含枸杞多糖保护液及其在提高间充质干细胞应对体内病理微环境中的应用方法
专利汇可以提供含枸杞多糖保护液及其在提高间充质干细胞应对体内病理微环境中的应用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且含枸杞多糖保护液及其在提高间充质干细胞应对体内复杂病理微环境中的应用方法。该方法采用间充质干细胞的分离、培养、鉴定；含枸杞多糖保护液使用功效鉴定及保护液成分、配比；保护液作用机制等方法步骤，利用天然药物提取物枸杞多糖作为主要组分，替代现有基因编辑或化学药物处理等方法，即：利用纯天然物质干预间充质干细胞，使其更好的适应体内复杂病理微环境，提高生存能 力 和 治疗 潜力。本 发明 保护液可显著促进间充质干细胞在体内病理微环境的存活率，提升治疗效果。，下面是含枸杞多糖保护液及其在提高间充质干细胞应对体内病理微环境中的应用方法专利的具体信息内容。
1.含枸杞多糖保护液，其特征在于，该保护液的组成成分及配比为：枸杞多糖20-100g，人血清白蛋白20-50g，维生素C200-250mg，谷胱甘肽80-100 mg，PH=7.2的磷酸缓冲液1L，将上述成分按所需要求混合搅拌均匀过滤即得到本制剂。
2.含枸杞多糖保护液在提高间充质干细胞应对体内病理微环境中的应用方法，其特征在于，该应用方法包括以下步骤：
（1）间充质干细胞的分离、培养、鉴定：
①间充质干细胞的分离及无血清培养：
3
收集健康足月产妇的胎盘组织，取胎盘侧约 0.5 cm 厚的组织，剪成 1 mm 的碎块，用 HBSS 充分漂洗后，加入 1 g/L 的 Collagenase A 和 1μg/mL DNaseⅠ，37℃水浴消化 2.0 h，收集上清液中的细胞并转入无血清培养基（STEMCELL Technologies），37℃，5%二氧化碳培养箱中培养，24 h 后首次换液，待细胞 80% 90%融合时，以 1∶3 的比例传代；
~
②间充质干细胞特异标志物的鉴定：
将间充质干细胞制备成单个细胞悬液，根据说明书，向加有1×106个细胞的流式细胞管，分别加入荧光基团标记的mAb：IgG2a-FITC、IgG1-PE、CD14-FITC、CD34-FITC、CD45-FITC、CD73-PE、CD90-FITC、CD105-PE、HLA-DR-FITC和同型对照抗体，至终体积为100 μL；避光，室温静置20 min，PBS漂洗后，流式细胞术检测；
③间充质干细胞分化潜能鉴定：
分别按1×105个/孔接种间充质干细胞于6孔板，当细胞生长汇合至约80%，弃掉原培养基，分别加入脂肪细胞诱导液，以及成骨细胞诱导液，37 ℃ 5% CO2 饱和湿度的细胞培养箱中培养 每周换2次液，培养2 ～ 3周后，分别用油红O和茜红素染色，倒置显微镜观察；
（2）含枸杞多糖保护液使用功效鉴定及保护液成分、配比：
①保护液处理间充质干细胞：
选取第2代正常生长的间充质干细胞，用胰蛋白酶消化后，以6000-8000个细胞/cm2接种于培养皿。待细胞生长至60-70%的融合度时，按照1: 100的稀释比例在细胞培养液中加入保护液，继续培养24h后，用胰蛋白酶消化并收集细胞，待用；
②动物分组、制备小鼠肺纤维化模型及间充质干细胞注射：
取雄性6周龄C57BL /6J小鼠40只，随机分为博来霉素组、间充质干细胞治疗组和保护液干预间充质干细胞组、阴性对照组，每组各10只。经腹腔注射10 g /L戊巴比妥钠麻醉，博来霉素组、间充质干细胞治疗组和保护液干预间充质干细胞组分别经气管内注入50μL博莱霉素( 1 g /L) 制备肺纤维化模型，阴性对照组经气管内注入50μL PBS，利用ThermoFisher的Dil Stain标记间充质干细胞，尾静脉注射200μL含5×105个细胞的PBS溶液至间充质干细胞治疗组和保护液干预间充质干细胞组的肺纤维化模型小鼠；
