗CTLA4是另一种促进T细胞活化并使T调节细胞(Treg)丧失能力的检查点抗体(Pardoll,D.M.Nat.Rev.Cancer 2012,12,(4),252-264；Wang,C.等人Adv.Mater.2014,26,(48),8154-8162)。由于在aPD1处理之后在TIL上观察到的CTLA4表达增加(Lussier,D.M.等人J .Immunother .Cancer2015 ,3 ,(1) ,1-11；Curran ,M.A .等人
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2010,107,(9),4275-4280)，针对在一半的抗体剂量下这些疗法的功效的增加，检查通过MN进行的抗CTLA4抗体(aCTLA4)和aPD1共递送的组合。携带
B16F10黑素瘤的小鼠用负载有IgG(1mg/kg，同种型对照)、aCTLA4(1mg/kg)、aPD1(1mg/kg)或共负载有aCTLA4和aPD1(分别0.5mg/kg)的MN-GOx贴片处理。如图22A所示，与单独的
aCTLA4、单独的aPD1或IgG MN处理的小鼠相比，通过MN共递送的aCTLA4和aPD1的组合实现明显的协同效应。此外，通过MN递送的aCTLA4和aPD1的组合产生完全的黑素瘤控制，其中在
60天内在用aCTLA4和aPD1的组合处理的大约70％小鼠中具有长期的无疾病存活(图22B)。
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2010,107,(9),4275-4280)，针对在一半的抗体剂量下这些疗法的功效的增加，检查通过MN进行的抗CTLA4抗体(aCTLA4)和aPD1共递送的组合。携带
B16F10黑素瘤的小鼠用负载有IgG(1mg/kg，同种型对照)、aCTLA4(1mg/kg)、aPD1(1mg/kg)或共负载有aCTLA4和aPD1(分别0.5mg/kg)的MN-GOx贴片处理。如图22A所示，与单独的
aCTLA4、单独的aPD1或IgG MN处理的小鼠相比，通过MN共递送的aCTLA4和aPD1的组合实现明显的协同效应。此外，通过MN递送的aCTLA4和aPD1的组合产生完全的黑素瘤控制，其中在
60天内在用aCTLA4和aPD1的组合处理的大约70％小鼠中具有长期的无疾病存活(图22B)。
[0188] 总之，MN贴片辅助的免疫疗法可递送aPD1用于增强皮肤癌的治疗。贴片可无痛地穿透表皮并浸入在间质液中，以有效地将其有效载荷递送到肿瘤微环境。每个针中的纳米颗粒(NP)含有aPD1和葡萄糖氧化酶，所述葡萄糖氧化酶促进NP的“自解离”并且随后以持续方式有利于aPD1的释放。使用具有黑素瘤的小鼠模型的体内研究显示单一施用MN贴片抑制肿瘤生长，优于在肿瘤内(i.t.)注射相同剂量的情况下获得的那些。此外，共负载有aCTLA-4和aPD1的MN产生黑素瘤的协同治疗。综合而言，这些结果显示，MN辅助的递送系统提供一种具有改善的安全性、免疫原性和逻辑运算的用于施用癌症免疫治疗剂的新平台技术。
[0189] 参考文献
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[0232] 除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语都与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义具有相同的含义。本文所引用的出版物和致使它们被引用的材料是以引用的方式特别并入。
[0233] 本领域的技术人员将会理解，可对本发明的优选实施方案做出各种变化和修改，并且可在不脱离本发明的精神的情况下做出这些变化和修改。因此，所附权利要求意欲覆盖落在本发明的真实精神和范围内的所有这些等同变化。
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