③保护液影响间充质干细胞治疗肺纤维化的功效评估：
取造模后第7天各实验组5只小鼠，制备肺脏冰冻切片，荧光共聚焦显微境观察肺组织中间充质干细胞的数量和分布情况，确定保护液在间充质干细胞对抗肺纤维化病理微环境中的作用，取造模后第21天各实验组5只小鼠，制备各组小鼠肺脏的石蜡切片，经HE染色，根据Ashcroft评分方法确定肺泡炎和肺纤维化程度，同时，进行 Masson染色，观察肺脏组织中胶原的沉积情况；
④保护液提高间充质干细胞的增殖能力：
选取第2代正常生长的间充质干细胞，用胰蛋白酶消化后，以1000个细胞/孔接种于96孔板，同时，按照1：100的比例加入保护液。利用CCK8检测24h、48h、72h、96h和120h细胞的增殖情况，以未加保护液的细胞为对照组；
⑤保护液提高间充质干细胞在肺纤维化病理微环境中的生存力：
利用博莱霉素制备小鼠肺纤维化模型，收集造模后第7天的肺泡灌洗液（BALF），将胰蛋白酶消化后的间充质干细胞，以2000个细胞/孔接种于96孔板，同时，按照1：100的比例加入保护液及BALF，利用CCK8检测培养72h后细胞的增殖情况，以未加保护液的细胞为对照组；
⑥保护液抑制间充质干细胞在肺纤维化病理微环境中的凋亡：
将胰蛋白酶消化后的间充质干细胞接种于35mm培养皿中，待细胞生长至60-70%时，按照4.2.5的方法，使用保护液和BALF处理细胞，24h后，利用Annexin V & Propidium Iodide (PI)凋亡试剂盒检测细胞的凋亡情况，以未加保护液的细胞为对照组；
（3）保护液作用机制：
①保护液影响肺纤维化模型中间充质干细胞自噬的发生：
经腹腔注射10 g /L戊巴比妥钠麻醉，经气管内注入50μL博莱霉素( 1 g /L) 制备肺纤维化模型，利用mRFP-GFP-LC3腺病毒感染间充质干细胞，于造模后第3天尾静脉注射正常和保护液预处理24h的人胎盘来源MSCs，分别制备细胞注射后24h的肺脏冰冻切片，荧光共聚焦显微境观察肺组织中间充质干细胞胞内出现点状聚集的情况；
②保护液调控纤维化病理微环境中间充质干细胞自噬的发生：
利用博莱霉素制备小鼠肺纤维化模型，收集造模后第7天的肺泡灌洗液（BALF），按照1：
100的比例，用保护液预处理人胎盘来源间充质干细胞 24h后，加入上述BALF，提取细胞总蛋白质，western印迹检测自噬标志分子LC3I/II和Beclin1的表达情况，利用mRFP-GFP-LC3腺病毒感染间充质干细胞，按照上述方法用保护液和BALF处理细胞，细胞爬片，荧光共聚焦显微境观察细胞中的点状聚集，确定自噬的发生及自噬潮(autophagic flux)的进行情况；
③Nrf2/ARE信号通路调控作用的鉴定：按照前述病理微环境中间充质干细胞自噬的发生方法处理间充质干细胞，提取细胞总蛋白质，western印迹检测Nrf2及其下游蛋白血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）的表达情况，确定Nrf2/ARE信号通路与保护液调控肺纤维化病理微环境中间充质干细胞自噬的相关性。
含枸杞多糖保护液及其在提高间充质干细胞应对体内病理微
环境中的应用方法
技术领域
背景技术
发明内容
（1）间充质干细胞的分离及无血清培养：
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收集健康足月产妇的胎盘组织，取胎盘侧约 0.5 cm 厚的组织，剪成 1 mm的碎块，用 HBSS 充分漂洗后，加入 1 g/L 的 Collagenase A 和 1μg/mL DNaseⅠ，37℃水浴消化 2.0 h。收集上清液中的细胞并转入无血清培养基（STEMCELL Technologies），37℃，5%二氧化碳培养箱中培养。24 h 后首次换液，待细胞 80% 90%融合时，以 1∶3 的比例传代。
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5 mmol /L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和10 mg /L胰岛素的高糖DMEM培养基) ，以及成骨细胞诱导液( 含10% FBS0. 1 nmol /L地塞米松10 mmol /L -甘油 磷 酸 钠 和0. 5 mmol /L 抗坏血酸的高糖DMEM) ，37 ℃ 5% CO2 饱和湿度的细胞培养箱中培养 每周换2次液，培养2 ～ 3周后，分别用油红O和茜红素染色，倒置显微镜观察。
选取第2代正常生长的间充质干细胞，用胰蛋白酶消化后，以6000-8000个细胞/cm2接种于培养皿。待细胞生长至60-70%的融合度时，按照1: 100的稀释比例在细胞培养液中加入保护液，继续培养24h后，用胰蛋白酶消化并收集细胞，待用。
经腹腔注射10 g /L戊巴比妥钠麻醉，经气管内注入50μL博莱霉素( 1 g /L) 制备肺纤维化模型，利用mRFP-GFP-LC3腺病毒感染间充质干细胞，于造模后第3天尾静脉注射正常和保护液预处理24h的人胎盘来源MSCs，分别制备细胞注射后24h的肺脏冰冻切片，荧光共聚焦显微境观察肺组织中间充质干细胞胞内出现点状聚集的情况。
100的比例，用保护液预处理人胎盘来源间充质干细胞 24h后，加入上述BALF，提取细胞总蛋白质，western印迹检测自噬标志分子LC3I/II和Beclin1的表达情况。利用mRFP-GFP-LC3腺病毒感染间充质干细胞，按照上述方法用保护液和BALF处理细胞，细胞爬片，荧光共聚焦显微境观察细胞中的点状聚集，确定自噬的发生及自噬潮(autophagic flux)的进行情况。
1、枸杞多糖属于食药两用植物，经过长期的大量研究和应用，其安全性已得到了充分肯定；
2、本发明不涉及对细胞的基因改造、信号通路化学诱导以及其它非正常生理手段的干预；
3、本发明首次通过体外实验证实所发明保护液具有提高间充质干细胞增殖能力、抑制细胞衰老的作用；
4、所发明保护液具有提高间充质干细胞抵御体内复杂病理微环境的生物功能，本发明通过动物实验首次证实；
5、所发明保护液在间充质干细胞中的应用，易操作、时效性佳。
附图说明
图3为本发明无血清培养人胎盘胎儿来源MSCs分化潜能分析示意图；
图4为本发明保护液促进人胎盘来源间充质干细胞抑制肺纤维化示意图；
图5为本发明保护液提高PMSCs对小鼠肺纤维化模型胶原沉积的抑制作用示意图；
图6为本发明保护液提高肺纤维化小鼠模型中PMSCs的存活率示意图；
图7为本发明保护液提高人胎盘间充质干细胞的增殖能力示意图；
图8为本发明保护液增强人胎盘间充质干细胞在肺纤维化病理微环境中的生存力示意图；
图9为本发明保护液显著抑制肺纤维化病理微环境中人胎盘间充质干细胞的凋亡示意图；
图10为本发明保护液提高肺纤维化小鼠模型中fPMSCs自噬的发生示意图；
图11为本发明保护液上调肺纤维化病理微环境中PMSCs自噬的发生示意图；
图12为本发明保护液上调肺纤维化病理微环境中PMSCs的Nrf2/ARE信号通路示意图。
具体实施方式
37℃，5%二氧化碳培养箱中培养。24 h 后首次换液，待细胞 80% 90%融合时，以 1∶3 的比~
例传代。无血清培养基培养的第3代人胎盘来源间充质干细胞，形态均一、贴壁、呈梭形涡旋式生长，符合典型的间充质干细胞形态（40×）。
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